專利名稱：熒光化合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及新的光致發光化合物，涉及新的蛋白質檢測物(detector)并涉及檢測蛋白質在流體、特別是水或體液中的存在的新方法。
光致發光化合物是已知的，并且已知的光致發光化合物包括被稱為squaraine染料的染料類別，特別是假吲哚系列的squaraine染料，它們是如下通式的取代和未取代化合物 其中X＝S，Se或C(CH3)2和R1＝烷基和R2＝H，烷基或鹵素已知的假吲哚squaraine染料包括對稱和不對稱的化合物，并且描述于，例如E.Terpetschnig等在Anal.Chim.Acta 282(1993)第633-641頁的文章中。
這些染料在水中是不可溶的，并且特別用于在流體中的蛋白質存在的定性檢測。為了使用這些染料來對蛋白質的存在進行檢測，必須將所述染料溶解在包含水和醇諸如甲醇的混合物的溶劑中，所述蛋白質本身在流體，特別是水性流體中是水溶性的。當將蛋白質加入假吲哚squaraine染料的水/甲醇溶液中時，存在熒光的增加。在上述引用的文章中公開的分析方法是純定性的方法，僅僅記錄蛋白質在測試的流體樣品中的存在或缺乏，并且因此不能用于測定存在的蛋白質的量。
目前對于流體中蛋白質的定量分析的方法和對于凝膠中的蛋白質進行定量和半定量分析如染色的方法包括針對流體的Bradford[M.M.Bradford，Anal.Biochem.72(1976)248]，Lowry[O.H.Lowry等J.Biol.Chem.193(1951)265]方法和二金雞納酸(bicinchoninic acid)(BCA)[P.K.Smith等Anal.Biochem.150(1985)76]方法以及針對凝膠的銀染[C.R.Merril，Meth.Enzymol.182(1990)477]和考馬斯藍[S.Fazekas de St.Groth等，Biochim.Biophys.Acta 71(1963)377]。Bradford，Lowry和BCA方法是比色技術(即，顏色變化)并適合于8-2000μg/mL的溶液蛋白質范圍，需要多個試劑和溫育時間并受到來自許多常見試劑的干擾。用在Bradford方法中的考馬斯藍需要20-30分鐘并且不被tris緩沖液所阻礙。銀染是非常敏感的(10-100ng/mL)顯色技術并被用作凝膠染色技術但是在處理凝膠中必須小心，整個技術需要2-3小時。考馬斯藍也是凝膠染色劑并且如果蛋白質范圍在顯色μg范圍內，可以代替銀染色劑使用。檢測蛋白質濃度的其它商業技術包括來自Molecular Probes的NanoOrangeTM蛋白質定量試劑盒和CBQCATM蛋白質定量試劑盒，它們是依賴于熒光變化的超靈敏溶液技術，但是在對于squaraine衍生物給定的范圍內不是線性的。這兩種技術也需要30分鐘的制備時間。
本發明的一個目的是提供新的光致發光化合物，特別是可溶于水、或包含水的溶劑混合物的新的光致發光化合物，并且它保持其在這些介質中的光致發光性質。
本發明的另一個目的是提供檢測蛋白質在流體中的存在的方法，或作為凝膠染色的方法，其中上述時間限制被減少或基本被避免并具有更高的靈敏度。
本發明提供包括下式對稱骨架結構的水溶性光致發光化合物
其中x可以代表任意整數，并且其中苯環可以被取代。
特別優選的按照本發明的化合物包括其中x＝3的那些。
另外優選的按照本發明的化合物包括未被取代的那些或其中一個或兩個苯環在5位上被烷基(包括i丙基和t丁基)或鹵素基團取代的那些。
特別優選的按照本發明的化合物包括2，4-二(1-(丙-3-磺酸)-3，3-三甲基-2-二氫亞吲哚基甲基)環丁烯二鎓-1，3-二醇酸酯(diolate)或所述磺酸的任何金屬或季氮(即，銨，一-、二-或三烷基銨，吡啶鎓等)鹽。
本發明還提供蛋白質檢測物，所述檢測物以1×10-9-1mol/L的濃度，在水溶液或含水的溶劑混合物中，包含包括如下通式的對稱骨架結構的化合物 其中x可以表示任何整數，并且其中苯環可以被取代。
本發明還提供測量流體樣品的總溶解蛋白質含量的方法，所述方法包括如下步驟(a)以1×10-10-1mol/L的濃度，在水溶液或含水的溶劑混合物中溶解包括如下通式的對稱骨架結構的化合物
其中x可以表示任何整數，并且其中苯環可以被取代。
(b)將步驟(a)的溶液與測試流體樣品混合；(c)測量樣品的熒光；和(d)將所述熒光與一個標準值或多個標準值(即，校正曲線)比較從而獲得所述總蛋白質含量的值。
本發明還提供檢測蛋白質和/或將蛋白質定量的方法，所述蛋白質在十二烷基硫酸鈉(SDS)存在或缺乏的情況下，在已經被固定在包含含水甲醇和含水乙酸的水性/有機/酸混合物中的支持基質例如聚丙烯酰胺、瓊脂糖或淀粉中以電泳分離，在所述方法中接著以1×10-10到1mol/L的濃度，用在10％含水甲醇或含水乙酸的溶液中的光致發光化合物對所述基質進行染色，并進行脫色以顯現條帶，所述光致發光化合物包括如下通式的對稱骨架結構 其中x可以代表任何整數，并且其中苯環可以被取代。
為了在需要的檢測范圍內建立蛋白質水溶液的熒光的標準值，使用5×10-8M的化合物的水溶液來測量含有已知濃度的蛋白質BSA的溶液的熒光，所述化合物包括下式的對稱骨架結構
其中x＝3染料1，所述熒光測量是在624nm的激發波長(ε＝1.0×105mol-1cm-1)和638nm的檢測波長下進行。
在0-100ng/mL BSA的范圍內，對于兩條單獨的校正曲線的結果顯示于
圖1；在0-500ng/mL BSA的檢測范圍內，對于三條單獨的校正曲線的結果顯示于圖2；在0-10μg/mL BSA的檢測范圍內，對于三條單獨的校正曲線的結果顯示于圖3。
特別令人吃驚的是注意到在這些檢測范圍內的線性反應。
對于本發明的光致發光化合物而言還有一個優勢的是，一旦已經使用BSA建立了校正曲線，那么可以即刻測量任何數量的蛋白質濃度。熒光也在較高的波長，并且不被任何漫射的較低波長的有機熒光所掩蔽。
實施例 圖1
圖2圖3實驗例原材料
使用E.Havinga等在Synthetic Metals 69(1995)第581-582頁中的文獻方法，通過使用迪安-斯達克裝置在過量1，3-丙磺酸內酯和甲苯中加熱2，3，3-三甲基假吲哚來制備2，3，3-三甲基-1-(丙-3-磺酰基)假吲哚。冷卻后，將過量溶劑傾析掉并用石油醚重復洗滌從而得到紅色的油。在靜置數周后，從所述油形成2，3，3-三甲基-1-(丙-3-磺酰基)假吲哚的晶體，單晶x-射線結構顯示于圖4。
圖4
2，3，3-三甲基-1-(丙-3-磺酰基)假吲哚結構的分子構象和原子命名方案。
染料1的制備 使用Sprenger和Ziegenbein在Agnew.Chem.Int.Ed.6(1967)第533頁中的文獻方法，通過使用迪安-斯達克裝置，與在50/50甲苯/丁烷-1-醇中的催化量的quinaline一起回流2∶1摩爾量的2，3，3-三甲基-1-(丙-3-磺酰基)假吲哚和方形酸來制備2，4-二(1-(丙-3-磺酸)-3，3-二甲基-2-二氫亞吲哚基甲基)環丁烯二(鎓)-13-二醇酸酯。去除反應溶劑后，在真空中收集產物并重復用石油醚熱洗。
權利要求
1.包括下式的對稱骨架結構的水溶性光致發光化合物 其中，x可以代表任何整數，并且其中苯環可以被取代。
2.按照權利要求1的光致發光化合物，其中x＝3。
3.按照權利要求1或權利要求2的光致發光化合物，其是未被取代的。
4.按照權利要求1或權利要求2的光致發光化合物，其中一個或兩個苯環在5位上被烷基或鹵素基團所取代，所述烷基包括i丙基和t丁基。
5.按照權利要求1-4中任一項的光致發光化合物，其是2，4-二(1-(丙-3-磺酸)-3，3-三甲基-2-二氫亞吲哚基甲基)環丁烯二鎓-1，3-二醇酸酯或所述磺酸的任何金屬或季氮(即，銨，一-、二-或三烷基銨，吡啶鎓等)鹽。
6.基本上如本文所述并參考實施例的光致發光化合物。
7.一種蛋白質檢測物，其在水溶液中以1×10-10到1摩爾/L的濃度包含光致發光化合物，所述光致發光化合物包括如下通式的對稱骨架結構 其中x可以表示任何整數，并且其中苯環可以被取代。
8.一種測量流體樣品的總溶解蛋白質含量的方法，該方法包括如下步驟(a)以1×10-10-1mol/L的濃度，在水溶液中溶解包括如下通式的對稱骨架結構的光致發光化合物 其中x可以表示任何整數，并且其中苯環可以被取代；(b)將步驟(a)的溶液與測試流體樣品混合；(c)測量所述樣品的熒光；和(d)將所述熒光與標準值比較從而獲得所述總溶解蛋白質含量的值。
9.一種檢測蛋白質和/或將蛋白質定量的方法，所述蛋白質在十二烷基硫酸鈉(SDS)存在或缺乏的情況下、在已經被固定在包含含水甲醇和乙酸的水性/有機/酸混合物中的支持基質中電泳分離，其中接著以1×10-10到1mol/L的濃度、用在10％含水甲醇或含水乙酸的溶液中的光致發光化合物對所述基質進行染色，并進行脫色以顯現條帶，所述光致發光化合物包括如下通式的對稱骨架結構 其中x可以代表任何整數，并且其中苯環可以被取代。
10.按照權利要求9的方法，其中所述支持基質是聚丙烯酰胺，瓊脂糖或淀粉。
全文摘要
本發明公開了一種水溶性光致發光化合物，其包括式(A)的對稱骨架結構，其中x可以代表任何整數，并且其中苯環可以被取代。本發明還公開了包含這種化合物的蛋白質檢測物和測量流體樣品中總溶解蛋白質含量的方法。
文檔編號G01N33/58GK1863889SQ200480028870
公開日2006年11月15日 申請日期2004年9月30日 優先權日2003年10月3日
發明者D·E·林奇, J·黑普廷斯托爾 申請人:考文垂大學
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