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專利名稱：對蝦白斑桿狀病毒的診斷試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖生物病毒的診斷試劑盒及其檢測方法，更具體涉及對蝦白斑桿狀病毒的診斷試劑盒及其檢測方法。
1993年以來，我國蝦病爆發(fā)性流行，引起養(yǎng)殖的對蝦大面積死亡，經(jīng)濟(jì)損失慘重。研究表明，其主要是由一種新的沒有包涵體的C型桿狀病毒一對蝦白斑桿狀病毒所致。該病毒可以感染我國所有人工養(yǎng)殖的對蝦種類，感染性強(qiáng)，發(fā)病快，死亡率高，給對蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來極大的危害；據(jù)報(bào)道，其它國家和地區(qū)也有類似情況。目前，對對蝦病毒病尚無有效的治療方法，避免與病毒病源接觸被認(rèn)為是最有效的預(yù)防措施，而這主要依賴于早期的快速診斷。目前的診斷方法主要有多聚鏈反應(yīng)(PCR)、核酸探針技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)。PCR技術(shù)雖然靈敏度高，但費(fèi)用昂貴，只有少數(shù)有經(jīng)濟(jì)實(shí)力的單位可使用。核酸探針技術(shù)對技術(shù)條件要求高，檢測時間長，廣大蝦農(nóng)掌握此技術(shù)難度很大，難以推廣；酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)雖可在養(yǎng)蝦場應(yīng)用，但由于此法所需的多克隆抗體和單克隆抗體制備麻煩、費(fèi)用高，限制了該技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。
早期快速診斷對蝦白斑桿狀病毒是目前對蝦養(yǎng)殖的主要預(yù)防措施和減少蝦農(nóng)損失的有效途徑，因此，快速、方便的診斷試劑盒及其檢測方法是廣大蝦農(nóng)急切盼望的。
本發(fā)明的目的是提供一種由噬菌體抗體展示技術(shù)制備的能識別對蝦白斑桿狀病毒的單鏈抗體A1，以及以此為主體設(shè)計(jì)的對蝦白斑桿狀病毒的診斷試劑盒及其檢測方法，該試劑盒可批量生產(chǎn)、成本低，操作簡單、方便，能在實(shí)驗(yàn)室或養(yǎng)蝦現(xiàn)場用于對蝦白斑桿狀病毒的檢測；該檢測方法可快速、方便地檢測出對蝦待測樣品是否感染對蝦白斑桿狀病毒。
本發(fā)明的一種對蝦白斑桿狀病毒的診斷試劑盒由下列部件構(gòu)成(1)、1號小管，內(nèi)裝能識別對蝦白斑桿狀病毒的單鏈抗體A1，為大腸桿菌培養(yǎng)液凍干粉或大腸桿菌周質(zhì)空間提取液凍干粉。
(2)、2號小管，內(nèi)裝抗單鏈抗體E-tag的兔抗鼠免疫球蛋白IgG/辣根過氧化物酶與脫脂奶粉/PBS的混合物。
(3)、3號小管，內(nèi)裝純化對蝦白斑桿狀病毒。
(4)、4號小管，內(nèi)裝二氨基聯(lián)苯胺。
(5)、5號小管，內(nèi)裝10x三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)，pH 7.6(6)、6號小管，內(nèi)裝H2O2(7)、7號小管，內(nèi)裝重鉻酸鉀。
(8)、8號小管，內(nèi)裝吐溫-20(9)、9號小袋，內(nèi)裝硝酸纖維素膜。
(10)、10號小袋，內(nèi)裝PBS鹽類組合。
(11)、11號小袋，內(nèi)裝脫脂奶粉。
(12)、長方體盒子。
(13)、1塊泡沫板，其大小與長方體盒子的底面相同，泡沫板的一邊有8個孔，孔的大小正好可放入上述1～8號小管。
對蝦白斑桿狀病毒的檢測裝置的各部件按下列方式安置1～8號小管順序放在泡沫板的8個孔中，9～11號小袋放在泡沫板的另一邊。
對蝦白斑桿狀病毒的檢測方法按下列步驟進(jìn)行1)將待測樣品對蝦血淋巴液點(diǎn)于硝酸纖維素膜上。
2)將膜放入4％脫脂奶粉/PBS中，于室溫放置0.5～3分鐘。
3)再將膜浸入0.025mol/L重鉻酸鉀溶液中，室溫放置9～11分鐘，使對蝦血淋巴中的氧化酶類失活。
4)用PBS將膜洗2～5次。
5)將膜與含有單鏈抗體A1的大腸桿菌培養(yǎng)液，在室溫下保溫5～15分鐘。
6)用0.1％吐溫-20/PBS將膜洗2～5次，再用PBS洗2～5次。
7)將膜與4％脫脂奶粉/PBS 1∶8000倍稀釋的抗單鏈抗體E-tag的免抗鼠IgG/辣根過氧化物酶在室溫下保溫5～15分鐘。
8)將膜用吐溫-20/PBS洗2～5次，再用PBS洗2～5次。
9)將二氨基聯(lián)苯胺和H2O2加入到50mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-Hcl)，PH 7.6中，制成底物溶液，再將膜放入底物溶液中，反應(yīng)5～15分鐘，有褐色斑點(diǎn)即為病毒陽性。
其中1號小管中A1單鏈抗體的DNA序列如下GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGAAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAAGTTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAATGGATTGGATGGATTTATCCTGACAATGGTAATACTATATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCAGAATAACAGCAGATACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGTTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGTGGTGGTAACCCCTGGGTACTGGGGTCAAGGCACCACTCTCTCCGTGTCACAGGTGGAGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGAGGTTCTAGACGTCGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTAGCCTGNTATCNACAGAAACCAGGGCGATCTCCTAAAACACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAGCAGCTATCCTCTCACATTCGGTGGTGGGACCAAGTTGGAAATCAAGCGCGCGGCCGCA其制備方法為首先從感病斑節(jié)對蝦的血淋巴液中分離純化白斑桿狀病毒，將抗體片段的基因克隆到絲狀噬菌體N-末端第三蛋白基因區(qū)域，表達(dá)的融合蛋白在噬菌體尾尖表面展示。具有抗原結(jié)合活力的抗體片段若由重鏈和輕鏈的可變區(qū)域組成，由一可彎曲的小肽連接成為氨基酸單鏈的形式，稱為單鏈抗體。單鏈抗體片段的獲得是通過PCR技術(shù)對免疫過或未免疫的小白鼠脾臟mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，克隆到噬菌體表達(dá)載體上。具有抗原結(jié)合活力的噬菌體抗體可直接利用抗原親和性從重組噬菌體抗體文庫中淘選，通過再感染大腸桿菌及菌體擴(kuò)增培養(yǎng)，可獲得本發(fā)明所述的單鏈抗體A1。
其具體制備方法包括如下步驟1、采用蔗糖密度梯度超速離心法，用電鏡檢測，從感病斑節(jié)對蝦的血淋巴液中分離純化白斑桿狀病毒。
2、用蛋白量為20～150μg純化的完整對蝦白斑桿狀病毒粒子注射小鼠，用Titremax佐劑或福氏佐劑或氫氧化鋁等常用佐劑，經(jīng)17～26天進(jìn)行二次或三次免疫，再經(jīng)3～5天用酶聯(lián)免疫印跡法和酶聯(lián)免疫吸附法測定抗體效價，取抗體效價最高的小鼠脾臟，從中提取mRNA。
3、將此mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再用對應(yīng)于重鏈和輕鏈抗體可變部位DNA的引物通過PCR技術(shù)將抗體的重鏈和輕鏈的可變片段的DNA擴(kuò)增。
4、用一編碼可彎曲小肽的DNA小片段將重鏈和輕鏈DNA片段連接起來組成單鏈抗體DNA，再用對應(yīng)單鏈抗體DNA的引物用PCR技術(shù)將整個片段擴(kuò)增。
5、將單鏈抗體DNA片段兩端的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(Sfi I和Not I)酶切，再與具同樣酶切位點(diǎn)的噬菌體表達(dá)載體連接，電轉(zhuǎn)移至大腸桿菌中，可獲得較高效價的噬菌體抗體cDNA文庫。
6、用吸附在朔料管壁上的對蝦白斑桿狀病毒對上述噬菌體抗體文庫進(jìn)行1～4次淘選，用酶聯(lián)免疫吸附法篩選可得到抗原結(jié)合專一性的陽性克隆，該陽性克隆分泌的單鏈抗體可專一性識別對蝦白斑桿狀病毒。
7、選取具有較強(qiáng)ELISA信號的菌株，用于制備可溶性單鏈抗體，可得到專一識別對蝦白斑桿狀病毒的單鏈抗體A1。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與效果單鏈抗體A1可直接用于診斷對蝦白斑桿狀病毒，適合對蝦病毒病的早期檢測，其制備方法比多克隆抗體和單克隆抗體要簡便和便宜的多，且可大量制備。以單鏈抗體A1為主體設(shè)計(jì)的病毒檢測試劑盒，實(shí)現(xiàn)了感染對蝦白斑桿狀病毒快速、簡便、靈敏的檢測需要，1小時內(nèi)可檢測100個樣品，大大快于PCR和DNA雜交檢測方法。
實(shí)施例1對蝦白斑桿狀病毒的診斷試劑盒，該試劑盒由下列部件組成(1)、1號塑料小管，內(nèi)裝能識別對蝦白斑桿狀病毒的A1單鏈抗體，用3ml大腸桿菌培養(yǎng)液凍干粉或100μl大腸桿菌周質(zhì)空間提取液凍干粉。
(2)、2號塑料小管，內(nèi)裝0.5μl抗單鏈抗體E-tag的兔抗鼠免疫球蛋白IgG/辣根過氧化物酶(Pharmarcia公司購得)與脫脂奶粉/PBS混合的凍干粉。
(3)、3號塑料小管，內(nèi)裝純化對蝦白斑桿狀病毒，凍干粉2μg。
(4)、4號塑料小管，內(nèi)裝二氨基聯(lián)苯胺(DAB，華美公司購得)，固體6mg。
(5)、5號塑料小管，內(nèi)裝10X三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，pH 7.6，1ml(6)、6號塑料小管，內(nèi)裝10μl H2O2(7)、7號塑料小管，內(nèi)裝重鉻酸鉀，固體37mg。
(8)、8號塑料小管，內(nèi)裝吐溫-20，0.1ml液體。
(9)、9號塑料小袋，內(nèi)裝50mm×80mm兩片硝酸纖維素膜(國產(chǎn))。
(10)、10號塑料小袋，內(nèi)裝PBS鹽類組合3g。
(11)、11號塑料小袋，內(nèi)裝脫脂奶粉1g。
(12)、長方體盒子(11×7×3.5cm)。
(13)、1塊泡沫板，其大小與長方體盒子的底面相同，泡沫板的一邊有8個孔，孔的大小正好可放入上述1～8號小管。
對蝦白斑桿狀病毒的檢測裝置的各部件按下列方式安置1～8號小管順序放在泡沫板的8個孔中，9～11號小袋放在泡沫板的另一邊。
實(shí)施例2對蝦白斑桿狀病毒的檢測方法，該方法按下列步驟進(jìn)行(以下所用的塑料小管和塑料小袋的號均指實(shí)施例1中的號碼)1、將3號塑料小管中的凍干粉溶于5ml純凈水中與5μl待測樣品對蝦血淋巴液分別點(diǎn)在9號塑料小袋中的硝酸纖維素膜上的不同位置，干后再放回9號塑料小袋中。
2、將300ml純凈水加入10號塑料小袋中，使PBS鹽類完全溶解；再取25ml PBS加入11號塑料小袋中，制成4％脫脂奶粉/PBS。取5ml 4％脫脂奶粉/PBS放入9號塑料小袋中，于室溫下保溫1分鐘，將液體倒出。
3、將7號塑料小管中的重鉻酸鉀溶于5ml純凈水中，再加入9號塑料小袋中，使硝酸纖維素膜浸入10分鐘，使對蝦血淋巴液中的氧化酶類失活。
4、用10ml PBS將膜清洗，將液體倒出，這樣反復(fù)清洗3次。
5、將1號塑料小管中的單鏈抗體溶于3ml純凈水中，再將其加入9號小袋中，與膜在室溫下保溫10分鐘。
6、將8號塑料小管中的吐溫-20溶于100ml PBS，用其15ml×3將膜洗3次，再用10ml×3PBS洗三次。
7、將2號塑料小管中的二抗溶于3ml純凈水中，再將其加入7號小袋中，與膜在室溫下保溫10分鐘。
8、將膜用吐溫-20/PBS洗3次，再用PBS洗3次。
9、將5號塑料小管中的液體稀釋10倍至10ml，再將其與4號和6號塑料小管中之物混合，制成底物溶液，再將膜放入底物溶液中，反應(yīng)10分鐘，有褐色斑點(diǎn)即為病毒陽性。
權(quán)利要求
1.一種對蝦白斑桿狀病毒的診斷試劑盒，其特征在于，該診斷試劑盒由下列部件構(gòu)成(1)、1號小管，內(nèi)裝能識別對蝦白斑桿狀病毒的單鏈抗體A1，為大腸桿菌培養(yǎng)液凍干粉或大腸桿菌周質(zhì)空間提取液凍干粉；(2)、2號小管，內(nèi)裝抗單鏈抗體E-tag的兔抗鼠免疫球蛋白IgG/辣根過氧化物酶與脫脂奶粉/PBS的混合物；(3)、3號小管，內(nèi)裝純化對蝦白斑桿狀病毒；(4)、4號小管，內(nèi)裝二氨基聯(lián)苯胺；(5)、5號小管，內(nèi)裝10X三羥甲基氨基甲烷一鹽酸(Tris-HCl)，pH 7.6；(6)、6號小管，內(nèi)裝H2O2；(7)、7號小管，內(nèi)裝重鉻酸鉀；(8)、8號小管，內(nèi)裝吐溫-2O；(9)、9號小袋，內(nèi)裝硝酸纖維素膜；(10)、10號小袋，內(nèi)裝PBS鹽類組合；(11)、11號小袋，內(nèi)裝脫脂奶粉；(12)、長方體盒子；(13)、1塊泡沫板，其大小與長方體盒子的底面相同，泡沫板的一邊有8個孔，孔的大小正好可放入上述1～8號小管；對蝦白斑桿狀病毒的診斷試劑盒各部件按下列方式安置1～8號小管順序放在泡沫板的8個孔中，9～11號小袋放在泡沫板的另一邊。
2.一種使用對蝦白斑桿狀病毒診斷試劑盒的檢測方法，其特征在于，該檢測方法順序按下列步驟進(jìn)行(1)、將待測樣品對蝦血淋巴液點(diǎn)于硝酸纖維素膜上；(2)、將膜放入4％脫脂奶粉/PBS中，于室溫放置0.5～3分鐘；(3)、再將膜浸入0.025mol/L重鉻酸鉀溶液中，室溫放置9～11分鐘，使對蝦血淋巴中的氧化酶類失活；(4)、用PBS將膜洗2～5次；(5)、將膜與含有單鏈抗體A1的大腸桿菌培養(yǎng)液，在室溫下保溫5～15分鐘；(6)、用0.1％吐溫一2O/PBS將膜洗2～5次，再用PBS洗2～5次；(7)、將膜與4％脫脂奶粉/PBS 1∶8000倍稀釋的抗單鏈抗體E-tag的兔抗鼠IgG/辣根過氧化物酶在室溫下保溫5～15分鐘；(8)、將膜用吐溫-20/PBS洗2～5次，再用PBS洗2～5次；(9)、將二氨基聯(lián)苯胺和H2O2加入到50mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-Hcl)，PH 7.6中，制成底物溶液，再將膜放入底物溶液中，反應(yīng)5～15分鐘，有褐色斑點(diǎn)即為病毒陽性。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種對蝦白斑桿狀病毒的診斷試劑盒及其檢測方法,以單鏈抗體A1為主體設(shè)計(jì)的病毒檢測試劑盒,實(shí)現(xiàn)了感染對蝦白斑桿狀病毒快速、簡便、靈敏的檢測需要,其檢測方法利用診斷試劑盒可在1小時內(nèi)快速、簡便、靈敏地檢測100個對蝦樣品,大大優(yōu)于PCR和DNA雜交檢測方法。
文檔編號G01N33/569GK1356550SQ00131230
公開日2002年7月3日 申請日期2000年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月8日
發(fā)明者戴和平, 高宏, 趙新顏, 戴玲芬, 張憲孔, 趙若虹, 韓明申, M Hanmingsen) (Seam, 高坤山 申請人:中國科學(xué)院水生生物研究所