專利名稱：：從人的血漿中分離α1-抗胰蛋白酶及其檢測系統的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種純化人的α1-抗胰蛋白酶(一種肝細胞癌的潛在性腫瘤生化標記物)以及構建用于檢測血清中α1-抗胰蛋白酶含量的檢測體系的方法。腫瘤標記物在與放射性理療法相結合的惡性癌腫早期診斷、甄別方法中變得越來越重要。除α-胎兒蛋白外，α1-抗胰蛋白酶被認為是一種檢測肝細胞癌的新的生化腫瘤標記物。于是建立起一種有效的操作方法，用于提純α1-抗胰蛋白酶為同質形式，并構建一種很容易用于測量血清α1-抗胰蛋白酶水平的檢測系統。在建立純化步驟時，考慮下面幾點1)整個方法應是簡單的且在一短時間內能完成。2)仔細地設計步驟，以使在純化過程中蛋白質不會變性。下面是早期建立的分離α1-抗胰蛋白酶的方法、該方法效率低且利用該法分離出的蛋白質不純。對于分離血清蛋白，可利用聚丙烯酰胺(Anal.Biochem.，21∶57-67，1967)、瓊脂糖(Scand.J.Clin.Lab.Invest.，124∶71-82，1972)和SDS-聚丙烯酰胺(Anal.Biochem.，109∶76-86，1980)凝膠。但是由于難于從這些凝膠上回收完整形式的蛋白質，這些方法僅適用于分析目的。圍繞這個問題，人們一直利用各種層析柱為純化血清蛋白質。例如，Crawfortetal.(Arch.Biochem.&Biophys.，156∶215-222，1973)用DEAE-纖維素，QAE-交聯葡聚糖凝膠和交聯葡聚糖凝膠150柱，Saklatvala(Biochem，J.，157∶339-351，1976)用DEAE-纖維素和ConA-瓊脂糖柱純化α1-抗胰蛋白酶。親和性-瓊脂糖凝膠藍和其他離子交換劑和分子篩柱也由Travis(Med.Enz.80∶754-765，1981)和Kang(Kor.Biochem.J.，21∶485-490，1988)用于純化α1-抗胰蛋白酶。但是，這些操作相當復雜和花費時間，從而也就降低了純化酶產量。一般地說，建立一種檢測某種蛋白質的方法，應考慮下面幾點1)測量應是精確的。2)操作應是簡單的。易于掌握和花費時間短。3)如果可能，該方法最好不用任何有害化學試劑，危險的器械或昂貴的工具。在這方面，Ouchterlony(InProgressinAllergy，5∶1，1958)，Lieberman(Chest.，62∶557，1972)，Kew(Br.J.Cancer，37∶635，1978)，Stockley(Am.Rev.RespiratoryDis.，120∶1981)，Fragion(Clin.Genet.，19∶134，1981)，Kim(Kor.J.InternalMed.，24222，1981)和Sparos(Br.J.Cancer，49∶567，1984)曾使用過的放射性免疫擴散(RID)法程序是無效的，因為該方法不靈敏，不能夠測量十分之一μg的某種血清蛋白質。而在巴比妥鈉緩沖液中進行的火箭免疫電泳(RIE)顯示血清蛋白含量的可信數據。通過利用RIE，Laurell(Anal.Biochem.，15∶45，1966)，Eriksson(ActaMed.Scand.，195∶451，1974)，Vaughan(B.B.A.，701∶339，1982)，Choi(Cancer，43∶596，1979)，和Bernacka(Cancer，62∶1188，1988)檢測出α1-抗胰蛋白酶和其他蛋白質的含量。Gaiclulis(Clin.Chem.，29(10)1983)和Carlson(Scand.J.Gastroenterol.，20∶835，1985)也分別利用比濁法和ELISA法測出血清中α1-抗胰蛋白酶的含量。正如上面所述，事實上，以前報道的大多數方法均使用RID或RIE。但是，這兩種方法有各自的缺點。RID是相當費時間(＞48小時)且僅得出近似值。RIE檢定時間較短(3-6小時)，但是電泳需要一個冷卻系統(Anal.Biochem.，15∶45，1966)且需要巴比妥作緩沖液，它是一種能使人產生癖好和毒癮的藥劑。對附圖的簡單描述下面借助附圖描述本發明，如下圖1表示用于純化人的α1-抗胰蛋白酶的各柱的連接。圖2表示在含有1mMEDTA的40mMTris-醋酸鹽緩沖液(PH8.0)中的火箭免疫電泳的結果。本發明的一個目的是建立純化人的α1-抗胰蛋白酶的有效程序以及提供一個檢測系統的方法，利用該檢測系統可在不使用毒品和成癮藥或如ELISA讀數器的昂貴儀器的情況下檢測血清α1-抗胰蛋白酶的含量。為了將α1-抗胰蛋白酶純化為同質形式，進行瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，再通過一系列柱色譜分析。直接連接的親和性-凝膠藍和DEAE-纖維素柱在一個短時間期間內產生同質型的α1-抗胰蛋白酶。為了以簡便快速方法檢測血清α1-抗胰蛋白酶含量，修改了RIE(17)方法。以Tris-醋酸鹽緩沖液代替巴比妥用于電泳。經修改的方法不需要一個冷卻系統且可在室溫下進行。在RIE實驗中實際的測量距離(凝膠上火箭高度)通常接近100mm，而RID實驗中擴散區域直徑不足10mm。因此，事實證明RIE比RID顯示出更精確蛋白質的血清含量值。表1中概括了RID和RIE之間的差異。下面是該純化人α1-抗胰蛋白酶方法的概要。將人血清冷卻到0-4℃。在該血清中加入硫酸銨，最終達到50%飽和度。將該樣品在4℃保持30-60分鐘后，離心該溶液，重新收集上清液。在上清液中再加入硫酸銨，使最終濃度達到80%飽和度。再次將該樣品在4℃保持30-60分鐘且離心。然后將沉淀重新懸浮，在TAE(40mMTris-醋酸鹽，PH8.0，1mMEDTA)或磷酸鹽(20mM磷酸鈉，PH8.0，1mMEDTA)緩沖液中透析。將樣品蛋白質在0.9-1.5%瓊脂糖或8-12%聚丙烯酰胺凝膠上電泳。電泳后，切割下與二甲苯苯胺一起遷移的蛋白質帶且在液氮中用研缽將該譜帶研成粉狀。圖1進一步說明各步驟。將該凍干粉轉移到樣品柱上，加入一直保存在4-8℃的TAE緩沖液，使研成粉的凝膠解凍。柱Ⅰ和柱Ⅱ用親和性-凝膠藍裝填柱Ⅲ用DEAE-纖維素填充。從凝膠中洗提到的蛋白質按順序依次通過這三個相連接的柱。這個步驟所用緩沖液含有10-50mMTris，PH6.5-8.5，1mMEDTA，和1mMβ-巰基乙醇。將該緩沖液收集于F3(圖1)中，直至體積達到樣品柱床體積的10倍時，關閉閥門8。收集1-10ml餾分，在280nm處測量每一餾分的光密度值。匯集含有α1-抗胰蛋白酶的餾分。上面介紹的方法是一種不為公眾所知的新技術，預期這種技術廣泛地用于純化α1-抗胰蛋白酶和其他蛋白質。實際的純化工作在實施例1)中進一步詳述，本發明的方法所得的產品的純度和實驗所需時間與已知方法所得的相關數據一起分別概括于表2和表3中。從上述實驗純化的每一種同質α1-抗胰蛋白酶中各取100-150μg分別注射入每只兔子。得到α1-抗胰蛋白酶的單特效抗血清，將該抗血清加入45-55℃的瓊脂糖溶液(50-100mMTris-醋酸鹽，PH8.0，2mMEDTA，0.8-1.2%瓊脂糖)中，使最終濃度為0.5-3.0%，將該含有抗血清的瓊脂糖溶液傾倒至凝膠平板上。在含有2mMEDTA的50-100mMTris-醋酸鹽緩沖液(PH8.0)中以10-20伏/cm進行水平凝膠電泳1-3小時。電泳后，通過比較試驗樣品與已知量的標準樣品的火箭高度計算出α1-抗胰蛋白酶的血清含量。該試驗中進行的實際過程在實施例2)中進一步說明。上面介紹的方法具有以下幾方面的優點1)可精確地測定血清α1-抗胰蛋白酶含量。2)以Tris-醋酸鹽緩沖液代替巴比妥緩沖液(一種毒品和成癮藥)，電泳可以正常方式操作。3)電泳可在室溫下進行，不需任何冷卻系統，且在3小時內完成。實施例1通過在Tris-醋酸鹽緩沖液中的火箭免疫電泳和三個相連接的親和-凝膠藍和DEAE-纖維素柱，從人血漿中分離同質型α1-抗胰蛋白酶。將粉末狀硫酸銨加到人血清中，直至濃度達到50%飽和度。將該樣品在4℃放置60分鐘，離心后，回收上清液。將額外的粉狀硫酸銨再加到上清液中，使最終濃度達80%。再次在4℃保持60分鐘后，回收沉淀且重新懸浮于緩沖液(40mMTris-醋酸鹽，PH8.0，2mMEDTA)。在相同緩沖液中透析該樣品。將該蛋白質溶液加到1%瓊脂糖凝膠上，電泳3個小時。切下與二甲苯苯胺一起移動的帶，在液氮中用研缽研磨。將凍干膠粉加到樣品柱上，如圖1所示。然后將緩沖液(20mMTris-HCl，PH7.4，1mMEDTA，1mMβ-巰基乙醇)加到樣品柱，依次通過親和性-凝膠藍Ⅰ，親和性-凝膠Ⅱ，和DEAE-纖維素柱。在F3中收集足夠體積的緩沖液后，一個線性NaCl梯度(0.0-0.3M)加到DEAE-纖維素柱上。該實驗結果概括于表2。最后產率為62%，純化α1-抗胰蛋白酶的比活性是817個單位/mg。一個酶單位表示在一分鐘內將O.D410琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-P-硝基酰苯胺還原所需的蛋白質的量。實施例2通過在Tris-醋酸鹽緩沖液中進行火箭免疫電泳檢測α1-抗胰蛋白酶。每隔10天，取100～150μg經過純化的α1-抗胰蛋白酶注射兔子。第4次注射后，回收抗血清。將該抗血清加到50℃的瓊脂糖溶液(1%)中，使最終抗血清濃度為1.5%。然后將該瓊脂糖溶液傾倒至凝膠板上，制成3mm厚的凝膠板。待膠冷卻后，每種樣品血清各取1μl加到凝膠板的每一孔中。在含有2mMEDTA的40mMTris-醋酸鹽緩沖液中，以15伏/cm在室溫下電泳3小時。測量火箭高度，且與已知標準樣品的火箭高度相比較，結果顯示于圖2。表1.放射性免疫擴散(RID)和火箭免疫電泳(RIE)之間的比<p>表2.通過本發明使用的方法純化α1-抗胰蛋白酶</tables>＊一個胰肽酶E-抑制活性單位定義為每分鐘將△A410降低1.0吸收單位的蛋白質量。測試混合物含有0.2MTris-Cl，PH8.0，1.2×10-6mol胰肽酶E和9.97×10-4mol琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-P-硝基酰苯胺。表3.純化α1-抗胰蛋白酶的每個步驟所需時間常規方法時間(hr)本發明所用方法時間(hr)硫酸銨分餾2硫酸銨分餾2透析3透析3QAE-交聯葡聚糖5凝膠電泳2凝膠A-50硫酸銨沉淀1凝膠洗提和5連續柱層析透析3親和性-凝膠藍Ⅰ2親和性-凝膠藍Ⅱ2硫酸銨沉淀1透析3伴刀豆球蛋白A柱5層析總計27總計12附圖的進一步描述圖1栓Ⅰ親和性-凝膠藍Ⅰ栓Ⅱ親和性-凝膠藍Ⅱ栓ⅢDEAE-纖維素B緩沖液V閥門F餾分收集器圖2.在含有1mMEDTA的40mMTris-酸鹽緩沖液(pH8.0)中進行的火箭免疫電泳的結果。室溫下，以15伏/Cm的電壓將已純化的α1-抗胰蛋白酶和健康人血清在含有1.5免抗血清的1%瓊脂糖凝膠上，在TAE(40mMTris-酸酸鹽，1mMEDTA，pH8.0)緩沖液中電泳3小時，用酰胺黑10B染色凝膠A、該圖表示火箭高度和α1-抗胰蛋白酶濃度之間的相關性B、孔2，3，4和5含有0.6，1.5，3.0和6.0μg的抗α1-抗胰蛋白酶。孔1和6僅含有TAE緩沖液、孔7和8含有1μl健康人體人血供體的血清。權利要求1.純化α1-抗胰蛋白酶為同質型的方法，包括通過硫酸銨分餾(50～75%之間)和瓊脂糖凝膠電泳部分純化后，再通過三個相連接的柱子(親和性-凝膠藍I，親和性-凝膠Ⅱ和DEAE-纖維素)純化。2.測量血清α1-抗胰蛋白酶的檢測系統，該檢測系統使用含1-3%α1-抗胰蛋白酶的抗血清的瓊脂糖凝膠，且將該檢測系統設計成在室溫，不含任何成癖和毒癮藥的TAE緩沖液(100mMTris-醋酸鹽，PH8.0，1mMEDTA)或其他緩沖液中進行火箭免疫電泳。全文摘要本發明涉及一種純化人的α文檔編號G01N30/46GK1053445SQ9011032公開日1991年7月31日申請日期1990年11月30日優先權日1989年12月21日發明者南永祐申請人:國際藥品工業株式會社
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