專利名稱：：H5n1型高致病性禽流感的納米量子點檢測方法
技術領域：
：本發明涉H5N1型高致病性禽流感的納米量子點檢測方法，更具體說是一種釆用超聲乳化改性制備的量子點標記禽流感病毒單抗或多抗進行檢觀啲方法，屬于檢驗檢疫領域。
背景技術：
：禽流行性感冒(簡稱禽流感，avianinfluenza,AI)是由A型流感病毒引起的禽類烈性傳染病，被國際獸疫局定為A類傳染病，其中H5N1亞型禽流感是近年來爆發的最為頻繁一種高致病性禽流感，給家禽業帶來了巨大的經濟損失，也威脅著人類的生命健康。隨著我國也發現了人感染禽流感的病例，高致病性禽流感的防控工作尤為重要。禽流感的控制關鍵在于建立快速診斷禽流感病毒的方法，而現有的禽流感診斷技術不能滿足我國高致病性禽流感的快速診斷的需要，因此,建立快速診斷禽流感技術已成為我國預防和控制高致病性禽流感的當務之急。對禽流感的快速檢測是控制該病的根本前提。由于禽流感的臨床癥狀和病理變化因感染禽的種類、齡期、病程長短、并發感染情況及感染毒株力等的不同而有所不同，因此，禽流感的癥狀一直依賴于病原的分離鑒定。目前禽流感的診斷的主要是通過病毒分離和血清學試驗檢測病毒或是檢測感染雞的抗體進行鑒定。其中血清學診斷包括瓊脂擴散試驗(AGP)、血凝(HA)和血凝抑制試驗(HI)、神經氨酸酶抑制試驗(NI)、中和試驗(NT)、免疫熒光技術(IFT)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等六種檢測方法。近年來，隨著分子生物學技術的發展，RT-PCR方法也逐漸應用于禽流感的檢測。現有技術的不足之處在于1.病毒的分離鑒定是診斷AI的一種可靠方法，但病毒分離培養耗時長，至少需7d,不利于快速診斷和免疫程序的合理制定，難以勝任對高致病性AI快速診斷的需要。2.瓊脂擴散(AGP)試驗進行病毒抗原性特異性試驗，此法雖然簡單易行，但敏感性較差，易出現假陽性。在進行HA實驗時，應先出去非特異性非凝集抑制因子。血凝實驗(HA)和血凝抑制實驗(HI)特異性好，但其過程繁瑣費時，但其操作相對繁瑣，同時必須具備一定血凝效價的標準病毒和新鮮制備的紅細胞。血清學檢査對最后確診有回顧性的診斷價值，一般只能在發病23周甚至更長時間才能有抗體陽性出現。神經氨酸酶試驗(NI)試驗比HI試驗復雜得多，一般的診斷實驗室不能完成，應由專門從事禽流感檢測的參比實驗室完成。中和試驗(NT)是一種比較敏感而特異的血清學方法，但是其操作繁瑣、耗時費料，臨床幾乎不用。3.ELISA是近年來發展得較為成熟的一種方法，敏感性較高，缺點是試驗的敏感性受樣本質量的影響很大。陰性結果并不表明未感染禽流感病毒，只能解釋為未檢出。免疫熒光技術(IF)即熒光抗體(fluoresentantibody,FA)技術，是鑒定和定位流感病毒感染細胞中特異性的抗原，主要是流感病毒的核蛋白(NP)或基質蛋白(MP抗原)。禽流感病毒的檢測通常采用的是直接熒光法，這種方法用于診斷具有快速、簡便和敏感等特點，但是有時會出現假陽性(非特異性熒光)，間接免疫熒光技術也可以用來檢測NP及MP抗原與抗體的反應，其敏感性很高。但對抗原制備要求較高，需用非離子型去污劑對純化的病毒粒子進行裂解。4.RT-PCR方法是一種敏感特異的方法，靈敏度要高于ELISA，由于該技術條件要求高，且田間樣本復雜多變,干擾大,樣本處理難，因此大規模檢測比較困難。納米量子點(quantumdot,QD)又可稱為半導體納米微晶體(semiconductornanocrystal)，是一種由II-VI族或III-V族元素組成的穩定的、溶于水的、尺寸在220nm之間的納米晶粒。目前研究較多的是CdS、CdSe、CdTe、ZnS等。近年來，半導體量子點由于其獨特的性質越來越受到人們的重視，其研究內容涉及物理、化學、材料、生物等多學科，已成為一門新興的交叉學科。量子點由于粒徑很小，電子和孔穴被量子限域，連續能帶變為具有分子結構的分立能級結構。因此光學行為與一些大分子很相似，可以發射熒光。與傳統的熒光染料相比，量子點有很多優點無機微晶能夠承受多次的激發和光發射，而有機分子卻會分解.持久的穩定性可以讓研究人員更長時間地觀測細胞和組織，并毫無困難地進行界面修飾連接。量于點最大的好處是有豐富的顏色。生物體系的復雜性經常需要同時觀察幾種組分，如果用染料分子染色，則需要不同波長的光來激發，而量于點則不存在這個問題，使用不同大小(進而不同色彩)的納米晶體來標記不同的生物分子。使用單一光源就可以使不同的顆粒能夠被即時監控。并且從紫外線到紅光，量子點有廣泛的激發光譜范圍，能夠用量子點的大小和成分來調節激發光譜。同時量子點具有狹窄對稱的熒光發射譜峰，這樣就可以同時使用不同光譜特性的量子點，而發射光譜不出現重疊。因此，納米量子點作為一種新型的熒光標記材料，在生物領域中的應用越來越受到了關泛的關注,特別是在臨床診斷方法取得了長足的進展。
發明內容本發明要解決的第一個技術問題是提供一種H5N1型高致病性禽流感的納米量子點檢測方法。本發明要解決的第二個技術問題是提供一種可用于標記抗體進行生物檢測的新型水溶性羧基化納米量子點。本發明要解決的第三個技術問題是提供超聲乳化改性制備量子點的方法。為實現上述目的，本發明采用以下技術方案H5N1型高致病性禽流感的納米量子點檢測方法，包括如下步驟(1)制備和純化H5N1型禽流感單克隆抗體或多克隆抗體；(2)制備水溶性羧基化納米量子點；(3)納米量子點標記H5N1型禽流感單克隆抗體或多克隆抗體；(4)樣品測定。所述(1)制備和純化H5N1型禽流感單克隆抗體的方法為用純化濃縮的H5N1型禽流感病毒作為免疫抗原免疫8周齡Balb/c小鼠；獲得免疫脾細胞與SP2/0細胞融合得到雜交瘤細胞；篩選陽性雜交瘤細胞的克隆進行培養獲得穩定分泌抗體的雜交瘤細胞株；將雜交瘤細胞株注射入Balb/c小鼠腹腔以體外誘生腹水法獲得含單克隆抗體的腹水；采用辛酸-飽和硫酸胺法濃縮和純化腹水獲得單克隆抗體。所述(1)制備和純化H5N1型禽流感多克隆抗體的方法為用純化濃縮的H5N1型禽流感病毒作為免疫抗原，免疫新西蘭大白兔；10天后心臟采血，分離血清；飽和硫酸銨粗提多抗；DEAE-纖維素層析過柱后純化的IgG置透析袋中，用固體聚乙二醇包埋進行濃縮獲得多克隆抗體。所述(3)納米量子點標記H5N1型禽流感單克隆抗體或多克隆抗體的方法為制備醛基化玻片；利用交聯劑EDC和sulfo-NHS采用共價鍵連接的方法進行抗體的量子點標記。玻片由于樣品不易在其表面滲透和擴散以及它的疏水性，特別是熒光背景低便于熒光觀察等特點，因而被我們作為此課題研究中實驗反應的載體。將玻片表面進行醛基化是在玻片表面固定蛋白最常用的途徑。采用氨基硅烷和戊二醛先后進行氨基化和醛基化反應，在玻片表面形成活化的醛基，活化的醛基與蛋白質的氨基縮合反應，形成共價鍵的方法從而在玻片表面固定蛋白質。所述制備醛基化玻片是指將玻片用洗液(K2Cr0720g+濃H2S04350ml+H2040ml)浸泡過夜，然后用大量的去離子水沖洗，6(TC烘干2h后，將玻片浸入5。/。APTES的乙醇溶液中作用60min進行玻片表面的氨基化，取出水洗，晾干后，將玻片浸入含5%戊二醛的PBS(0.2mol/L,pH8.0)溶液中進行玻片的醛基化，PBS溶液清洗晾干后備用。EDC和量子點表面的羧基反應生成酰基異脲，但酰基異脲在水溶液中容易水解，又生成羧基產物。如果在溶液中加入sulfo-NHS，酰基異脲就極易和sulfo-NHS反應，生成具有胺反應活性的sulfo-NHS酯，sulfo-NHS酯與抗體表面的氨基反應生成穩定的酰胺，從而進行抗體的量子點標記。根據條件試驗，我們最后確定的量子點標記抗體的實驗條件為偶聯劑EDC和sulfo-NHS的最佳使用濃度為2.OmM和5.OmM,量子點的濃度為3.0mM，抗體與量子點最佳的比例為3:1，抗體標記的最佳pH值為7.5，最佳的反應時間為2h。所述利用交聯劑EDC和sulfo-NHS采用共價鍵連接的方法進行抗體的量子點標記是指在1.5ml的印pendorf中加入lml的活化緩沖液(0.1MMES，0.5MNaCl,P服.0)，然后加入加入適量的EDC和sulfo-NHS溶液；再在溶液中加入20ul量子點溶液，不停地混合溶液，室溫下反應20min;加入1.4ul(20mM)2-巰基乙醇在室溫下反應10min，得到活化的量子點溶液；在活化的量子點溶液中，加入lml含適量H5N1型禽流感抗體的PBS溶液(0.01M，pH7.5)，并用NaOH溶液調節PH至7.5，室溫下攪拌反應2小時；4000，離心分離1分鐘，除去小分子和未反應完全的抗體；用5ml去離子水溶解沉淀,重復對量子點標記的禽流感單克隆抗體溶液進行溶解/沉淀2次，最后用2ml去離子水溶解沉淀，4'C保存。所述(4)樣品測定的方法為在醛基化的玻片表面滴加待檢樣品尿囊液，37°C孵育2h;用洗滌玻片3次，每次5min;然后在玻片表面滴加含5%BSA的PBS-Tween溶液，37i:孵育45rain;用0.01M，pH7.2的PBS洗滌玻片3次，每次5min后，加入量子點標記的禽流感抗體，37"孵育45min，用0.01M，pH7.2的PBS洗滌玻片3次，每次5min;室溫下晾干后在熒光顯微鏡下觀察，判斷樣品的陰陽性。一種可用于標記抗體進行生物檢測的新型水溶性羧基化納米量子點，采用如下方法制備得到。制備水溶性羧基化納米量子點的方法，包括如下步驟(1)制備CdSe核殼量子點；(2)制備CdSe/CdS核殼量子點；(3)巰基乙酸修飾CdSe/CdS量子點；(4)雙親性高分子疏水自組裝改性量子點；(5)超聲乳化改性量子點。現在通常使用的量子點表面都被大量有機溶劑分子包覆而呈疏水性，而生物大分子或者藥物一般是溶解或分散在水溶液中的，所以量子點與它們既不能充分接近更不能直接7有效的結合，因此要得到穩定的熒光探針，大多先要將量子點表面進行修飾。利用Zn、Cd等IIB族原子與硫原子之間有效的鍵合作用，用帶巰基的雙功能分子，如巰基羧酸類、二硫蘇糖醇(DTT)、硫代膽堿等取代QDs表面的有機分子，以使其從疏水性轉變為親水性，然后通過另一端的功能基團可以與生物大分子連接，這種方法簡單、重復性好。但由于使用的是小分子作為連接物，修飾以后原有的有機分子對量子點的保護和穩定作用得不到有效的替代，所以穩定性不好。用雙親性高分子疏水自組裝改性量子點雖然所得的量子點粒徑較小，但是此種方法純化比較困難，且環境不友好。乳化有利于形成微膠囊的形成，然而，假如只是簡單的機械攪拌，所形成的微膠囊體系不夠穩定。超聲作用有助于乳化且可以形成氣穴，維持乳液穩定。所以我們采用超聲乳化的方法來實現水溶性改性。采用的超聲乳化改性制備的量子點具有方法創新性，高分子層較厚且嚴實致密，能更好的保護量子點，避免環境介質滲入而造成量子點的發光性能的破壞如光降解，光漂白，以及Cd離子的滲出而產生毒性；該方法純化簡單，只需離心，而一般水溶性改性(通過疏水作用自組裝改性)需要過膜—濃縮一凝膠過濾一再濃縮等步驟；采用0/W法，有機溶劑用量少，省時節能，環境友好；疏水作用自組裝修飾的納米粒子表面不光滑，而超聲乳化制備的納米粒子表面光潔，不容易引起非特異性吸附，能更好的應用在生物檢測方面。本文研制出了CdSe/CdS核殼量子點，并采用超聲乳化的方法對量子點迸行了水溶性改性，建立了納米量子點用于H5N1型禽流感病毒的檢測方法。此檢測方法檢測速度快，從樣品的處理到出結果只需4個小時。檢測結果穩定，熒光不易發生淬滅，檢測過的樣本在數十天后仍可觀察結果。并且量子點標記禽流感抗體的方法十分簡單，只需簡單離心就可對標記產物進行純化。而傳統的抗體的熒光素標記方法需要反應過夜，標記產物還需要透析法或層析法進行純化，整個過程耗時，且操作繁瑣。該方法對雞胚尿囊液檢測最高稀釋度為10"6，與雞胚病毒分離的靈敏度基本相當，高于RT-PCR的檢測靈敏度。本發明的優點是納米量子點應用于H5N1型高致病性禽流感檢測的診斷方法，該方法快速、穩定、便于高通量檢測、條件要求低、操作簡便，易于推廣，具有操作簡單、快速和靈敏度高等特點。該方法的建立將為我國高致病性禽流感的監測和診斷提供了一種有效的手段，在進出口檢疫上具有良好的推廣和應用前景。下面結合附圖和具體實施方式對本發明做進一步說明，并非對本發明的限制。凡是依照本發明公開內容所做的任何本領域的等同替換，均屬于本發明的保護范圍。圖l為三種不同粒徑大小的CdSe/CdSQDs的吸收光譜(a)和熒光光譜(b)。圖2為巰基乙酸修飾CdSe/CdS油溶性量子點的紫外吸收光譜。圖3為雙親性高分子材料自組裝改性量子點的TEM照片190，000X。圖4(a)是雙親性高分子疏水自組裝改性量子點的紫外吸收光譜。圖4(b)是改性后的熒光光譜。圖5為超聲乳化改性量子點后的TEM照片。圖6是超聲乳化改性量子點的紫外吸收光譜。圖7為醛基化玻片結果驗證結果圖(a)加入羊抗兔IgG;(b)加入羊抗雞IgG。圖8為量子點標記抗體的反應原理圖。圖9為沉淀離心量子點標記多抗后過柱的峰形圖。圖10為沉淀離心量子點標記的產物反應熒光圖片。圖11為過柱純化量子點標記的禽流感多抗產物圖。圖12為過柱純化各組分與抗原反應熒光圖片。圖13為過柱純化量子點標記的禽流感單抗圖。圖14為沉淀離心純化量子點標記單抗產物后過柱的峰形圖。圖15a、b、c和d分別表示量子點標記的H5N1型禽流感單抗檢測新城疫F48E9、IBDV、鴨瘟病毒和鴨肝炎病毒結果圖。圖16為本發明方法和間接熒光免疫法對未感染禽流感病毒的尿囊液進行檢測的結果圖。具體實施例方式主要材料和儀器1.HT培養基(Sigma公司)，HATA選擇培養基(Sigma公司)，DMEM高糖培養基(CIBC0BRL公司)，細胞融合劑(Sigma公司)，青霉素鈉(華北制藥)，硫酸鏈霉素(華北制藥)；十二烷基磺酸鈉(SDS)(Sigma公司)，正辛酸(北京化學試劑公司)，HRP標記的羊抗鼠IgG(欣經科生物制品有限公司)，聚乙二醇(PEG,分子量6000)(欣經科生物制品有限公司)，凝膠過濾填料S印hadexG-200(Amershambioscience)，禽流感H5N1病毒、雞新城疫病毒(NDV)、產蛋下降綜合癥病毒(EDS76V)為本實驗室保存，SPF雞胚購自梅里亞動物保健品有限公司，BALB小鼠購自北京市實驗動物研究所，SP2/0細胞為本實驗室保存，新西蘭大白兔購自北京實驗動物中心。自動純水機(美國PALI.CO)，二氧化碳培養箱(日本三洋)，倒置顯微鏡(日本Olympus)，高速離心機(美國Optime)，酶聯檢測儀(美國ThermoLabsystems)，臺式電子天平(德國SAT0RI0VS)，恒溫水浴箱(芬蘭HETO),微孔細胞培養板()，電泳成套設備(美國Invitrogen)，倒置熒光顯微鏡(日本Olympus)，centrifuge5810R臺式冷凍離心機(德國印pendorf公司)；AKTABasic蛋白純化儀(AmershamBiosciences)。2.量子點的制備三正辛基氧化磷(TOPO，90%,Aldrich)，三正丁基磷(TBP,90%,TCI，Japan)、十八胺(ODA，90%'ACROS)、十八烯(ODE,90%,ACROS)，單質硫(S，99.9%Aldrich)、油酸(OA，90%,Aldrich)，氧化鎘(CdO，99.5%,Aldrich)以及Se粉(lOOmesh,99.99%,Aldrich)、甲苯、乙醇，甲醇、正己垸，氯仿，二氯甲烷和丙酮均為分析純，購自天津大學科威試劑公司。UV-2450紫外可見分光光度計(日本島津公司)，PJEM-IOOCXII型透射電子顯微鏡(erkinElmerInc.)，F-4500熒光分光光度計(日立)，G2F20透射電子顯微鏡(Tecnai)，SHJM-1型數顯恒溫攪拌電熱套(山東省鄄城福利科研儀器廠)，HettichMikro22R型冷凍離心機(JEOL公司)，電子天平ALC-100.4(北京賽多利斯天平有限公司)3.抗體的量子點標記EDC(l-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亞胺鹽酸鹽，Pierce)，sulfo-NHS(sulfo-N_羥基琥珀酰亞胺，Acrose)，(3-氨甲基)三乙氧基硅烷(APTES，((3-Amin叩ropyl)，triethoxysilane，AlfaAcesar)，凝膠過濾填料Superdex200(Amershambioscience)，凝膠過濾填料s印harose6FastFlow(Amershambioscience)。UV-2450紫外可見分光光度計(日本島津公司)，centrifuge5810R臺式冷凍離心機(德國印pendorf公司)，BX51正置熒光顯微鏡(日本Olympus)，AKTABasic蛋白純化儀(AmershamBiosciences)，wd-9403f紫外透射儀(北京六一儀器廠)。4.樣品的檢測牛血清蛋白(BSA，北京化學試劑公司)，Tween-20(北京化學試劑公司)，新城疫F48E9、IBDV、鴨瘟病毒和鴨肝炎病毒由本實驗室留存(本發明的實施也可選取其他的同類病毒，不影響效果)。BE500恒溫培養箱(德國ME羅ERT)，BX51正置熒光顯微鏡(日本Olympus)。實施例l:病毒的繁殖、純化及濃縮1.病毒的繁殖取AIVH5N1病毒，作1X1(T倍稀釋，尿囊腔接種10日齡雞胚，0.2ml/枚，37。C培養，每日照蛋3次，淘汰24小時內死亡的死胚，收集24-96小時仍未死亡的雞胚。放4'C冷卻，無菌收集尿囊液。2.病毒的滅活及純化(1)滅活:在收集的尿囊液中加入甲醛使其終濃度為O.1%，置于37。C生化培養箱中滅活。(2)差速離心4000rpm，4。C離心45分鐘，棄去沉淀。上清夜于100，OOOXg，4。C超速離心2小時，收集沉淀，以原尿囊液1/20體積的PBS(pH7.4)重懸病毒，-8(TC保存。(3)凝膠過濾用0.OIM，PH7.4的PBS作為平衡液和洗脫液。取lgS印hadexG-200，以蒸餾水煮沸30min,充分溶漲后裝柱，用平衡液充分平衡柱床。將粗提病毒裝入柱內，待病毒液全部進入層析柱后，關閉下口完成上樣，然后加入洗脫液進行洗脫，控制流速為0.3ml/min，2ml/管，根據各管的OD娜值和HA價，收集符合要求的個管洗脫液。(4)洗脫液的濃縮將收集的各管洗脫液裝入透析袋，用固體聚乙二醇(PEG，分子量6000)包埋10h進行濃縮。取出病毒濃縮液，用紫外分光光度計測定其OD加。和0D280，根據公式蛋白質濃度(mg/ml)=1.45乂0028。_0.74乂0026。,計算病毒蛋白的濃度，并測定濃縮蛋白的HA價。3.結果取200ml尿囊液進行純化，差速離心，以初體積的1/20的PBS蟲懸沉淀，紫外分光光度計測定其0D2s。和OD加。，并根據公式病毒蛋白濃度(mg/ml)二(1.45XOD28。_0.74X0D260)X稀釋倍數，計算得到病毒蛋白的含量為1.3564mg/ml。凝膠過濾后，共收集洗脫液20管(l.Oml/管)，根據ATAKBASIC蛋白純化儀顯示的各收集組分的0D28。，合并OD，處于第一個縫的各管，共得到lOml，用固定乙二醇(PEG，分子量6000)包埋，10h后體積為1.5ml。用紫外分光光度計測得濃縮病毒蛋白濃度為2.6859mg/ml。血凝試驗結果表明，所獲得的病毒濃縮液的HA價為1:211。實施例2:制備和純化H5N1型禽流感單克隆抗體l.小鼠免疫程序用實施例l純化濃縮的病毒作為免疫抗原免疫8周齡Balb/c小鼠。共免疫四次，第一次免疫用等量氟氏佐劑完全乳化，第二次和第三次免疫加等量的氟氏不完全佐11劑，第四次不加佐劑。每次免疫間隔2周。每次免疫的病毒劑量為每只小鼠150yg,免疫途徑為頸背部下多點注射。第四次免疫2周后尾哺采血測定血清的HA價，若血清效價合理，融合前三天進行一次加強免疫，用不加佐劑的病毒抗原經腹腔注射。2.雜交瘤細胞的建立(1)SP2/0細胞的準備融合前24-48h將SP2/0細胞分瓶擴大培養,融合前6h,棄去瓶中培養液，換上新液。融合時，選擇形態良好、呈對數生長的SP2/0細胞，將其從瓶壁上輕輕吹下，收集于50ml離心管內，1500rpra離心3min，用5mlDMEM基礎培養液懸浮沉淀，再離心一次，然后用DEME重新懸浮后計數備用。(2)飼養細胞的制備將未經免疫的ICR小鼠眼球放血處死；將處死的小鼠置75%酒精中浸泡5min，轉入超凈臺，置于無菌腰盤中；剝離小鼠皮膚，無菌取出脾臟，放入盛有10mlDMEM基礎培養液的平皿中，剔出結締組織，并輕輕漂洗；將睥臟移入另一盛有10mlDMEM基礎培養液的平面皿中，用滅菌的鈍頭反復夾取積壓睥臟，充分釋放其中的脾細胞；將含有脾細胞的DMEM移入離心管內，1500rpm離心3min，棄上清；用10mlDMEM基礎培養液重懸沉淀，吸吹均勻，1500rpm，離心3min:棄上清。此步驟重復2-3次；沉淀用10mlHAT選擇培養基懸浮備用。(3)免疫脾細胞的制備在強化免疫72h后，將免疫小鼠摘除眼球放血并分離血清作為抗體陽性對照；免疫脾細胞的制備同上述飼養細胞的制備過程；最后，沉淀用DMEM基礎培養液懸浮計數備用。(4)細胞融合分別取2.4X108個脾細胞和含有6.0X107個SP2/0細胞的懸液，加入到一只50ml離心管內，輕輕混勻；1500rpm離心3min，將上清盡量棄去;用手掌輕輕震動管底，使沉淀細胞松散均勻成糊狀；用移液管吸取lml細胞融合劑，使移液管尖部接觸細胞，緩緩加入融合劑，使細胞與融合劑充分接觸，控制在60s加完；加入25mlDMEM液終止細胞融合劑的作用，方法如下第1分鐘緩緩加入lmlDMEM液，第2分鐘加入4mlDMEM液，然后在3分鐘內加入20mlDMEM液;將離心管置于37。CC02培養箱靜置5min;1500rpra/min離心3min,棄上清，用105mlHAT選擇培養基融合細胞，將制備好的10ml飼養細胞懸液全部加入，輕輕將細胞混合均勻；將懸浮細胞液滴入到6塊96孔板中，每孔200ul，置于37°C0)2培養箱中培養；融合第二天，用HAT選擇培養基半量換液，融合后第四天，再用HAT選擇培養基半量換液一次，第八天改用HT選擇培養基半量換液。每天記錄細胞生長情況。(5)獲得陽性雜交瘤細胞用血凝試驗(HI)進行檢測。先用4單位AIVH5亞型血凝抗原檢測，對于陽性孔，再用8單位血凝抗原檢測一次，篩選強陽性孔。所用的血球為0.5%(V/V)濃度的雞紅血球，直接對上清液原液進行HI檢測；篩選待融合后的細胞克窿生長到覆蓋細胞孔底部面積的1/10時，用確立好的HI方法對其培養上清進行檢測。對于用8單位血凝抗原檢測呈陽性的細胞孔，及時進行克隆；4單位血凝抗原檢測呈陽性，而8單位抗原檢測呈陰性的細胞，換上細胞凍存液，放入-8(TC冰箱保存。(6)陽性雜交瘤細胞的克隆(采用有限稀釋法)克隆的當天制備飼養細胞，制備過程如前所述，將制備好的飼料細胞懸液加入到96孔板中，100ul/孔；將檢測為強陽性的細胞孔用吸管輕輕吸使細胞分散均勻，吸至lml含20%胎牛血清的DMEM液中，取少量懸液進行細胞計樹；用HT選擇培養液稀釋陽性雜交瘤至20個/ml、10個/ml、5個/ml;將稀釋好的細胞懸液加到有飼養細胞的96孔板中，100ul/孔，每一種稀釋度加到32孔；每天觀察細胞的生長情況。第四天用HT選擇細胞培養液半量換液；待孔中細胞液變黃進行檢測；選擇僅有一個克隆上生長的陽性孔再次進行克隆化，直至陽性克隆達到100%;獲得穩定分泌抗體的雜交瘤細胞株后，及時擴大培養并凍存。3.細胞的凍存與復蘇(1)細胞的凍存選擇處于對數生長期的細胞，輕輕將細胞從瓶壁上吹下；1500rpm離心3rain，棄上清；用凍存液將細胞沉淀懸浮，分裝于細胞凍存管內，L5ml/管，加蓋封嚴，注明細胞代號；將凍存管置于無水乙醇的小燒杯內，于4"C冰箱靜置2h后轉入-8(TC冰箱過夜，再將之移入液氮罐內長期保存。(2)細胞的復蘇從液氮管裝中取出凍存管，迅速放入37X:水浴中，輕輕晃動使其盡快融化；1500rpm離心3rain，棄上清；用含20%血清的DMEM液將沉淀懸浮，移入細胞瓶，置C02培養箱內培養。4.單克隆抗體的制備(采用體外誘生腹水法)挑選經產Balb/c小鼠，腹腔注射滅菌石蠟油0.5ml/只；10-14天后，將雜交瘤細胞吹打下來，1500rpm離心3min，棄上清，用5mlDMEM重新懸浮，計數備用；每只小鼠腹腔接種雜交瘤細胞106個；7-IO天后，可見小鼠腹部明顯增大，采集腹水；將腹水3000rpm離心10min，收集上清，-2(TC保存備用。5.單克隆抗體的濃縮及純化(采用辛酸-飽和硫酸胺法)取腹水10ml，加入0.06M醋酸鈉-醋酸緩沖液(pH4.0)20ml(邊加邊攪拌)；用1M氫氧化鈉將腹水pH調至4.8后，邊攪拌邊加入正辛酸0.33ml,室溫攪拌30min;腹水經6000rpm離心30min，棄沉淀，上清用1M氫氧化鈉將pH調至7.2，邊加邊攪拌，緩慢加入等體積的飽和硫酸銨，攪拌30min后，經6000rpm/min離心30min后，棄去上清，沉淀溶于6mlPBS中；緩慢加入4ml飽和硫酸銨胺，并不斷攪拌，30min后，6000rpm/min離心30min，將沉淀溶于適量PBS中，移至透析袋中進行透析。6.單克隆抗體的鑒定(1)HI價測定將收集的腹水3000rpm，10min離心處理，棄掉雜質，測定HI價。(2)ELISA效價的測定包被以差速離心提純的H5病毒作為包被抗原，用包被液稀釋，100"1/孔，4。C過夜；洗滌甩干包被液，以洗滌液洗滌3次，3min/次；加入封閉液，100yl/孔，37°C2h.甩干，同上洗滌；加二抗用PBS將HRP標記羊抗鼠IgG按工作濃度稀釋，100iil/孔，37°C60min.甩干，同上洗滌；加底物每孔加入新鮮配制的底物溶液，100ul/孔，37°C，15min。g:終止液每孔加入100yl1MH2S0J冬止反應；讀數自動酶聯檢測儀檢測各孔的0D280。抗原包被濃度和抗體稀釋度的測定將包被抗原作l:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560稀釋，小鼠陽性和陰性血清作l:2500、1:5000、1:10000、1:20000、1:40000、1:80000稀釋，間接ELISA法測定各孔0D655，方陣法確定抗原最佳稀釋度。(3)單克隆抗體ELISA效價測定將腹水從l:IO起作倍比稀釋，按確定的間接ELISA方法測定其效價。(4)交叉試驗分別用H7、H9、NDV、EDS76V的血凝抗原對腹水做HI交叉反應。有HI反應的判為有交叉反應，無HI反應的判為無交叉反應。(5)單抗重鏈、輕鏈分子量的測定采用SDS-PAGE檢測單抗分子量，腹水的辛酸-飽和硫酸銨純化產物作電泳樣品。濃縮膠和分離膠濃度分別為5%和12%。7.單抗的鑒定結果經測定，做制備的禽流感H5亞型單克隆抗體的HI效價為1:211，ELISA效價為106。針對H7和H9的血凝抑制活性，只對H5具有血抑活性，說明所制備的抗體為抗H5亞型禽流感血凝素的特異性單抗。用辛酸-飽和硫酸胺法純化單抗，然后進行SDS-PAGE電泳，在約50KD和27KD處各有一條明顯的條帶，重鏈約為50KD，輕鏈約為27KD。實施例3:制備和純化H5N1型禽流感多克隆抗體1.用純化濃縮的H5N1型禽流感病毒作為免疫抗原，免疫3只健康的體重在2kg左右成年雄性新西蘭大白兔，免疫程序如表l。前三次免疫每次間隔2周，第三次免疫后10d耳緣靜脈采血，分離血清，用瓊脂免疫擴散試驗(AGID)檢測兔血清的效價，若瓊擴效價達1:16以上，用不加佐劑的濃縮的重組蛋白自耳靜脈緩慢注射加強免疫l次，10d后心臟采血，分離血清，用于兔抗AIVH5亞型的重組蛋白的IgG的提取。表1兔免疫程序<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>2.多克隆抗體的提純(1)飽和硫酸銨粗提取20ml血清，加生理鹽水20ml，再加入飽和硫酸銨溶液10ml，使成20%的硫酸銨溶液，邊加邊攪拌，充分混勻后，靜置30min。3000rpm離心20min，棄沉淀。在上清液中加入再加入飽和硫酸銨30ml，使成50%硫酸銨溶液，充分混勻，靜置30min。3000rpm離心20min，泣上清。于沉淀中加入20ml生理鹽水，使之溶解，再加飽和的硫酸銨溶液10ml，充分混勻后，靜置30in。3000rpm離心20min，棄上清，重復溶解/沉淀2-3次，用10ml生理鹽水溶解沉淀。在生理鹽水中4r透析過夜，中間換液數次(用線的BaCl檢査透析液中的SO/'，直到無S0/—為止)。離心去沉淀，上清液即為粗提的IgG，將粗提的IgG溶解于PBS(0.OIM，pH7.2)中用于過柱。(2)DEAE-纖維素層析過柱用0.0175M，pH6.7的PBS作為平衡液和洗脫液。取適量的DEAE-纖維素于0.5M的氫氧化鈉溶液中，浸泡lh，不時攪拌，用布氏漏斗抽濾，用蒸餾水洗滌，再抽濾，直至濾液接近中性為止。再將纖維素浸泡于0.5M的HC1中，同樣抽濾至中型，再將纖維素浸泡于0.5M的NaOH中，同樣處理，洗至中型。然后進行平衡、裝柱、上樣后進行洗脫。連接洗脫瓶，打開柱下口開始洗脫，用20%的磺基硫酸鈉檢査，開始產生白色沉淀時收集洗脫液，直到收集液中無蛋白質為止，即為純化的IgG。將提純的IgG置透析袋中，用固體聚乙二醇(PEG，分子量6000)包埋10h進15行濃縮；測定蛋白的濃度。3.多克隆抗體測定經紫外分光光度計測定其濃度為2.8345mg/ml。實施例4:水溶性羧基化量子點的制備1.CdSe核殼量子點的制備取O.1429g硒粉，溶于lml十八烯和1.2mlTBP(三辛基磷)，密封保存備用。在三口瓶中稱取0.3mmo1氧化鎘，0.4ml油酸和4ml十八烯，在氬氣氛圍中保持30min后加熱至氧化鎘完全溶解。稱取0.5gT0P0(三辛基氧化磷)，于室溫下加入上述混合溶液中。再通氬氣45min后，混合溶液加熱至260°C,快速加入已經制備好的硒溶液，反應2min后，繼續攪拌冷卻至室溫。制備好的CdSe量子點用丙酮沉淀、洗滌兩遍后，溶于三氯甲烷中備用。2.CdSe/CdS核殼量子點的制備稱取51.9mg氧化鎘，溶于0.4ml油酸和10ml十八烯中。通氬氣30min后，混合溶液加熱至270°C，此時溶液呈淡黃透明狀，冷卻到室溫備用。稱取硫粉12.8mg，溶于10ml十八烯中，通氬氣30min后，混合溶液加熱至170°C，溶液呈黃色透明狀，冷卻到室溫備用。取2mlCdSe核量子點，加5ml十八烯，十八胺、TOPO各0.5g于燒瓶中，通氬氣40min后，加熱至10(TC，保持10min以除去多余的三氯甲垸，再加熱到220°C,此時保持系統穩定。按照文獻數據，計算出制備每層量子點所需要CcT、S2—的量。先逐滴加入第一層所需的鎘溶液，待8min后，加入第一層所需的硫溶液，25min后，再加入第二層所需的鎘溶液，同樣待8min后，加入第二層所需的硫溶液。制備好的CdSe/CdS量子點用丙酮沉淀、洗滌兩遍后，避光密封保存在冰箱中待用。3.納米量子點的表面修飾(1)巰基乙酸修飾CdSe/CdS量子點CdSe/CdS油溶性量子點先用丙酮洗滌三次，離心分離取沉淀，再用氯仿溶解分散CdSe/CdS油溶性量子點。取過量巰基乙酸加入到CdSe/CdS油溶性量子點氯仿溶液中，避光攪拌6小時，油溶性量子點表面的TOPO/TOP有機小分子大都就被水溶性的巰基乙酸分子所替代，從而實現油溶性量子點的水溶性化。反應6小時后，離心取沉淀，再用PBS溶解分散，再離心，反復三次以除去過量的巰基乙酸和其他有機分子。(2)雙親性高分子疏水自組裝改性量子點取適量的油溶性量子點粉末和雙親性三嵌段高分子溶解在3:1的氯仿/乙醇溶液中。攪拌數小時以除去氯仿有機溶劑。當氯仿被除去后(聞不到氯仿氣味時)，加入適量的PBS緩沖溶液，再超聲分散3分鐘。所得到的溶液再過0.22um膜以除去大量未結合的高分子，過膜后溶液變得光學透明。所得到的過膜溶液再用超濾管濃縮到一定濃度后再過凝膠色譜柱，進一步除去未結合的高分子。收集組分再用超濾管濃縮到適當濃度以備用。(3)超聲乳化改性取合適摩爾比的油溶性量子點/三嵌段高分子，溶解在二氯甲烷中。溶解完全后，用潔凈干燥的lml注射器移取量子點/高分子溶液。稱取6.Omg的F-68乳化劑溶解在去離子水中，劇烈攪拌得到均勻的乳液后放入超聲探頭下，超聲探頭伸入液面0.5cm以下，注射器針頭與超聲探頭底部并行。開動超聲，功率50瓦，工作時間設置為5秒，間歇時間為3秒。在超聲進行時，緩慢注入量子點/高分子溶液，此時溶液變為乳白色且在手提紫外燈照射下發出明亮的熒光。注射完畢，迅速將乳液放在磁攪拌儀上攪拌以維持穩定乳液狀態，且進一步除去二氯甲烷有機溶劑。半小時后離心分離取沉淀，反復3次以除去沒有結合的高分子和F-68乳化劑分子。4.測定制得的CdSe量子點的紫外吸收和發射光譜如圖1所示，其吸收光譜寬且連續分布，在吸收光譜上有4個激子吸收峰，表明所得產物的強量子效應。第一激子吸收峰尖銳，且隨著粒徑變大而紅移。發射譜窄而對稱，而且沒有長波拖尾現象，半峰寬只有23nm。隨著產物的粒徑大小不同，其發射光譜也不同，粒徑變大，其發射光譜也隨之紅移。如此狹窄的譜峰說明產物的粒徑分布非常狹窄(可以從HRTEM照片中看出其單分散性質)。圖2是巰基乙酸修飾CdSe/CdS油溶性量子點的紫外吸收光譜。從圖上可以看出，修飾后第一激子吸收峰變得平坦，第一激子吸收峰幾乎沒有偏移，說明改性后光譜特性變動甚少。跟蹤巰基乙酸修飾后產物的穩定性，修飾后的量子點在一周后出現少許沉淀物，且出現沉淀現象的程度與量子點溶液的濃度相關，濃度越大，出現沉淀現象越明顯。油溶性量子點表面的有機物層被親水性的巰基乙酸取代，Cd-S鍵結合的牢固程度決定了量子點的聚集程度。巰基乙酸修飾后，由于破壞了原有量子點表面化學結構，且在空氣水溶液介質中，巰基乙酸小分子也會由于量子點表面光氧化，光降解而脫離量子點，量子點濃度越大，其相互之間聚集的機會越大，從而加大沉淀的形成。雙親性高分子自組裝核心是通過疏水作用結合。油溶性量子點表面的T0P0/T0P均是含有8個碳原子的烷基疏水鏈，我們所采用的三嵌段高分子含有豐富的親水性羧基基團，經過部分羧基烷基化改性，使之連接上具有8個碳原子的辛胺。這樣通過高分子上的8碳原子與量子點表面的8碳原子疏水作用結合，在量子點表面進行自組裝，且高分子上的羧基提供親水性，使得油溶性量子點水溶性化。圖3為雙親性高分子材料自組裝改性量子點的TEM照片190，000X。圖4a是雙親性高分子疏水自組裝改性量子點的紫外吸收光譜。高分子材料由于對光也有吸收和折射，水溶改性后第一激子吸收峰變得平坦，且最大吸收峰紅移少許，表明量子點表面有高分子包裹。圖4b是改性后的熒光光譜。其半峰寬基本沒有變化，但最大發射波長有紅移(585-596nm)，進一步說明了量子點表面有被高分子包裹。圖5是超聲乳化改性量子點后的TEM照片。從圖上可以看出粒徑均勻，納米顆粒表面光滑，呈球形。且實現了量子點的單個包裹。每個顆粒里面的小黑點是油溶性CdSe/CdSQDs。超聲乳化改性，可以在量子點表面形成比較致密嚴實的高分子層，能更好的保護量子點，避免環境介質滲入而造成量子點的發光性能的破壞(如光降解，光漂白，以及Cd離子的滲出而產生毒性)；純化簡單，只需離心，而一般水溶性改性(通過疏水作用自組裝改性)需要過膜一濃縮一凝膠過濾一再濃縮等步驟。采用0/W，有機溶劑用量少，省時節能，環境友好；疏水作用自組裝修飾的納米粒子表面不光滑，而超聲乳化制備的納米粒子表面光潔，不容易引起非特異性吸附，能更好的應用在生物檢測方面。圖6是超聲乳化改性量子點的紫外吸收光譜。高分子材料由于對光也有吸收和折射，水溶改性后第一激子吸收峰變得平坦，表明量子點表面有高分子包裹且最大吸收峰幾乎沒有變化，說明量子點原有的光譜特性得以保留。從改性后的熒光光譜看最大發射波長有紅移(612-619nm)，進一步說明了量子點表面有被高分子包裹。實施例5:抗體的量子點標記1.醛基化玻片的制備將玻片用洗液(K2Cr0720g+濃H2S04350ml+H2040ml)浸泡過夜，然后用大量的去離子水沖洗，6(TC烘干2h后，將玻片浸入5%APTES的乙醇溶液中作用60min進行玻片表面的氨基化，取出水洗，晾干后，將玻片浸入含5%戊二醛的PBS(0.2mol/L，pH8.0)溶液中進行玻片的醛基化，PBS溶液清洗晾干后備用。為了驗證醛基化玻片的效果，用PAPpen在玻片上畫圈，標記出溶液反應的位置。在圓圈內加入兔IgG，37。C溫孵2h，PBS-T(0.01mol/L，pH7.2，0.05%Tween20)洗滌4次，10s/次；同等條件下，再以含1%BSA的0.02mol/LPBS溶液封閉lh。雙蒸水清洗，晾干后，加入量子點標記的羊抗兔IgG和量子點標記的羊抗雞的IgG(如圖7所示)，孵育30min，PBS-T洗滌4次，每次10min，最后用雙蒸水沖洗，熒光顯微鏡下觀察。如圖7所示，加入羊抗兔IgG可以看見橙黃色的熒光，而加入羊抗雞的IgG沒有熒光，從而證明我們制作的醛基化玻片表面能固定蛋白，并能保持所固定蛋白的活性。2.用交聯劑EDC和sulfo-NHS，采用共價鍵連接的方法進行抗體的量子點標記參見圖8所示，EDC和量子點表面的羧基反應生成酰基異脲，但酰基異脲在水溶液中容易水解，又生成羧基產物。如果在溶液中加入sulfo-NHS，酰基異脲就極易和sulfo-NHS反應，生成具有胺反應活性的sulfo-NHS酯，sulfo-NHS酯與抗體表面的氨基反應生成穩定的酰胺，從而進行抗體的量子點標記。具體的反應條件如下(1)在lml的活化緩沖液(O.1MMES，0.5MNaCl，PH6.0)中加入0.4mg(2.OmM)EDC和1.lmg(5.OmM)sulfo-NHS。(2)在溶液中加入20ul量子點溶液(3.0mM)，不停地混合溶液，在室溫下反應20min。(3)加入1.4ul(20mM)2-巰基乙醇在室溫下反應10min，得到活化的量子點溶液。(4)在lml連接緩沖液(PBS,PH7.5)中加入禽流感所需標記的(抗體與量子點分子數比例為3:1)。并用NaOH溶液調節PH至7.5，在室溫下攪拌反應2小時。(5)4000rpm離心分離1分鐘，除去小分子和未反應完全的抗體。(6)吸去并棄置上清液。(7)用2ml去離子水溶解沉淀，用反復離心或凝膠填料S印harose6FF過濾方法純化量子點標記產物。3.量子點標記產物的純化(1)沉淀離心純化把反應后的溶液14000rpm離心30min。取其沉淀，用去離子水洗滌后，用適量的PBS(PH7.4，0.01M)溶解沉淀得到量子點標記的抗體復合物。(2)凝膠過濾純化和濃縮(在AKTABasic蛋白純化儀上進行)取適量的S印harose6FF填料，用抽濾器進行抽濾，并用蒸餾水洗滌2-3次。在濾過的填料中按l:l的體積比加入蒸餾水，混勻；把填料連續地倒如柱中，打開泵裝置，并用蒸餾水進行洗滌，直至填料的液面位置不再下降為止，標記此時填料的液面位置；松開柱頭，調整柱頭的位置為填料液面以下2-3mm;用0.OIM，pH7.4的PBS作用平衡液，流速為2ml/min,觀察測定的實時的0D28。值曲線，至UOD，值曲線穩定為一條直線時停止平衡；用自動加樣器加入量子點標記的抗體溶液，用0.01M，pH7.4的PBS作為洗脫液，流速為2ml/min;收集洗脫液，每管lml，直到顯示的OD，值曲線為一條平直的直線時停止收集；按照0D28。值曲線顯示的各峰的0D28。值，合并各峰的洗脫液，其中峰1的洗脫液為量子點標記的抗體溶液；將提純的量子點標記的抗體溶液裝入透析袋中。用固體聚乙二醇(PEG，分子量6000)包埋10h進行濃縮。4.結果測定(1)量子點標記禽流感多抗我們把最后PBS溶解沉淀得到的溶液用凝膠過濾填料s印harose6FF過柱。用PBS(O.lM,pH7.4)作為平衡液和洗脫液，得到一個尖峰，峰形如圖9所示。由此看出，沉淀離心后得到的量子點標記多抗的產物為量子點標記多抗的復合物，并通過離心去除了未連接的游離的抗體、未反應的小分子偶聯劑以及其他的中間產物等。合并該峰的收集組分，在表面固定有禽流感抗原的玻片上進行封閉和洗滌后，滴加該峰的收集組分，洗滌后，在熒光顯微鏡下觀察，可以觀察到橙黃色的熒光(如圖10)。由此看出，沉淀離心后得到的量子點標記多抗的產物為量子點標記多抗的復合物,并通過離心去除了未連接的游離的抗體、未反應的小分子偶聯劑以及其他的中間產物等。合并沉淀洗滌過程中的上清液，測定D280、D260，計算上清液中游離抗體濃度，根據反應前加入的抗體的量，由此我們計算得到抗體的量子點標記效率為41.83%.取量子點標記后的抗體溶液，不經過離心，直接用凝膠過濾填料s印harose6FF進行純化，用PBS(O.1M，pH7.4)作為平衡液和洗脫液，得到的譜圖如圖11。合并峰1、峰2和峰3的收集組分，在紫外透射儀下觀察，收集的峰1組分發出橙黃色的熒光，而峰2和峰3的組分沒有發出熒光。在表面固定有禽流感H5NI抗原的玻片上進行封閉和洗滌后，滴加各峰的收集組分，洗滌后，在熒光顯微鏡下觀察，可以觀察到加入峰l組分的玻片發出橙黃色的熒光，可以證明峰1為量子點標記的禽流感多抗(如圖12a),而加入峰2和峰3的組分的玻片在熒光顯微鏡下沒有觀察到熒光(如圖12b、12c)，從而證明峰1組分為我們的目標產物即量子點標記禽流感多抗復合物。分別測定峰l、峰2、峰3組分的吸光度，按照各峰收集的體積和濃度可以算出禽流感多抗的量子點標記效率為42.64%。由此,我們可以看出，可以用沉淀離心和過柱的方法對量子點標記禽流感多抗的反應產物進行純化，兩種方法得到量子點標記禽流感多抗的效率分別為41.83%和42.64%。(2)量子點標記禽流感單抗我們采用了同樣的方法用制備的量子點標記禽流感單抗，并分別用沉淀離心和過柱的方法對標記的產物進行了純化取峰1的組分加到表面固定有禽流感抗原的玻片上進行封閉和洗滌后，滴加該峰的的組分，洗滌后，在熒光顯微鏡下觀察，可以觀察到滴加峰1組分的玻片發出橙黃色的熒光，可以證明峰1為量子點標記的禽流感單抗。通過沉淀離心方法得到的量子點標記物，過柱以后得到一個尖峰(如圖14):通過計算，沉淀離心和凝膠過濾的方法對量子點標記的多抗產物進行純化，最后得到量子點標記的禽流感多抗復合物的產率45.38%和46.18。從上述實驗中可以看出，通過沉淀離心和凝膠過濾的方法都可以對標量點標記禽流感的單抗和多抗進行純化，沉淀離心得到的目標產物的產率略低于凝膠過濾，但是凝膠過濾其操作費時，凝膠過濾后還需要濃縮，故我們采用沉淀離心的方法對量子點標記產物進行純化。實施例6:樣品的檢測1.檢測方法在醛基化的玻片表面滴加待檢樣品尿囊液，37i:孵育2h.。用PBS(0.OIM，pH7.2)洗滌玻片3次，每次5min。然后在玻片表面滴加含5%BSA的PBS-Tween溶液，37。C孵育45min。用PBS(0.01M，pH7.2)洗滌玻片3次，每次5min后，加入量子點標記的禽流感抗體，37。C孵育45min，用PBS(0.OIM，pH7.2)洗滌玻片3次，每次5min，室溫下晾干后在熒光顯微鏡下觀察，判斷樣品的陰陽性。2.降低方法的非特異性研究在玻片上孵育陰性樣品后，進行封閉和洗滌,然后加入量子點標記的禽流感多抗和禽流感標記的單抗，進行以下的方法非特異性研究(1)分別加入濃度為0.5%、0.8%、1.0%和1.5%的BSA進行封閉，研究不同濃度BSA封閉的效果。(2)實驗濃度為O.1、0.05、0.02、0.01、0.005緩沖體系中，樣品檢測出現的非特異性，確定緩沖溶液的離子強度。(3)中Tween-20濃度的確定在PBS緩沖液中分別加入濃度為0.01%、0.05%、0.1%、0.2%和0.5%的Tween-20,試驗洗滌液中Tween-20的濃度。結果通過在陰性樣品上加入不同濃度BSA的封閉效果研究，我們選定濃度為1。/oBSA作為封閉液。由于量子點表面修飾羧基，帶負電,所以離子強度過高，會引起靜電吸附，我們適當降低了緩沖溶液的離子強度，以降低非特異性吸附。經過實驗，我們釆用了0.OIM、pH7.4的PBS為緩沖溶液。為了減少非特異性吸附，我們在洗滌液PBS中加入不同濃度的Tween。通過實驗確定，我們選用0.1%的PBS-T作為洗滌緩沖液。通過實驗驗證，本方法中，用量子點標記的單抗其特異性要略優于量子點標記的禽流感多抗。3.方法的特異性研究(1)標記選擇的禽流感單抗或多抗，用量子點標記的抗體分別檢測常見的禽類病毒新城疫F48E9、IBDV、鴨瘟病毒和鴨肝炎病毒進行檢測，觀察是否出現假陽性結果，驗證方法的特異性。(2)取一份未感染禽流感病毒的雞胚尿囊液，分別按本研究所建立的方法和間接免疫熒光法進行檢測，在熒光顯微鏡下觀察，比較兩種方法的非特異性。結果(1)圖15a、b、c和d分別表示量子點標記的H5N1型禽流感單抗檢測新城疫F48E9、IBDV、鴨瘟病毒和鴨肝炎病毒，實驗結果證明，沒有出現假陽性結果。證明方法的特異性較好。(2)分別按本研究建立的方法和間接熒光免疫法對未感染禽流感病毒的尿囊液進行檢測，兩種方法檢測的結果如圖16，a為本研究建立方法的檢測結果，b為免疫熒光檢測的結果。從圖16可以看出，本研究所建立的檢測方法，其非特異性較好，沒有觀察到非特異性的熒光，而用免疫熒光方法出現了少量的非特異性熒光。證明此方法的特異性要優于免疫熒光的方法。4.方法的靈敏度研究取感染的尿囊液作10倍梯度稀釋，然后用本研究所建立的方法進行檢測，確定方法的靈敏度。結果通過實驗驗證，我們在檢測尿囊液時，本研究所建立的方法能檢測積胚尿囊液的最高稀釋倍數為1Q—6。5.檢測結果的穩定性研究用本研究所建立的方法對陽性樣本進行檢測，然后在室溫下放置l天、3天、5天、10天、15和30天后再觀察檢測結果。結果通過實驗證明，檢測過的樣本在室溫下放置30天后仍能觀察到明亮的熒光。權利要求1.H5N1型高致病性禽流感的納米量子點檢測方法，其特征在于包括如下步驟(1)制備和純化H5N1型禽流感單克隆抗體或多克隆抗體；(2)制備水溶性羧基化納米量子點；(3)納米量子點標記H5N1型禽流感單克隆抗體或多克隆抗體；(4)樣品測定。2.根據權利要求1所述的H5N1型高致病性禽流感的納米量子點檢測方法，其特征在于所述(1)制備和純化H5N1型禽流感單克隆抗體的方法為用純化濃縮的H5N1型禽流感病毒作為免疫抗原免疫8周齡Balb/c小鼠；獲得免疫脾細胞與SP2/0細胞融合得到雜交瘤細胞；篩選陽性雜交瘤細胞的克隆進行培養獲得穩定分泌抗體的雜交瘤細胞株；將雜交瘤細胞株注射入Balb/c小鼠腹腔以體外誘生腹水法獲得含單克隆抗體的腹水；采用辛酸-飽和硫酸胺法濃縮和純化腹水獲得單克隆抗體。3.根據權利要求1所述的H5N1型高致病性禽流感的納米量子點檢測方法，其特征在于所述(1)制備和純化H5N1型禽流感多克隆抗體的方法為用純化濃縮的H5N1型禽流感病毒作為免疫抗原，免疫新西蘭大白兔；10天后心臟采血，分離血清；飽和硫酸銨粗提多抗；DEAE-纖維素層析過柱后純化的IgG置透析袋中，用固體聚乙二醇包埋進行濃縮獲得多克隆抗體。4.根據權利要求1所述的H5N1型高致病性禽流感的納米量子點檢測方法，其特征在于所述(3)納米量子點標記H5N1型禽流感單克隆抗體或多克隆抗體的方法為制備醛基化玻片；利用交聯劑EDC和sulfo-NHS采用共價鍵連接的方法進行抗體的量子點標記。5.根據權利要求4所述的H5N1型高致病性禽流感的納米量子點檢測方法，其特征在于所述制備醛基化玻片是指將玻片用洗液(K2Cr0720g+濃H2S04350ml+H2040ml)浸泡過夜，然后用大量的去離子水沖洗，6CTC烘干2h后，將玻片浸入5。MPTES的乙醇溶液中作用60min進行玻片表面的氨基化，取出水洗，晾干后，將玻片浸入含5%戊二醛的PBS(0.2mol/L，pH8.0)溶液中進行玻片的醛基化，PBS溶液清洗晾干后備用。6.根據權利要求4所述的H5N1型高致病性禽流感的納米量子點檢測方法，其特征在于:所述利用交聯劑EDC和sulfo-NHS采用共價鍵連接的方法進行抗體的量子點標記是指在1.5ml的印pendorf中加入lml的活化緩沖液(O.腦ES，0.5MNaCl，PH6.0)，然后加入加入適量的EDC和sulfo-NHS溶液；再在溶液中加入20ul量子點溶液，不停地混合溶液，室溫下反應20min;加入1.4ul(20mM)2-巰基乙醇在室溫下反應10min,得到活化的量子點溶液；在活化的量子點溶液中，加入lml含適量H5N1型禽流感抗體的PBS溶液(0.01M,pH7.5)，并用NaOH溶液調節PH至7.5，室溫下攪拌反應2小時；4000rpm離心分離1分鐘，除去小分子和未反應完全的抗體；用5ml去離子水溶解沉淀，重復對量子點標記的禽流感單克隆抗體溶液進行溶解/沉淀2次，最后用2ml去離子水溶解沉淀，4。C保存。7.根據權利要求1所述的H5N1型高致病性禽流感的納米量子點檢測方法，其特征在于所述(4)樣品測定的方法為在醛基化的玻片表面滴加待檢樣品尿囊液，37"C孵育2h;用洗滌玻片3次，每次5min;然后在玻片表面滴加含5%BSA的PBS-Tween溶液，37。C孵育45rain;用0.OIM，pH7.2的PBS洗滌玻片3次，每次5min后，加入量子點標記的禽流感抗體，37t孵育45min，用0.OIM，pH7.2的PBS洗滌玻片3次，每次5min;室溫下晾干后在熒光顯微鏡下觀察，判斷樣品的陰陽性。8.—種水溶性羧基化納米量子點，其特征在于采用如下方法制備得到(1)制備CdSe核殼量子點；(2)制備CdSe/CdS核殼量子點；(3)巰基乙酸修飾CdSe/CdS量子點；(4)雙親性高分子疏水自組裝改性量子點；(5)超聲乳化改性量子點。9.一種制備水溶性羧基化納米量子點的方法，包括如下步驟-(1)制備CdSe核殼量子點；(2)制備CdSe/CdS核殼量子點；(3)巰基乙酸修飾CdSe/CdS量子點；(4)雙親性高分子疏水自組裝改性量子點；(5)超聲乳化改性量子點。全文摘要本發明公開了一種H5N1型高致病性禽流感的納米量子點檢測方法，屬于屬于檢驗檢疫領域。該方法包括如下步驟(1)制備和純化H5N1型禽流感單克隆抗體或多克隆抗體；(2)制備水溶性羧基化納米量子點；(3)納米量子點標記H5N1型禽流感單克隆抗體或多克隆抗體；(4)樣品測定。本發明的優點是納米量子點應用于H5N1型高致病性禽流感檢測的診斷方法，該方法快速、穩定、便于高通量檢測、條件要求低、操作簡便，易于推廣，具有操作簡單、快速和靈敏度高等特點。該方法的建立將為我國高致病性禽流感的監測和診斷提供了一種有效的手段，在進出口檢疫上具有良好的推廣和應用前景。文檔編號G01N33/533GK101290319SQ20071006555公開日2008年10月22日申請日期2007年4月16日優先權日2007年4月16日發明者劉全國,劉旭輝,史喜菊,津常,張兵波,李冰玲,李炎鑫,馬貴平申請人:北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心;天津大學
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