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一種人s100蛋白檢測試劑及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種人S100蛋白檢測試劑及制備方法，特別是采用乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測人S100蛋白的試劑及制備方法，包括試劑R1、試劑R2以及校準(zhǔn)品，其特征在于：所述試劑R1為pH值為7.0-8.0的改性緩沖液；所述試劑R2為抗人S100蛋白抗體膠乳試劑；所述校準(zhǔn)品為含有定量的S100蛋白的重組蛋白或者是從人血清中提取出來的天然S100蛋白標(biāo)準(zhǔn)液。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下特點(diǎn)：①準(zhǔn)確性高（與化學(xué)發(fā)光免疫分析法的相關(guān)性R2為0.9956-0.9995）。②檢測快速（從測定開始到得出結(jié)果只需要10分鐘）。能夠在常規(guī)生化儀上進(jìn)行大批量樣本測定，大大提高了檢測工作效率。該試劑的制備方法操作簡便，原料易得，成本不高，適合各類醫(yī)學(xué)研究單位以及常規(guī)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。
【專利說明】—種人SIOO蛋白檢測試劑及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種人SlOO蛋白檢測試劑及制備方法，特別是采用乳膠增強(qiáng)免疫比 濁法檢測人SlOO蛋白的試劑及制備方法，可應(yīng)用在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]人中樞神經(jīng)蛋白(S-100蛋白)主要集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞及相應(yīng)的 腫瘤細(xì)胞內(nèi)，s-100分子由a和0亞基組成，其分子量為21000，生物半衰期22小時(shí)。腦 脊液中的S-100蛋白與年齡有關(guān)，隨著年齡的增加而增高，但血漿中的S-100蛋白濃度與年 齡、性別無確切關(guān)系。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞損傷時(shí)SlOO蛋白從胞液中滲出進(jìn)入腦脊液，再 經(jīng)受損的腦血屏障進(jìn)入血液。因此腦脊液和血液中SlOO蛋白增高是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷特 異和敏感的生化標(biāo)志。
[0003]目前，臨床已經(jīng)使用S-100蛋白單克隆抗體對臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測，從檢測角度上 來說，目前臨床上用于測定s-100的方法主要有放免法、ELISA法、化學(xué)發(fā)光法等。
[0004]過去以放免為代表的人SlOO蛋白(S-100)測定試劑受方法學(xué)的限制，其靈敏度和 抗干擾能力嚴(yán)重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市場，目前應(yīng)用較多的為酶聯(lián)免疫檢 測技術(shù)和化學(xué)發(fā)光技術(shù)。
[0005]酶聯(lián)免疫法(ELISA)自動(dòng)化程度不高，且受人為因素影響較大，重復(fù)性差，整個(gè)反 應(yīng)測定時(shí)間也很長(至少需要40分鐘)。
[0006]化學(xué)發(fā)光法(CLIA)是利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑催化和氧化劑氧化，形成一個(gè) 激發(fā)態(tài)的中間體，這種激發(fā)態(tài)的中間體回到穩(wěn)定基態(tài)時(shí)，發(fā)出光子，利用發(fā)光信號測量儀測 量光子數(shù)，從而間接測定濃度。該方法又分為兩種，一種是直接標(biāo)記法，屬于瞬間發(fā)光型，很 難保證測試結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性，而且需要特殊的檢測儀器。不便于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室開展。第 二中生物素-親和素標(biāo)記電化學(xué)發(fā)光免疫試劑法，需要配套昂貴的全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光檢測 儀，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室無法開展，而且給患者帶來不必要的費(fèi)用，增加患者負(fù)擔(dān)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于克服上述問題，提供一種人SlOO蛋白檢測試劑；所提供的試劑 具有準(zhǔn)確度高、測定時(shí)間短(最多只需要15分鐘、甚至更短)、重復(fù)性好，操作簡單、適用于各 種類型的生化分析儀的特點(diǎn)；所提供的試劑制備方法具有制作方便以及成本不高的特點(diǎn)。
[0008]人SlOO蛋白檢測試劑及制備方法，作為兩項(xiàng)發(fā)明創(chuàng)造，具有共同的特定技術(shù)特 征:通過膠乳微粒和抗人SlOO抗體的偶聯(lián)，利用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法檢測人血清SlOO含 量，屬于一個(gè)相同的發(fā)明構(gòu)思，符合單一性要求。
[0009]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:一種人SlOO蛋白檢測試劑，包 括試劑R1、試劑R2以及校準(zhǔn)品，其特征在于:所述試劑Rl為PH值為7.0-8.0的改性緩沖 液；所述試劑R2為抗人SlOO蛋白抗體膠乳試劑；所述校準(zhǔn)品為含有定量的SlOO蛋白的重 組蛋白或者是從人血清中提取出來的天然SlOO蛋白。[0010]前述的一種人SlOO蛋白檢測試劑，所述的試劑用于人外周血血清樣本的測定。
[0011]前述的一種人SlOO蛋白檢測試劑，所述的試劑Rl組成如下:
【權(quán)利要求】
1.一種人SlOO蛋白檢測試劑，包括試劑R1、試劑R2以及校準(zhǔn)品，其特征在于:所述試劑Rl為PH值為7.0-8.0的改性緩沖液；所述試劑R2為抗人SlOO蛋白抗體膠乳試劑；所述校準(zhǔn)品為含有定量的SlOO蛋白的重組蛋白或者是從人血清中提取出來的天然SlOO蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人SlOO蛋白檢測試劑，其特征在于:所述的試劑用于人外周血血清樣本的測定。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種人SlOO蛋白檢測試劑，其特征在于，所述的試劑Rl組成如下:
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種人SlOO蛋白檢測試劑，其特征在于:試劑R2由抗人單克隆或多克隆抗體膠乳微球、緩沖液、穩(wěn)定劑和防腐劑組成；抗體為兔抗人SlOO蛋白單克隆抗體、鼠抗人SlOO蛋白單克隆抗體、羊抗人SlOO蛋白單克隆抗體一種或者幾種混合；或者為兔抗人SlOO蛋白多克隆抗體、鼠抗人SlOO蛋白多克隆抗體、羊抗人SlOO蛋白多克隆抗體的其中一種。所述穩(wěn)定劑選自小牛白蛋白、甘氨酸、明膠、吐溫20、曲拉通的一種或者幾種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種人SlOO蛋白檢測試劑，其特征在于:所述的膠乳微球的基本材質(zhì)是聚苯乙烯或共聚苯乙烯，表面用羧基基團(tuán)COOH修飾或不作任何修飾；羧基膠乳微球直徑為80-300nm。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種人SlOO蛋白檢測試劑，其特征在于:所述的校準(zhǔn)品包括5份形成SlOO蛋白系列濃度的參考校準(zhǔn)品；5份參考校準(zhǔn)品中的 SlOO 蛋白含量由低到高分別為 20pg/ml、60pg/ml、.180pg/ml、540pg/ml、1620pg/ml ;或者所述SlOO蛋白校準(zhǔn)品是單點(diǎn)高濃度的SlOO蛋白參考校準(zhǔn)品；其中校準(zhǔn)品的組成如下:
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任意一項(xiàng)所述的一種人SlOO蛋白檢測試劑，其特征在于:所述的試劑能檢測SlOO蛋白濃度在0.02ng/ml-l.6ng/ml的樣本,通過最低檢出限和定標(biāo)曲線的最高值確定；當(dāng)樣本濃度超過該范圍，先對樣本進(jìn)行稀釋處理。
8.—種人SlOO蛋白檢測試劑的制備方法，其特征在于:按照以下步驟進(jìn)行:①Rl試劑制備:按配方量將緩沖液、促進(jìn)劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、電解質(zhì)以及純化水混合均勻，調(diào)PH值至.7.0-8.0 ；②所述R2試劑抗人SlOO蛋白抗體的膠乳試劑的制備包括以下步驟:步驟1:將膠乳在PH6.0的溶液中活化；取羧基膠乳微球用緩沖液稀釋成濃度為0.01mg/ml的懸浮液，按Iml的羧基膠乳微球懸浮液加20mgl-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDAC羧基活化劑)和40mg 的N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽(NHS)的比例，即加入EDAC和NHS，混勻后在室溫將此混合物反應(yīng)15-30分鐘并不斷攪拌；步驟2:用緩沖液或純化水洗滌羧基膠乳微球，去掉溶液中未反應(yīng)的碳化二亞胺，并將膠乳微球在純化水中懸浮得羧基膠乳微球懸浮液，使其濃度控制為0.01mg/ml ；步驟3:將抗SlOO蛋白抗體溶于緩沖溶液中，使抗人SlOO蛋白抗體的蛋白質(zhì)濃度為 5ng/ml ；步驟4:取步驟2中的羧基膠乳微球懸浮液Iml立即加入步驟3中的抗人SlOO蛋白抗體Iml ;使該混合液中羧基膠乳微球、抗人SlOO蛋白抗體和緩沖溶液的濃度分別為 0.005mg/ml、2.5mg/ml、25mmol/L ；步驟5:將混合物在37°C反應(yīng):4小時(shí)，不斷攪拌；步驟6:按Iml反應(yīng)混合物加2.5 ii I的乙醇胺的比例加入乙醇胺，反應(yīng)10-30分鐘，不斷攪拌；步驟7:離心除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)和乙醇胺，用緩沖液稀釋，使抗人SlOO蛋白抗體膠乳顆粒濃度為0.002-0.01mg/ml，然后加入穩(wěn)定劑、防腐劑溶解混勻后即得試劑R2 ；③所述校準(zhǔn)品:先按配方量將防腐劑、穩(wěn)定劑及緩沖液混合并分成5份混合液，然后按照需要的SlOO 蛋白參考校準(zhǔn)品濃度，將相應(yīng)量的10ng/ml的SlOO蛋白純品分別加入上述混合液中，獲得形成系列濃度的5份參考校準(zhǔn)品；5份參考校準(zhǔn)品中的SlOO蛋白含量由低到高分別為 20pg/ml、60pg/ml、180pg/ml、540pg/ml、1620pg/ml ；或者按配方量將防腐劑、穩(wěn)定劑及緩沖液混合后得混合液，然后在混合液中加入一定量的10ng/ml的SlOO蛋白純品，獲得單點(diǎn)高濃度SlOO蛋白參考校準(zhǔn)品；使用時(shí)再用生理鹽水稀釋成多個(gè)不同濃度的參考校準(zhǔn)品；制得的SlOO蛋白參考校準(zhǔn)品能與樣品比較，并能測定樣品中SlOO蛋白的含量。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種人SlOO蛋白檢測試劑的制備方法，其特征在于:在步驟 2中，去掉溶液中所含的未反應(yīng)的物質(zhì)時(shí)，采用高速離心機(jī)或者單層微孔濾膜進(jìn)行過濾；離心機(jī)轉(zhuǎn)速為15000轉(zhuǎn)/分，單層微孔濾膜的孔徑為0.22um。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種人SlOO蛋白檢測試劑的制備方法，其特征在于:在步驟7中，所述的穩(wěn)定劑是小牛白蛋白、甘氨酸、明膠、吐溫20、曲拉通的一種或者幾種。
【文檔編號】G01N33/68GK103604931SQ201310572894
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月15日
【發(fā)明者】陸上蘇 申請人:陸上蘇