專利名稱：：一種卵巢腫瘤血清標志物的制作方法
技術領域：
：本發明屬生物
技術領域：
，具體涉及一種卵巢腫瘤血清標志物。
背景技術：
：研究揭示，卵巢癌為婦科三大惡性腫瘤之一，死亡率居女性生殖系統惡性腫瘤的首位。目前臨床對于卵巢癌的早期診斷仍面臨諸多困難，一般體檢和影像學檢查作用有限，待能夠發現和明確診斷時，往往已到了中、晚期，缺少預警價值。常用于檢查的血清標志物如癌抗原125(CA125)對于惡性卵巢腫瘤有提示作用，但仍容易與炎癥、良性腫瘤導致的改變相混淆，因而易造成誤診(準確性70%-80%)。為了滿足臨床診斷日益提高的靈敏度和特異性要求，開發新的血清腫瘤標志物勢在必行。研究顯示，惡性腫瘤發生必然伴隨一系列基因結構的改變，引起細胞代謝方式轉換。如由有氧呼吸為主改變為無氧酵解方式；由定向生長變為無向繁殖，并分泌酶類降解基質侵入周圍；還大量分泌原先不/弱表達的多肽，如CA125、pl85等。這種代謝變化在早期即可被檢測出，如在絨癌早期，可以測出血清中高糖化人絨毛膜促性腺激素beta單位的核心成分beta-hCGcore。故尋找到這些部位、組織特異性的血清生物標志物臨床意義顯得尤為重要。卵巢腫瘤血清標志物的研究一直是本領域的研究重點。血清中蛋白含量較多，其譜型變化其中是由代謝改變所致結果，如分泌、合成(同一型的轉換)、肽鏈切割點改變，修飾基團變化等；或是導致代謝改變的原因，如環氧化酶I(COX-I)和環氧化酶2(C0X-2)轉換。實踐顯示，代謝組學分析的對象物理化學參數差異大，采用單一分離分析手段難以對其進行無偏向全面分析。在代謝組學的研究中，常采用色譜、質譜、核磁共振(NMR)、紅外光譜、庫侖分析、紫外吸收、熒光散射、發射性檢測、光散射等分離分析手段及其組合。其中，色譜以其高分離度、高通量，質譜以其普適性、高靈敏度和特異性，核磁共振技術特別是H-NMR以其對含氫代謝產物的普適性而成為最主要的分析工具；由于液一質聯用和氣-質聯用分析范圍較廣，成為代謝組學研究分析中很重要的工具。核磁共振技術具備快速和無偏向性的特點，但與其它技術相比靈敏度太低；其它方法，如CE/LIF技術有很高的檢測靈敏度，但為選擇性檢測，故色譜質譜聯用是目前常采用的能較好兼顧靈敏度和無偏性的檢測方法。
發明內容本發明的目的在于提供一種卵巢腫瘤血清標志物。根據本發明，可建立系列的良性、交界性和惡性卵巢腫瘤的血清代謝組學指紋圖譜。進一步建立系列的良性、交界性和惡性卵巢腫瘤的血清代謝組學指紋模型。本發明采用色譜和質譜技術，高通量、大規模對患者血清進行多層次的分析，篩選血清差異表達分子，通過對卵巢腫瘤患者血清進行不同層次的代謝組學以及多肽譜分析，明確其中的小分子代謝譜，從而找到多組與良性、交界性和惡性卵巢腫瘤相關的特征性生物標志物。本發明有可能為大規模篩查不同階段的卵巢腫瘤提供簡易的方法，亦可為相關臨床病人的鑒別診斷提供有價值的參考依據。本發明的目的通過下述技術方案和方法實現，(1)、收集各種類型的卵巢腫瘤患者的血清標本；首先制定標本收集規程和配套管理、教育軟件。包括，記錄病人基本信息腫瘤分期、分型和分級，治療方式，化療和用藥類型、劑量、時間等，以便歸類分層。并對病人進行跟蹤隨訪，為預后分析做好準備。同時收集正常人群(女性)等量外周血標本，以及卵巢良性腫瘤(內異癥、囊腺瘤、畸胎瘤等)標本。所有患者信息均輸入數據庫，加密保存并備份。(2)、質譜_色譜聯用的代謝組學方法完成標本差異表達分子的篩選；將收集到的標本妥善保存(-70°C)，在規定時間內進行處理。對不合格的標本(數量不夠或混有雜質)，重新收集。標本內容物的提取、層析均按標準化過程進行。所收集到的正常對照，良性及惡性腫瘤患者的血清進行平行的代謝組學和蛋白組學分析①、基于UPLC-Q/TOFMS(超高效液相色譜/飛行時間質譜)的血液全組分代謝組學分析。將一定量的血清經過除蛋白，凍干等前處理之后，進行UPLC-Q/TOFMS分析，得到患者的全血的代謝物譜圖，然后經過代謝組學軟件的處理，得到各種代謝物的相關信息，所有數據歸一化之后，進行下一步的多維數據綜合分析。②、基于HPLC-Q/TrapMS(高效液相色譜/串聯四級桿離子阱質譜)的血清磷脂的代謝輪廓分析以及溶血磷脂酸(LPA)的代謝靶標分析。對血清樣本，首先進行針對磷脂的液液萃取，然后利用LC-Qtrap進行分離分析，利用色譜圖并結合EPI質譜圖對各類磷脂分子進行定性。之后，利用自主開發的軟件提取色譜峰并進行半定量分析。在此基礎上，通過數據處理方法，找出其中代謝變化明顯的磷脂分子，進而研究其在代謝通路中的作用、生物學意義以及對發病機理的影響。對于LPA的分析過程與磷脂類似，只是在提取方法及質譜條件上會有所不同。上述所有分析結果經過數據處理之后，進入下一步的數據綜合分析。③、基于MALDITOFMS(基質輔助激光解析電離/飛行時間質譜)的血清多肽譜的分析。將全血中的蛋白質及多肽經分離純化后進行MALDITOFMS分析，將得到的多肽譜進行解析，找到與疾病相關的特征峰，并且進一步分析其肽鏈結構，最后將得到的結果進行綜合整理之后進入下一步的數據綜合分析。(3)、通過數據分析軟件，實現對血清代謝組學指紋圖譜的化學計量學分析。上述分析結束之后，將原始數據進行化學計量學的分析。例如PCA(主成分分析)ANN(人工神經元網絡)等分析，以期取得下列結果從血液全組分分析數據之中找出癌癥相關的小分子生物標記物，并鑒定其結構；得到癌癥病人的磷脂代謝輪廓分析譜以及溶血磷脂酸的代謝靶標分析譜，并分析其病理機制；得到病人的血清多肽代謝譜，并盡可能的鑒定其中的特征峰的氨基酸序列。最后，在綜合上述所有工作的基礎之上，通過數據分析軟件，利用上述得到的所有的譜圖數據，確定有應用價值的篩選良性、交界性和惡性卵巢腫瘤的血清代謝組學指紋圖譜。本發明不但提供了有關卵巢腫瘤血清血清多肽譜變化，還能建立其變化與代謝譜之間的聯系，做到某種程度上的相互印證。在腫瘤血清標志物的蛋白組學研究方興未艾之際，將其研究領域由多肽譜推及到包括其他代謝小分子在內的代謝譜。不但避免了和國內外同行的簡單重復競爭，而且開拓了篩選范圍，將會得到更具實用和基礎研究意義的差異性生物標志物。圖1是惡性卵巢腫瘤組與健康對照組的PLS-DA模型，其中，A得分矩陣□為惡性卵巢腫瘤組，▲為健康對照組，每個點表示一個樣品，t表示樣本在主成分投影值；B載荷矩陣每個點表示一個質譜檢測到的離子，w*c表示變量在主成分上的載荷投影值，變量重要性因子由每個變量(質譜檢測到的離子)在載荷矩陣中的載荷投影值計算得出，離原點遠的點具有大的變量重要性因子，為潛在標志物。圖2是良性卵巢腫瘤與健康對照組的PLS-DA模型，其中，A得分矩陣+為良性卵巢腫瘤組，▲為健康對照組，每個點表示一個樣品，t表示樣本在主成分投影值；B載荷矩陣每個點表示一個質譜檢測到的離子，w*c表示變量在主成分上的載荷投影值，變量重要性因子由每個變量(質譜檢測到的離子)在載荷矩陣中的載荷投影值計算得出，離原點遠的點具有大的變量重要性因子，為潛在標志物。圖3是交界性卵巢腫瘤與健康對照組的PLS-DA模型，其中，A得分矩陣〇為交界性卵巢腫瘤組，▲為健康對照組，每個點表示一個樣品，t表示樣本在主成分投影值；B載荷矩陣每個點表示一個質譜檢測到的離子，w*c表示變量在主成分上的載荷投影值，變量重要性因子由每個變量(質譜檢測到的離子)在載荷矩陣中的載荷投影值計算得出，離原點遠的點具有大的變量重要性因子，為潛在標志物。圖4是健康人與良性，惡性卵巢腫瘤的血清全組分分析PLS-DA模型，其中，A得分矩陣□為惡性卵巢腫瘤組，+為良性卵巢腫瘤組，▲為健康對照組，每個點表示一個樣品，t表示樣本在主成分投影值；B載荷矩陣每個點表示一個質譜檢測到的離子，w*c表示變量在主成分上的載荷投影值，變量重要性因子由每個變量(質譜檢測到的離子)在載荷矩陣中的載荷投影值計算得出，離原點遠的點具有大的變量重要性因子，為潛在標志物。圖5是健康人與良性，惡性，交界性卵巢腫瘤的血清全組分分析PLS-DA模型，其中，A得分矩陣□為惡性卵巢腫瘤組，+為良性卵巢腫瘤組，ο為交界性卵巢腫瘤組，▲為健康對照組，每個點表示一個樣品，t表示樣本在主成分投影值；B載荷矩陣每個點表示一個質譜檢測到的離子，w*c表示變量在主成分上的載荷投影值，變量重要性因子由每個變量(質譜檢測到的離子)在載荷矩陣中的載荷投影值計算得出，離原點遠的點具有大的變量重要性因子，為潛在標志物。圖6是惡性卵巢腫瘤與健康對照模型和良性卵巢腫瘤與健康對照模型的SUS圖。圖7是對惡性卵巢與健康對照模型和交界性卵巢腫瘤與健康對照模型SUS圖。圖8是交界性卵巢腫瘤與健康對照模型和良性卵巢腫瘤與健康對照模型SUS圖。具體實施例方式實施例11、各種類型的卵巢腫瘤患者的血清標本收集收集正常對照組362例、良性組281例、交界性組51例和惡性組305例。2、利用選定的基于質譜-色譜聯用的代謝組學方法完成標本差異表達分子的篩選工作。建立了用于卵巢癌惡性腫瘤生物標志物譜發現的代謝組學分析模型。包括惡性卵巢腫瘤組與健康對照組，良性卵巢腫瘤與健康對照組，交界性卵巢腫瘤與健康對照組，健康對照組與良、惡性卵巢腫瘤，健康對照組與良、惡性和交界性卵巢腫瘤的血清全組分代謝譜模型；采用多變量統計分析方法尋找到了特征性的生物標志物譜，并對特征代謝物結構進行了鑒定。①、惡性卵巢腫瘤組與健康對照組的血清全組分代謝譜模型。選取27例惡性卵巢腫瘤樣本和28例健康對照用于惡性卵巢腫瘤組與健康對照組的血清全組分分析模型的建立。將得到的總離子流(TIC)圖進行峰提取、峰匹配。數據用偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)方法對惡性卵巢腫瘤以及健康對照血清的代謝指紋數據進行建模。結果如圖1從圖IA中可以看出惡性卵巢腫瘤和健康對照組的代謝顯型有比較顯著的區別，據此建立的PLS-DA模型可以解釋90.7%的分類信息，并且模型的預測能力達到71.6%。根據變量重要性因子篩選對分類貢獻最大的10個檢測離子，這些代謝物可被認為是在惡性卵巢腫瘤代謝產生影響的生物標志物譜。表1是與惡性卵巢腫瘤有關的化合物。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>②、良性卵巢腫瘤與健康對照組的血清全組分代謝譜模型。選取31例良性卵巢腫瘤血清樣本和28例健康對照血清樣本，用于健康人和良性卵巢腫瘤的血清全組分分析模型的建立。實驗條件與健康對照組與惡性卵巢腫瘤組的分析模型相同。將得到的總離子流(TIC)圖進行峰提取、峰匹配。數據用偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)方法對良性卵巢腫瘤以及健康對照血清的代謝指紋數據進行建模，結果如圖2所示。從圖2A可知良性卵巢腫瘤與健康對照樣本的血清代謝輪廓也有比較明顯的區別，據此建立的PLS-DA模型能夠解釋73.2%d的分類信息，預測準確率為54.9%。根據變量重要性因子篩選對分類貢獻最大的10個檢測離子，這些代謝物可被認為與在良性卵巢腫瘤代謝產生影響的密切相關。表2是與良性卵巢腫瘤有關的化合物。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>③、健康對照組與交界性卵巢腫瘤的血清全組分分析模型。選取19例交界性卵巢腫瘤血清樣本和28例健康對照血清樣本用于健康人與交界性卵巢腫瘤的血清全組分分析模型的建立，實驗條件與健康對照組與惡性卵巢腫瘤組的分析模型相同。將得到的總離子流圖進行峰提取、峰匹配。數據用偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)方法對交界性卵巢腫瘤以及健康對照血清的代謝指紋數據進行建模，結果如圖3所示。所建模型能夠解釋74.2%的分類信息，預測準確率為56.1%。根據變量重要性因子篩選對分類貢獻最大的10個檢測離子，這些代謝物可被認為是在交界性性卵巢腫瘤代謝產生影響的生物標志物譜。表3是與交界性卵巢腫瘤相關的化合物。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>④、健康對照組與良性，惡性卵巢腫瘤的血清全組分分析模型。健康人的血清代謝輪廓分別與惡性卵巢腫瘤，良性卵巢腫瘤和交界性卵巢腫瘤得到明顯的區分。在此基礎上，用偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)方法對良性卵巢腫瘤，惡性卵巢腫瘤以及健康對照血清的代謝指紋數據進行建模，結果如圖4所示。從圖4A可以看出，模型中健康人和良性腫瘤落在主成分1投影值為負的區域，惡性卵巢腫瘤樣本位于主成分1投影值為正的區域。因此，根據主成分1可以檢測出惡性卵巢腫瘤，并可以避免由于良性腫瘤帶來的假陽性結果。而健康人群和良性卵巢腫瘤分別落在主成分2投影值為負和正的兩個區域，根據主成分2也可以區分健康人和良性卵巢腫瘤。載荷矩陣中，落在1，4象限的點(主成分1投影值為正，主成分2投影值為負)，在惡性卵巢腫瘤中上調。同樣，載荷矩陣(圖4B)中落在第二象限和第三象限的點，在良性卵巢腫瘤和健康人中上調。投影值越大化合物重要性越高。⑤、健康對照組與良性，惡性，交界性卵巢腫瘤的血清全組分分析模型。用偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)方法對良性卵巢腫瘤，惡性卵巢腫瘤以及健康，交界性卵巢腫瘤以及健康對照血清的代謝指紋數據進行建模，結果如圖5所示。從圖5A中可以看出健康對照樣本，良性卵巢腫瘤和惡性卵巢腫瘤的主成分1投影值均為正值，且它們的主成分2投影值逐漸降低。而交界性卵巢腫瘤樣本都落在主成分1投影值為負值的區域，可見交界性卵巢腫瘤和良性，惡性卵巢腫瘤的代謝顯型有顯著區別。與主成分1相關的化合物是區別交界性與良，惡性卵巢腫瘤的重要化合物。3、通過數據分析軟件，實現對血清代謝組學指紋圖譜的化學計量學分析。采用代謝組學技術對良性、交界性和惡性卵巢腫瘤之間的關系進行了研究。通過SUS-plot(sharedanduniquestructure)對惡性與良性卵巢腫瘤，惡性與交界性卵巢腫瘤，良性與交界性卵巢腫瘤的關系進行了研究，尋找到了與不同卵巢腫瘤均相關和具有腫瘤相關唯一性的特征代謝物，同時發現良性和交界性卵巢腫瘤的代謝譜相關性較低。本發明采用SUS圖來體現模型之間的相互關系。SUS圖是一種的載荷矩陣，圖中的每一個點代表一個化合物，坐標為化合物與模型中主成分的相互關系。當化合物的橫縱坐標值均大于0.5或者均小于-0.5時，代表這些化合物與兩個模型的主成分都正相關或相關。通過這些化合物可以體現兩個模型的共性。當化合物的橫坐標絕對值大于0.5而縱坐標值接近0時，這個化合物與橫坐標所代表模型相關而與縱坐標代表模型不相關，體現了橫坐標模型的獨特性。同樣，當化合物的縱坐標絕對值大于0.5而橫坐標值接近0時，這個化合物體現了縱坐標所代表模型的獨特性。①、對惡性卵巢腫瘤與健康對照模型和良性卵巢腫瘤與健康對照模型作SUS圖(圖6)。圖6中區域1，4內的化合物是良、惡性卵巢腫瘤中都相關的一些化合物，區域3內的化合物是只與惡性卵巢腫瘤相關而與良性腫瘤不相關的。區域4內的化合物只與良性卵巢腫瘤相關而與惡性腫瘤不相關的。初步發現，區域4內都是色氨酸的一些碎片離子，而區域3內是LPC類的化合物。表4是惡性卵巢腫瘤和良性腫瘤的關系研究中涉及的重要化合物。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>②、對惡性卵巢腫瘤與健康對照模型和交界性卵巢腫瘤與健康對照模型作SUS圖，見圖7。圖7中區域1，3內的化合物是交界性，惡性卵巢腫瘤中都相關的一些化合物，區域2，4內的化合物是只與交界性卵巢腫瘤相關而與惡性腫瘤不相關的。區域5內的化合物只與惡性卵巢腫瘤相關而與交界性腫瘤不相關的化合物。表5是惡性腫瘤和交界性腫瘤的關系研究中涉及的重要化合物。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>③、對交界性卵巢腫瘤與健康對照模型和良性卵巢腫瘤與健康對照模型作SUS圖，如圖8所示。從圖8可知良性腫瘤和交界性腫瘤的相關性非常低，圖中沒有與交界性，良性卵巢腫瘤中均相關的化合物，區域3內的化合物是只與交界性卵巢腫瘤相關而與良性腫瘤不相關的。區域1內的化合物只與惡性卵巢腫瘤相關而與交界性腫瘤不相關的。區域2內的是與交界性腫瘤負相關而與良性腫瘤正相關的化合物。表6是交界性卵巢腫瘤和良性卵巢腫瘤的關系研究中涉及的化合物。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權利要求一種卵巢腫瘤血清標志物，其特征在于通過色譜和質譜技術，高通量、大規模對患者血清多層次的分析，篩選血清差異表達分子，對卵巢腫瘤患者血清進行不同層次的代謝組學以及多肽譜分析，明確其中的小分子代謝譜后，得到卵巢腫瘤血清標志物。2.檢測權利要求1所述的卵巢腫瘤血清標志物的方法，其特征在于通過下述方法和步驟(1)、收集各種類型的卵巢腫瘤患者的血清標本；(2)、采用質譜_色譜聯用的代謝組學方法進行標本差異表達分子的篩選；(3)、通過數據分析軟件，實現對血清代謝組學指紋圖譜的化學計量學分析。3.按權利要求2所述的檢測卵巢腫瘤血清標志物的方法，其特征在于所述步驟1的各種類型的卵巢腫瘤是良性和惡性卵巢腫瘤。4.按權利要求2所述的檢測卵巢腫瘤血清標志物的方法，其特征在于所述步驟2是對所收集到的正常對照，良性及惡性腫瘤患者的血清進行平行的代謝組學和蛋白組學分析。5.按權利要求4所述的檢測卵巢腫瘤血清標志物的方法，其特征在于所述步驟2的代謝組學和蛋白組學分析是①、基于超高效液相色譜/飛行時間質譜的血液全組分代謝組學分析；②、基于高效液相色譜/串聯四級桿離子阱質譜的血清磷脂的代謝輪廓分析以及溶血磷脂酸(LPA)的代謝靶標分析；③、基于基質輔助激光解析電離/飛行時間質譜的血清多肽譜的分析。6.按權利要求2所述的檢測卵巢腫瘤血清標志物的方法，其特征在于所述步驟3的對血清代謝組學指紋圖譜的化學計量學分析是將原始數據進行主成分分析或人工神經元網絡分析。全文摘要本發明屬生物
技術領域：
，具體涉及一種卵巢腫瘤血清標志物。本發明采用色譜和質譜技術，高通量、大規模對患者血清進行多層次的分析，篩選血清差異表達分子，通過對卵巢腫瘤患者血清進行不同層次的代謝組學以及多肽譜分析，明確其中的小分子代謝譜，從而找到多組與良性、交界性和惡性卵巢腫瘤相關的特征性生物標志物。本發明有可能為大規模篩查不同階段的卵巢腫瘤提供簡易的方法，亦可為相關臨床病人的鑒別診斷提供有價值的參考依據。文檔編號G01N30/72GK101832977SQ20091004725公開日2010年9月15日申請日期2009年3月9日優先權日2009年3月9日發明者萬小平,何以豐,吳曉華,康玉,張曉燕,徐叢劍,房國良,曹銳,程明軍,許國旺,趙素敏,路鑫,陳靜申請人:復旦大學附屬婦產科醫院
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