專利名稱：鑒定藥物作用途徑的方法
1.發明的領域本發明的領域涉及用于鑒定藥物在細胞內作用的方法，特別是用于尋找受藥物作用影響的細胞內生物途徑的方法，以及應用這些方法發現藥物。
2.背景鑒別藥物或候選藥物作用的生物途徑是一個具有巨大經濟價值的課題，并對人類有重大意義。雖然常?？芍阑蛲茰y一種藥物影響的主要靶分子和細胞途徑，因為最初是通過特定的藥物篩選方法選擇了這種藥物，但是重要的是要證明它對這種主要途徑的作用，并定量它常常以未預料的方式沿著其它可能是有害的或者有利的次要途徑的作用。在另一些情況下，藥物作用的主要途徑是未知的，必須對確定這些途徑。
對于許多應用研究領域，例如藥物的發現，這種信息是重要的，藥物的發現是一個借助它對生物活性化合物進行鑒定和初步描述特征的過程。在對人類疾病治療的進程中藥物的發現是一個關鍵性步驟。目前，二種途徑支配著新藥尋找過程。首先是以特定的生物檢測法進行測定，開始篩選對細胞或機體具有所需作用的化合物(例如，誘發細胞凋亡或抑制血管形成)。然后可對具有所需活性的化合物進行修飾，以便增強其效力，增加穩定性或其它特性，并以此生物測定法再次測試這種經修飾的化合物。這樣，當以小鼠腫瘤模型進行測試時，就可能鑒定具有血管形成抑制劑作用的化合物，然后合成結構相關的化合物，并用同樣的測定法再次測試。這種方法的一個局限性是，通過篩選常常不知道也不能測定其作用機制，例如受此化合物影響的靶分子的細胞途徑。此外，這種測定方法僅能提供很少有關藥物作用特性的信息，不論是有關作用的靶標或作用途徑。最后，所需要花費的實驗努力限制了通過測試對細胞或動物生物作用可篩選的化合物數量。
相比之下，藥物篩選的第二種途徑包括測試大批化合物對已知靶分子的特異性作用，典型的靶分子是克隆的基因序列或者分離出的酶或蛋白質。例如，可用于測試大批化合物改變來自特定啟動子轉錄水平的能力，或者改變對已鑒定蛋白質結合能力的方法，可以發展成為高通量的測定方法。雖然使用高通量的篩選是鑒定候選藥物的強有力的方法，但也具有局限性。主要的缺點是這種測定方法僅能提供很少，或者不能提供有關化合物在細胞或機體水平作用的信息，特別是涉及受影響的真正細胞途徑的信息。為了測定在體內的毒性或副作用，必須通過將藥物用于一系列生物細胞和整體動物試驗來測試這些作用。實際上，對候選藥物特性和毒性研究的分析可能耗費藥物開發過程的大部分時間(參見例如Oliff等1997，“藥物開發的靶分子”，in Devite等，癌腫瘤學的原理與實踐，第五版，1997 Lippincott-Raven出版公司，Philadelphia)。
幾種基因表達的測定方法現在已可實際應用于在細胞培養中定量測定藥物對大部分基因和蛋白質的作用(參見例如Schena等，1995，對具有互補DNA微陣列的基因表達模型的定量監測，科學270467-470；Lockhort等，1996，通過對高濃度寡核苷酸序列的雜交進行表達監測，自然生物技術學141675-1680；Blanchqrd等，1996，排列順序探測基因組的奧密，自然生物技術學14，1649；1996，US專利5,569,588，Ashby等1996.10.29公開，標題為“藥物篩選的方法”)。來自這些基因表達測定法的原始數據常常難以協調一致地加以解釋。這種測定技術一般可報告在應答藥物時具有改變表達的許多基因，典型地是50-100，可能達到1000，或者少至10。在一般情況下，不作進一步分析，僅根據這些數據不可能辨別其原因和作用。在一對相關的生物狀態下許多基因中的一個或幾個也具有改變表達的事實，導致幾乎不能理解是什么引起了這種改變以及這種改變的作用是什么。這些數據本身并不告訴研究者關于受影響的途徑或作用機制。它們并不指示哪些作用起因于對主要途徑的作用，以及哪些作用是受藥物影響的其它次要途徑的結果。所有這些受影響途徑一個一個單獨的知識，對于理解藥效，副作用，毒性，可能的失效，以及對代謝應答的激活等等都是有用的。進而，鑒定藥物作用的所有途徑可以導致發現適合于達到原先治療目的的另外一些途徑。
基因表達研究者必須進一步實驗。至少在藥物靶標篩選的情況的基因表達研究者必須進一步實驗。至少在藥物靶標篩選的情況下，需要用于指導分析整理這些數據和這種進一步實驗的系統方法。
因此，需要有改進的方法(例如，更快速和較少花費的方法)用于根據對這些數據如基因表達數據的有效分析整理，鑒定藥物的活性特征和受藥物影響的細胞途徑的特征。本發明提供了用于快速鑒定受候選藥物影響的靶分子和途徑以及描述它們特性的方法。還進一步提供了基于不同于基因表達分析的測定方法的一些方法。
3.發明概述本發明提供了用于測定通過它藥物對細胞起作用的主要和次要生物途徑的方法，以及鑒定通過每種途徑被影響的蛋白質和基因的方法。這種方法包括將在應答藥物暴露時RNA或蛋白質豐度或者活性的測定量與在應答對每種途徑受控的已知擾動時可能受藥物影響的途徑中RNA或蛋白質豐度或者活性的測定量進行比較。在不同強度的藥物暴露下測定RNA或蛋白質的豐度或者活性。將已知的途徑擾動控制在不同的強度，跨越從途徑抑制直至途徑飽和范圍內的主要區域。另外，本發明提供了通過比較在應答同時的藥物處理和受控的途徑擾動時RNA或蛋白質豐度或者活性的測定量，證實受藥物影響的可能途徑的方法。進而本發明提供了比較二種不同藥物作用的方法，是通過將在應答暴露于第一種藥物時RNA或蛋白質豐度的測定量與在應答暴露于另一種或幾種藥物時RNA或蛋白質豐度的測定量進行比較。
本發明的方法是基于如下發現，通過應用涵蓋一系列途徑擾動強度和藥物暴露水平的數據，可以使對藥物作用生物途徑的分析堅實可靠。一般來說，生物途徑的擾動和藥物暴露水平優選地包括從對整個途徑沒有作用至飽和狀態的范圍。在以前的方法中，這種分析常常僅基于這些范圍內的二個點，即不暴露或擾動和充分飽和的暴露或擾動。這種局限的信息導致了較少堅實可靠的結果。
例如，這些方法具有顯著的優點和改進，優于僅僅基于應用遺傳缺失或過度表達的分析方法，這種方法一般僅能給出對固定飽和狀態的數據。首先，遺傳缺失或過度表達的細胞株未必可用于所需的生物系統。其次，應用來自一系列生物途徑擾動強度和藥物暴露水平的應答數據，大大提高了區別沿不同途徑所介導作用的能力。例如，一種所研究的藥物可能沿二條途徑具有不同的效力，這二條途徑會聚影響一組重疊的基因?？缭揭幌盗型緩綌_動強度和藥物暴露水平的實驗可以表明，這些途徑在不同的藥物暴露水平變得有效。另一方面，來自完全中斷每條途徑的遺傳缺失突變的數據，不能分辨這種效力差異。
更詳細地說，本發明提供了用于通過如下步驟鑒定和表現藥物對細胞作用的生物途徑的方法(i)測定細胞成分對細胞分級暴露于所研究藥物的應答；(ii)測定細胞成分對一種或幾種細胞生物途徑擾動的應答；以及(iii)定標一組所測定的途徑應答，以便使所測定的藥物應答最好地符合于客觀的測定。在另一些實施方案中，本發明還提供用于檢驗所鑒定表現的顯著性，以及用于驗證所鑒定途徑是藥物作用的真實途徑。在一些不同的實施方案中，可以通過測定基因表達(即RNA水平)，蛋白質豐度，蛋白質活性，或一組這樣的測定量來檢定細胞成分的應答。在不同的實施方案中，通過使用可滴定的表達系統，使用轉染系統，改變途徑RNAs的豐度，改變途徑蛋白質的豐度，或者改變途徑蛋白質的活性，可以形成對細胞內生物途徑的擾動。本發明還提供了基于鑒定藥物作用生物途徑的方法用于藥物開發的方法。
在第一個實施方案中，本發明提供了一種方法，用于表現包含在一種細胞類型藥物作用中的生物途徑，此方法包括(a)提供該藥物在此細胞類型中的藥物應答，該藥物應答已通過包括在對該藥物的多種暴露水平下，測定此細胞類型的細胞中許多細胞成分的方法獲得；(b)提供一種作為該細胞類型中一種或幾種生物途徑應答組合的模式藥物應答，其中該細胞類型中的生物途徑應答是一種方法的結果，此方法包括在對該生物途徑的多種擾動水平測定該細胞類型細胞中該生物途徑的細胞成分，并且其中該組合中所述一種或幾種生物途徑應答的每一種須經單獨的定標轉換；以及(c)確定該一種或幾種生物途徑應答的最佳定標轉換，它可最小化該藥物應答與所述模式藥物應答之間差異的目標函數值，從而該一種或幾種生物途徑應答組合在最佳定標轉換條件下可表現包含在該細胞類型藥物作用中的生物途徑。
在第一實施方案的第一方面中，本發明進一步提供，這種確定步驟還包括確定該目標函數的“真實”最小化值，以及在該確定步驟(即上面的步驟c)之后，通過一種方法評價此一種或幾種生物途徑的所述最佳定標轉換的統計學顯著性的步驟，此方法包括(a)獲得該目標函數最小化值的預期概率分布；以及(b)依據該目標函數最小化值的預期概率分布，評價所述目標函數真實最小值的統計學顯著性，其中該目標函數真實的最小化值是從所提供的藥物應答和所述模型藥物應答確定的目標函數最小化值。在第一實施方案的這方面，本發明進一步提供，獲得所述目標函數最小值預期概率分布的步驟進一步包括如下步驟(a)通過隨機化相對于所述一種或多種生物途徑的多種擾動水平的一種或幾種生物途徑應答，隨機化所述相對于多種藥物暴露水平的藥物應答和隨機化所述模式藥物應答；(b)通過尋找該一種或幾種隨機化的生物途徑應答的最佳定標轉換，確定該目標函數的“理論”最小化值，此最佳定標轉換可最小化所述隨機化的藥物應答與隨機化的模式藥物應答之間差異的目標函數；以及(c)重復前面的二個步驟，以便確定多個理論最小值，該多個理論最小化值形成所述最小化值的預期概率分布。
在第一實施方案的第三方面，本發明進一步提供了在所述的確定步驟之后通過一種方法驗證所述一種或幾種生物途徑是真實地包含在該細胞類型該藥物作用中的生物途徑的步驟，此方法包括(a)通過一種方法提供在該細胞類型中組合的藥物-擾動應答，此方法包括測定同時暴露于一種或幾種對該藥物的暴露水平和一種或幾種對所述一種或幾種生物途徑的擾動水平的該細胞類型中的多種細胞成分；以及(b)選擇如下模式應答中行為最類似于所述組合的藥物-擾動應答的模式應答(i)第一種模式應答在最佳定標轉換的條件下包含一種或幾種生物途徑應答的組合，此最佳定標轉換是按一個或幾個第一總數估算的，每個第一總數是一個或幾個藥物暴露水平中的一個在定標轉換的條件下與一個或幾個對生物途徑擾動水平中一個的總和，(ii)第二種模式應答包含一個或幾個第二總數，每個第二總數在按一個或幾個對生物途徑擾動水平中一個估算的最佳定標轉換條件下，是按一個或幾個藥物暴露水平中一個計算的藥物應答與一個或幾個生物途徑應答組合的總和，從而如果選擇第一種模式應答則可驗證所述一個或幾個生物途徑為真實包含在該細胞類型該藥物作用中的生物途徑。
在第一實施方案的第四方面，本發明進一步提供，在所述的確定步驟之后，將存在于藥物應答中的細胞成分指定屬于所述一種或幾種生物途徑中一種的步驟，其中該細胞成分的生物途徑應答在其最佳定標轉化的條件下具有與該細胞成分的藥物應答最大的相關性。
在第二實施方案，本發明提供了一種從最初的候選藥物中確定更具途徑-特異性的候選藥物的方法，包括(a)通過第一實施方案的方法表現與最初候選藥物作用有關的生物途徑；(b)修飾最初候選藥物的結構；(c)通過第一實施方案的方法表現與所修飾的最初候選藥物作用有關的生物途徑；以及(d)如果所修飾的最初候選藥物具有比最初候選藥物更少的與其作用有關的生物途徑，則確定該修飾的最初候選藥物比最初候選藥物是更具途徑-特異性的候選藥物。
在第三實施方案中，本發明提供了一種方法，用于鑒定一種或幾種與藥物的作用有關并介導此藥物的副作用的特異性生物途徑，該方法包括(a)對第一種藥物實行第一實施方案的方法；(b)對第二種藥物實行第一實施方案的方法，其中第一和第二種藥物是不同的，并且對相同的疾病或障礙表現出治療效果；以及(c)鑒定那些與第一種藥物作用有關并與第二種藥物作用的生物途徑不同的特異性生物途徑，從而鑒定出一種或幾種與第一種藥物作用有關并且介導第一種藥物的副作用的特異性生物途徑。
在第四實施方案中，本發明提供了一種方法，用于鑒定參與介導一種疾病或障礙治療效果的一種或幾種特異性生物途徑，該方法包括(a)對第一種藥物實行第一實施方案的方法；(b)對第二種藥物實行第一實施方案的方法，其中第一和第二種藥物不同并表現出對相同的疾病或障礙有治療效果；以及(c)鑒定那些與第一種藥物和第二種藥物作用有關的特異性生物途徑，從而鑒定出與第一種藥物作用有關并介導對該疾病或障礙治療效果的一種或幾種特異性生物途徑。
在第五實施方案，本發明提供了一種方法，用于通過如下步驟比較在一種細胞類型上來自二種不同藥物的藥物應答，并從而測定此二種不同的藥物對該細胞類型作用的相似性(a)對在該細胞類型所研究的第一種藥物提供第一種藥物應答，已通過一種方法獲得了這種藥物應答，此方法包括在對第一種藥物多種暴露水平測定該細胞類型細胞中的多種細胞成分；(b)對在一種細胞類型所研究的第二種藥物提供第二種藥物應答，已通過一種方法獲得了第二種藥物應答，此方法包括在對第二藥物多種暴露水平測定該細胞類型中的多種細胞成分；以及(c)確定第二種藥物應答的最佳定標轉換，它可最小化第一種與第二種藥物應答之間差異的目標函數數值。
在第六實施方案中，本發明提供了一種方法，用于表現與環境改變對一種細胞類型作用有關的生物途徑，此方法包括(a)提供該細胞類型中對此環境改變的環境應答，已通過一種方法獲得了這種環境應答，此方法包括在該環境改變的多種嚴重程度下測定該細胞類型細胞中的多種細胞成分；(b)提供一種模式環境應答作為該細胞類型中一種或幾種生物途徑應答組合的模式環境應答，其中該細胞類型中的生物途徑應答是一種方法的結果，此方法包括在對該生物途徑的多種擾動水平測定該細胞類型細胞中該生物途徑的細胞成分，并且其中該組合中所述一種或幾種生物途徑應答的每一種須經單獨的定標轉換；以及(c)確定該一種或幾種生物途徑應答的最佳定標轉換，它可最小化該環境應答與模型環境應答之間差異的目標函數值，從而該一種或幾種生物途徑應答組合在最佳定標轉換條件下可表現與此環境改變對該細胞類型作用有關的生物途徑。
在第七實施方案，本發明提供了一個計算機系統，用于表現參與一種細胞類型藥物作用的生物途徑，此系統包括處理器和偶聯于該處理器的存儲器，該存儲器編碼一種或幾種程序，該一種或幾種程序導致處理器執行包括如下步驟的方法(a)接收該細胞類型中該藥物的藥物應答，該藥物應答包括在多個藥物暴露水平的該細胞類型細胞中多種細胞成分的測定量；(b)接收一種或幾種生物途徑應答，該一種或幾種生物途徑應答的每一種都包括在對該生物途徑多個擾動水平的該細胞類型細胞中該生物途徑細胞成分的測定量；(c)形成一個作為該一種或多種生物途徑組合的模式藥物應答，該組合中所述一種或幾種生物途徑應答的每一種須經單獨的定標轉換；(d)確定該藥物應答與模式藥物應答之間差異的目標函數值；以及(e)通過改變所述一種或幾種生物途徑應答的定標轉換以便獲得可最小化所確定的目標函數值的最佳定標轉換，用于最小化所確定的目標函數值；從而，所述一種或幾種生物途徑應答組合在最佳標定轉換的條件下可表現參與該細胞類型該藥物作用的生物途徑。
4.附圖簡述
圖1圖解說明假定藥物D對生物系統作用的示范性途徑。
圖2A圖示說明在暴露于藥物D的圖1生物系統中，基因G1，G2和G3表達的示范性應答(數值被標準化成未處理值)；圖2B圖示說明發生在蛋白質P1對P1分級擾動的途徑中基因G1，G2和G3的示范性應答；圖2C圖示說明在圖2A-B中說明的應答之間的示范性相關性。
圖3圖示說明來自大約6000個所測定的酵母基因30個酵母基因的應答曲線，這些基因對于氨甲喋呤藥物暴露具有最大的表達率改變；氨甲喋呤暴露水平是3，6，25，50，100和200μm；100μm滴度導致了50％生長缺乏；在任意橫座標的-0.5應答已被設置于0。
圖4圖示說明Hill函數對圖3中所示基因YOLO31C應答的擬合。
圖5圖解說明本發明方法實施方案的操作流程圖。
圖6圖示說明藥物D對基因Gk作用可能的另外途徑。
圖7A-B圖示說明等式10和11的表面透視圖。
圖8A-C圖示說明對分別暴露于藥物環孢菌素A，氨甲喋呤和FK506具有最大表達率改變的酵母基因的應答曲線；圖8D圖示說明圖8C中所示的應答對圖8A-B中所示應答總和的相關性。
圖9圖解說明本發明計算機系統的示范性實施方案。
5.詳述此部分對本發明及其對藥物發現的應用給予了詳細的描述。是通過幾個對本發明一般性方法的示范性圖解說明，以逐漸增加的詳細程度和特殊性進行這種描述。這些實施例不是限制性的，并且對本領域技術人員顯然可見的相關變化形式將被包含在所附的權利要求中，下面這些實施例是對伴隨這些一般性方法的數據匯集步驟實施方案的描述。
5.1引言本發明包括用于確定生物途徑的方法，通過這種生物途徑藥物對生物系統(例如細胞，細菌或病人)發揮作用。這些方法包括將應答分級藥物暴露時細胞生物狀態改變的測定量，與很可能參與此藥物作用的生物途徑的生物狀態改變測定量進行比較，并且后者的改變是應答對這些途徑已知的分級擾動。從這種比較得出的結果是作為該藥物對每個生物途徑單獨作用組合的該藥物對此細胞作用的表現。
此部分首先提供了某些基本概念，包括藥物作用，細胞生物狀態，以及生物途徑的概念，根據本發明，這些概念可代表藥物在細胞內的作用。其次，提供了本發明方法的示意性和非限制性的概述。下面的章節更加詳細地提供了本發明的方法。
雖然為簡便起見，本公開內容常常提到單細胞(例如，從在單個基因受干擾的細胞中分離RNA)，但是，本領域的技術人員將理解到，更通常是使用許多起源類似的細胞，例如來自培養的細胞系來實施本發明的任何特定步驟。在此這些類似的細胞被稱為“細胞類型”。這些細胞或者來自天然的單細胞生物，或者從多細胞高等生物得到。
具體地說，5.1節描述了對進一步說明本發明有用的某些基本概念。5.2節概括地描述了本發明的方法。5.3節描述了本發明方法的優選分析實施方案。5.4節描述了干擾生物途徑的方法。5.5節描述了測定細胞成分的方法，最后5.6節描述了本發明對藥物發現和開發的某些示范性應用。
藥物作用和生物狀態根據本發明，藥物是可干擾生物系統的具有任何復雜程度的任何化合物，不論是通過已知的還是未知的機制，以及是否將它們用于治療。因此藥物包括具有研究或治療價值的典型的小分子；天然存在的因子如內分泌因子，旁分泌因子或自動分泌因子，或者與任何類型細胞受體相互作用的因子；細胞內因子如細胞內信號傳輸途徑的成分；以及從其它天然來源分離出的因子等等。藥物的生物作用可能特別是藥物介導的如下改變的結果對一種或幾種RNA轉錄或降解速度的改變，對一種或幾種多肽翻譯或翻譯后加工速度和程度的改變，對一種或幾種蛋白質降解速度和程序的改變，以及對一種或幾種蛋白質的作用或者活性抑制或刺激作用的改變等等。事實上，絕大多數藥物是通過與蛋白質相互作用行使它們的影響。增加速度或刺激蛋白質活性的藥物在此被稱為“激活性藥物”，而降低速度或抑制蛋白質活性的藥物在此被稱為“抑制性藥物”。
除藥物之外，本發明還同樣適用于那些以靶定的方式干擾生物系統的物理環境或物理環境狀況的改變。這種環境改變可以包括適度的溫度改變(例如溫度升高10℃)或者暴露于適度劑量的放射性作用。其它一些環境狀況包括營養環境如存在唯一的特種糖類，氨基酸等等。
在本發明是通過觀察細胞生物狀態改變來測定藥物(或物理環境改變)的生物作用。以如在此使用的細胞生物狀態意指一群細胞成分的狀態，它足以滿足鑒定細胞的預定目的，如表示藥物作用的特征。對這些成分所作的測定和/或觀察，可以是它們的豐度(即細胞中的含量或濃度)，或它們的活性，或它們的修飾狀況(例如磷酸化)，或其它與藥物作用特征的測定。在不同的實施方案中，本發明包括對不同的細胞成分群進行這些測定和/或觀察。在此也將這些不同的細胞成分群稱為細胞生物狀態形式(如在此使用的術語“細胞成分”不打算指已知的細胞器如線粒體，溶酶體等)。
在本發明通常測定的細胞生物狀態的一種形式是它的轉錄狀態。細胞的轉錄狀態包括細胞在給定的一組條件下RNA組成種類，特別是mRNAs的同一性和豐度。優選地是對細胞中所有RNA組成種類的基本組分都進行測定，但是，至少應測定表現所研究藥物作用特征的基本組分。轉錄狀態是本發明測定的生物狀態目前優選的方面。通過例如以幾種現有的基因表達技術中的任何一種測定cDNA豐度，它可以被方便地確定。
在本發明通常測定的細胞生物狀態的另一種形式是它的翻譯狀態。細胞的翻譯狀態包括在給定的一組條件下細胞中蛋白質組成種類的同一性和豐度。優選地是測定細胞中所有蛋白質組成種類的基本組分，但是，至少應測定表現所研究藥物作用特征的基本組分。如本領域的技術人員都知道，轉錄狀態常常足以表現出翻譯狀態的特征。
細胞生物狀態的其它形式方面也可用于本發明。例如，細胞的活性狀態，如在此使用的術語包括在給定的一組條件下細胞中蛋白質組成種類的活性(以及還有任選地催化活性的核酸種類)。如本領域技術人員所知道的，翻譯狀態常常足以表現活性狀態的特征。
在相關處本發明還可適用于細胞生物狀態的“復合”形式，細胞生物狀態不同形式的測定量被組合在其中。例如在一種復合形式中，是將某些RNA種類和某些蛋白質種類的豐度與某些其它蛋白質種類活性的測定量組合在一起。進而從下面所述還將理解到，本發明還適用于可測定的細胞生物狀態的其它形式。
藥物暴露典型地將影響在本發明特定實施方案中被測定和/或觀察的細胞生物狀態任何一種形式的許多成分。例如，由于已知存在于細胞中的調節、體內平衡和代償性網絡及系統，即使一種“理想的藥物”，即只直接影響細胞內單一成分而不直接作用于任何其它成分的藥物，也將具有復雜的，并且常常是不可預料的間接作用。設想例如有一種可特異性和完全抑制假定的單一蛋白質即蛋白質P活性的藥物。雖然這種藥物本身將直接改變僅僅蛋白質P的活性，但是，受蛋白質P抑制或刺激的，或者被增加或減少以及代償蛋白質P活性損失的另一些細胞成分也將受到影響。還有其它一些細胞成分也將受第二層次成分的水平或活性改變的影響等等。因此，藥物對其靶標蛋白質P的直接作用被隱藏在從蛋白質P向下游方向的大量間接作用中。這種向蛋白質P下游方向的作用在此被稱為起源于蛋白質P的生物途徑(見下面)。
因此，一個不理想的藥物，例如直接影響一個以上靶分子的藥物，可能還具有更復雜的向下游方向的作用。一方面根據本發明，分析這些作用可提供關于藥物的相當多的信息，包括例如，對受該藥物影響的生物途徑的鑒別，并可解釋它在細胞中的作用和毒性副作用。在相關的方面，本發明提供了用于實現這種分析的方法。
在本發明，測定細胞的轉錄狀態是優選的，不僅因為它比較容易測定，而且因為，雖然藥物可能通過轉錄后機制(如，抑制蛋白質的活性或改變它的降解速度)起作用，但是，給藥對于細胞幾乎總會通過直接或間接的作用導致可測定的轉錄狀態改變。藥物暴露改變細胞轉錄狀態的原因是因為以前所提到的反饋系統或網絡，它們以代償性方式對感染，基因修飾，環境改變包括給藥等等起反應，首先就通過改變基因表達或轉錄的模式起反應。由于內部的代償作用，對生物系統的許多擾動雖然對系統的外部行為僅有沉默的作用，但是仍然可以深刻地影響細胞中個別成分的內部應答，例如基因表達。
生物途徑在本發明，藥物對細胞的作用，不論是理想的還是不理想的藥物以及無論在特定的儀器內如何測定，都是通過組合藥物對單個生物途徑的作用來表示。例如，圖1圖示說明藥物D通過與生物途徑101，102和103相互作用對細胞發揮作用(未顯示出途徑103的細節)。藥物D與這些途徑之間的弧線表示藥物D對這些途徑的可能作用。假定藥物D對該細胞總的作用可表示為藥物對這三條途徑中的一條或一條以上作用的組合。在下面的章節中，首先描述如根據本發明一般使用的生物途徑，隨之描述便于將本發明應用于它的特定生物途徑。
如在此使用的，生物途徑一般被理解為一群相關的細胞成分，其中此群集中的每一細胞成分，按照某種生物機制，受此群集中一種或幾種其它細胞成分的影響?？梢詮募毎餇顟B的任一方面引導出構成特定途徑的細胞成分，例如從轉錄狀態，或翻譯狀態，或活性狀態，或者生物狀態的復雜形式。因此，一種途徑的細胞成分可以包括mRNA水平，蛋白質豐度，蛋白質活性，蛋白質或核酸修飾的程度(例如磷酸化或甲基化)，以及這些類型細胞成分的組合等等。此群集中的每種細胞成分，通過某種不需詳細說明或者甚至不需理解的生物機制，受此群集中至少一個其它細胞成分的影響。在此提供的圖解說明中，一種細胞成分對另一種細胞成分的影響，不論是直接的或是間接的，都被顯示為二種細胞成分之間的弧線，并且總的途徑被顯示為連接該途徑細胞成分的弧線網絡。因此，生物途徑被認為是從生物狀態某一方面引出的細胞成分的群集，連同這些成分之間影響的網絡。
例如圖1中，生物途徑101包括蛋白質P1(例如P1的豐度或者活性)以及基因G1，G2和G3(例如，它們所轉錄的mRNA水平)，連同蛋白質P1對此三個基因的直接或間接影響，這種影響被顯示為從P1引向這三個基因的弧線。這些影響機制的發生可能因為例如，蛋白質P1可結合于這些基因的啟動子，并提高它們轉錄的豐度。
如在此所理解的，生物途徑的具體實例對于本領域是熟知的。它們依賴于不同的生物機制，借此細胞成分相互影響。例如，生物途徑包括熟知的生物合成途徑，在其中例如分子被降解以便提供細胞能量，或者構成分子以便提供細胞能量貯存，或者其中蛋白質或核酸前體物被合成。合成途徑的細胞成分包括酶和合成的中間產物，并且，前體分子對后續分子的影響是通過直接的酶介導的轉化作用。生物途徑還包括信號傳輸和控制途徑，它們的許多例子也是熟知的。這些途徑的細胞成分典型地包括起始的或中間信號傳輸分子，以及通常賦予這些途徑特征的，參與此信號或控制級聯的蛋白質。在信號傳輸途徑中，信號分子對受體的結合通常直接影響中間信號傳輸分子的豐度，并間接影響途徑蛋白質的磷酸化(或其它的修飾)的程度。這二種作用本身又影響細胞蛋白質的活性，這些細胞蛋白質是由信號啟動的細胞過程的關鍵性作用因子，例如通過影響細胞的轉錄狀態?？刂仆緩饺缈刂萍毎芷跁r間和發生的途徑也是類似的。在這里，多重并常常是不間斷的細胞過程暫被協調，常常是通過反饋控制，達到一種穩定的結果，例如細胞分裂與染色體分離的協調。這種協調是該途徑發揮功能的結果，常常是由蛋白質對其它各種分子磷酸化(或其它的修飾)程度的影響所介導的。還有一些熟知的控制途徑，在波動的環境面前設法保持最佳的細胞代謝水平。另一些按照已被理解的機制運行的細胞途徑的例子對于本領域的技術人員也是熟知的。
在本發明中特別感興趣的途徑被定義為“起源”在特定細胞成分的途徑，特別是起源在特定細胞成分的分級途徑。起源在特定細胞成分的途徑包括那些特定的細胞成分，受此特定細胞成分直接影響的第二類細胞成分，受第二類細胞成分直接影響的第三類細胞成分，等等以及在各類細胞成分之間發生影響的網絡。細胞成分之間的影響可以是按照任何一種生物機制，例如信號傳輸機制，或者調節或體內平衡控制機制，或者合成機制。在圖1中包括一種蛋白質和幾種基因的途徑101起源在蛋白質P1。包括二種蛋白質和幾種基因的途徑102起源在蛋白質P2和P3。
生物途徑也可以是分級的或非分極的。一般來說，分級的生物途徑不具有反饋環路。更詳細地說，分級途徑是一種在其中它的細胞成分可以被排列成限定數水平層次的途徑，致使屬于特定的限定數水平的細胞成分可以只受到屬于較低限定數水平的細胞成分影響。分級途徑起源于最低限定數的細胞成分。圖1中途徑101和102是分級的。途徑101是明顯分級的。在途徑102，在最低層次數水平上的蛋白質P2和P3二者都(直接)影響在中間層次水平上的基因G?；騁本身又(可能是間接地)影響均處于最高層次數水平上的基因G4，G5和G6。不同的是，非分級的途徑具有一個或幾個反饋環路。生物途徑中的反饋環路是該途徑細胞成分的子系統，反饋環路的每種成分既影響反饋環路中的其它成分，也受這些成分影響。例如，在圖1的途徑102中，如果基因G6(可能是間接地)影響了蛋白質P3，那么將形成一個包括基因G和G6以及蛋白質P3的反饋環路。
因此概括地說，如在此使用的，生物途徑包括一群細胞成分，它們通過任何一種已知的或未知的生物機理相互影響，例如通過細胞的合成，調節，體內平衡或控制網絡。一種細胞成分對另一種細胞成分的影響可以特別是通過一種細胞成分合成轉換成其它細胞成分，通過二種細胞成分直接的物理相互作用，通過由中間生物過程介導的二種細胞成分的間接相互作用，或者通過其它一些機制。進而，某些對本發明特別感興趣的途徑可以被認為起源于特定的細胞成分，它們影響該途徑中的其它細胞成分，但是本身不受該途徑中其它細胞成分影響，而在這些途徑中沒有反饋環路的途徑被認為是分級的。
因為本發明涉及通過生物途組合表示藥物的作用，所以某些類型的途徑特別有價值。藥物典型地是通過與一種細胞成分直接相互作用而對細胞起作用，并且更通常是與5-10-50或更多的許多細胞成分直接相互作用。在此將這些細胞成分稱為藥物的“靶標”。藥物對細胞的另一些作用來自直接或間接地受藥物直接靶標影響的其它細胞成分。因此，本發明用于表示藥物作用有價值的途徑包括起源于特定細胞成分的途徑，并且特別是分級的途徑。并且該起源性細胞成分優選地是潛在性藥物靶標的細胞成分。因為大多數藥物靶標是蛋白質，所以特別是起源于細胞蛋白質的途徑對表現藥物作用特別有價值。在表現藥物作用中分級途徑是優越的，因為存在于非分級途徑中的反饋環路可以通過在減弱藥物影響的細胞成分中引起代償性影響而掩蓋藥物的作用。
下面對本發明不同實施方案的描述，僅為了節省文字并且不帶任何限制，主要是針對途徑，并且常常只是針對起源于特寫蛋白質的分級途徑。鑒于后面的敘述，對于本領域的技術人員如何將本發明應用于包括起源于其它細胞成分如mRNA豐度的非分級途徑在內的途徑將是顯而易見的。
對生物途徑的鑒定和擾動為了用于本發明，可通過幾種方式對生物途徑，特別是起源于蛋白質的或分級的生物途徑進行鑒定，包括通過應用已知的途徑以及借助于細胞生物狀態方面的測定量。已知的途徑如上述的示范型途徑通常包括可能是藥物靶標的已知活性蛋白(或其它類型的細胞成分)。這種完全已知的途徑可以被用于表示藥物的作用。另外，可以將這種已知途徑的一些部分(在此也被稱為“亞-途徑”)用于本發明。例如，從這些已知蛋白質(或很可能是藥物靶標的其它細胞成分)中任何一種或幾種起源的亞-途徑，包括受一種或幾種已知蛋白質(并排除影響此一種或幾種蛋白質的途徑成分)直接或間接影響的途徑成分。可以從單一已知途徑得出許多亞-途徑。按照本發明的方法，這些亞-途徑中的一種或幾種可被用于表示藥物的作用。
借助于細胞生物狀態方面的測定量，例如借助于轉錄狀態，或翻譯狀態，或活性狀態，或生物狀態復合形式的測定量，也可以足夠詳細地對用于本發明的生物途徑進行鑒定。借助于細胞生物狀態方面的測定量，在不同干擾狀態的條件下，如由暴露于不同藥物或由不同的基因操作引起的狀態，可對以相互關聯方式變化的細胞成分群進行鑒定。相互關聯的變化在此意指在此群集中細胞成分的相關變化，換句話說，細胞成分變化的式樣在不同狀態下是類似的。可以從不同狀態中這種類似的變化式樣推導出一個將這些成分的群集連接成生物途徑的相互影響的網絡。當測定過程中這些不同的狀態作用在此生物途徑上，此途徑的成分以由它們相互影響的類型和方向決定的相似變化式樣表示應答。即使對這種影響的確切網絡和它們作用的機制都還不了解，也可以將這種成分的群集用作本發明中的一種生物途徑。
例如，已知作用于單一明確靶標的藥物可以被用于測定以這種靶標起源的途徑。將細胞暴露于不同濃度的這種藥物，可測定生物狀態方面的細胞成分，例如轉錄狀態。那些改變藥物濃度時以相互關聯式樣變化的細胞成分可以被鑒定為起源在那些藥物的一種途徑。
另外，在已經知道途徑的情況下，如果在暴露于另外一些環境的過程中測定顯示出原來途徑的亞-群集按照不同的式樣變化，則可以確定被測定途徑的亞-途徑。然后這些不同變化的亞-群集構成可用于本發明的亞途徑。可以根據它們借以受到最大影響的亞途徑將所測定途徑的細胞成分進行分類。
例如，在一種途徑通過測定暴露于變化濃度藥物的細胞已被鑒定的情況下，可通過對此細胞進行基因敲除來鑒定亞途徑。通過對例如暴露于此藥物并具有某些基因敲除的細胞測定其轉錄狀態，可以鑒定起源于此缺失基因的藥物途徑的亞途徑。
圖3圖示說明通過測定所鑒定的一個途徑的例子。此圖顯示，釀酒酵母30個基因的mRNA表達水平在應答藥物氨甲喋呤六個不同的滴度時具有最大的表達改變，此30個基因是來自此酵母基因組內大約6000個基因中。如在5.4部分所述，以基因轉錄陣列構成了這些基因表達水平的測定量。這20個基因中的每一個都表現出對暴露于不同濃度氨甲喋呤相互關聯的應答改變，其中每個基因在應答逐漸增加濃度的氨甲喋呤時，都表現出從自然豐度到飽和豐度的一致增加或降低。因此，這30個基因可以在本發明被用作一種途徑，它包含受氨甲喋呤影響的轉錄狀態細胞成分。另外，如果暴露于另外一些環境如不同的藥物或藥物敲除物(Knockouts)，可顯示出另一些行為式樣，那么可將這30個基因的組再分成另一些亞途徑。
本發明的方法可使用對生物途徑分級擾動的測定量，這種方法將很可能與藥物作用相關的途徑分級擾動的測定量同細胞分級暴露于該藥物的測定量進行比較，以便鑒定確實包含在該藥物作用中的途徑?？梢园磶追N方式實施分級的途徑擾動。在起源于已知蛋白質(或其它細胞成分)的已知或已測定途徑的情況下，可以通過如突變，轉染，可控制的啟動子系統，或已知特異性作用的其它藥物等方法，以分級的方式干擾這些蛋白質(或其它細胞成分)的豐度或者活性。在5.4節中更詳細地描述了這些方法。
借助于確定此途徑的影響網絡，對起源細胞成分的分級擾動將被傳播至該途徑的其它細胞成分。這種應答數據特別由對該受影響途徑中基因或基因產物的基因轉錄物或蛋白質豐度測定量組成。借助于隨后在5.5節詳細論述的方法可以測定應答數據。
在通過測定確定途徑的情況下，如果鑒定該途徑起源于這些成分是特別有益的。在那時，如對已知途徑所述的，可以干擾這些起源成分。如果該起源成分沒有被鑒定，則可以按分級的方式操作確定該途徑的條件。例如，在其確定條件之一是藥物暴露的途徑中，可將此藥物暴露分級，并觀察其細胞成分。如果該確定條件包括基因操作，則可以按照5.4節中所述的方法以分級的方式實施基因操作。
5.2將藥物應答分解成途徑作用此部分首先提供本發明方法的概述，其次提供這些方法主要構架的延伸說明實施例。
本發明方法的概述通過將一種細胞在應答分級藥物暴露時生物狀態改變測定量與很可能是參與該藥物作用的生物途徑的生物狀態改變測定量進行比較，本發明的方法可確定通過它藥物對生物系統起作用的生物途徑，后者的改變是應答對這些途徑的分級擾動。
在應答多種強度的藥物暴露中，優選地是在從沒有藥物至充分的藥物作用中，測定(如在5.6節中所述的)細胞生物狀態的一些方面，例如轉錄狀態，翻譯狀態或者活性狀態。在此將這些測定量的集合稱為“藥物應答”，并任選地以圖解方式提供?？梢栽趶耐耆緩揭种浦敝脸浞滞緩斤柡头秶鷥鹊闹饕糠郑凑兆兓膹姸确旨墝Ρ景l明有用的途徑擾動。在應答多種分級的途徑擾動強度時，測定類似于在藥物應答時所測定的細胞生物狀態的一些方面，例如轉錄狀態。在此將這些測定量的集合稱為“途徑應答”或“途徑特征”，并任選地以圖解方式提供。優選地是在改變該途徑中主要蛋白質或基因的活性或者豐度的實驗中測定這些途徑應答。
將在藥物暴露中變化的細胞成分與在途徑應答中變化的細胞成分相比較，以便發現與全部或基本上全部藥物應答相匹配的生物途徑或生物途徑的組合。當發現大多數在藥物應答中變化的細胞成分在一種或幾種途徑應答中以類似的方式變化時，基本上所有的藥物應答與途徑應答相匹配。優選地至少75％在藥物應答中變化的細胞成分可以被匹配，更優選地至少90％可以被如此匹配。鑒于實驗誤差，當二種狀態的數據很可能是相同數據時，細胞成分在二種應答中以類似的方式變化。
在優選的實施方案中，通過一種方法實施將藥物應答與一種或幾種途徑應答進行比較，按此方法所測定的藥物應答與模式藥物應答之間差異的客觀測定被減至最小。通過組合被認為很可能包含在此藥物作用中的那些途徑的途徑應答來構建模式藥物應答。如果一種特殊的細胞成分在唯一的途徑應答中發生變化，那么在模式藥物應答中那種細胞成分的變化是那一種途徑應答中的變化。如果一種特殊的細胞成分在二種或更多途徑應答中發生變化，那么在此模式藥物應答中那種細胞成分的變化是一組此途徑應答中的變化?？梢酝ㄟ^疊加或者通過另一種數量組合法進行這種組合(見5.3節)。因為對該藥物的強度(例如由描述其作用的動力常數所描述的)與分級途徑擾動效率(例如任意測定的擾動控制參考所描述的)的關系還不知道，所以可在對被組合在模式藥物應答中的每種途徑應答分級擾動強度與分級藥物暴露之間形成一個可調整的定標。以可調整的定標將這些細胞成分的變化組合在一起成為其模式藥物應答。對于一種途徑的可調整的定標通常與對于其它途徑的定標無關。
在一個實施方案中，通過調整其模式藥物應答中每種途徑應答的定標和/或通過改變組合在此模式藥物應答中的生物途徑的數目或同一性，可使客觀測定最小化。通過在不希望的生物途徑中設置可調整的定標，可簡便地達到改變組合于模式藥物應答中的途徑的目的，以致使細胞成分不發生改變。在優選的實施方案中，在此是通過在其途徑擾動參數與藥物暴露之間的線性轉換實施這種可調整的定標，通過標準的數值分析技術可實現使客觀測定最小化。見例如，Press等，1996，C中的數字訣竅，第二版，劍橋大學出版，Ch.10；Branch等，1996，Matlab最佳工具當使用者指南，Mathworks(Natick，MA)。還有，可以改變來自不同途徑的相同細胞成分數值組合變化的方法。例如，可包括相乘的向量積項，此項將特別提供來自多轉錄因子的倍增應答，這種多轉錄因子是從不同集合途徑會集的，以便形成一個轉錄復合體。
為了在最小化目標函數之前提供所測定的藥物應答，可以按不同的方式選擇組合在模式藥物應答中的途徑。最簡便地是，可以將包括許多細胞功能的一大批生物途徑同如下數據組合在一起獨立可調整的定標；最小化的客觀測定；以及最佳表現所確定藥物應答的生物途徑的組合。生物途徑的“綱要”是用于檢測的生物系統中的一組途徑，這些途徑基本上完全地，或者至少基本上完全地包括所有很可能與藥物作用有關的途徑。優選地，如果可以將這批途徑縮小至很可能包含在藥物作用中的途徑，那么這種最小化作用變得更有效。例如，以前對藥物作用生物途徑重要性的認識可以成為這種縮小的根據。
更優選地是，選擇起源于特定細胞成分的途徑，并且優越地還是分級的(最小化負反饋環路的減弱作用或正反饋的放大作用)。最優選地是，這些起源性細胞成分很可能是所研究藥物的靶標，通常是功能性活性蛋白質。例如，給定一種所研究的藥物和在細胞中選擇一種可能的靶標，那么首先可以測定起源于每種可能靶標的生物途徑(如以前在5.1節所述的方法)。第二步，將這些途徑與獨立的定標因子，最小化的客觀測定以及所確定的最佳表現此藥物作用的途徑組合相組合。從而，在確定包含在藥物作用中的真實途徑的同時，此藥物的真實靶標也被鑒定為真實途徑起源于它的細胞成分。
在確定包含在藥物作用中的途徑之后，可借助于如下本發明的補充方法來證實它們。按照第一種證實方法，基于統計學檢驗所確定途徑的顯著性是無疑的，此統計學檢驗是參照從客觀測定由電腦計算的最小值進行的。一個優選的檢驗如上所述以許多隨機化的藥物應答數據由電腦計算途徑表現，以便確定客觀測定最小值的分布。對比此分布，可以判斷確實從未隨機化的藥物應答數據得到的客觀測定最小值的統計學顯著性。
按照第二種證實方法，借助于對同時既暴露于藥物和也具有受干擾的一種或幾種確定途徑的細胞所作的測定，可以證實所確定的途徑。通過干擾藥物暴露的細胞(或給藥干擾的細胞)，可以得到證據證明此途徑實際上是包含在特異性的下游基因和蛋白質的應答中。如果受干擾的生物途徑不是包含在此藥物的作用中，那此藥物和這些擾動將對細胞成分的變化產生獨立的，通?；旧鲜歉郊拥淖饔?。如果受干擾的生物途徑確實包含在此藥物的作用中，那么此藥物和擾動的作用將不是獨立的。這些作用將干擾對藥物暴露或途徑擾動單獨觀察到的數值，細胞成分的變化也將在這些值達到飽和。
對本發明方法的圖解說明下面的章節將參照圖1和圖2A-C概括地說明本發明的幾個方法。圖1圖解說明藥物D可能通過三條可能的途徑對細胞起作用。途徑101和102分別起源于蛋白質P1以及P2和P3，最后影響所指示基因的表達水平，可能是通過影響附加的介導性細胞成分。途徑103的細節沒有被顯示出。本發明的方法確定這三條途徑中哪條途徑可單獨地或以某種組合形式解釋藥物D對細胞的真實作用。
為了作出這種確定，本發明的方法試圖通過途徑101，102和103的一組途徑應答來表現藥物D對細胞的作用，即它的藥物應答。對于那種藥物D真實影響的途徑組合這種表現將是成功的，并且藥物D的應答也將被充分地表現。如果通過這些途徑應答中的僅僅一種就可以充分地表現所觀察到的藥物D應答，那么鑒定此途徑為藥物D作用的唯一途徑。
在分別起源于蛋白質P1以及P2和P3的途徑101和102的情況下，通過對起源蛋白質豐度、或者活性、或者與藥物D作用相關的某種其它特征的已知擾動，可以直接確定這些途徑應答。例如，應用可變的擾動104改變蛋白質P1的相關特征，從而影響途徑101中其它細胞成分的特征，例如基因G1，G2和G3的表達水平。能夠以分級的方式應用擾動104以便在許多擾動控制值產生途徑應答，從被干擾蛋白質P1特征的自然水平至那些特征的充分飽和或抑制?？蓪Φ鞍踪|P2形成類似的已知擾動，并且測定基因G4，G5和G6的表達水平。
另一種方法是，如果可以將藥物D在細胞上的應答表現為通過干擾P1或P2產生的途徑應答，那么本領域的技術人員應理解到，從而這些P1或P2將被鑒定為藥物D的蛋白質靶標。
圖2A圖示說明細胞對藥物D的一種可能轉錄應答。橫座標指示藥物暴露的程度，例如在細胞環境中藥物的濃度，范圍從為0數值的未暴露至為數值5的飽和暴露。縱座標指示在暴露于藥物D時基因的表達對不存在藥物D時基因表達比率的對數。因此，這些藥物應答曲線都是在沒有藥物D時以0開始，對應于表達率1。假定為了此實施例，僅細胞的基因G1、G2和G3以由所標明的應答曲線指示的應答明顯地應答對藥物的暴露。
雖然為了圖示說明，此基因應答曲線被表示為連續的曲線，但是在真正實驗確定的藥物應答中，僅對有限的一組不連續的藥物暴露水平測定了表達率。在真實情況下，曲線圖表示的藥物應答將由僅在這些不連續的藥物暴露水平進行選擇和定位，以致使藥物應答曲線的陡峭區被充分地取樣。優選地使至少5和5以上，更優選地10或10以上的暴露水平位于應答曲線的這些區域，在這些區域藥物應答以未暴露水平變化至飽和水平。
借助于5.5節的方法可以制作和測定這種應答曲線。特別是通過應用基因表達分析技術，配合釀酒酵母的基因組序列，可以對這種酵母的幾乎全部基因實驗制作這種應答曲線。雖然本發明的許多描述是針對測定和模擬基因表達數據，但是本發明同樣可用于細胞生物狀態其它方面的測定量，如蛋白質豐度或者活性。
圖2B圖示說明對途徑101(圖1中)的可能途徑應答，途徑101以蛋白質P1起源，并在應答對起源蛋白質P1的擾動104時包含基因G1，G2和G3的表達水平。此圖中的橫座標指示施加于P1的擾動104的強度，范圍從在0數值的對P1沒有擾動至在數值5的對P1飽和擾動。視情況而定擾動104可以是抑制或激活蛋白質P1。如在5.4節中更詳細描述的，特別是通過以不同量表達P1的基因轉染以便增加P1的豐度，或者通過在其本身被藥物或小分子控制的可控制啟動子的控制下表達P1，或者通過暴露于對P1具有已知特異性作用的不同藥物而抑制P1的活性，可以實現這種擾動作用。類似于圖2A，圖2B中的縱座標指示暴露于擾動104時基因表達對不存在擾動104時基因表達比率的對數。通過所標明的曲線圖示說明了基因G1，G2和G3表達水平的應答，這些基因是受蛋白質P1影響(不論直接或間接地)的途徑101的組成成分。
也類似于圖2A的是，雖然這些途徑應答曲線被表示為連續的曲線，但是，事實上是以有限的一組不連續值對蛋白質P1施加擾動104，此“曲線”確切地是在這些不連續的擾動控制參數值的表達比率數值。同樣優選地是，對這些不連續的擾動值進行選擇和定位，以致使途徑應答曲線的陡峭區被充分地取樣，使至少5和5以上，優選地10或10以上的擾動控制參數值位于應答曲線的這些區域，在這些區域應答從未暴露水平變化至飽和水平。
圖2A和2B中的藥物應答曲線的途徑應答曲線顯示了這種曲線的一般預期的形狀。這種預期的形狀包括在低藥物暴露或擾動控制參數的閾下區，在此區域實際上不存在此途徑中細胞成分的應答。在此閾下區之后，藥物或擾動開始達到有效，細胞成分的特征數值受到干擾。預期這種干擾值的曲線通常具有一個指向飽和漸近水平的單調上升或下降，超過此水平未見進一步的改變。應答曲線終止于此飽和區。
事實上，在某些情況下，被預期的可能是更復雜的，非單調的應答曲線形狀。例如，在藥物或擾動具有毒性作用的情況下，當毒性出現，上升的細胞成分豐度可能開始下降，而下降的豐度可能開始更快地下降。已知存在于生物系統中的非線性和反饋機制也可能導致非單調的多相應答。這樣一種應答可能隨著不斷增加的擾動幅度或藥物暴露先上升然后下降。例如，一種藥物或擾動可能通過二種途徑對某些細胞成分起作用，以不同閾值，并且以相反的作用產生先上升然后下降(或者相反)的應答。雖然根據單調應答曲線如圖2A-B圖示說明的，對本發明的方法進行了圖解說明和初步描述，但是如根據隨后的描述本領域技術人員將發現，這些方法同樣適用于非單調的應答曲線。
有了被測定的藥物和途徑應答，要確定通過它(圖1的)藥物D對細胞起作用的途徑，此問題需要把這種藥物應答匹配為一組途徑應答。圖2A圖解說明在對藥物D的藥物應答中，基因G1，G2，G3，G4，G5和G6的豐度如何變化。因為這些相同的基因在起源于P1和P2的分立途徑中發生變化，所以按照本發明的方法可以確定，是否這二種途徑都確實參與對藥物D的應答中。
根據本發明的方法，是通過調查是否可以將起源于P1和P2途徑的途徑應答曲線轉換匹配圖2A的藥物應答曲線來作出這些確定。對于起源于P1的唯一途徑，是通過嘗試將圖2B中所顯示的此途徑的途徑應答曲線轉換成圖2A中所顯示的對于G1，G2和G3的藥物應答曲線，來獲得是否此途徑確實包含在藥物D作用中的確定。在此不需要考慮對于G4，G5和G6的藥物應答曲線，因為起源于P1的途徑不影響這些基因。
圖2B的途徑應答曲線轉換成圖2A的藥物應答曲線一直可以既有縱向分量又有橫向分量。在此實例中沒有預期到這些曲線的縱向轉換。二組應答曲線的幅度將是相等的，因為它們二者都在相同的范圍變化，從沒有擾動或藥物暴露的靜態(0)至飽和，藥物和擾動已最大程度地影響了途徑101的狀態。但是，橫向轉換很可能是必須。因為沒有理由認為限定擾動控制的數值，如表達P1的病毒轉染載體的暴露數值，或已知特異性作用于P1的其它藥物，是與限定暴露于所研究藥物D的數值相同的數值，所以這些藥物和途徑應答曲線必須被橫向轉換，以便確定任何可能的匹配。因為圖2B中對于G1，G2和G3的曲線具有與圖2A中相應曲線相同的一般形狀，所以在些情況下，這樣一種橫向轉換多半是可能的。
按照本發明尋找一種橫向轉換法，通過參數化一組可能的轉換進行處理。然后，尋找此參數的最佳值，這將使途徑應答盡可能確切地說明藥物應答。一組更可取的和簡單的轉換是從振動控制參數值至藥物暴露值的線性定標，以延伸或收縮的程度將它們簡單地參數化。然后可以借助于標準的方法找到線性延伸的最佳值，例如借助于最小化對途徑和藥物應答曲線差異的客觀測定。
圖2C提供了尋找最佳線性定標參數的示范性圖解說明。此曲線圖的縱座標指示平均相關數，是在圖2B的途徑應答曲線G1，G2和G3與分別是圖2A的藥物應答曲線G1，G2和G3之間計算的數值。本領域技術人員熟知，當二組曲線相同時，它們將具有理想的相關數1.0。橫座標指示從0至10的可能線性定標參數。在此實例中，理想的相關數1.0出現在定標數參2。以上的線性定標可以將圖2B的途徑應答曲線轉換成完全匹配圖2A的藥物應答曲線。因此，可以得出結論，起源于P1的途徑是藥物D作用的途徑之一。
為了確定以起源于P1和P2的途徑是否可以說明藥物D的全部作用，按照本發明可以將這二種途徑應答(起源于P2的途徑應答未被顯示)的總和(這些途徑是分立的)轉換成所有六個基因對藥物D的應答曲線。
5.3分析實施方案本發明方法的分析實施例包括第一，用于將藥物應答表現為一組途徑應答的實施方案，以及第二，用于評估統計學顯著性和驗證所找到的表現結果。
圖5對本發明方法的優選實施方案提供了一操作流程圖。此實施方案對一種特定藥物依據途徑應答數據511，確定了表現的藥物應答數據510，用于一種或幾種途徑以及對所確定的表現法作顯著性評估和驗證。
在本發明的其它實施方案中，圖5中所顯示的某些步驟可能被省去或者按不同于所顯示的順序進行。例如，在某些實施方案中，候選途徑選擇步驟501和定標參數化選擇步驟502可以被實施一次，用于分析來自幾個優選相關藥物的應答數據，并且不需要對每個藥物分析分別進行。在特定的實施例中，也可以不進行途徑顯著性賦值和驗證，并且因此可以省去步驟505和506，步驟507或步驟508中的一步或一步以上。
5.3.1藥物應答的表現表現依據途徑應答數據的藥物應答數據優選地以對一種或幾種候選生物途徑的選擇，開始于步驟501，通過這種選擇以便對所研究的藥物提供藥物應答數據。如所論述的，被優選采用的途徑是起源于一種或幾種細胞成分的途徑，更優選地是起源于很可能是所研究藥物靶標的蛋白質成分。最優選地是，此候選途徑起源于很可能是所研究藥物靶標的單一細胞成分。
在不知道候選藥物靶標時，可以從現有的途徑中，也許是儲存于途徑一覽表中選擇單一的途徑，并按照圖5中所示的如下步驟檢驗它在表現此藥物應答數據中的顯著。然后可以采用那些被單獨發現在表現藥物應答數據中具有顯著性的途徑，組合在一起，并實施圖5的步驟，以便確定用于表現藥物作用的最佳途徑組合。途徑一覽表對于用于檢測的生物系統優選地是基本完整的(其中它包括那系統中基本上所有的生物途徑)，或者至少包括很可能是包含在藥物作用中的基本上所有的途徑。
按步驟511，對在步驟501中選擇的途徑測定途徑應答數據。在許多情況下，例如，在已通過測定確定了途徑時，將已經測定了用于擾動所選擇途徑的應答數據。在另一些情況下必須在本發明的后續步驟之前測定這些應答數據。如上面所述，一種途徑的應答數據，包括存在于該途徑中的細胞成分相關特征，對于多種擾動該途徑的控制水平，相對改變的測定量。例如，在通過起源于一種蛋白質成分的基因表達水平確定了該途徑時，可以按分級的方式干擾此起源蛋白質的活性，并且測定所構成的自然基因表達水平對被干擾的基因表達水平的比率(或這些比率的對數)。擇優選擇擾動控制水平，以致使5或5以上，或者更優選地10或10以上的擾動控制水平存在于細胞成分的特征從自然水平至飽和水平迅速改變的區域內。
在下面，變量“p”一般指擾動控制水平，可變量“R”一般指途徑應答數據。詳細地說，在第i生物途徑中的第l擾動控制水平被稱為“pi，l”。第i途徑中對于第k細胞成分的途徑應答是Ri，k。因此，Ri，k(pi，l)是在第l擾動控制參數水平，第i途徑中第k細胞成分的應答。
同樣，按步驟510可獲得藥物應答數據，并且如果不是已經現存的就必須測定。如上面所述，通過在多個藥物暴露水平(在此也稱為“藥物滴定水平”)測定細胞成分特征的改變可獲得這些數據。同途徑應答數據一樣，擇優選選擇藥物暴露水平(或“藥物滴定量”)，以致使5或5以上，或者更優選地10或10以上的暴露水平存在于細胞成分的特征從自然水平至飽和暴露水平迅速改變的區域內。
在下面，變量“t”一般被用于指藥物暴露(或“滴定”)水平，變量“D”一般指藥物應答數據。更詳細地，第l測定的藥物暴露水平被稱為“t1”。第k細胞成分的藥物應答是DK。因此，DK(t1)是在第l藥物暴露水平第k細胞成分的藥物應答。
在這些方法的隨后步驟中，特別是在步驟504，在可能還未測定的藥物暴露值或擾動控制參數值時，可能需要藥物應答數據值和途徑應答數據值。此結果是根據如下事實得出的測定的藥物暴露水平與途徑擾動控制參數不一定相關。也就是說，對于特定L的變量t1與對于不同途徑i的pi，l沒有既定的關系。因此，在步驟502必須提供插入不同的應答數據，以便得到所需的值。通過仿樣擬合或通過模式擬合可優選地實現這種插入法。在步驟502可實現對插入法和任何必要參數的選擇。
在仿樣擬合中，通過相加適當仿樣插入函數S乘以所測定數據值的乘積可插入藥物和途徑應答數據，如由如下公式所示的。 變量“u”意指藥物暴露水平或擾動控制參數的任意值，在此值分別計算藥物應答數據和途徑應答數據。一般地，S可以是具有在應答函數中預期結構寬度特征的有限載體的任何平滑(至少以片段方式連續的)函數?？梢赃x擇具有特定距離的示范性寬度，在此距離被插入的應答函數其漸近值從10％上升至90％。對于藥物應答數據和途徑應答數據，以及甚至對于不同途徑的應答數據，不同的S函數都可能是適合的。示范性S函數包括線性插入和高斯插入。
對于模式擬合，藥物應答和途徑應答各自以單一參數化函數通過近似法被插入。適合于近似轉錄狀態的示范性模式擬合函數是Hill函數，此函數具有可調整的參數a，uo和n。H(u)=a(u/uo)n1+(u/uo)n----(2)]]>對于藥物應答的每種細胞成分和對于途徑應答的每種細胞成分，單獨地選擇可調節的參數。擇優選擇可調整的參數，以致對于每種途徑應答的每種細胞成分，從Ri，k(pi，l)至H(pi，l)的距離平方和被最小化，并且對于藥物應答的每種細胞成分，從DK(t1)至H(t1)的距離平方和被最小化。這種優選的參數調整法在本領域被稱為H()對Ri，k()或對Dk()的最小平方擬合。另一些可能的模式函數是基于多項式擬合，例如借助于不同的已知類型多項式。
根據圖3和4可圖示說明以Hill函數的模式擬合。如所論述的，圖3顯示被氨甲喋呤干擾和通過測定鑒別的一種途徑的實例。此圖顯示，釀酒酵母基因組內大約6000個基因中，在應答六個不同的氨甲喋呤暴露水平時具有最大表達改變的此酵母菌30個基因的mRNA表達水平。圖4顯示，借助于Hill函數，這些基因表達水平之一的途徑應答的擬合。特別是，通過Hill函數使此酵母菌的基因YOLO31C與借助于以前所述的最小平方法選擇的參數n＝2，a＝-0.61和lob10(uo)＝1.26相擬合。
因為具有最大應答的所有30個基因都表現出單調的行為，即沒有一個應答隨藥物暴露增加從其最大幅度顯著地降低(或者從其最小的幅度顯著地提高)，所以Hill函數是一種適合的模式擬合函數。對于非單調表現的將不是這樣。
在選擇應答數據插入法之后，藥物應答數據擬合前的最后步驟503是選擇一種定標轉換以及任何一些必要的參數，這些參數將使生物途徑應答與藥物應答相關聯。一般來說，一種定標轉換可能需要垂直定標以及水平定標。為了使在獲得這些應答數據時所形成的每種細胞成分相關特征的不同測定量相關聯，垂直定標可能是必不可少的。例如，這些測定量可能是mRNA的豐度或蛋白質的活性。在按相應單位形成這些測定量的情況下，僅為了使不同的測定單位相關聯而需要垂直定標。另外，在跨越從自然水平至充分飽和的參數范圍形成藥物以及途徑測定量的情況下，這通常是優選的，可以例如通過飽和值定標這些測量值。這種定標可避免需要任何垂直定標。在此情況下，例如，當通過與Hill函數擬合插入途徑應答時，對于所有應答數據參數“a”的值都基本上等于1。在下面，將假定已通過飽和值進行了任何必要的垂直定標，并且所有的途徑數據在普通的自然水平與飽和值之間變化。
一般來說，預料水平定標是必不可少的。如上面在5.2節所論述的，這種定標是必不可少的，因為對于不同的候選生物途徑，擾動控制參數值在相同數量的擾動控制值很可能不引起飽和應答，在與藥物暴露的飽和應答相同的數量值也不引起飽和應答。例如，途徑擾動可能按照像如下這樣一些完全不同的機制起作用表達一種途徑起源性蛋白質的病毒轉染載體的滴定度；或一種控制起源性蛋白質表達的可控制啟動子的控制參量；或已知特異性作用于起源性蛋白質的藥物暴露水平。這些機制的飽和控制值，以及它們確實的動力學特征，很可能是完全不相關的。所有這些機制可能都不同于所研究藥物的作用。例如，在對一種途徑起源性細胞成分的擾動作用可以作為Hill函數被模擬的情況下，沒有理由認為不同的“uo”參數將是相同的。
優選的水平定標轉換是藥物暴露水平線性轉換成為相應的擾動控制參量。這樣一種轉換的示范性表達式為如下。
pi，l＝αit1+βi(3)等式(3)提供了在相應于第l藥物暴露水平的第i途徑中的擾動控制值。其線性定標常數是αi和βi。以一組定標參數表示每種途徑的特征。一般地，βi將是0，因為藥物暴露和擾動控制值都是以0開始。實質上αi代表特定的途徑擾動強度對所研究藥物強度的比率。例如，當此應答數據可以以Hill函數建立模型時，αi是所研究藥物的uo參數對此特定途徑的uo參數的比率。
更通用的水平定標轉換可能以一些補充的參數表示特征。以若干足夠小的，即使是非線性的參數，靈活的定標轉換有可能被有效地應用于步驟504的最小化程序。在此用“αi”代表對于第i途徑的多重定標參數。定標轉換的另一個實例是一般化線性轉換等式(3)的多項式展開。更一般性定標轉換的一個簡單實例是按照下面等式使用的以前所述的Hill函數。pi,1=αi(t1/μi)ni1+(t1/μi)ni----(4)]]>等式(3)再次提供了在相應于第l藥物暴露水平的第i途徑中的擾動控制值，并且通過3個參數αi，μi和ni對于每種途徑參數化此等式。Hill函數定標是更通用的，至少其中當ni是1，并且t1比ui小很多時它降低為線性定標。
步驟504是本發明方法的中心步驟，其中藥物應答被表現為一組適當定標的途徑應答。藥物應答的優選表現是作為途徑應答的一個定標的線性組合。當受一種途徑影響的細胞成分或者不受其它途徑的影響，或者如果多種途徑會集于相同的細胞成分如mRNA或蛋白質豐度而具有線性附加作用時，這種表現法特別有用。因為途徑的會聚或重疊最可能在遠離初始靶標的下游，在此影響已經分支包括許多基因，所以多種途徑的作用更可能作為無關的和附加的影響偶然起作用。如果這些作用通過一種新的細胞成分會聚在二種途徑中，那么無關性和附加性就不大可能。在這種情況下，可包括相乘的叉積項，此項可特別表示一種細胞成分的倍增應答，這種應答是起因于多種途徑在那種細胞成分的會聚。即使在后一種情況下以及在其它情況下，在這些情況下不保持有線性相加性，可以使線性相加性導入的誤差與5.3.1節的技術相關聯。
因此，優選地是按照如下等式將藥物應答數據通過途徑應答數據表示。Dk(t1)=ΣiRi,k(αi,t1);k=1,K;l=1,L----(5)]]>等式(5)對于按照由αi參數化的所選擇轉換定標的第k細胞成分，用途徑應答的和表示在藥物暴露的第l水平第k細胞成分的模式藥物應答。在此和隨后一般都應理解到，按照步驟502的方法可插入Ri，k()，因為很少有如下情況，按由所定標的藥物暴露水平給定的擾動控制值將獲得這些測定量。在包括相乘的叉積項的情況下(例如，以前所述的情況)，等式5也包括如Ri，k(αi，t1)Ri，k(αit1)項。
通過本領域熟知的數值近似法可以獲得此后一等式的足夠精確的解。這些解確定最佳定標轉化，以致使模式藥物應答與藥物應答盡可能密切地匹配。優選的方法提供了一個程度的數值指示(在此被稱為“殘數”)，達到此程度等式5則不能被充分滿足。按照一種優選的方法，由相關的最小二乘方近似問題的最小化可以確定途徑定標參數。 在等式(6)中，Ri，k的內部和包括所有插入的途徑應答，這些途徑應答是按照相應于藥物暴露水平t1的參數αi定標的。對于每種生物途徑參數αi一般是確定定標轉換的一組幾個參數，如從1至5的參數。在ti此和與藥物應答差的絕對值的平方本身又對被‘l’標記的所有的藥物暴露水平，以及被‘k’標記的藥物應答中或生物途徑中所有的細胞成分相加。以對此后一個總和的最小化處理可確實依據生物途徑對藥物應答的表示法，此總和是相對于每種途徑定標轉換參數{αi}的總和。此總和的最小值提供了一個程度的數值指示，即“殘數”，達到此程度等式5將被滿足。
對于線性定標轉換，等式6具有如下較簡單的形式。 在等式7，每個αi是對每種生物途徑的單獨定標常數。自然地，每個αi取決于藥物暴露所選擇的單位，以及對擾動控制值所選擇的單位，并且取決于藥物的效力與擾動方法的效力之間確實的物理相關性。
應用許多現有數值方法中的任何一種方法可實施對最小二乘方等式6或7的最小化。參見例如Press等1996，C中的數據訣竅，第二版劍橋大學出版，第10，14章；Branch等，1996，Matlab最佳化工具書，用戶指南，Mathworks(Natick，MA)。一種優選的方法是Levenbery-Mar-quant法(在Press等的著作中，14.4節)。因為有K基因和藥物暴露的水平L，所以等式6或7代表KL的單獨等式。未知數等于假設的途徑數目乘以每種途徑定標參數的數目。在線性定標的情況下，定標參數的數目等于途徑的數目。典型地是，數目KL比定標參數的數目大很多，此致使此最小二乘方問題是相當超定的。超定法是優越的方法，按此方法可使此解法準確，那在單個細胞成分的應答中對測定誤差遲鈍。
一種代替在等式6和7中所簡述的用于解等式5的最小二乘方程序的方法，是最大化在模式藥物應答與所測定的藥物應答之間的標準化相關性。此程序在數學上與最小二乘方程序密切相關。按照此程序是從求解等式8來確定αi。 在此等式中，ρk(αi)是對于第k細胞成分的藥物應答與對于第k細胞成分的模式途徑應答之間的相關系數。詳細地說，此相關系數可由等式9給出。ρk(αi)=Σ1Dk(t1)(ΣiRi,k(αit1))(Σm(Dk(tm))2ΣnΣi(Rik(αitn))2)1/2----(9)]]>在等式9，內部總和(對i)表示對第k細胞成分的模式藥物應答。對所有的藥物暴露水平相加模式藥物應答與測定藥物應答的積，并通過這些應答的平方根(在此也稱為“RMS”)值標準化此總和，以便給出相關系數。返回到等式8，優選地可通過幅度ADK和ARK標準化此相關系數的值，此幅度ADK和ARK是對于第k細胞成分測定的和模式藥物應答的應答幅度。這些幅度被選擇為在所有的藥物暴露水平測定的和模式藥物應答的RMS值。這種標準化對具有較大幅度的應答給予較大的加權值，同時確保充分的相關性給出整數值。
另一方面并較少優選的是，可以將這些相關系數非標準化，在這種情況下，等式(8)中的幅度被取作單一值。還可以用此相關系數的負數代替此相關系數，在此情況下，等式(8)的表達式被最小化(而不是被最大化)，以便找到最佳定標參數。
通過在最小二乘方法的情況下所述的方法可以求解等式8和9。本領域的技術人員將明了，上述擬合法與最小化等式8的負數值是等價的。
不論對于最小二乘方法和相關法，對此轉換的藥物暴露水平相加這些途徑應答可能導致超過擾動控制參數測定區間范圍的值。這是因為此定標參數αi可以是基本上大于或小于整數。為了避免測定值的外延，在此二種情況下(等式6和8)的總和僅在具有測定數據的間隔內被延伸。
當將來自二種不同藥物的藥物應答進行比較時，可以進行此節前面所述的步驟，以便獲得一個相關系數，或者按另一種方法得到一個最小二乘方殘數，它是二種藥物作用相似性的一個測定量。在此實施方案中，僅一種應答途徑被定標，以便擬合藥物應答數據。因此，在此特定的實施方案中，是按照前述的等式5，在此K＝1，將第二“擾動”藥物的應答R與第一種藥物D的應答數據相比較。
5.3.2途徑確證在確定了將藥物應答表示為一組途徑應答之后，優選地，雖然是任選的是，對在步驟506中確定的途徑組合賦予統計學顯著性，并且確證所確定的途徑在步驟507中是顯著性的。
檢驗統計學顯著性對于步驟506，是通過將從求解等式5確定的最小殘數值與預期的殘數機率分布相比較，確定途徑組合的統計學顯著性。最小殘數按照這種分布表示的可能性越小，所測定的途徑組合越具顯著性。在相關最大化法的情況下，可以將相同的方法用于等式8中找到的最大值。特別是，可以發現此最大值的預期分布，并且可從此分布確定真實獲得的最大值的顯著性。
借助于本領域已知的任何一種方法可以評估殘數的預期機率分布。典型地是，根據有效輸入機率分布的某一事先的假設，分析性地估算這種分布。因為在此情況下這種分析性估算是困難的，所以優選地是根據Fisher所述的方法，通過模擬估算此殘數分布。參閱Conover第二版1980，實用非參量統計學，John wiley。此方法通過對輸入的數據采取重排列或隨機的正集提供經驗性殘數分布。詳細地說，在此可相對于藥物暴露水平改變輸入。
按照這種優選的方法，通過以隨機化的輸入數據重復地求解等式5和累加此殘數，構建殘數分布圖，以便形成經驗性殘數分布。從而，此構建的經驗性殘數分布圖由隨機數據產生，這些隨機數據具有與真實數據相同的統計學總體。詳細地說，首先在步驟505使藥物暴露水平或擾動控制參數，或者是藥物應答數據，或者是途徑應答數據(但不是二者)被隨機化。通過如下轉換可表示這種隨機化轉換。
Dk(tl)-Dk(tn(l)) (10)Ri，k(pi，l)-Ri，k(pi，n(l))在等式(10)，∏表示對每種細胞成分獨立選擇的擾動。按照等式10，或者藥物應答，或者每種途徑應答(但不是二者)被隨機化。因此，隨機化的藥物或途徑應答數據是通過測定點的獨立擾動從測定的數據得到。第二，然后通過在步驟504中所選用的數值近似技術求解等式5，并且省去形成殘數的值。為了足夠地隨機化，重復這些步驟，以便構建一個充分顯著性的，預期的殘數分布。為了獲得99％或更好的置信度水平(即P值小于0.01)，需要大于100的隨機化。
在步驟506已構建經驗性殘數分布圖之后，將真實確定的殘數與所構建的分布和根據此分布確定的其機率相比較。此機率是被賦予此途徑的顯著性。換句話說，在此優選的實施方案中，是通過機率值的微小度對一組途徑與藥物應答的任何擬合給出統計學顯著性，此機率值使隨機化數據比真實數據通過假定的途徑組合較好地被擬合。
在某些情況下，起初在步驟501中選擇的途徑組合具有適合的顯著性。例如，如果此途徑組合具有普通用于醫學科學的至少標準的95％機率閾值時情況就是這樣。如果這樣，那么在步驟507中可以證實此起始的途徑組合，并且可以在步驟508中確定一些細胞成分具有單獨的生物途徑。在另一些情況下，最初不能發現可接受的顯著性閾值。如果是這樣，那么如箭頭512所指示的有利的情況可以是返回至步驟501并選擇一組新的候選途徑，以便找到一組符合此選擇的顯著性閾值標準。
因此，所賦予的顯著性為賦予顯著性值并在途徑組合之間進行選擇提供了一種客觀的方法。這種賦予顯著性的客觀方法使有可能從一大批很可能包含在所研究藥物作用中的可能途徑有目的地鑒定這些途徑，并且當模式藥物應答(可能組合了多種途徑)充分客觀的顯著性時，為停止尋找另外的途徑提供了客觀的依據。
在如上面確定的顯著性的另一種用途中，可按照二種不同的方法檢驗單一候選途徑的顯著性。按第一種方法，選取只包含此候選途徑的模式藥物應答，并通過相關性或最小二乘方殘數(如在5.3.1節中所述的)將隨此途徑的途徑應答數據與藥物應答數據相比較。將通過上述隨機化法確定的擬合顯著性與一個閾值如醫學科學中的95％閾值標準相比較，并且如果此顯著性大于閾值，則此候選途徑被認為是藥物作用途徑。
按第二種方法，假定此模式藥物應答參與包括所研究的候選途徑在內的多種途徑。然后按照等式10，對于此候選途徑通過隨機作此唯一的途徑數據選擇性地隨機化途徑應答數據，借助于以前的方法評估模式藥物應答對此選擇性隨機化數據的顯著性。如果此后者的顯著性顯著地小于此真實數據前者的顯著性，那么選取已顯著地改善了此模式藥物應答的候選途徑。在此情況下，該途徑很可能是所研究藥物作用的途徑。
證實途徑組合關于下一步驟507，通過在此節所述的優選的，但是任選的步驟可以獨立地驗證按照途徑應答對藥物應答的表示法。在本發明前面的步驟中(步驟510和511)，生物系統通過藥物暴露或通過對所選擇途徑的擾動而受干擾，但是不該受藥物暴露又受途徑擾動的干擾。在步驟504和506，先通過一組所選擇途徑擾動的結果擬合藥物暴露的結果，然后檢驗此擬合的統計學顯著性。現在在步驟507中，是將在步驟504中所確定的對此顯著性途徑同時的藥物暴露和擾動，用于證實這些途徑確實是藥物作用的真實途徑。
在論述途徑證實的分析細節之前，先根據圖6中所示的情形示范性說明同時的藥物暴露和途徑擾動的優越性。在圖6中，基因Gk的表達(例如轉錄狀態的mRNA豐度測定量)受二種途徑影響，一種起源于蛋白質P1，另一種起源于蛋白質Px。假定藥物D通過抑制P1或通過抑制Px對基因Gk起作用。如果對此二種途徑的抑制性擾動在基因Gk產生相似的應答，那么即使藥物D僅通過抑制Px起作用，它的藥物應答在步驟504中也將通過抑制性擾動601很好地擬合于起源于P1的途徑，并且此途徑可能被錯誤地鑒定為藥物D作用的很可能途徑。通過同時暴露于藥物D和抑制P1或Px可以補救這種誤差。暴露于藥物D和抑制P1將不會導致藥物應答改變，因為藥物應答實際上是由Px介導的。但是，暴露于藥物D和抑制Px將會導致藥物應答改變，因為現在藥物和擾動都作用于Px。在這二種情況中對同時的藥物暴露和途徑擾動不同的應答，使之能夠對藥物D作用的正確途徑進行明確的鑒定。
開始概述驗證步驟507時，首先考慮只有一種途徑被參與表現藥物應答的情況，隨后考慮多種途徑的一般情況。在下面如同以前，Dk(t1)表示第k細胞成分對第l水平藥物暴露的應答，Ri，k(Ri，l)表示在應答時第i途徑中第k細胞成分對第l水平的適當擾動控制參數的應答。另外，變量DR表示生物系統組合暴露于藥物和途徑擾動的結果。詳細地說，DRi，k(Ri，l，tm)表示在應答時第i途徑中第k細胞成分對第l水平的適當擾動控制參數和對第m水平的藥物暴露的應答。
在單一途徑藥物作用的情況下，如果藥物確實作用在那種途徑，那么可用如下等式給出組合應答DR。
DRi，k(pi，l，tm)＝Ri，k(pi，l+αitm)(11)在此αi是對此途徑確定的最佳定標參數。在此假定是線性定標；根據前面的描述顯然適合于更一般的定標轉換。DR具有上述形式是因為在這種情況下藥物和擾動都對途徑的相同成分起作用，特別是對它們的起源成分起作用，并且這種途徑應答是由于其相加的作用。
等式(11)的狀態被圖解顯示在圖7A中，在此只是作為例子，D和R已被Hill函數模擬。特征上，在此情況下函數DR在基本上相同的值飽和，對于大的藥物暴露(藥物“滴定量”)接近星號701，對于大的擾動接近星號702，而對于大藥物暴露和大擾動的組合接近圓圈703。
如果不是那樣，藥物對不同的途徑起作用，而不是對第i途徑起作用，那么可由如下等式給出組合的應答DR。
DRi，k(pi，l，tm)＝Ri，k(pi，l)+Dk(tm) (12)在此情況下應答具有這種形式是因為藥物只對第i途徑之外的細胞成分起作用。因為途徑擾動被限制于第i途徑中的細胞成分，所以它獨立地起此藥物的作用。因而，藥物的作用和擾動是獨立的，并且它們的作用是附加在細胞成分上。(需要時按照在5.2節中所論述的另一些組合函數這些作用可以被組合)。
圖7B圖解顯示了等式12的狀態(假設αi等于1)，在此僅為了作為例子D和R同樣已被Hill函數模擬。在此情況下，函數DR在基本上相同的值飽和，對于大的藥物暴露(藥物“滴定量”)接近于星號704，而對于大的擾動接近于星號705。但是對于大藥物暴露和大擾動的組合，此函數基本上達到比在星號704或705高的值，接近于圓圈706，在此只是藥物暴露或擾動單獨處于飽和中。
顯然，通過對藥物暴露和途徑擾動都同時存在的驗證條件進行實驗，有可能區分由圖7A和7B表示的情況。這些實驗優選地是在由圖7A和7B中圓圈所表示的藥物暴露和擾動值，而最優選地是在圓圈703和706表示的值。較少優選地是這些實驗在這些圖中顯示的表面內部的數值下進行，特別是在由圖7A中星號701和702與圓圈703之間的線條所限定的區域內，以及在由圖7B中星號703和704與圓圈705之間的線條所限定的區域內。同樣明顯的是，僅僅通過進行其中只有一個藥物暴露值或擾動控制值是非0的實驗是不可能區分這些情況。圖7A中星號710與星號701或星號702之間的曲線，基本上與圖7B中星號711與星號704或星號705之間的曲線相同。
總之，如果與圖7B相比實驗結果更密切地相似于圖7A，則可證實第i途徑為此藥物作用途徑的鑒定。
考慮到一般是多種途徑的情況，TRk(Ri，L，tm)表示在應答第i途徑中第l水平的適當擾動控制參數以及應答第m水平的藥物暴露時，第k細胞成分的總應答。如果此藥物通過所指出的途徑起作用，則可用如下等式給出TR。TRk(pi,1,tm)=ΣiDRi,k(pi,1,tm)=ΣiRi,k(pi,1+αitm)----(13)]]>如此此藥物不通過所指出的途徑起作用，則可用如下等式給出TR。TR(pi,1,tm)=ΣiDRi,k(pi,1,tm)=Σi(Ri,k(pi,1)+Dk(tm))----(14)]]>按照類似于前面小節中所描述的統計學系數評估法的方式，可以在這二種可能性之間作出客觀的選擇。等式13和14左邊TRk(Ri，l，tm)的值可對不同優選驗證條件通過實驗確定，而等式右邊的值可根據步驟510和511中藥物應答和途徑應答的測定量，以及根據步驟504中對最佳定標參數的確定來計算。然后計算對于這二個等式的殘數，即左邊與右邊差的平方和。沒有更多時，具有較少殘數的二者之一是此客觀的選擇。
可首先通過評估殘數的機率分布來評估此殘數的統計學顯著性。通過相對于擾動控制參數的指數和藥物暴露的指數重復隨機化等式13和14的右邊，然后重新計算此殘數可確定所評估的殘數機率分布。然后相對于此模式機率分布確定真實殘數的統計學顯著性。
典型地是，以顯著性證實存在步驟506中被確定的具有顯著性的途徑，只需要小數目的驗證條件。
在最后任選的步驟508中，在步驟504藥物應答已被表示為一組途徑應答，并且最佳擬合定標參數已被相應地確定之后，可以將每種受影響的細胞成分分配給與它的藥物應答最相關的途徑。任選地還可在步驟506中基于一個顯著性閾值如通常用于醫學科學的標準的95％機率閾值，判斷此途徑是顯著性的。在每種途徑的應答數據中對于第K細胞成分，它的藥物應答Dk(tl)與該成分的單個應答相關聯。
ρi，k＝corr(Dk(tl)Ri，k(αitl))=Σ1Dk(t1)Ri,k(αit1)(Σm(Dk(tm))2Σn(RJk(αJtn))2)1/2----(15)]]>在等式15中，ρi，k是第k細胞成分的藥物應答與在第i途徑中其應答的相關性。第K細胞成分被分配給第i途徑，在此由于所有的l都不等于i，ρi，k大于ρL，k。類似于前面的顯著性評估法，可以通過隨機化等式15中的藥物應答數據來確定此相關性的統計學顯著性。
5.3.3執行系統和方法通過使用如下計算機系統并按照如下的程序和方法，可優選地執行在前面各小節中所述的分析方法。圖9顯示了一個適合于執行本發明分析方法的示范性計算機系統。計算機系統901被顯示包括內部組件，并被連接于外部組件，此計算機系統的內部組件包括處理器元件902，與內存903相互連接。例如，計算機系統901可以是IntelPentium為基礎的200兆或更大時鐘頻率的處理器，并具32MB或更多的內存。
外部組件包括大容量存儲器904。這種大容量存儲器可以是一個或幾個硬盤(它通常與處理器和內存包裝在一起)。這種硬盤一般具有1GB或更大的存儲容量。其它的外部組件包括使用者界面裝置905，它可以是一套監視器和鍵盤，以及可以是鼠標的點擊裝置906，或者其它的圖形輸入裝置(未顯示出)。典型地，計算系統901還連接于網絡鏈路907，此網絡鏈路可以是Ethernet連接于其它局部計算機系統的一部分，遠程計算機系統，或者廣域通信網絡如Internet。此網絡鏈路可使計算機系統901與其它計算機一起分享資料和處理任務。
操作此系統時，先將幾種軟件成分裝入內存，這些軟件成分既是本領域標準的，又是本發明將有的。這些軟件成分共同地導致此計算機系統按照本發明的方法運行。這些軟件成分通常存儲在大容量存儲器904上。軟件成分910提供操作系統，負責管理計算機系統901和它的網絡互相連接。此操作系統可以是Microfoft WindowsTM家族如Windows 95，Windows 98或Windows NT。軟件成分911提供通用語言和功能，方便地存在于此系統上，以便促進程序執行對本發明特定的方法?？捎糜诰幊瘫景l明分析方法的語言包括C和C++，或較差點的JAVA。最優選地是，以數學軟件包編程本發明的方法，使之可以應用方程式的符號入口和包括算法的高水平處理規程，從而使用戶不需要從程序上編程單個的方程式或算法。這種軟件包包括來自Mathworks(natick.MA)的Matlab，來自Wolfram Ragearch(Champaign，Illinois)的Mathematica，或來自Math soft(Seattle，Washington)的S-plus。
因此，軟件成分912和913提供本發明的分析方法，如在程序語言或符號包中所編程的。成分912提供一種程序執行用于在5.3.1節中所述的藥物應答表示的方法，以及成分913提供一種程序，執行用于在5.3.2節中所述的評估藥物應答表示的顯著性。
在示范性的執行過程中，為了實行本發明的方法，使用者首先將藥物應答數據和途徑應答數據輸入計算機系統901。這些數據可被使用者從監視器和鍵盤905直接輸入，或者從由網絡連接907連接的，或在可移動存儲介質(示顯示出)上的其它計算機系統輸入。下一步使用者引起執行藥物應答表示軟件912，在任選地供給所研究的起始途徑之后，隨之執行顯著性評估軟件913。從而，使用者可獲得一個模式藥物應答和它的統計學顯著性。最后如在5.3.2節中所述，使用者可以通過引起重復和迭代執行藥物應答表示軟件和統計學顯著性評估軟件，根據幾個選擇方案對第一個模式藥物應答反復地改進提高。
對于本領域的技術人員，用于執行本發明分析方法的另一些系統和方法將是顯而易見的，并打算將它們包括在所伴隨的權利要求中。特別是打算使伴隨的權利要求包括用于執行本發明方法的另一些程序結構，這對于本領域的技術人員是容易實現的。
5.4途徑擾動方法用于在不同的細胞水平定向擾動生物途徑的方法在本領域逐漸被廣泛地認識和應用。任何能夠特異性地靶向和可控制地修飾(例如通過分級的增加或激活或者通過分級的減少或抑制)特定細胞成分(例如基因表達，RNA濃度，蛋白質豐度，或蛋白質活性等)的這樣一些方法，都可被用于實施途徑擾動。對細胞成分的可控制性修飾因而可控制性干擾起源于所修飾細胞成分的途徑。起源于特定細胞成分的這些途徑被優選地用于在本發明表示藥物作用。優選的修飾方法能夠單獨靶向多種細胞成分中的每一種，而最優選地是靶向這些細胞成分的主要部分。
下面的方法是可被用于修飾細胞成分，并從而產生途徑擾動的示范性方法。這些途徑擾動可產生途徑應答，用于前述本發明方法的步驟中。本發明可合適于用于對途徑形成可控制性擾動的其它方法，特別是對途徑起源的細胞成分的可控制擾動。
優選地可在從如下任何生物體獲得的細胞類型中形成途徑擾動，對于這些生物體其基因組信息和表達序列信息是現在可利用的，并且也有對于這些生物體允許可控制性地修飾特定基因表達的方法。目前正在對幾種真核生物進行基因組測序，包括人，線蟲，擬南芥和蠅。在優選的實施方案中，是用一種酵母菌實施本發明，釀酒酵母(S.Cerevisiae)是最優選的，因為已經確定了釀酒酵母菌株的全部基因組序列。此外，用于可控制性修飾酵母菌基因表達的方法已充分地建立或被利用。優選的酵母菌株是已知基因組序列的釀酒酵母菌株，如S288C株或它的同源衍生株(參見例如，自然369，371-8(1994)；P.N.A.S.923809-13(1995)；E.M.B.O.J.135795-5809(1994)；科學2652077-2082(1994)；E.M.B.O.J.152031-49(1996)，全部被引入作為參考。但是，其它菌株也可能同樣良好地被使用。酵母菌株可從美國典型培養物保藏中心(Rockville.MD20852)得到。在如下文獻中描述了用于操作酵母菌的標準技術C.Kaiser，S.Michaelis d A.Mitchell，1994，酵母菌遺傳學方法冷泉港實驗室運行手冊，冷泉港實驗室出版，紐約；和Sherman等，1986，酵母菌遺傳學方法實驗室手冊，冷泉港實驗室出版，紐約冷泉港，它們二者全部被引入作為參考。
下述的示范性方法包括使用可滴定的表達系統，使用轉染或病毒轉導系統，包括使用具有已知特定作用的藥物(或一般的化合物)直接修飾RNA豐度或活性，直接修飾蛋白質豐度，以及直接修飾蛋白質活性。
可滴定的表達系統幾種可用于芽殖酵母釀酒酵母的已知可滴定或同樣可控制的表達系統中的任何一種都適用于本發明(Mumberg等，1994，釀酒酵母菌的可調節啟動子轉錄活性比較及它們對異源性表達的用途。核酸研究225767-5768)。通常是通過轉錄控制，以將受控制基因的啟動子被一個可控制的外源性啟動子代替來控制此基因的表達。酵母中最常用的可控制性啟動子是GAL1啟動子(Johnston等，1984，釀酒酵母菌中調節趨異性GAL1-GAL10啟動子的序列，分子細胞生物學81440-1448)。培養基中存在葡萄糖可強烈地抑制GAL1啟動子。通過逐漸降低葡萄糖的濃度并存在半乳糖，可逐漸以分級的方式開啟GAL1啟動子使之達到高水平的表達。GAL1啟動子通常對所研究的基因可達到在5-100倍范圍內的表達控制。
其它常用的啟動子系統包括MET 25啟動子(Kerjan等1986，釀酒酵母菌MET25基因的核苷酸序列，核酸研究147861-7871)和Cup1啟動子(Mascorro-Gllardo等，1996，構建調整釀酒酵母菌內基因表達的基于Cup1啟動子的載體，基因172169-170)，培養基中不存在甲硫氨酸可誘導MET 25啟動子，而銅離子可誘導Cup1啟動子。所有這些啟動子系統都是可控制的，其中可通過生長培養基中可控制部分濃度的遞增性改變使基因表達受到遞增性控制。
上面所列舉表達系統的一個缺點是，控制啟動子的活性(例如受碳源改變的影響，除去某些氨基酸)，常常會引起細胞生理學的其它一些改變，這些改變可獨立地改變其它基因的表達水平。最近對酵母菌建立的一個系統Tet系統在很大程度上解決了這個問題(Gari等1977，用于調整釀酒酵母菌基因表達，具有四環素調節性啟動子系統的一組載體，酵母菌13837-848)。采自哺乳動物表達系統的Tet啟動子(Gossen等，1995，四環素對哺乳動物細胞的轉錄激活作用，美國國家科學院學報895547-5551)受抗菌素四環素或結構相關化合物強力霉素濃度的調節。因此，不存強力霉素時此啟動子誘導高水平的表達，加入逐漸提高濃度的強力霉素，導致增加對啟動子活性的抑制作用。通過加入中等濃度的藥物，可使中等水平的基因表達達到穩定狀態。而且，給予最大的啟動子活性抑制作用的強力霉素濃度(10μg/ml)，對于野生型酵母細胞的生長速度沒有明顯的作用(Gari等1997，用于調整釀酒酵母基因表達，具有四環素可調節性啟動子系統的一組載體，酵母13837-848)。
對于哺乳動物細胞，有幾種滴定基因表達的方法是現存可利用的(Spencer，1996，對哺乳動物引起條件性突變，遺傳學動向12181-187)。如上所述，Tet系統正廣泛地被使用，它的原來形式，“正向”系統，對其中加入強力霉素可抑制轉錄作用，面對于新型的“反向”系統，對其中加入強力霉素可刺激轉錄作用(Gossen等，1995，美國國家科學院學報895547-5551；Hoffanarm等1997，核酸研究251078-1079；Hofmann等1996，美國國家科學院學報835185-5190；Panlus等，1996，病毒學雜志7062-67)。另一個在哺乳動物細胞中常用的可控制性啟動子系統是由Evans及其同事建立的蛻皮激素-誘導性系統(No等1996，在哺乳動物細胞中蛻皮激素-誘導的基因表達和轉基因小鼠，美國國家科學院學報933340-3351)，在此，表達受加入到培養細胞中的muristerone濃度控制。最后，應用由Schreibe.Crabtree及其同事建立的“化學劑”誘導的二聚體形成(CID)系統(Belshaw等1996，用誘導蛋白質異二聚體形成的合成配體控制蛋白質的結合和亞細胞定位，美國國家科學院學報934604-4607；Spencer 1996，對哺乳動物引起的條件性突變，遺傳學動向12181-187)及酵母菌中類似的系統也可以調節表達。在此系統中，是將所研究的基因置于CID-應答啟動子的控制之下，并被轉染進入表達二個不同的雜合蛋白質的細胞，一個雜合蛋白質由融合于FKBP12的DNA-結合功能域組成，此功能域可結合FK506。另一個雜合蛋白質包含也融合于FKBP12的轉錄激活功能域。CID誘導分子是FK1012，這是FK506的同型二聚體形式，它能夠同時結合DNA結合性雜合蛋白質和轉錄激活性雜合蛋白。對于分級存在的FK1012，可激活受控制基因的分級轉錄作用。
對于上述的每種哺乳動物表達系統，如本領域技術人員廣泛知道的，是將所研究的基因置于可控制性啟動子的控制之下，并將包含這種構建體以及抗菌素抗性基因的質粒轉染進入培養的哺乳動物細胞內。一般地說，此質粒DNA整合進入基因組，選擇出藥物活性集落，并對調節基因的適當表達進行篩選。另外，還可以將此受調節基因插入一個游離基因質粒如PCEP4(Invitrogen公司)中，此質粒包含質粒復制所必需的EB病毒成分。
在優選的實施方案中，是將如上述的可滴定的表達系統導入缺乏相應內源性基因和/或此內源性基因活性的細胞或細菌中，例如其中該內源性基因已被破壞或刪除的細菌。產生這種“敲除”的方法對本領域的技術人員是熟知的，參見如Pettitt等1996，發育1224149-4157；Spradling等1995，美國國家科學院學報9210824-10830；Ramires-Sdis等1993，酶學方法，225855-878，和Thomas等1987細胞51503-512。
用于哺乳動物細胞的轉染系統靶標基因的轉染或病毒轉導可以將可控制性擾動導入哺乳動物細胞內的生物途徑中。優選地可對天然不表達所研究靶標基因的細胞使用靶標基因的轉染或轉導?？梢詮恼Ｇ闆r下不表達此靶標基因的組織，或者可使此靶標基因在細胞中特異性地突變的組織中獲得這種非表達性細胞。此所研究的靶標基因可以被克隆進入許多哺乳動物表達質粒的一種，例如PCENA3.1+/-系統(Invitrogen公司)或反轉錄病毒載體，以及被導入非表達性宿主細胞。通過對由此表達載體編碼的藥物抗性標記進行選擇，可分離出表達此靶標基因的被轉染或轉導的細胞。基因轉錄水平僅與轉染劑量相關聯。因此，可以檢查靶標基因水平變化的作用。
應用這種方法的一個特殊例子是尋找靶向src-家族蛋白胰蛋白酶激酶lck的藥物，lck是T細胞受體激活途徑的關鍵性成分(Anderson等，1994，在T細胞信號傳輸和胸腺細胞發育中包含蛋白質胰蛋白酶激酶P56(lck)，免疫學進展56171-178)。這種酶的抑制劑作為可能的免疫抑制藥物正在研究中(HankeJH.1996，一種新型、強有力的src-家族選擇性胰蛋白酶激酶抑制劑的發現，生物化學雜志271(2)695-701)。Jurkat T細胞系(JcaM1)的特異性突變體是可利用的，它不表達lck激酶(Straus等，1992，關于在通過T細胞抗原受體信號轉導中包含lck胰蛋白酶激酶的遺傳學進展，細胞70585-593)。因此，通過轉染或轉導將lck基因導入JCaM1使之有可能特異性地擾動由lck激酶調節的T細胞激活途徑。轉染或轉導的效率與這種擾動水平確實有關。這種方法一般可用于對正常情況下不表達受干擾基因的細胞提供基因表達或蛋白質豐度擾動。
修飾RNA豐度或活性的方法目前修飾RNA豐度和活性的方法有下三類核酶，反義物質和RNA銜接子法(Good等，1997，基因治療445-54)?？煽刂频貙毎褂没驅⒓毎┞队谶@些物質則能夠可控制地擾動RNA豐度。
核酶是能夠催化RNA裂解反應的RNA。(Cech 1987，科學2361532-1539；PCT國際公開WO 90/11364，1990年10月4日公布；Sarver等1990，科學2471222-1225)?？梢栽O計“發夾”型和“錘頭”型RNA核酶用于特異性地裂解特定的靶標mRNA。已經確立了設計具有核酶活性的短RNA分子的準則，也就是能夠以高度的序列特異性方式裂解其它RNA分子，并且可以靶向實際上所有種類的RNA(Haseloff等，1988，自然334585-591；Koizumi等1988 REBS通訊228228-230；Koizumi等，1988，FEBS通訊239285-288)。核酶法包括將細胞暴露于這種RNA核酶小分子，還包括在細胞等內表達這種小分子。(Grassi和Merini，1996，醫學年鑒28499-510；Gibson，1996，癌及轉移述評15287-299)。
可以在體內以對裂解mRNA催化有效的足夠數量常規地表達核酶，并且從而改變細胞內mRNA的豐度(Cotten等1989，核酶介導的體內RNA破壞，EMBO雜志83861-3866)。特別是，可以將按照前述準則設計、并通過例如亞磷酰胺化學法合成的，編碼DNA序列的核酶連接進入編碼tRNA基因的反密碼子莖和環中的限制性酶位點，然后可以借助于本領域常規的方法將它轉化進入所研究的細胞，并在此細胞內表達。優選地還將一個可誘導性啟動子(例如糖皮質激素或四環素應答成分)轉導進入這種構建體，以致可以選擇性地控制核酶的表達。tDNA基因(即編碼tRNA的基因)可用于本申請，因為它體積小，轉錄速度快，以及在不同種組織內普遍存在表達作用。因此，可以按常規設計實際上可裂解任何mRNA序列的核酶，并且可按常規以編碼這種核酶的DNA轉化細胞，以致表達可控制的、催化有效量的核酶。因此可以干擾實際上任何RNA種類的豐度。
在另一個實施方案中，可以通過可控制地使用反義核酸可控制地抑制靶標RNA(優選地是mRNA)的活性，特別是它的翻譯速度。如在此使用的“反義”核酸是指能夠借助于與編碼區和/或非編碼區互補的某一序列與靶標RNA的序列-特異性(例如非-聚腺苷酸)部分雜交的核酸。本發明的反義核酸可以是雙鏈或單鏈的寡核苷酸，RNA或DNA，它的修飾物或衍生物，可以將這種反義核酸以可控制的方式直接對細胞給藥，或者可通過以足夠干擾靶標RNA翻譯的可控制量轉錄外源性導入的序列，在細胞內產生這種反義核酸。
優選的反義核酸至少有6個核苷酸，而優選地是寡核苷酸(在6-大約200個寡核苷酸的范圍內)。在特殊情況下，此寡核苷酸至少有10個核苷酸，或至少15個核苷酸，或至少100個核苷酸，或至少200個核苷酸。此寡核苷酸可以是DNA或RNA，或者它們的嵌合混合物、衍生物或修飾的形式，單鏈或雙鏈的。可以在堿基部分，糖基部分或磷酸骨架修飾此寡核苷酸。此寡核苷酸還可能包括其它的添加部分如肽或促進跨細胞膜轉運的作用劑(參見例如Letsinger等1989，美國國家科學院學報866553-6556；Lemaitre等1987，國家科學院學報84648-652；PCT公布號WO/88/09810，1988、12、15公布)，雜交觸發的裂解劑(見例如Krol等1988。生物技術6958-976)或嵌入劑(見例如Zon，1988，藥學研究5539-549)。
在本發明優選的方面是提供了一種反義寡核苷酸，優選地是單鏈DNA?？稍谄浣Y構的任何部位以本領域一般已知的組成成分修飾此寡核苷酸。
此反義寡核苷酸可能包括至少一個選自如下種類的被修飾的堿基部分，包括但不局限于5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黃嘌呤，黃嘌呤，4-乙?；奏?，5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶，5-羧基甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶，5-羧基甲基氨甲基尿嘧啶，二氫尿嘧啶，β-D-半乳糖基queosine，次黃苷，N6-異戊烯基腺嘌呤，1-甲基鳥嘌呤，1-甲基次黃苷2，2-二甲基鳥嘌呤，α-甲基腺嘌呤，2-甲基鳥嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘌呤，N6-腺嘌呤，7-甲基鳥嘌呤，5-甲基氨甲基尿嘧啶，5-甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶，β-D-甘露糖基queosine，5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲基硫代-N6-異戊烯基腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧乙酸(V)，Wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯，尿嘧啶-5-氧乙酸(V)，5-甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶，(acp3)W，以及2，6-二氨基嘌呤。
在另一實施方案中，此寡核苷酸包含至少一個選自但不局限于如下種類的修飾的糖基部分阿拉伯糖，2-氟阿拉伯糖，木酮糖和已糖。
在還有一個實施方案中，此寡核苷酸包含至少一個選自如下種類的修飾的磷酸骨架硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，酰胺硫代磷酸酯，氨基磷酸酯，二氨基磷酸酯，甲基膦酸酯，烷基磷酸三酯，以及formacetal或其類似物。
在再一個實施方案中，此寡核苷酸是2-α-異頭寡核苷酸。α-異頭寡核苷酸與互補RNA形成特異性雙鏈雜合體，其中與通常的β-單位相反，二條鏈相互平行存在(Gantier等1987，核酸研究156625-6641)。
此寡核苷酸還可能與另一分子偶聯，例如肽，雜交觸發的交連劑，轉運劑，雜交觸發的裂解劑等。
本發明的反義核酸包含與靶RNA的至少一部分互補的序列。但是，也不需完全互補，雖然優選地是完全互補。這里所指的與“某一RNA的至少一部分互補”的序列意指一種具有能夠與此RNA雜交，形成穩定雙螺旋的足夠互補性的序列；在雙鏈反義核酸的情況下，因此可以測定此雙螺旋DNA的一條單鏈，或者可能測試三鏈體形式。雜交的能力將取決于互補性的程度和此反義核酸的長度。一般是，雜交的核酸越長，它可能包含與靶標RNA越多的錯配，并仍可形成穩定的雙螺旋(或三鏈體，視情況而定)。通過應用標準的程序測定此雜交復合體的熔點，本領域的技術人員可以確定可允許的錯配程度。借助于標準的測試技術還可以確定對抑制靶標RNA翻譯有效的反義核酸的量。
可以借助于本領域已知的標準方法合成本發明的寡核苷酸，例如通過使用自動DNA合成儀(如可以從Biosearch，Applied Biosystems等購買到)。作為例子，可借用于Stein等(1988，核酸研究163209)的方法合成硫代磷酸酯寡核苷酸，通過使用控制孔徑的玻璃聚合物支持體可以制備甲基膦酸酯寡核苷酸(Sarin等1988，美國國家科學院學報857448-7451)，等等。在另一實施方案中，此寡核苷酸是2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987，核酸研究156131-6148)，或者是一個嵌合的RNA-DNA類似物(Inoue等1987，FEBS通訊215327-330)。
然后可以將此合成的反義寡核苷酸以可控制的方式對細胞給藥。例如，可以將此反義寡核苷酸以可控制的濃度加入到此細胞生長的環境中，在此細胞可以吸收它們。通過應用本領域已知的方法可以檢測對此反義寡核苷酸的吸收。
在另一實施方案中，本發明的反義核酸通過從一個外源性序列的轉錄，可控制地在細胞內被表達。例如，可將一個載體導入體內，以致它被細胞吸收，在該細胞內此載體或它的一部分被轉錄，產生本發明的反義核酸(RNA)。這種載體含有編碼此反義核酸的序列。這種載體可以仍然是游離基因或者被染色體整合，只要它能夠被轉錄產生所需要的反義RNA?？梢酝ㄟ^本領域標準的重組DNA技術構建這種載體。載體可以是質粒，病毒或本領域已知的，用于在哺乳動物中復制和表達的其它載體。可以通過本領域已知的在所研究細胞中起作用的任何一種啟動子表達編碼此反義RNAs的序列。這種啟動子可以是誘導的或組成型的。最優選地是，通過給予外源性部分啟動子可被控制或誘導，以便實現對此反義寡核苷酸的受控制性表達。這種可控制的啟動子包括Tet啟動子。可用于哺乳動物細胞但相對不優選的啟動子包括，但不局限于SV40早期啟動子區(Bernoist和Chambon，1981，自然290304-310)，包含在Rows肉瘤病毒3’長末端重復序列中的啟動子(Yamamoto等，1980細胞22787-797)，皰疹胸苷激酶啟動子(Wagner等，1981，美國國家科學院學報781441-1445)，金屬硫蛋白基因的調節序列(Brinster等1982，自然29639-42)等。
因此，反義核酸可以被常規地設計靶向實際上任何一種mRNA序列，并且可以用編碼這種反義序列的核酸常規地轉化細胞，或者使細胞暴露于這種核酸，以致能表達有效的可控制量反義核酸。因此，實際上可以控制性地干擾任何一種RNA的翻譯。
最后，在另一個實施方案中，可以將RNA銜接子導入細胞，或者在細胞中被表達。RNA銜接子是對蛋白質的特異性RNA配體，例如對于Tat和Rev特異的RNA(Good等，1997，基因治療445-54)，此配體可以特異性地抑制它們的翻譯。
修飾蛋白質豐度的方法修飾蛋白質豐度的方法包括，特別是改變蛋白質降解速度的方法和應用抗體的方法(此抗體結合于影響天然靶標蛋白質豐度或活性的蛋白質)。增加(或降低)某種蛋白質的降解速度，可降低(或增加)這種蛋白質的豐度。本領域已知的用于在應答提高溫度和/或暴露于特定藥物中可控制地增加靶標蛋白質降解速度的方法可被用于本發明。例如，這樣一種方法可利用熱誘導的或藥物誘導的N-末端降解決定子，它是N-末端蛋白質的一個片段，在較高溫度(例如37℃)時它暴露出啟動蛋白質迅速降解的降解信號，而在較低溫度時(例如23℃)它被隱藏以便防止蛋白質迅速降解(Dohmen等，1994，科學2631273-1276)。范例性的這樣一種降解決定子是Arg-DHFRts，這是鼠二氫葉酸還原酶的變異體，其中N-末端Val被Arg取代了，并且位置66的Pro被Leu取代了。按照這種方法，例如借助于本領域已知的標準的基因打靶法(Lodish等，1995，細胞分子生物學，W.H.Freeman and Co.紐約，特別是第8章)用編碼融合蛋白Vb-Arg-DHFRts-P(“Vb”代表遍在蛋白)的基因代替編碼靶標蛋白P的基因。在暴露N-末端降解決定子的翻譯之后，N-末端遍在蛋白被迅速裂解。在較低溫度時，Arg-DHFRts內部的賴氨酸不被暴露，此融合蛋白的遍在蛋白化不發生，降解緩慢，活性靶標蛋白濃度高。在較高濃度(不存在氨中喋呤)時，Arg-DHFRts內部的賴氨酸被暴露，此融合蛋白的遍在蛋白化發生，降解迅速，活性靶標蛋白濃度低。通過氨甲喋呤暴露可控制地阻斷降解的熱激活作用。此方法適合于對其它誘導因子如藥物和溫度改變敏感的其它N-末端降解決定子。
還可以通過(中和)抗體降低靶標蛋白質的豐度，并且也直接或間接地降低它的活性。通過提供受控制的暴露于這種抗體，可以可控制地改變蛋白質的豐度/活性。例如，針對蛋白質表面適合抗原表位的抗體，通過主動結合靶標蛋白的野生型活性形式，成為與未結合的野生型形式相比較具有較小或最小活性的復合物，可以降低此野生型活性形式的豐度，從而間接地降低它的活性。另外，通過例如，與活性位點直接相互作用，或者通過阻斷底物接近活性位點，抗體也可以直接降低蛋白質的活性。相反地，在某些情況下，(激活的)抗體帶可以與蛋白質和它的活性位點相互作用，而增加由此引起的活性。在這二種情況下都可以(通過將要論述的方法)產生針對特異性種類蛋白質的(將要描述的不同類型的)抗體，并篩選它們的作用?？梢詸z測這種抗體的作用，并可選擇提高或降低靶標蛋白濃度和/或活性的適合的抗體。這種檢測包括將抗體導入細胞(見下面)，并借助于本領域已知的標準方法(如免疫測定法)檢測野生型數量的濃度或靶標蛋白質的活性。借助于適合于靶標蛋白已知活性的檢測方法可測定野生形式的凈活性。
可以用多種方式將抗體導入細胞，包括例如將抗體顯微注射進入細胞(Morgan等1988，今日免疫學984-86)，或者使編碼所需抗體的雜交瘤mRNA轉化進入細胞(BurkeTFFU，1984，細胞36847-858)。按照進一步的技術，重組抗體可以是工程構建的，并在廣泛多種非淋巴細胞中被表達，以便結合于靶標蛋白以及阻斷靶標蛋白的活性(Bioccn等1995，細胞生物學動向5248-252)。優選地此抗體的表達是在可控制性啟動子如Tet啟動子的控制之下。第一步是選擇對此靶標蛋白具有適當特異性的特定的單克隆抗體(見下面)。然后可以將編碼所選擇抗體可變區的序列克隆成為不同的工程構建抗體形式，包括例如，全抗體，Fab片段，Fv片段，單鏈Fv片段(以肽接頭結合的VH和VL區)(“ScFv”片段)，雙抗體(二個具有不同特異性的結合的ScFv片段)，等等(Hayden等1997，免疫學的當前觀點9210-212)。通過將它們表達為與不同已知細胞內引導序列的融合體，可以使細胞內表達的不同形式抗體靶向進入細胞內的區室(例如細胞質，核，線粒體等)(Bradbury等，1995，抗體的工程構建(第二卷)(Borrebaeck編輯)PP295-361，IRL出版)。特別是ScFv形式似乎特別適合于靶向細胞質。
抗體類型包括，但不限于，多克隆抗體，單克隆抗體，嵌合抗體，單鏈抗體，Fab片段，以及Fab表達文庫。本領域已知的不同程序都可以用于產生針對一個靶標蛋白質的多克隆抗體。為了產生這種抗體，可以通過以此靶標蛋白質注射來免疫不同的宿主動物，這種宿主動物包括但不限于兔，小鼠，大鼠等。取決于宿主動物的種類，可使用不同的佐劑以理增強免疫應答，包括但不限于福氏(完全和不完全)佐劑，礦物凝膠如氫氧化鋁，表面活性物質如溶血卵磷酸，Pluronic多元醇，聚陰離子，肽，油乳劑，二硝基酚，以及潛在地可用于人的佐劑如卡介苗(BCG)和小棒桿菌。
為了制備針對一種靶標蛋白的單克隆抗體，可以應用提供通過培養中的連續細胞系產生抗體分子的任何一種技術。這些技術包括但不限于，最初由Kohler和Milstein(1975，自然256495-497)建立的雜交瘤技術，三瘤技術，人B細胞雜交瘤技術(Kozbor等，1983，今日免疫學472)，以及產生人單克隆抗體的EBV雜交瘤技術(Cole等1985，在單克隆抗體和癌治療中，Alan R.Liss.公司PP.77-96)。在本發明的補充實施方案中，單克隆抗體可以利用最新技術在無菌動物中產生(PCT/US90/02545)。根據本發明可以使用人抗體，并可以通過應用人雜交瘤(Cote等，1983，美國國家科學院學報802026-2030)，或者通過在體外以EBV病毒轉化人B細胞(Cole等，1985，在單克隆抗體和癌治療中，Alan R.Liss公司PP.77-96)可以獲得人抗體。實際上，根據本發明還可以應用通過如下方法產生“嵌合抗體”(Morrison等，1984，美國國家科學院學報816851-6855；Nenberger等，1984，自然312604-608；Takeda等，1985，自然314452-454)的技術將來自小鼠的，對靶標蛋白質特異性的抗體分子的基因與來自人的，具有適當生物活性的抗體分子的基因拼接在一起；這種抗體包括在本發明的范圍之內。
此外，如果單克隆抗體較有利，也可以應用噬菌體顯示技術從大抗體文庫中將它們挑選出(Marks等，1992，生物化學雜志26716007-16010)。應用這種技術，已使達到1012不同抗體的文庫表達在fd絲狀噬菌體表面，在體外形成一個“單容器”(“Single pot”)抗體免疫系統，可用于選擇單克隆抗體(Griffiths等，1994，EMBO雜志133245-3260)。借助于本領域已知的技術可以從這文庫中選擇抗體，包括使此噬菌體與固定化的靶標蛋白質觸，選擇和克隆結合于此靶標的噬菌體，并且將編碼此抗體可變區的序列亞克隆進入表達所需抗體形式的適當載體內。
根據本發明，產生單鏈抗體的技術(美國專利4,946,778)可適合于產生對該靶標蛋白質特異性的單鏈抗體。本發明的另一個實施方案應用構建Fab表達文庫的技術(Huse等1989，科學2461275-1281)，使之能夠快速簡便地鑒定對該靶標蛋白質具有所需特異性的單克隆Fab片段。
應用本領域已知的技術可以產生包含該靶標蛋白質獨特型的抗體片段。例如，這類片段包括，但不限于可以通過胃蛋白酶消化抗體分子產生的F(ab’)2片段；可通過還原F(ab’)2片段二硫橋產生的Fab’片段；可通過用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子產生的Fab片段，以及Fv片段。
在產生抗體時，借助于本領域已知的技術例如ELISA(酶連免疫吸附檢測法)，可以實現對所需抗體的篩選。為了選擇對靶標蛋白質特異性的抗體，可以對產生的雜交瘤或噬菌體顯示抗體文庫檢測結合于該靶標蛋白質的抗體。
修飾蛋白質活性的方法直接修飾蛋白質活性的方法包括特別是，優勢負突變，特異性藥物(在本申請的意義上使用的)或一般的化合物，以及使用前面所述的抗體。
優勢負突變是對內源性基因或突變體外源性基因的突變，當這些基因在細胞內表達時會破壞所靶向蛋白質種類的活性。取決于所靶向蛋白質的結構和活性，存在一般性規則來指導選擇適當的方案，用于構建破壞靶標活性的優勢負突變(Hershkowits，1987，自然329219-222)。在活性單體形式的情況下，無活性形式的過度表達可引起對天然底物或配體的競爭，足以顯著地降低靶標蛋白質的活性。通過例如結合突變基因和增加活性的啟動子，優選地是可控制的或可誘導的啟動子，可以實現這種過度表達。按另一種方法，可以使活性位點的殘基發生改變，以致發生與靶標配體實際上不可逆的結合。以某種胰蛋白酶激酶，通過小心地取代活性位點絲氨酸殘基可達到此目的(Perlmntter等，1996，免疫學現代觀點8285-290)。
在活性多聚體形式的情況下，有幾種方案可以指導選擇優勢負突變體。通過編碼外源性蛋白質片段的基因表達，可以可控制地降低多聚體的活性，這種外源性蛋白質片段結合于多聚體的結合功能區，而阻止多聚體形成。另一方面，可控制地過度表達特定類型的無活性蛋白單位，可以阻礙無活性多聚體中的野生型活性單位，從而降低多聚體的活性(Nocka等，1990，EMBO雜志91805-1813)。例如，在二聚體DNA結合蛋白質的情況下，可以從DNA結合位點刪去DNA結合功能區，或者從激活單位中刪去激活功能區。在這種情況下，還可以使DNA結合功能區在沒有引起與激活單位結合的功能區的情況下被表達。從而，DNA結合位點被阻礙，沒有任何可能的表達活性。在特定類型的單位在活性期間正常地經受構象改變的情況下，剛性單位的表達可以使形成的復合物失活。如一個例子是，與細胞機制有關的蛋白質一般是由少數類型的許多亞單位結合組成，這些細胞機制包括例如細胞運動，有絲分裂過程，細胞構建等。這些結構對于包含幾個具有結構缺損的單聚體單位的損壞通常高度敏感。這種突變單位會破壞相關蛋白質的活性，并可以在細胞內可控制地被表達。
除了優勢負突變之外，借助于本領域熟知的誘變和篩選步驟，可以找到對溫度(或其它外源性因素)敏感的突變靶蛋白。
本發明的技術人員還將理解到，還可以將結合和抑制靶標蛋白的抗體的表達用作另一種優勢負突變策略。
已知特異性作用的藥物最后，通過暴露于藥物或配體可以可控制地改變某些靶標蛋白質的活性。在優選的情況是，已知某藥物僅與細胞內一個靶標蛋白相互作用，并且僅僅改變這一個靶標蛋白的活性。將細胞分級地暴露于不同量的藥物，從而引起對起源于此蛋白質的途徑分級的擾動。這種改變可以是降低活性或者增加活性。次優選情況是，已知所使用的某藥物以單獨的，不同的和非重疊的作用僅改變幾個(例如2-5個)靶標蛋白質的活性。分級暴露于這種藥物引起對起源于該靶蛋白質的幾種途徑的分級擾動。
5.5測定方法通過測定被藥物暴露或被途徑擾動改變的細胞成分獲得用于本發明的藥物應答和途徑應答。這些細胞特征可以是細胞生物狀態的任何方面。它們可以是測定其中RNA豐度的轉錄狀態，測定其中蛋白質豐度的翻譯狀態，測定其中蛋白質活性的活性狀態。這種細胞特征還可以是混合形式，例如其中起始特定生物途徑的一種或幾種蛋白質的活性，與在該起源蛋白質的途徑下游中細胞成分的RNA豐度(基因表達)一起被測定。此部分將描述用于測定藥物或途徑應答中細胞成分的方法。本發明也適應這種測定的其它方法。
基于測定藥物和途徑應答轉錄狀態的本發明實施方案是優選的。借助于將在下一小節中描述的與核酸或核酸模擬探針的序列雜交的技術，或者借助于在隨后的小節中描述的其它基因表達技術，可以測定這種轉錄狀態。但是所測定的結果是包括表示RNA豐度比率值的應答數據，它通常反映DNA的表達比率(在不存在RNA降解速度差異時)。這種測定方法在5.5.1節中被描述。
在本發明另一些不同的實施方案中，可測定不同于轉錄狀態的其它生物狀態方面，例如翻譯狀態，活性狀態，或混合形式。在此部分將描述這些實施方案的細節。在5.5.2節中描述這些測定方法。
5.5.1轉錄狀態測定優選地，通過與轉錄物陣列雜交構成了對轉錄狀態的測定，在本小節將對它進行描述。在本小節的后面描述了轉錄狀態測定的某些其它方法。
轉錄物陣列概述在優選實施方案中，本發明使用了“轉錄物陣列”(在此也被稱為“微陣列”(“microarrays”))。轉錄物陣列可被用于分析細胞中的轉錄狀態，特別是用于測定暴露于分級水平的待研究藥物或暴露于對所研究生物途徑分級擾動的細胞轉錄狀態。
在一個實施方案中，是通過使存在于細胞中，代表mRNA轉錄物的可測定標記的多核苷酸(例如從細胞總的mRNA合成的熒光標記的cDNA)與一個微陣列雜交來產生轉錄物陣列。微陣列是具有有序排列的結合(例如雜交)位點的表面，這些結合位點是對細胞或細菌基因組中許多基因，優選地是絕大多數或幾乎全部基因產物的結合位點。可以通過多種方式形成微陣列，下面將描述其中的幾種方法。但所產生的微陣列具有某些共同特征這些陣列是可以再生的，有可能對給定的陣列產生多拷貝，并容易互相比較。優選地此微陣列較小，通常小于5cm2，它們由在結合(例如核酸雜交)條件下穩定的材料制成。微陣列中某一給定的結合位點或獨特的一組結合位點將特異性地結合細胞中的單一基因產物。雖然每個特定的mRNA可能存在一個以上物理結合位點(此后稱位點)，但是為了敘述清楚，下面將假定存在單一位點。
應該理解到，當形成了與細胞RNA互補的cDNA，并在適當的雜交條件下與微陣列雜交時，對在相應于任何特定基因的陣列中位點的雜交水平，將反映細胞中從該基因轉錄的mRNA的優勢。例如，當將與細胞總mRNA互補的可測定標記(例如以熒光團標記)的cDNA對微陣列雜交時，對應于不是在此細胞內轉錄的基因(即能夠特異性結合該基因產物的)的陣列上的位點將具有少量信號或沒有信號(例如熒光信號)，并且對于它所編碼的mRNA具有優勢的基因將具有比較強的信號。
在優選的實施方案中，是將來自二種不同細胞的cDNAs對此陣列的結合位點雜交。在藥物應答的情況下，使一種細胞暴露于藥物，而另一種相同類型的細胞不暴露于藥。在途徑應答的情況下，使一種細胞暴露于途徑擾動，而另一種相同類型的細胞不暴露于途徑擾動。在途徑應答的情況下，使一種細胞暴露于途徑擾動，而另一種相同類型的細胞不暴露于途徑擾動。對來自這二種類型細胞每一種的cDNA作不同的標記，以致可以區分它們。在一個實施方案中，例如應用熒光素標記的dNTP合成了來自以藥物處理的(或暴露于途徑擾動的)細胞的cDNA，并且應用若丹明標記的dNTP合成了來自未作藥物暴露的第二種細胞的cDNA。當將這二種cDNA混合，并對微陣列雜交時，可對陣列上每個位點測定來自每組cDNA信號的相對強度，并且可檢測特定mRNA豐度的任何相對差異。
在上述的實例中，當熒光團被激發時，來自藥物處理(或途徑干擾)細胞的cDNA將發綠色熒光，而來自未處理細胞的cDNA將發紅色熒光。結果，當藥物處理對細胞中特定mRNA的相對豐度沒有直接或間接的作用時，mRNA在二種細胞中都同樣占優勢，對于逆轉錄，紅色標記的和綠色標記的cDNA也同樣占優勢。當對微陣列雜交時，對于各種RNA的結合位點將發出二種熒光團的波長特征(組合顯示出棕色)。對比之下，當以一種直接或間接增加細胞中mRNA優勢的藥物處理藥物暴露的細胞時，綠色熒光對紅色熒光的比率將增加。當藥物降低mRNA的優勢時，此比率將降低。
對于使用二種顏色的熒光標記和檢測以便確定基因表達改變的方案已有論述，例如Shena等1995，用互補性DNA微陣列定量監測基因表達的方式，科學270467-470，此文獻在所有場合下全部被引入作為參考。應用以二種不同熒光團標記cDNA的優點是，可以對二種細胞狀態中對應于每種陣列基因的mRNA水平進行直接的和內部控制的比較，由于實驗條件(如雜交條件)微小差異引起的改變將不會影響隨后的分析。但是還應承認，也可能使用來自單一細胞的cDNA，并且比較例如在藥物處理的或途徑干擾的細胞和未處理的細胞中特定mRNA的絕對量。
微陣列的制備微陣列是本領域已知的由一種表面組成，序列上與基因產物(例如cDNAs，mRNAs，cRNAs，多肽和它們片段)相對應的探針可以在已知的位置特異性地對此表面雜交或結合于此表面。在一個實施方案中，此微陣列是一種陣列(即矩陣)，其中每個位置代表對于一種由基因編碼產物(例如一種蛋白質或RNA)的一個分立的結合位點，并且對于該生物體基因組中絕大多數或幾乎全部基因產物的結合位點都存在于其中。在優選的實施方案，該“結合位點”(此后稱為“位點”)是一種核酸或核酸相似物，特定的同源cDNA可以特異性地對它們雜交。此結合位點的核酸或相似物可以是例如合成的寡聚體，全長度cDNA，比全長度稍短的cDNA，或基因片段。
雖然在優選的實施方案中，這種微陣列包含對于靶標生物體基因組中幾乎全部基因產物的結合位點，但是這種全面的包含不是必需的。通常該微陣列具有相當于基因組中至少大約50％基因的結合位點，常常是至少約75％，較通常的是至少約85％，更通常的是大于約90％，而最通常的是最少約99％。優選地，此微陣列具有對于與所研究藥物的作用相關的，或者在所研究生物途徑中的基因的結合位點?！盎颉北昏b定為優選地至少是50，75或90個氨基酸的一個開放讀框(ORF)，在生物體(例如如果是單細胞生物體)或在多細胞生物體的某一細胞中信使RNA從此讀框被轉錄。從由生物體表達的mRNA的數目，或者通過從良好特征化的基因組部分推斷，可以估算出基因組中的基因數量。研究中的有機體的基因組被測序時，就可以確定ORFs的數目，并可通過分析其DNA序列對mRNA編碼區進行鑒定。例如，已經對釀酒酵母基因組進行了完整地測序，并報告具有長度多于99個氨基酸的大約6275個開放讀框(ORFs)。對這些ORFs的分析表明，有588個ORFs很可能是規定蛋白質產物的(Goffean等，1996，具有6000個基因的生命，科學274546-567，此文獻全部被引入作為參考)。對比之下，估計人基因組包含大約105個基因。
制備用于微陣列的核酸如上面指出的，特定的同源cDNA與之特異性雜交的“結合位點”通常是附著于此結合部位的核酸或核酸相似物。在一個實施方案中，此微陣列的結合位點是對應于某生物體基因組中每個基因至少一部分的DNA多核苷酸。借助于例如聚合酶鏈反應(PCR)擴增來自基因組DNA，cDNA(例如借助于RT-PCR)，或克隆序列的基因區段可以獲得這些DNAs。根據已知的基因或cDNA序列選擇可導致獨特片段(即不與微陣列上任何其它片段共有相同鄰接序列的10個以上堿基的片段)擴增的PCR引物。計算機程序可用于設計具有所需特異性和最佳擴增特性的引物。參見例如Oligo版本5.0(國家生物科學)。在對應于非常長基因的結合位點的情況下，有時理想的是擴增靠近基因3’末端的區段，以致當使寡-dT觸發的cDNA探針對微陣列雜交時，比全長度短的探針將能夠有效地結合。微陣列上每個基因片段的長度典型地應在大約50bp與大約2000bp之間，更典型的是大約100bp-1000bp，而通常是大約300bp-800bp。PCR法是熟知的，已在例如如下文獻中被論述Innis等編輯，1990 PCR方案方法及應用指南，Academic出版公司SanDiego.CA，被全部引入作為參考。顯然，計算機控制的機器人系統對分離和擴增核酸是有用的。
產生用于微陣列核酸的另一種方法是通過應用N-膦酸或氨基磷酸化學過程人工合成多核苷酸或寡核苷酸(Froehler等，1996，核酸研究145399-5407；McBride等1983，四面體通訊24245-248)。合成的序列長度約15-500個堿基，更典型的是約20-50個堿基。在某些實施方案中，合成的核酸包括非天然堿基，例如次黃嘌呤核苷。如上所述，可用核酸相似物作為雜交的結合位點。適合的核酸相似物的一個例子是肽核酸(參見例如Fgholm等1993，服從Watson-Crick氫鍵原則的PNA對互補寡核苷酸的雜交，自然365566-568；還見美國專利No 5,539,083)。
在另一實施方案中，此結合(雜交)位點是由質粒或基因的噬菌體克隆(例如被表達的序列標志)，或者來自其的插入片段構成的(Nguyen等，1995，在鼠胸腺中通過陣列cDNA克隆的定量雜交檢測的差示基因表達，基因組29207-209)。在再一個實施方案中，結合位點的多核苷酸是RNA。
使核酸附著于固體表面將核酸或相似物附著于固體支持物，它可能是由玻璃，塑料(例如聚丙烯，尼龍)，聚丙烯酰胺，硝酸纖維素或其它材料。用于將核酸附著于一種表面的優選方法是印制在玻璃板上，如由Schena等在1995，用互補的DNA微陣列定量監測基因表達的式樣，科學270467-470中所概述的。這種方法特別適用于剝離cDNA微陣列。還參見Derisi等1996，用cDNA微陣列分析人癌中的基因表達式樣，自然遺傳學14457-460；Shalon等，1996，應用二種顏色熒光探針的雜交分析復合DNA樣品的DNA微陣列系統，基因組研究6639-645；以及Schena等1995，人基因組平行分析法；基于微陣列的1000個基因的表達。美國國家科學院學報9310539-11286。上述每篇文獻均被全部引入作為參考。
用于制備微陣列的第二種優選方法是通過制備高密度的寡核苷酸陣列。技術是已知用于產生包含幾千個互補于限定序列的寡核苷酸陣列的技術，在一種表面的限定位置，將光刻技術用于原位合成(參見Fodor等1991，光定向的可空間尋址的平行化學合成法，科學251767-773；Pease等1994，用于快速DNA序列分析的光定向的寡核苷酸陣列，美國國家科學院學報915022-5026；Lochhart等1996，通過對高密度寡核苷酸陣列的雜交監測表達，天然生物技術141675；美國專利No.5,578,832，5,556,752，和5,510,270，每篇文獻均全部引入人微言輕參考)，或者用于快速合成并沉積限定寡核苷酸的其它方法(Blanchard等1996，高密度的寡核苷酸陣列，生物傳感器和生物電子學11687-90)。當應用這些方法時，是直接在一種表面，如衍生化處理的載波電表面合成已知序列的寡核苷酸(例如20個基體)。通過所產生的陣列是冗余的，每個RNA可有幾個寡核苷酸分子?？梢赃x擇寡核苷酸探針交替地檢測拼接的mRNA。制備微陣列的另一種優選方法是應用噴墨印制法直接在一種固相表面合成寡核苷酸，如在如下專利中所描述的共同未決的申請美國專利申請號09/008,120，1998，1，16由Blanchard提交，標題是“應用溶劑微滴的化學合成”，在此全部被引入作為參考。
還可以應用其它一些方法制備微陣列，例如通過掩蓋法(Maskosand Sonthern，1992，核酸研究201679-1684)。主要是將任何形式的陣列，例如斑點印跡在尼龍雜交膜上(見Sambrook等，分子克隆-實驗室手冊(第二版)，1-3卷，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989，全部被引入作為參考)，雖然也可以使用并且也得到本領域技術人員的認可，但是制備的陣列將非常小，因為雜交容量比較小。
產生標記探針制備總RNA和Poly(A)+RNA的方法是已知的，已被概述在Sambrook等，同上中。在一種實施方案中，應用硫氰酸胍鹽裂解，隨后通過CsCl離心(Chirgwin等1979，生物化學185294-5299)，從本發明研究的不同類型細胞中提取RNA。借助于以寡-dT纖維素的選擇法(見Sambrood等，同上)選擇出Poly(A)+腺苷酸RNA。所研究的細胞包括野生型細胞，藥物暴露的野生型細胞，修飾的細胞和藥物暴露的修飾細胞。
通過寡dT引物或隨機引物逆轉錄從mRNA制備標記的cDNA，這二種方法都是本領域熟知的(見例如Klug和Berger 1987，酶學方法，152316-325)。可在有偶聯于可檢測標記的dNTP存在時進行逆轉錄，最優選的是用熒光標記的dNTP。按另一種方法，可以通過在有標記的dNTPs存在時體外轉錄雙鏈cDNA將分離出的mRNA轉變成所合成的標記反義RNA(Lockhart等1996，通過對高密度寡核苷酸陣列雜交監測表達，天然生物技術141675，被全部引入作為參考)。在另一些實施方案中，可以在沒有可檢測標記存在時合成cDNA或RNA探針，并隨后進行標記，例如通過摻入生物素化的dNTP，或rNTP，或者某些類似的方法(例如生物素與RNAs的光交連的psoralen衍生物)，隨后加入標記的鏈親和素(例如藻紅素偶聯的鏈親和素)或等效果的物質。
當使用熒光探記探針時，許多適合的熒光團是已知的，包括熒光素，麗絲胺，藻紅素，若丹明(Perkin Elmer cetns)，Cy2，Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy5.5，Cy7，Flnorx(Amershem)和其它一些(見例如Kricka，1992，非同位素DNA探針技術，Academic出版，San Diego.CA)。選擇具有不同發射光譜的幾對熒光團，以致可以方便地區分它們將有更高的價值。
在另一個實施方案中，使用了不同于熒光的標記。例如，可以使用放射活性標記，或一對具有不發射光譜的放射活性標記(見Zhao等，1995，高密度cDNA濾器分析法用于大批量，定量分析基因表達的新穎方法，基因156207；Pietu等1996，由高密度cDNA陣列定量雜交揭示的人肌肉內優選表達的新型基因轉錄，基因組研究，6492)。但是，因為放射活性微粒的分數，并隨之需要寬大空間的結合位點，所以使用放射性同位素是不大優選的實施方案。
在一個實施方案中，是通過在42℃將一個混合物與逆轉錄酶(例如Super SeriptTMII，LTI公司)共溫育60分鐘來合成標記的CDNA，此混合物包含0.5mM dGTP，dATP和dCTP加0.1mM dTTP加熒光脫氧核糖核苷酸(例如0.1mM若丹明110 UTP(Perken Elmer Cetus)或0.1mM Cy3 dUTP(Amersham))。
對微陣列雜交選擇核酸雜交和漂洗的條件，以致探針能夠特異性地結合于或者特異性地雜交于特定的陣列位點，也就是說，探針能夠雜交、雙螺旋化或結合于具有互補核酸序列的陣列序列位點，但是不雜交于具有非互補核酸序列的位點。如在此所使用的，如果當此較短的多核苷酸是小于或等于25個堿基，應用標準的堿基配對原則而沒有錯配，或者如果此較短的多核苷酸是大于25個堿基，面存在的錯配不大于5％，則認為一個多核苷酸序列與另一個多核苷酸序列是互補的。優選地此多核苷酸是完美地互補(沒有錯配)。通過進行一個包括陰性對照的雜交試驗可容易地證明，特異性的雜交條件可導致特異性的雜交(見例如Shalon等，同上，和Chee等，同上)。
最佳的雜交條件取決于標記探針以及固定化多核苷酸或寡核苷酸的長度(例如寡聚體對多核苷酸大于200個堿基)和類型(例如RNA，DNA，PNA)。對于核酸特異性(即嚴格的)雜交條件的一般參數被描述在如下文獻中Sambrook等，同上，以及Ausabel等1987，分子生物學現代方法，Green Publishing和Wiley-Interseience，紐約，被全部引入作為參考。當使用Schena等的cDNA微陣列，典型的雜交條件是在5×SSC加0.2％ SDS中65℃雜交4小時，隨后在低嚴格漂洗緩沖液(1×SSC加0.2％ SDS)中25℃漂洗，隨之在高嚴格漂洗緩沖液(0.1×SSC加0.2％ SDS)中25℃漂洗10分鐘(Shena等1996美國國家科學院學報9310 614)。例如在如下文獻中也提供了有用的雜交條件Tijessen 1993與核酸探針雜交Elsevier科學出版社，B.V，以及Kricka，1992，非同位素DNA探針技術，Academic出版，San Diego.CA。
信號檢測和數據分析當使用熒光標記探針時，優選地可借助于掃描共焦激光顯微鏡檢測每個轉錄陣列位點的熒光發射。在一個實施方案中，應用適當的激發線路對所使用的二種熒光團的每一種實施了單獨的掃描。按另一種方法，可以使用的激光是，它有可能在對二種熒光團特異的波長進行同時試樣顯示，并且可以同時分析來自二種熒光團的發射(見Shalon等1996，一種應用二色熒光探針雜交，用于分析復合DNA樣品的DNA微陣列系統，基因組研究6639-645，全部被引入作為參考)。在優選的實施方案中，是用具有計算機控制的X-Y級和顯微鏡物鏡的激光熒光掃描器掃描此陣列。以復線路混合氣體激光可達到連續激發二種熒光團的目的，借助于波長可使發射光分開，并用二個光電倍增管檢測。在Schena等1996，基因組研究6639-645和在此引用的其它一些文獻中描述了熒光激光掃描裝置。另外，Ferguson等1996，自然生物技術141681-1684描述的光纖維束也可用于同時監測在大量位點的mRNA豐度水平。
在優選的實施方案中，借助于計算機，例如應用對數字板的12位模擬量，記錄信號并進行分析。在一個實施方案中，先應用繪圖程序(例如Itijaak Graphics Suite)使掃描圖像去點綴，然后應用圖像網格化程序進行分析，對每個位點在每個波長形成一個平均雜交作用的電子數據表。如果必要，可以通過實驗確定二種熒光頻道之間對“串話干擾”(或重疊)的相關性。對于轉錄陣列上任何一個特寫的雜交位點，可以計算出二種熒光團發射的比率。此比率與同源基因的絕對表達水平無關，但是可用于其表達明顯地受給藥，基因缺失或任何其它試驗過程調制的基因。
根據本發明的方法，對二種細胞或細胞系mRNA的相對豐度被計分表示為所確定的擾動和它的大小(即對于被測試的二種來源的mRNA其豐度是不同的)，或者表示為沒有受干擾(即相對豐度相同)。如在此使用的，在二種來源的RNA之間至少有大約25％的差異(從一種來源的RNA比另一種來源的RNA豐度多25％)被記分為擾動，而比較通常是大約50％，甚至常常多大約2倍(2倍的豐度差異)，3倍(3倍的豐度差異)，或5倍(5倍的豐度差異)。目前的檢測方法能夠可靠地檢測大約3倍-5倍數量級的差異，但是預期將發展更靈敏的方法。
優選地除了鑒定擾動是陽性或陰性之外，最好還能確定擾動的大小。如上所述，通過計算用于不同標記的二種熒光團的發射比率，或者通過本領域技術人員顯而易見的類似方法可以實現此目的。
對途徑應答的測定在本發明的一個實施方案中，通過將各對應(即互補)于所研究的不同細胞mRNA的二種不同標記探針的混合物對微陣列雜交，形成了可反映所研究細胞轉錄狀態的轉錄陣列。根據本發明，這二種細胞是相同類型的，即相同的種或株，但是少數基因座(例如一個，二個，三個或五個，優選地是一個)可能在遺傳上有差別。另一種情況是，它們是同源的，而它們的環境歷史不同(例如暴露于藥物與沒有暴露比較)。
為了測定途徑應答，可在對所研究的途徑存在分級擾動時制備或培養細胞。暴露于擾動的細胞和未暴露于擾動的細胞被用于構建轉錄陣列，測定此陣列，以便發現由于暴露于藥物具有表達改變的mRNA及改變的程度。因此，得到了途徑應答。
分級藥物暴露和分級擾動控制參數水平的密度受單個基因應答的鮮明度和結構控制-應答的一部分越急劇、最急劇時，為了適當地分辨此應答需要越濃密的水平。通過圖3的實例大致地指示了此示范性密度。在此，對氨甲喋呤100倍濃度范圍的6種暴露正好是以分辨基因表達應答。但是，對這種途徑更精細的應答有更多的暴露是優選的。
進而，為了減少實驗誤差，在二種顏色的差異性雜交實驗中交換熒光標記是優選的，這樣可以減少為單個基因或陣列點位置所特有的偏差。換句話說，優選地是，首先測定來自二種被測定細胞中具有一種標記的mRNA基因表達(例如以第一種熒光染料標記受干擾的細胞，以第二種熒光染料標記未受干擾的細胞)，然后測定來自具有相反標記細胞的基因表達(例如以第二種熒光涂料標記的受干擾細胞，以第一種熒光染料標記的未受干擾的細胞)。在暴露水平和擾動控制參數水平內進行多次測定，可提供附加的實驗誤差控制。當在應答函數中選擇用于在均衡誤差和喪失結構之間插入應答數據的仿樣函數S寬度時，以適當的取樣可能形成一個折衷選擇。在藥物暴露和擾動控制參數間隔內作大約10次測定，以相反的熒光標記重復一遍，二者合起來，每個藥物應答或擾動應答需要大約20次雜交實驗，這樣可對途徑以及它們的成員基因和蛋白質得到可靠的鑒定。
對藥物應答數據的測定為了測定藥物應答數據，將細胞暴露于分級濃度的所研究的藥物或候選藥物。當在體外培養細胞時，通常是將此化合物加到它們的營養培養基中，對于酵母菌，優選地是在對數生長早期收獲酵母細胞，因為表達式樣對那里的收獲時間相對不敏感。以分級的含量加入藥物，取決于藥物的特征，但通常是大約1ng/ml-100ng/ml。在某些情況下是將藥物溶解于溶劑中，如DMSO。
將暴露于藥物的細胞和不暴露于藥物的細胞用于構成轉錄陣列，對它們進行測定，以便發現由于暴露于藥物具有改變表達的mRNA。從而獲得藥物應答。
類似于對途徑應答的測定，在二色差異性雜交的情況下，也以相反的標記進行測定，對于藥物應答也是優選的。同樣優選的是，所用的藥物暴露水平對藥物應答的快速改變區提供了足夠的分辨能力(例如通過應用大約10個藥物暴露水平)。
轉錄狀態測定的其它方法還可借助于本領域已知的其它基因表達技術測定細胞的轉錄狀態。這樣的幾種技術可產生被限定復雜性的限制性片段混合物，用于電泳分析，例如，雙限制性酶消化與定相引物結合的方法(見例如歐洲專利0 534858 A1，1992年9月24日由Zabean等提交的)，或者選擇具有最靠近所確定mRNA末端位點的限制性片段的方法(見例如Prashar等1996，美國國家科學院學報93659-663)。另一些方法是對cDNA混合物進行統計學取樣，例如通過對每個多cDNA測序足夠的堿基(例如20-50個堿基)，以便鑒定每個cDNA，或者通過測序在相對于所確定mRNA未端已知位置產生的短標志(例如9-10個堿基)(見例如，Velculescu，1995，科學270484-487)。
5.5.2對生物狀態其它方面的測定在本發明不同的實施方案中，為了得到藥物應答和途徑應答，可以測定除了轉錄狀態以外的另一些生物狀態，例如翻譯狀態，活性狀態，或混合的形式。在此節將描述這些實施方案的細節。
基于翻譯狀態測定的實施方案可以按照幾種方法實施對翻譯狀態的測定。例如，通過構建一個微陣列可實施蛋白質的全基因組監測(即，“Proteome”，Goffeau等，同上)，此微陣列中其結合位點包含對該細胞基因組編碼的多種蛋白質特異性的固定化抗體，優選的是單克隆抗體。優選地，存在的抗體是針對所編碼蛋白質的基本組分，或者至少是針對與所研究的藥物作用相關的那些蛋白質。制備單克隆抗體的方法是熟知的(見例如Harlow和Lane，1988，抗體實驗室手冊，冷泉港，紐約，全部被引入作為參考)。在優選的實施方案中，是針對根據該細胞基因組序列設計的合成肽片段產生單克隆抗體。以這樣一種抗體陣列，使來自該細胞的蛋白質與此陣列接觸。
按另一種方法，可借助于雙向凝膠電泳系統使蛋白質分離。雙向凝膠電泳是本領域熟知的，典型地包括沿著第一向的等電聚焦，隨之沿著第二向的SDS-PAGE電泳。見例如Hames等1990，蛋白質凝膠電泳實踐入門，IRL出版，紐約，Shevchenko等1996，美國國家科學院學報931440-1445；Sagliocco等1996，酵母菌121519-1533；Lander，1996，科學274536-539。所形成的電泳圖譜可借助于多種技術進行分析，包括質譜技術，應用多克隆抗體和單克隆抗體的蛋白質印跡分析和免疫印跡分析，以及內部和N-端微測序。應用這些技術，有可能鑒定在給定生理狀態下產生的所有蛋白質的基本組分，包括暴露于藥物的細胞中(例如酵母菌中)，或者由例如特定基因缺失或過度表達所改變的細胞中的生理狀態。
基于生物狀態其它方面的實施方案雖然監測除mRNA豐度以外的細胞成分目前還存在某些在監測mRNAs中未遇到的技術困難，但是，本領域的技術人員都明了，本發明方法的用途，包括途徑擾動不同的已知方法的應用，也適用于可被監測的任何一種細胞成分。
特別是，在與藥物作用特征有關的蛋白質活性可以被測定的情況下，本發明的一些實施方案可以基于這些測定。通過適合于被特征化的特定活性的任何功能性的，生物化學的，或物理的手段，可以實現這些活性測定。在此活性包括化學轉變的情況下，可以使此細胞蛋白質與天然底物接觸，并測定這種轉變速度。在此活性包括多聚體單位中的締合時，例如激活的DNA結合復合體與DNA的締合，可以測定締合蛋白質的含量或此締合作用的繼發性結果，如被轉錄的mRNA含量。還有，在已知唯一的功能活性時，例如在細胞周期控制中，可以觀測這種功能的表現。然而蛋白質活性中的這些已知的和被測定的改變可構成借助于本發明前述方法分析的應答數據。
在另一個非限制性實施方案中，應答數據可由細胞生物狀態的混合形式構成。例如生物應答數據可以由某些mRNA豐度的改變，某些蛋白質豐度的改變，以及某些蛋白質活性的改變構成。
5.6對藥物發現的應用本發明在藥物發現領域具有多種用途，在這里將提供一些用途。在一種應用中，本發明提供了一種方法，用于確定其推定的作用途徑已經被鑒別確定的候選藥物作用的其它生物途徑。如前面指出的，藥物開發常常包括試驗許多化合物對已知生物途徑的特殊作用，例如起源于一克隆的基因序列或者分離的鹽或蛋白質的途徑。在此方法中，雖然鑒定了明顯影響此假定途徑的候選藥物，但是只得到了很少或沒有得到關于該藥物作用特異性(例如受影響的其它生物途徑是什么)的信息，或者關于該藥物對受影響途徑的特定作用的信息。本發明的方法可提供這種信息。
例如，倘若有一個似乎影響某假定生物途徑的候選藥物，可以應用本發明的方法證實此假定途徑確實是藥物作用的途徑，以及用于開發對此假定途徑更特異性的(即，更途徑特異性的)藥物(例如理想的藥物)，此藥物幾乎不影響除了所希望的假定途徑以外的生物途徑。通過直接采用在5.2節概述的，在5.3節具體描述的方法(特別是參照圖5)可以達到此應用目的。因此，一方面通過如下步驟可達到此目的(i)對于所研究的藥物或候選藥物測定藥物應答數據；(ii)對于藥物作用的假定生物途徑測定擾動應答(例如，如果此生物途徑起源于基因，那么可以按分級的方式控制此基因的表達)；(iii)盡可能最佳地將假定的藥物作用途徑的途徑應答數據表示為藥物應答數據；以及(iv)評估這種表示法的顯著性，以便確定是否已充分地表現了藥物的顯著作用，并證實此假定的途徑確實是此藥物作用的途徑。
如在上面關于步驟507中所詳述的，如果使細胞暴露于藥物同時暴露于對假定途徑的擾動可導致對此途徑細胞成分應答的干擾作用，那么表示此途徑確實是該藥物作用的途徑。換句話說，可評估這種組合應答以便確定與圖7B中顯示的相比較是否它更象圖7A中顯示的。另一方面，如果這種組合暴露的作用主要是附加性的(如在圖7B顯示的)，那么表明此假定的途徑不是藥物作用的途徑，如果發現通過途徑應答數據對藥物應答數據的最佳表示法是高度顯著性的，例如具有95％的顯著性閾限，那么表明此候選藥物對假定的生物途徑是高度特異性的(對其它的生物途徑，如起源于其它基因或基因產物，或者基因產物活性的生物途徑很少或沒有直接的作用)。另一方面，如果發現這種表示法沒有足夠的顯著性，那么表明其它的生物途徑受到了所研究藥物或候選藥物的影響。
在細胞中的其它生物途徑受到影響的后一種情況下，可對候選藥物的結構進行修飾(例如應用制藥學或藥物化學領域熟知的有機合成法)，或者可以對密切相關的化合物進行鑒定，等，并按照本發明進行試驗，直到鑒定出對于假定的途徑更具途徑特異性的(即幾乎不影響除假定途徑以外的途徑)藥物(或者甚至是只影響假定途徑的理想藥物)。
在另一種應用中，可應用本發明的方法，通過對一批化合物的所有的細胞生物途徑進行鑒定，從一組候選的化合物中挑選出具有最高途徑特異性的一個或幾個藥物。通常，具有最高途徑特異性的藥物將是只直接影響其預期途徑的藥物。當不知道預期的途徑時，那么與影響較多途徑的藥物相比較，影響最少途徑的藥物就很可能是更具途徑特異性的，而是優選的候選藥物。具有高特異性(即高途徑特異性)的藥物是所希望的藥物，因為這種藥物在對病人給藥時將很可能具有較少的副作用。
在進一步的應用中，對于一種對細胞(或對病人)具有已知生物作用，但不知道其作用機制或途徑的藥物，可以應用本發明鑒定它的作用途徑。通過鑒定具有理想治療活性的藥物作用途徑，有可能鑒定具有類似治療活性的化合物。在這種應用中，使藥物應答數據與很可能受此藥物影響的一組途徑擬合，或者與從途徑一覽表中簡單地抽出的途徑擬合，并確定最佳擬合藥物應答的途徑組合。相反地，可以用本發明的方法鑒定影響細胞中以前確定的特定生物途徑的，或者影響特定途徑組合的化合物。在這種應用中，需確定藥物應答數據對途徑應答數據(或途徑應答數據的組合)最佳擬合的顯著性，以便觀察它是否符合一定的顯著性閾限。
在還有另一種應用中，該方法用于鑒定“第二級藥物座位”。第二級藥物座位是間接受給藥影響的任何類型的細胞成分(如基因或基因產物或者基因產物的活性)。是根據如下事實對它們進行鑒定，它們相當于對途徑應答數據具有正或負擾動的細胞成分，但是不直接受藥物的影響。例如，第二級藥物座位包括起源于直接受影響藥物靶標的生物途徑中的細胞成分(排除直接受影響的起源性靶標細胞成分)。鑒定第二藥物座位對藥物設計是有用的。如上面所述，細胞的適應性機制通常可確保一種細胞成分的改變(例如基因或基因產生，或者基因產物的活性改變)，將通過其它細胞成分的表達和/或活性改變受到補償。
承認這種代償性改變提供了一種藥物介入的新方法，如下所述通常認為疾病是由于起源該途徑的細胞成分(如宿主或病源體的基因)的異常表達引起此生物途徑異常激活的結果。傳統的藥物介入方法尋求通過在此主要的起源性細胞成分起作用來調整異常的途徑活性。但是，本方法鑒定作為細胞成分的第二級藥物座位，如基因或基因產物，當某一途徑直接受影響時，藥物間接地影響第二級藥物座位(例如通過作為受影響生物途徑的一部分)。應用這種信息，有可能發現影響第二級細胞成分的藥物，提供治療疾病的另一種方法(以及更大的一批潛在性藥物作用途徑)。
例如，如果疾病狀態中細胞成分X被表達不足，那么傳統的治療目標是恢復X的表達，并且可能會認同通過直接影響X表達實現此結果的藥物。但是，本發明的方法使有可能鑒定具有X作為第二級藥物座位的其它細胞成分，正是這些其它的細胞成分起源了包括X的途徑，它們也受到藥物作用的影響。成分X的正確表達從而將由藥物對這些途徑的作用引起。因此，可以鑒定如果被抑制或激活將產生所需治療效果的第二級途徑(例如起源于蛋白質或蛋白質活性的途徑)，并且可以鑒定不同于通過直接作用于X，而是影響這些其它的途徑以便達到所需治療效果(例如恢復對X的表達)的藥物。
在另外的一些應用中，本發明可被用于通過將所研究的藥物與具有相似治療作用的其它藥物相比較，鑒定介導所研究藥物治療作用或副作用的生物途徑，如果二種藥物對病人或動物疾病模型的相同疾病或障礙表現出類似的治療效果，則可認為它們二者具有類似的治療作用。常常發現已知具有相似或密切相關治療效果的藥物對相同的生物途徑起作用。因此，可以將本發明的方法用于確定受所研究藥物影響的，并且也受具有類似治療作用的第二種藥物影響的途徑。對二種藥物共同的途徑是很可能介導所研究藥物(并且也是第二種藥物的)治療作用的那些途徑。通過比較對具有類似治療作用的補充藥物確定的共同途徑，可以進一步限定或發現介導所研究藥物治療作用的途徑。
類似地，通過本發明的方法可以確定受藥物影響的，介導副作用的途徑。按照本發明，可以確定受所研究藥物影響的，和受具有類似治療作用的第二藥物影響的途徑。還不是第二藥物途徑的所研究藥物的途徑，很可能是介導所研究藥物副作用的途徑。通過比較對具有類似治療作用的補充藥物確定的共同途徑，可以更肯定地鑒定介導所研究藥物副作用的途徑。任選地，通過下一步應用前述的步驟，改進所研究藥物的特異性以便刪除介導作用的途徑，可以鑒定出更具途徑特異性的所研究藥物的衍生物。
當用于本發明方法的細胞是非人類的真核生物細胞，例如酵母細胞時，常?？赡芨鶕幬飳Ψ侨祟惣毎淖饔猛茰y對人細胞的作用。這部分地是由于如下事實，在絕大多數真核生物中大部分基因都具有相似功能的同源物。如上面所指出的，在人類遺傳性疾病人，被鑒定為有缺損的幾乎半數蛋白質顯示出與酵母菌蛋白質的氨基酸相似性。還有報導，已知引起人類疾病的所有基因的大約80％在新桿秀麗線蟲中具有同源物(“討論用于功能基因分析技術的專家推測”，基因工程新聞16、1996，11，15)。
還有另一些應用，是可以將本發明的方法用于確定不同藥物作用的相似性。這種應用適合于特殊情況，其中被定標擬合藥物應答數據的途徑數目等于單數，即等于1。因此，在特定的實施方案中，R表示在此被稱為藥物R的“擾動”藥物的應答，將此應答與由在此被稱為藥物D產生的應答D相比較。從等式8和9得到的相關系數，或者按另一種方式，從等式6得到的最小二乘方殘數提供了此二個藥物作用相似性的定量測定。
由于如下原因，比較藥物應答的本方法顯著優于根據單濃度測定的相關方法。研究的二個藥物，藥物D和R可能具有相同的作用途徑，但是具有不同的效力。在一個濃度的測定因此只能在一個滴定水平取樣試驗藥物應答曲線，如在圖2A中顯示的曲線。一般地說，對應于藥物D給定濃度的滴定水平將不同于對應于藥物R相同濃度的滴定水平。例如，對藥物D的測定可能相當于圖2A中的滴定水平1，而對藥物R的測定可能相當于滴定水平4。因此對于藥物D僅觀察到基因G1和G2的改變，面對于藥物R將觀察到所有基因G1-G6的改變。結果是，藥物D和R應答的相似性將不像下述情況那樣很明顯如果對于藥物D和藥物R都從0濃度至飽和取樣試驗整個應答曲線，并且借助于如上面5.3.1節所述的定標轉換發現了最佳相關性。
這種對藥物相似性的優越測定法可能作為一種基礎，例如用于將新化合物歸類于由現存化合物所確定的種類中，包括基于這種分類識別可能的治療作用或毒性作用。這種對藥物相似性的優越測定法還可能作為基礎用于對新的或現有的化合物進行分類，以便減少冗長的化合物文庫或列表，或者支持對如下問題作出決定篩選什么化合物，或者對于特定化合物將選取其它什么作用。
6實施例作為對上面所述發明的說明而不是對前面所述內容的限制，將提供如下通過已知特定作用藥物的途徑擾動實施例。在此實施例中，通過將細胞分級暴露于環孢菌素A(“CyA”)和氨甲喋呤(“Mtx”)限定了途徑，并且確定了“未知”藥物，在此是FK506的作用途徑。
作為背景材料，CyA的作用是直接抑制鈣神經素，可以被用于限定起源于鈣神經素的途徑。Mtx的作用是直接抑制DHFR(二氫葉酸還原酶)蛋白，也可以被用于限定起源于這種蛋白質的途徑。FK506也是鈣神經素蛋白的特異性調節劑，它通過一個具有FK506結合蛋白的復合物對此蛋白質起作用(Cardenas等，1994，作為模擬T細胞的酵母菌，藥物發現和設計的前景2103-126)。
按如下詳述實施了在圖8A-C中顯示的基因表達測定。為了制作環孢菌素劑量應答曲線，將釀酒酵母R506株(基因型Mat a ura3-52 lys 2-801 ade 2-101 trp 1-Δ63 his 3-Δ200 leu 2-Δ1 his3∷HIS3)培養過夜的起始培養物以YAPD加10mM CaCl2的培養基稀釋至200ml(見例如，Ausubel等編著，1996，分子生物學現代方法，John Wiley & Sons公司，特別是第13章)，形成DO600為0.1并在30℃以300rpm速度振搖培養。30分鐘之后對培養物加入溶于乙醇的環孢菌素A，達到60，30，15，6和3μg/ml的最終濃度。對照培養物以正好相同體積的乙醇處理。通過OD600監測細胞培養，在OD600＝1.4±0.1時收獲細胞，借助于在Sorvall Rc5C+離心機SLA-1500轉子中室溫下離心2分鐘。棄去上清液，并吸去殘留的液體，將細胞再懸浮于4ml RNA提取緩沖液(0.2M Tris HClpH7.6，0.5M NaCl，10mM EDTA，1％ SDS)中。放置攪拌3秒鐘使細胞沉淀再懸浮，然后立即轉移至其中加有2.5g烘干玻璃微珠(425-600μm)和4ml苯酚∶氯仿(50∶50 v/v)的50ml圓錐形離心管中。先將此離心管在VWR多管渦旋器中，設定8檔攪拌2分鐘，然后在Sorvall T600D型臺式離心機中，3000rpm室溫下離心5分鐘進行相分離。以等體積苯酚∶氯仿(50∶50 v/v)。通過設定6檔攪拌30種，隨后同上離心，對水相作再提取。對水相加入2.5倍體積乙醇，并將此樣品貯存于-80℃等待分離polyA+mRNA。
為了制作FK506劑量應答曲線，再仿效上述程序，不同的是溶解于乙醇中的FK506被加到培養物中，最后的濃度是10，3.1，1.0，0.31，0.10μg/ml。
為了制作氨甲喋呤劑量應答曲線，將釀酒酵母By 4741株(基因型Mat a his3ΔO len2DO ura3Δ0 met15Δ0)培養過夜的起始培養物以SC培養基稀釋至200ml(見例如Ausubel等，第13章)，形成OD600為0.1，并在30℃以300rpm速度振搖培養。30分鐘之后，對培養物加入溶于水中的氨甲喋呤，達到最后濃度200，100，50，25，6.2和3.1μM。對照培養物以相同體積的水處理。其余的步驟同上。
對于所有的上述情況，都是借助于標準的方案(見例如Sambrook等1989，分子克隆，實驗室手冊，冷泉港實驗室出版)通過寡-dT纖維素層析法應用兩次選擇分離出poly A+RNA。如前面5.5.1節中所述的，將2μg poly A+RNA用于逆轉錄反應。也如前面5.5.1節中所述的將cDNA純化，并對聚賴氨酸玻片雜交。通過使用AppliedPrecision公司生產的標準型多框架CCD攝像機滑動裝置掃描確定雜交的程序。對圖象進行信息學處理，并輸入至Inpharma數據庫中，應用Mat Lab數據分析包進行分析。
圖8C顯示通過一系列FK506暴露得到的藥物應答數據。此圖的橫座標是藥物暴露數值，縱座標是受FK506影響的大多數基因表達率的對數值。圖8A顯示對于起源于鈣神經素的途徑，由一系列CyA暴露得到的途徑應答數據。此圖和圖8B具有途徑擾動控制參數值，在此情況下它是橫座標上的藥物暴露水平，在縱座標上具有受這些藥物影響的大多數基因表達率的對數值。圖8B顯示對于起源于DHFR(二氫葉酸還原酶)蛋白的途徑，由一系列Mtx暴露得到的途徑應答數據。
以所測定的由分級暴露于CyA或Mtx(分別暴露)引起的途徑應答的線性總和模擬了“未知”藥物FK506，形成了包括起源于鈣神經素和起源于DHFR的最少途徑的組合應答。圖8D顯示相關系數曲線，通過以FK506應答與CyA和氨甲喋呤組合途徑應答的全基因組相關性對用于FK506數據的定標參數的不同值作圖得到此曲線。按照5.3.1節描述的方法，特別是根據等式8和9得到了此相關系數?；厥盏酱蠹s是63的FK506和Cyc A近似相對效力，如圖8D中顯示的相關性峰值位置。
表I列出了FK506和CyC A應答共同的一批基因。這些基因被鑒定為具有在藥物和途徑應答曲線之間的相關系數的基因，對于這種基因至少0.9位于定標參數(63)的值，給出最大的全基因組相關性。按照等式9將這些相關系數計算為ρk(63)，在此下標‘k’對應于一個特定基因。無論Mtx途徑應答是否被加到求最小值的過程中，這些相關的基因都是相同的，表明在組合應答中鑒定一種途徑的能力。
表1
此實施例表明本發明方法的有效性，其中可容易地鑒定了定標參數的最大值和恒定的一批被鑒定的基因。
在此實驗中，對于數值分析線性地加入了Cyc A和氨甲喋呤應答(如前面所述)，在同時暴露于二個藥物的真實情況下，可能需要對此模式藥物應答加入非線性項。
7.被引用的參考文獻在此引用的所有參考文獻均以其完整形式全部同樣程度地被引入作為參考，如同每單一刊物或專利或者專利申請被特別地和單獨指出將以其完整形式全部被引入作為參考。
按照本發明的構思和范圍可以作出本發明的許多修改和變化的形式，這對于本領域的技術人員是顯而易見的。在此所述的特定實施方案僅作為實例被提供，并且，本發明將僅僅通過所附的權利要求加以限制，除此之外還有這些權利要求的等效形式的全部范圍。
權利要求
1.一種鑒定參與一種細胞類型中藥物作用的生物途徑的方法，包括(a)提供該藥物在此細胞類型中的藥物應答，該藥物應答已通過包括在對該藥物的多種暴露水平下測定此細胞類型中多種細胞成分的方法獲得；(b)將一種模式藥物應答表示為該細胞類型中一種或幾種生物途徑應答的組合，其中該細胞類型中的生物途徑應答是一種方法的結果，此方法包括在對該生物途徑的多種擾動水平測定所述細胞類型細胞中生物途徑的細胞成分，并且其中該組合中所述一種或幾種生物途徑應答的每一種須經單獨的定標轉換；以及(c)確定該一種或幾種生物途徑應答的最佳定標轉換，它可使所提供的藥物應答與所述模式藥物應答之間差異的目標函數值最小化，其中該一種或幾種生物途徑應答的組合，在最佳定標轉換條件下可鑒定參與該細胞類型中此藥物作用的生物途徑。
2.權利要求1的方法，其中的確定步驟(c)進一步包括確定該目標函數的真實最小化值，該目標函數的真實最小化值是從所提供的藥物應答和該模式藥物應答確定的目標函數的最小化值，并且其中所述的方法進一步包括在步驟(c)之后，通過一種方法檢驗此一種或幾種生物途徑的所述最佳定標轉換的統計學顯著性的步驟，此方法包括(d)獲得該目標函數最小化值的預期概率分布，以及(e)依據該目標函數真實最小值的預期概率分布，評價該目標函數其實最小化值統計學顯著性。
3.一種鑒定參與一種細胞類型中藥物作用的生物途徑的方法，該方法包括確定一種或幾種生物途徑應答的最佳定標轉換，它可使所提供的藥物與應答與模式藥物應答之間差異的目標函數值最小化，其中(a)所述一種或幾種生物途徑是一種方法的結果，此方法包括在對該生物途徑的多種擾動水平測定該細胞類型細胞中一種或幾種生物途徑的細胞成分；(b)通過一種方法提供這種所提供的藥物應答，此方法包括在對該藥物的多種暴露水平測定該細胞類型細胞中的多種細胞成分；以及(c)將所述模式藥物應答表示為該一種或幾種生物途徑應答的組合，該組合中所述一種或幾種生物途徑應答的每一種須經單獨的定標轉換，其中該一種或幾種生物途徑應答的組合，在最佳定標轉換條件下可鑒定參與該細胞類型中此藥物作用的生物途徑。
4.權利要求2的方法，其中獲得所述目標函數最小值預期概率分布的步驟包括(i)通過相對于對所述一種或幾種生物途徑的所述多種擾動水平隨機化一種或幾種生物途徑應答，而相對于所述多種藥物暴露水平隨機化藥物應答，并隨機化所述模式藥物應答；(ii)通過尋找到該一種或幾種隨機化的生物途徑應答的最佳定標轉換，確定該目標函數的理論最小值，此最佳定標轉換可使所述隨機化的藥物應答與隨機化的模式藥物應答之間差異的目標函數最小化；以及(iii)重復步驟(i)和(ii)，以便確定多個理論最小值，此多個最小值形成所述最小化值的預期概率分布。
5.權利要求1或3的方法，進一步包括通過一種方法驗證所述一種或幾種生物途徑確實是參與在該細胞類型中藥物作用的生物途徑的步驟，此方法包括從第一模式應答和第二模式應答中選擇一種行為與組合的藥物-擾動應答最相似的模式應答，其中(i)通過一種方法提供所述組合的藥物-擾動應答，此方法包括測定同時暴露于一種或幾種該藥物的暴露水平和一種或幾種所述一種或幾種生物途徑擾動水平的該細胞類型細胞中的多種細胞成分；(ii)該第一模式應答包括在最佳定標轉換下所述一種或幾種生物途徑應答的組合，此最佳定標轉換是按一個或幾個第一總數估算的，每個第一總數是最佳定標轉換下一個或幾個藥物暴露水平中的一個，與一個或幾個對該生物途徑擾動水平中一個的總和，(iii)該第二模式應答包括一個或幾個第二總數，每個第二總數在按一個或幾個對該生物途徑擾動水平中的一個估算的最佳定標轉換條件下，是按一個或幾個藥物暴露水平中一個估算的藥物應答與該一個或幾個生物途徑應答組合的總和，其中如果選擇第一模式應答，則可驗證所述一個或幾個生物途徑為確實參與該細胞類型中藥物作用的生物途徑。
6.權利要求1或3的方法，進一步包括將存在于藥物應答中的細胞成分指定屬于所述一種或幾種生物途徑中一種的步驟，其中該細胞成分的生物途徑應答在其最佳定標的條件下具有與該細胞成分的藥物應答最大的相關性。
7.權利要求1或3的方法，其中所述定標轉換包括將所述的藥物暴露水平轉換成對所述生物途徑相應的擾動水平。
8.權利要求7的方法，其中的轉換是通過線性作圖完成的。
9.權利要求1或3的方法，其中是通過選擇對所述定標轉換最佳的一組參數將所述目標函數最小化。
10.權利要求1或3的方法，其中所述目標函數包含在對該藥物暴露水平的藥物應答與在該藥物暴露水平的模式藥物應答差的平方和，并進一步須經所述定標轉換。
11.權利要求1或3的方法，其中的目標函數包含該藥物應答和模式藥物應答相關數的負值。
12.權利要求1或3的方法，其中是在對所述生物途徑的擾動水平，通過包括插入所測定值的方法提供所述生物途徑應答。
13.權利要求12的方法，在此所述的插入包括通過仿樣函數和的近似法。
14.權利要求12的方法，在此所述的插入包括通過Hill函數的近似法。
15.權利要求1或3的方法，其中該細胞類型中的一種或幾種生物途徑被選擇作為很可能參與該細胞類型中藥物作用的生物途徑。
16.權利要求1或3的方法，其中的一種或幾種生物途徑是選自該細胞類型存在的生物途徑一覽表。
17.權利要求1或3的方法，其中所述的細胞類型是基本上與釀酒酵母等基因的細胞類型。
18.權利要求1或3的方法，其中所述細胞成分包括存在于該細胞類型中的多種RNA的豐度。
19.權利要求18的方法，其中是通過一種方法測定該多種RNA的豐度，此方法包括使一個基因轉錄陣列與來自該細胞類型細胞的RNA，或者與由其得到的cDNA接觸，其中的基因轉錄陣列包括一個具有所附著核酸或核酸相似物的表面，該核酸或核酸相似物能夠與所述多種RNA，或者與由其得到的cDNA雜交。
20.權利要求19的方法，其中是通過一種方法實施步驟(a)中對細胞成分的測定，此方法包括使一種或幾種基因轉錄陣列(i)與RNA，或者與由其得到的cDNA接觸，此RNA是來自被暴露于該藥物的所述細胞類型的細胞，以及(ii)與RNA，或者與由其得到的cDNA接觸，而此RNA是來自未被暴露于該藥物的所述細胞類型的細胞，并且其中是通過一種方法實施步驟(b)中對細胞成分的測定，此方法包括使一種或幾種基因轉錄陣列(i)與RNA，或者與由其得到的cDNA接觸，此RNA是來自被暴露于對所述一種或幾種生物途徑擾動的該細胞類型的細胞，以及(ii)與RNA，或者與由其得到的cDNA接觸，而此RNA是來自未被暴露于所述擾動的該細胞類型的細胞。
21.權利要求1或3的方法，其中所述的細胞成分包括存在于該細胞類型中多種蛋白質的豐度。
22.權利要求21的方法，其中是通過一種方法測定該多種蛋白質的豐度，此方法包括使一種抗體陣列與來自該細胞類型細胞的蛋白質接觸，其中所述的抗體陣列包括具有附著抗體的表面，該抗體能夠與所述多種蛋白質結合。
23.權利要求21的方法，其中是通過一種方法測定該多種蛋白質的豐度，此方法包括對來自該細胞類型細胞的蛋白質實施雙向電泳。
24.權利要求1或3的方法，其中所述的細胞成分包括存在于該細胞類型中的多種蛋白質的活性。
25.權利要求1或3的方法，其中該細胞類型中的所述一種或幾種生物途徑包括起源于一種或幾種特定細胞成分的生物途徑，并且其中是通過包括修飾所述一種或幾種特定細胞成分的方法實施對該生物途徑的擾動。
26.權利要求25的方法，其中是通過一種方法修飾所述一種或幾種特定的細胞成分，此方法包括在可控制表達系統的控制之下引起該一種或幾種特定細胞成分表達。
27.權利要求25的方法，其中是通過一種方法修飾所述一種或幾種特定的細胞成分，此方法包括可控制地轉染表達該一種或幾種特定細胞成分的基因。
28.權利要求25的方法，其中是通過一種方法修飾所述一種或幾種特定的細胞成分，此方法包括可控制地降低該細胞類型細胞中編碼該一種或幾種特定細胞成分的RNA種類的豐度。
29.權利要求28的方法，其中所述可控制地降低該RNA種類豐度的方法包括將該細胞類型的細胞暴露于定向斷裂該RNA種類的核酶。
30.權利要求25的方法，其中是通過一種方法修飾所述一種或幾種特定的細胞成分，此方法包括可控制地降低該細胞類型細胞中編碼該一種或幾種特定細胞成分的RNA種類的翻譯速度。
31.權利要求30的方法，其中所述可控制地降低RNA種類翻譯速度的方法，包括將該細胞類型的細胞暴露于可對該RNA種類或對編碼此RNA種類的DNA雜交的反義核酸或反義核酸模擬物。
32.權利要求25的方法，其中所述一種或幾種特定的細胞成分是蛋白質種類的豐度或蛋白質種類的活性，并且其中是通過包括可控制地降低該細胞類型細胞中這些豐度的方法修飾該一種或幾種特定的細胞成分。
33.權利要求32的方法，其中可控制地降低所述豐度的方法，包括在該細胞類型細胞中引起將所述一種或幾種蛋白質種類表達為包含該蛋白質種類和一個降解決定子的融合蛋白，其中該降解決定子可控制地增加該蛋白質種類的降解速度。
34.權利要求32的方法，其中可控制地降低所述豐度的方法包括將該細胞類型的細胞暴露于抗體，其中該抗體可結合所述蛋白質種類。
35.權利要求25的方法，其中所述一種或幾種特定細胞成分是蛋白質的活性，并且其中是通過包括可控制地降低該細胞類型細胞中所述活性的方法修飾該一種或幾種特定細胞成分。
36.權利要求35的方法，其中可控制地降低所述活性的方法，包括將該細胞類型細胞暴露于可直接和特異性地抑制所述蛋白質種類活性的藥物。
37.權利要求35的方法，其中可控制地降低所述活性的方法，包括將該細胞類型細胞暴露于優勢負突變蛋白質種類，其中該優勢負突變蛋白質種類是抑制所述活性的蛋白質。
38.一種從最初的候選藥物中確定更具途徑-特異性的候選藥物的方法，包括(a)通過一種方法鑒定參與最初候選藥物作用的生物途徑，此方法包括確定一種或幾種生物途徑應答的最佳定標轉換，此生物途徑應答是一種方法的結果，此方法包括在對該生物途徑的多種擾動水平測定一種細胞類型細胞中一種或幾種生物途徑的細胞成分，其中(i)該最佳定標轉換可使對于該最初候選藥所提供的藥物應答與對于該最初候選藥物的模式藥物應答之間差異的目標函數值最小化，(ii)是通過一種方法提供了對于該最初候選藥物所提供的藥物應答，此方法包括在暴露于該最初候選藥物的多種水平測定此細胞類型細胞中的多種細胞成分，以及(iii)將對于該最初候選藥物的模式藥物應答表示為該一種或幾種生物途徑應答的組合，該組合中的一種或幾種生物途徑應答的每一種須經單獨的定標轉換；(b)修飾此最初候選藥物的結構，產生修飾的候選藥物；以及(c)通過一種方法鑒定參與此修飾的候選藥物作用的生物途徑，此方法包括確定該一種或幾種生物途徑應答的最佳定標轉換，其中(i)該最佳定標轉換可使對于修飾的候選藥物所提供的藥物應答與對修飾的候選藥物模式藥物應答之間差異的目標函數值最小化；(ii)是通過一種方法提供了對于修飾的候選藥物所提供的藥物應答，此方法包括在暴露于修飾的候選藥物的多種水平測定此細胞類型細胞中的多種細胞成分，以及(iii)將對于修飾的候選藥物的模式藥物應答表示為該一種或幾種生物途徑應答的組合，該組合中的一種或幾種生物途徑應答的每一種須經單獨的定標轉換；其中如果鑒定表明修飾的候選藥物作用中具有比最初候選藥物作用中更少的生物途徑，則該修飾的候選藥物是比最初候選藥物更具途徑特異性的候選藥物。
39.一種用于鑒定參與藥物作用并介導此藥物副作用的一種或多種特異性生物途徑的方法，此方法包括(a)通過確定一種或幾種生物途徑應答的最佳定標轉換，鑒定參與第一種藥物作用的一種或幾種生物途徑，此生物途徑應答是一種方法的結果，此方法包括在對該生物途徑的多種擾動水平測定一種細胞類型細胞中一種或幾種生物途徑的細胞成分，其中(i)該最佳定標轉換可使對于第一種藥物所提供的藥物應答與對于第一種藥物的模式藥物應答之間差異的目標函數值最小化，(ii)是通過一種方法提供對于第一種藥物所提供的藥物應答，此方法包括在暴露于第一種藥物的多種水平測定此細胞類型細胞中的多種細胞成分，以及(iii)將對于第一種藥物的模式藥物應答表示為該一種或幾種生物途徑應答的組合，該組合中的一種或幾種生物途徑應答的每一種須經單獨的定標轉換；(b)通過確定該一種或幾種生物途徑應答的最佳定標轉換，鑒定參與第二種藥物作用的一種或幾種生物途徑，其中該第一種和第二種藥物是不同的，并表現對相同的疾病或障礙具有治療效果，并且其中(i)該最佳定標轉換可使對于第二種藥物所提供的藥物應答與對于第二種藥物的模式藥物應答之間差異的目標函數值最小化，(ii)是通過一種方法提供對于第二種藥物所提供的藥物應答，此方法包括在暴露于第二種藥物的多種水平測定此細胞類型細胞中的多種細胞成分，以及(iii)將對于第二種藥物的模式藥物應答表示為該一種或幾種生物途徑應答的組合，該組合中的一種或幾種生物途徑應答的每一種須經單獨的定標轉換；以及(c)鑒定參與第一種藥物作用的特異性生物途徑，它們不同于參與第二種藥物作用的生物途徑，從而鑒定參與第一種藥物的作用并且介導第一種藥物的副作用的一種或多種特異性生物途徑。
40.一種用于鑒定參與介導對于疾病或障礙的治療效果的一種或多種特異性生物途徑，該方法包括(a)通過確定一種或幾種生物途徑應答的最佳定標轉換，鑒定參與第一種藥物作用的一種或幾種生物途徑，此最佳定標轉換是一種方法的結果，此方法包括在對該生物途徑的多種擾動水平測定一種細胞類細胞中一種或幾種生物途徑的細胞成分，其中(i)該最佳定標轉換可使對于第一種藥物所提供的藥物應答與對于第一種藥物的模式藥物應答之間差異的目標函數值最小化，(ii)是通過一種方法提供對于第一種藥物所提供的藥物應答，此方法包括在暴露于第一種藥物的多種水平測定此細胞類型細胞中的多種細胞成分，以及(iii)將對于第一種藥物的模式藥物應答表示為該一種或幾種生物途徑應答的組合，該組合中的一種或幾種生物途徑應答的每一種須經單獨的定標轉換；(b)通過確定該一種或幾種生物途徑應答的最佳定標轉換，鑒定參與第二種藥物作用的生物途徑，其中該第一種和第二種藥物是不同的，并表明對相同的疾病或障礙具有治療效果，并且其中(i)該最佳定標轉換可使對于第二種藥物所提供的藥物應答與對于第二種藥物的模式藥物應答之間差異的目標函數值最小化，(ii)是通過一種方法提供對于第二種藥物所提供的藥物應答，此方法包括在暴露于第二種藥物的多種水平測定此細胞類型細胞中的多種細胞成分，以及(iii)將對于第二種藥物的模式藥物應答表示為該一種或幾種生物途徑應答的組合，該組合中的一種或幾種生物途徑應答的每一種須經單獨的定標轉換；以及(c)鑒定參與第一種藥物和第二種藥物作用的特異性生物途徑，從而鑒定參與第一種藥物的作用并且介導對于該疾病的障礙的治療效果的一種或幾種特異性生物途徑。
41.一個用于鑒定參與一種細胞類型藥物作用的生物途徑的計算機系統，包括處理器和偶聯于該處理器的內存，該內存編碼一種或幾種程序，該一種或幾種程序導致處理器執行包括如下步驟的方法(a)接收該細胞類型中該藥物的藥物應答，該藥物應答包括在多個藥物暴露水平的該細胞類型細胞中多種細胞成分的測定量；(b)接收一種或幾種生物途徑應答，該一種或幾種途徑應答的每一種都包括在對該生物途徑多個擾動水平的該細胞類型細胞中該生物途徑細胞成分的測定量；(c)形成一個模式藥物應答作為該一種或幾種生物途徑的組合，其中該組合中所述一種或幾種生物途徑應答的每一種須經單獨的定標轉換；(d)確定該藥物應答與模式藥物應答之間差異的目標函數值；以及(e)通過改變所述一種或幾種生物途徑應答的定標轉換，以便獲得可使所確定的該目標函數值最小化的最佳定標轉換，用于使所確定的該目標函數值最小化；其中該一種或幾種生物途徑應答的組合在所述最佳定標轉換的條件下可鑒定參與該細胞類型藥物作用中的生物途徑。
42.權利要求41的計算機系統，在此所述的接收步驟包括形成從內存中可獲得的該藥物應答測定量和生物途徑應答測定量。
43.權利要求41的計算機系統，其中所述形成一個模式藥物應答包括加入該一種或幾種生物途徑應答。
44.權利要求41的計算機系統，其中所述的目標函數包括在所述藥物暴露水平下該藥物應答與模式藥物應答差的平方和，在所述藥物暴露水平通過借助于所述定標轉換將所述藥物暴露水平轉換成相應的對每個所述生物途徑的擾動水平，并且通過將所述生物途徑應答插入成所述相應的擾動水平，形成了所述模式藥物應答。
45.權利要求41的計算機系統，其中所述最小化包括實施Levenherg-Marquandt法。
46.一種測定二種藥物對某一細胞類型作用相似性的方法，包括(a)提供該細胞類型中第一種藥物的第一種藥物應答，已通過一種方法獲得了這種藥物應答，此方法包括在對第一種藥物的多種暴露水平測定該細胞類型細胞中的多種細胞成分；(b)對在某一細胞類型中的第二種藥物提供第二種藥物應答，已通過一種方法獲得了第二種藥物應答，此方法包括在對第二種藥物的多種暴露水平測定該細胞類型細胞中的多種細胞成分；以及(c)確定該生物途徑應答的最佳定標轉換，它可使第一種藥物應答與第二種藥物應答之間差異的目標函數值最小化，其中該目標函數的最小化值構成了對第一種藥物和第二種藥物在該細胞類型中作用相似性的測定。
47.一種用于鑒定參與環境改變對某一細胞類型作用的生物途徑的方法，包括(a)提供該細胞類型對此環境改變的環境應答，已通過一種方法獲得了這種環境應答，此方法包括在該環境改變的多種嚴格程度下測定該細胞類型細胞中的多種細胞成分；(b)將一種模式環境應答表示為該細胞類型中一種或幾種生物途徑應答的組合，其中該細胞類型中的生物途徑應答是一種方法的結果，此方法包括在對該生物途徑的多種擾動水平測定該細胞類型細胞中該生物途徑的細胞成分，并且其中該組合中所述一種或幾種生物途徑應答的每一種須經單獨的定標轉換；以及(c)確定該一種或幾種生物途徑應答的最佳定標轉換，它可使該環境應答與模式環境應答之間差異的目標函數值最小化，其中該一種或幾種生物途徑應答的組合，在最佳定標轉換條件下可鑒定為參與此環境改變對該細胞類型作用的生物途徑。
48.權利要求3的方法，其中對在最佳定標轉換條件下的該一種或幾種生物途徑應答的組合作了統計學顯著性檢驗，其中是通過一種方法進行此統計學顯著性檢驗，此方法包括(a)獲得該目標函數最小化值的預期概率分布；以及(b)依據此預期的概率分布評價該目標函數真實最小化值的統計學顯著性，其中該目標函數的真實最小化值是從所提供的藥物應答和此模式藥物應答確定的。
49.權利要求48的方法，其中是通過一種方法獲得所述預期概率分布，此方法包括(a)相對于所述多種藥物暴露水平隨機化該藥物應答，(b)通過一種方法隨機化該模式藥物應答，此方法包括相對于對所述一種或幾種生物途徑的多種擾動水平隨機化所述一種或幾種生物途徑應答；(c)通過確定該一種或幾種隨機化生物途徑應答的最佳定標轉換來確定該目標函數的理論最小值，此最佳定標轉換可使所述隨機化的藥物應答與隨機化的模式藥物應答之間差異的目標函數最小化；以及(d)重復步驟(a)-(c)，從而可確定多個理論最小值，其中此多個理論最小值形成所述預期概率分布。
50.一種用于鑒定參與環境改變對某一細胞類型作用的生物途徑的方法，此方法包括確定一種或幾種生物途徑應答的最佳定標轉換，它可使所提供的環境應答與模式環境應答之間差異的目標函數值最小化，其中(a)該一種或幾種生物途徑應答是一種方法的結果，此方法包括在對該生物途徑的多種擾動水平測定該細胞類型細胞中一種或幾種生物途徑的細胞成分；(b)通過一種方法獲得該所提供的環境應答，此方法包括在對該環境改變的多種暴露水平測定此細胞類型細胞中的多種細胞成分；以及(c)將該模式環境應答表示為該一種或幾種生物途徑應答的組合，此組合中該一種或幾種生物途徑應答的每一種須經單獨的定標轉換，其中該一種或幾種生物途徑應答的組合，在所述最佳定標轉換條件下可鑒定為參與所述環境改變對該細胞類型作用的生物途徑。
全文摘要
本發明提供了幾種方法,用于通過如下步驟鑒定和表現藥物對細胞作用的生物途徑:(ⅰ)測定對于細胞分級暴露于所研究藥物細胞成分的應答;(ⅱ)測定對于該細胞一種或幾種生物途徑中擾動的細胞成分的應答,以及(ⅲ)定標一組所測定的途徑應答,以便根據客觀的測定最佳地擬合所測定的藥物應答。在另一些實施方案中,本發明還對所鑒定的表現提供顯著性檢驗,并證實所鑒定的途徑是真實的藥物作用途徑。在不同的實施方案中,可通過測定基因表達,蛋白質豐度,蛋白質活性,或者這些測定量的組合來確定對細胞的作用。在另一些不同的實施方案中,通過使用可滴定的表達系統,使用轉染系統,改變途徑RNAs的豐度,改變途徑蛋白質的豐度,或者改變途徑蛋白質的活性,可以形成對細胞內生物途徑的擾動。本發明還提供了根據鑒定藥物作用生物途徑的方法用于藥物開發的方法,并且提供了一些方法,用于表現參與環境改變對細胞作用的生物途徑。
文檔編號G01N33/53GK1308684SQ99808348
公開日2001年8月15日 申請日期1999年5月7日 優先權日1998年5月8日
發明者S·H·弗里恩德, R·斯托頓 申請人:羅斯塔英法美蒂克斯公司
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
