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使用基于分子核酸的技術確定細胞活性的改進方法
【專利摘要】本發明涉及從含有活細胞和死細胞的混合物中選擇性排除死細胞的新穎方法和試劑盒，所述混合物例如含有微生物細胞的臨床樣品、血液制品、醫學/生物技術制品以及食物制品，其中對選定活細胞的隨后質詢是微生物活性存在的指標。具體而言，本發明涉及在血液和其他體液中進行例如聚合酶鏈反應（PCR）的直接核酸擴增技術以及恒溫技術的改進方法，以與菌血癥和真菌血癥樣品中的微生物細胞活性建立相關性。本發明所提供的改進方法特別有利于診斷敗血癥以及確定所有其他正常無菌體液的病理學狀態。
【專利說明】使用基于分子核酸的技術確定細胞活性的改進方法
[0001]相關申請的交叉參照
[0002]本申請為非臨時申請，其以引用的方式將2010年12月31日遞交的第61/428，892號美國臨時申請并入本文中，并且主張其優先權。
【技術領域】
[0003]本發明涉及利用分子檢測從含有活細胞和死細胞的混合物中選擇性排除死細胞DNA的方法，確切地說，涉及在血液以及其他體液中進行直接聚合酶鏈反應(PCR)技術以便與菌血癥、真菌血癥、病毒血癥以及其他類型的含寄生物樣品中的活微生物細胞建立相關性的改進方法。本發明所提供的改進方法特別有利于診斷敗血癥。
【背景技術】
[0004]診斷敗血癥時,得到結果的時間(time to result ;TTR)是病人存活的最重要決定因素。目前，血液培養是最高準則，但是其相對較慢，產生的的活微生物在隨后鑒定中轉為陽性的近似中值時間為15小時(通常范圍是3小時到5天)，隨后另外增加I至2天微生物鑒定用于分析。PCR等分子方法為微生物鑒定提供了極大改進的TTR，但是這些方法缺少特異性，這主要是由于在樣品制備期間對活微生物細胞的選擇不充分。傳統的血液敗血癥PCR測試按照慣例需要進行昂貴的DNA分離以除去PCR抑制劑，但是與血液培養的最高準則相比，分離也會造成假陽性以及敏感度降低，這主要是由于在DNA分離過程中包含了死亡微生物細胞的DNA以及與樣品處理相關的損失。
[0005]傳統上，敗血癥血液樣品PCR制備總是從血液以及血液制品中分離DNA，以除去久已熟知的Taq聚合酶血液源PCR抑制劑(參見下文引述的克魯士(Klouche)以及施羅德(Schroder)論文)。近來，為試圖克服這個抑制作用，一些團隊已開發出PCR增強型混合物以及修飾的熱穩定聚合酶(例如，熟知的“omni taq”以及“Phusion”技術)，這些聚合酶通過工程改造可減少血液制品對這些聚合酶的抑制作用(參見JMD，2010 ;12(2)，第152-161頁)。然而，這些方法的約束條件仍然缺少敏感性，這是因為血容量耐受性低以及與分離系統相關的高成本及樣品損失及高復雜度。此外，DNA分離系統通常包括來自死細胞的無細胞DNA，結果引起混淆不清的假陽性。
[0006]克魯士.M (Klouche, M.)以及施羅德.U (Schroder, U.)在發表于臨床化學與牟駘室醫學(Clin.Chem.Lab.Med.),2008 ;46 (7)，第888-908頁中的一篇標題為“血流感染的快速診斷方法(Rapid methods for diagnosis of bloodstream infections)，，的論文中，披露了基于核酸直接檢測和鑒定病人血液中的微生物病原體可以是快速診斷血流感染的一種非常有前景的工具。然而，根據這篇論文，利用血流感染常規檢查中寬范圍的分子方法檢測循環細菌或真菌核酸的意義目前尚不明確。可使應用于血流感染的分子診斷質量和再現性改進的鼓舞性論點包括:針對細菌核酸的選擇性富集程序、過量人類DNA的阻斷或消除方法，以及利用活標記物辨別臨床上相關的發現，如微生物安全分析經驗所表明。盡管目前的工藝昂貴且技術性要求高，但針對疾病的多重PCR，病原體微陣列以及蛋白質組學分析具有發展成診斷傳染性疾病的重要、快速且高通量診斷手段的潛能。目前，三個主要考慮妨礙了分子技術在血流感染常規診斷中的獨特應用:難以解釋NAT結果是由于:1)外部污染風險高，感染后核酸的持久性延長，以及暫時性菌血癥；2)對臨床上相對較低細菌負荷的分析靈敏度有限，以及對某些細菌和真菌的檢測有限，以及3)缺乏通過分子測試以及蛋白質組學測試進行的常規抗微生物敏感性測試。
[0007]區分活細胞與死細胞是微生物診斷學中的重要挑戰。代謝和復制活性以及在病原微生物情況下的潛在健康風險限于混合微生物群體中的有生命部分。常規技藝中利用四種生理狀態、使用熒光染劑、以流式細胞術辨別:可復制的活細胞、代謝活躍的細胞、完整細胞以及通透化細胞。根據條件，除通透化細胞外的所有階段在復活時都具有恢復的潛能，因此須視為潛在存活的。由于細胞死亡后的DNA的持久性相對較長，在數天到3周范圍內，因此基于DNA的診斷傾向于過高估價活細胞的數目。從樣品中提取的DNA可來源于處于上述四種生理狀態下的任何一種的細胞，包括死亡的通透化細胞。然而，不想要檢測到后者。區分活細胞與不可逆損害的細胞的最重要準則是細胞膜完整性。挑選出來源于膜受損細胞的噪音有助于針對細菌群落的完整存活部分指定代謝活性以及健康風險。具有完整細胞膜的活細胞的特征是它們能夠排除輕易滲入死細胞或膜受損細胞中的DNA結合染料。
[0008]近來，據報道EMA-PCR是一種可替代顯微鏡或流式細胞分析來區分活細胞與死細胞的的易用型方法。這種基于DNA的診斷方法將辨別活-死的染料的用途與實時PCR的速度和靈敏度結合起來。就此而言，已使用單疊氮溴乙錠(EMA)，它是一種具有疊氮基團的DNA嵌入染料，在曝露于亮可見光(460nm下的最大吸光度)時可化學共價結合到DNA。使細胞暴露于EMA5分鐘，讓染料滲入細胞壁/膜受損的死細胞中并且結合到它們的DNA。使用亮可見光使EMA發生光解，產生氮烯，所述氮烯可與DNA以及其他分子形成共價鍵。
[0009]據報道，光誘導交聯可以抑制死細胞DNA的PCR擴增。近來已表明，EMA與DNA交聯實際上使得DNA不能溶解，并且在基因組DNA提取期間導致DNA與細胞碎片一起損失。在溶液中保持游離狀態的未結合EMA可以通過與水分子反應而同時失活。所產生的羥胺不再能夠共價結合到DNA。因此，曝露于光之前因細胞壁/細胞膜完整而免于接觸反應性EMA的活細胞DNA，在細胞溶解之后未受到失活EMA的影響。因此，EMA處理包含活細胞與死細胞混合物的細菌培養物可選擇性除去死細胞的DNA。所測試的物種為大腸桿菌0157:H7、鼠傷寒沙門式菌、單核細胞增生李斯特菌以及空腸彎曲桿菌。然而這些研究并沒有檢查死細胞DNA的選擇性損失。
[0010]雖然此項技術很有前景，但是已發現在DNA提取之前使用EMA具有嚴重的缺陷。有時候，處理還導致了在對數生長期收獲的活細胞的基因組DNA損失大約60%。已觀察到EMA還容易滲入其他細菌種的活細胞中，導致部分DNA損失。敏感性以及總體適用性的這種缺乏已產生新開發的替代化學測試:單疊氮溴丙錠(PMA)。在2007年9月7日公開的授予諾克(Nocker)等人的第W0/2007/100762號已公開專利申請中，披露了 PMA適合從具有活細胞與死細胞的定義部分的細菌培養物中選擇性除去檢測到的死細胞基因組DNA。PMA與碘化丙錠(PI)相同，除了另外存在疊氮基團以便在曝露于光下時交聯到DNA。PI已廣泛用于鑒定混合群體中的死細胞。PMA分子電荷較高(兩個正電荷，相比之下，在EMA情況下僅有一個電荷)，并且由于PI對非活細胞的選擇性染色已成功地針對多種細胞類型執行，所以使得所屬領域的人們相信使用PMA可以減少所觀察到的EMA缺陷。在這個已公開專利中，在將這些參數應用于大范圍不同細菌種的研究中之前，利用一種革蘭氏陰性生物體以及一種革蘭氏陽性生物體優化PMA濃度以及培養時間。據稱，所披露的方法使分子診斷限于微生物群落中具有完整細胞膜的部分。這是通過將完整細胞與膜受損細胞混合物暴露于啡錠衍生物而實現。在所披露的優選實施例中，PCR是使用混合物中的基因組DNA作為模板來執行。
[0011]并且,2008年7月3日公開的授予洛倫茲(Lorenz)的第2008/0160528號已公開美國專利申請，披露了利用核酸酶，尤其是DNA降解核酸酶，在一種或若干種離液劑和/或一種或若干種表面活性劑存在的情況下使核酸降解。這個專利申請進一步披露了一種從DNA和RNA混合物中純化RNA的方法以及執行此類方法的試劑盒。還披露了一種從額外包含高等真核細胞的混合樣品中所提供的微生物細胞中分離核酸的方法以及于執行此類方法的試劑盒。
[0012]2001年10月18日公開的授予魯迪(Rudi)等人的第W0/2001/077379號已公開專利申請披露了檢測樣品中的細胞以及獲得樣品內關于細胞群體的定量信息的方法。具體而言，披露了一種區分樣品中活細胞與死細胞的方法。所述方法包含使樣品與修飾樣品內死細胞核酸的活性探針接觸以及檢測樣品中的細胞核酸。還描述了一種檢測樣品中的細胞的方法，所述方法包含:(a)使樣品與標記樣品內死細胞核酸的活性探針接觸；(b)將細胞核酸分離為標記部分以及未標記部分；以及(C)檢測所述一個或兩個部分中的核酸。

【發明內容】

[0013]鑒于上述【背景技術】，可以發現思考模式的轉移會開發出一種方法，所述方法在基于分子核酸的分析技術之前(例如在PCR建立之前)可以有效區分活微生物細胞DNA與死微生物細胞DNA，并且所述方法規避了為除去例如PCR抑制劑并且濃縮目標DNA所設計的傳統分離的高成本負面影響。出乎意料的是，根據本發明的一個實施例的實施，已經表明PCR與來源于血液的活微生物細胞相關聯，其將選擇性血液細胞溶解、洗滌(和/或)脫氧核糖核酸酶以及隨后微生物細胞溶解和PCR組合使用。
[0014]因此，與上述傳統.方法對比，本發明如下設法實現基于分子核酸的技術(包括PCR)的潛在TTR優勢:顯著簡化昂貴的DNA分離以及樣品制備，并且不是通過分離DNA，而是通過在快速分離死亡微生物DNA以及細胞之后對粗制的微生物溶解產物執行快速簡單的直接分析，從而選擇性富集活微生物細胞。這出乎意料地特別有利于診斷敗血癥，并且根據本發明的優選實施例如下完成:
[0015]1.除去混雜性死亡微生物細胞DNA，隨后獲得陽性非污染PCR結果指示存在活細胞，且因此PCR結果將指示存在敗血癥活微生物，即，血液微生物PCR=敗血癥活微生物。
[0016]I1.眾所周知，來自血液的死亡微生物細胞無法在血液培養液中生長，因此測量到單個血液培養瓶中的微生物特異性PCR信號顯著增強的任何兩個或多個時間點必須是測量活微生物。
[0017]II1.血液中的PCR抑制劑可以由化學變性劑(離液劑:清潔劑、pH、鹽類、基于經由偶極矩進行差別拯救的有機化合物，例如含有醇和胺的化合物，以及酶，例如核酸酶、蛋白酶等)與洗滌的簡單組合來清除，從而規避了 DNA分離并且能夠進行微生物溶解產物直接PCR (microbe lysate-Direct-PCR) IV.。
[0018]IV.接著可使用存在于血液以及血液培養液中的活/死微生物的比率作為治療有效性以及測試治療功效的量度。
[0019]因此，本發明的一個目標在于提供一種利用分子檢測從含有活細胞與死細胞混合物中選擇性排除死細胞DNA的改進方法。
[0020]本發明的另一目標在于提供一種改進方法，所述方法在基于分子核酸的分析或PCR之前，有效區分活微生物細胞DNA與死微生物細胞DNA，并且還規避了傳統分離的高成本負面影響，例如，為除去PCR抑制劑以及濃縮目標DNA所設計的傳統分離。
[0021]本發明的另一目標在于提供如下使PCR及其他分子分析技術的結果與血液源活微生物細胞的存在相關的方法:例如，將選擇性血細胞溶解、洗滌(和/或)脫氧核糖核酸酶以及隨后微生物細胞溶解和PCR組合使用。
[0022]本發明的又一目標在于提供在血液以及其他體液中進行直接PCR技術以便與菌血癥的以及真菌血癥樣品中的活微生物細胞相關聯的改進方法，本發明提供的這些改進方法特別有利于診斷敗血癥。
[0023]本發明的其他目標和優勢可從本發明的以下優選實施例的詳細說明清楚看出。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1以表格形式顯示為比較過濾-珠磨-原位微生物溶解和分析物分析(通過DNA聚合酶(PolMA))以及基因組DNA (通過定量基因特異性PCR)所執行的實驗的結果。
[0025]圖2以圖表形式顯示根據本發明檢測溶解產物中的微生物的策略說明。
[0026]圖3顯示的流程圖 說明根據本發明添加胰蛋白酶以及脫氧核糖核酸酶能夠明顯減少在處理兩種“困難”臨床樣品期間所觀察到的凝結。
【具體實施方式】
[0027]雖然本發明已經進行了描述，但是還提供以下實例以便具體說明本發明的實施例以及清晰理解。對于本領域普通技術人員而言顯而易見的是，根據本文中所闡明的本發明傳授內容，可以對如此所描述的這些實施例進行某些改變和修改，而此等改變和修改不脫離本發明的精神或范圍。
[0028]離液劑，也被稱作離液試劑和離散劑，是一種能夠分裂蛋白質、DNA或RNA等大分子的三維結構并且使它們變性的物質。離液劑干擾由氫鍵、范德華力以及疏水效應等非共價力調節的分子間相互作用的穩定。如利用圓二色性等方法檢測的常見結構特征可以離液劑濃度依賴性方式進行滴定。離液劑包括，例如:
[0029]尿素6_8mol/l
[0030]鹽酸胍6mol/l
[0031]高氯酸鋰4.5mol/l
[0032]變性作用(生物化學)
[0033]此外，高通用性鹽通過屏蔽電荷以及防止鹽橋穩定而可具有離液特性。氫鍵在非極性介質中較強，因此，增大試劑偶極距的鹽也可以使氫鍵不穩定。
[0034]如利用圓二色性等方法檢測的常見結構特征可以離液劑濃度依賴性方式進行滴定。歷史上用于生物化學以及分子生物學中的離液試劑的一些實例包括:尿素6-8mol/l、鹽酸胍6mol/l、高氯酸鋰4.5mol/l、醇類、胺類(尤其是季胺)、清潔劑(尤其是非離子型)、pH值改變、甜菜堿、脯氨酸、肉毒堿、海藻糖、NP-40等，以及BSA。根據本發明，實驗設計(DoE)流程已被用于優化多種離液劑的有效配方范圍以及范圍組合(混合物或試劑，或者“混合液”):a)使死細胞結構變性，從而根據尺寸(過濾)以及密度(離心)而輕易地將它們與活細胞分離；以及b)形成暴露于所得離液劑混合液的活細胞分離溶液，所述溶液與下游分析擴增試驗(例如PCR)以及活細胞源內生性蛋白直接相容，并且維持它們可測量的生化活性。可有效地優化離液劑混合液，從而根據細胞膜完整性的差異來區分活細胞與死細胞，維持活細胞內生性蛋白活性供活性相關性分析用。
[0035]樣品制備:
[0036]優選的血細胞溶解條件可優選地使血液微生物混合物中的血細胞均質化，例如在敗血癥血液培養樣品中所發現。均質化需要以足夠的水平發生(形成流體)，從而允許不需要的血細胞流體從進料側(保留需要的微生物細胞)通過過濾器進入濾液側，從而有效地分離這兩種群體。這些溶解條件能夠使微生物細胞保持完整，從而能夠通過持留微生物細胞而對均質化的血細胞進行快速/靈敏的過濾式分離。
[0037]根據本發明，采用了不同的血細胞分解以及其所得細胞碎片的充分均質化，以將血細胞減少到能夠采用不同的可濾性的流體水平，此處過濾器將微生物保留在進料側，從而為了隨后的無菌流體 分析而分離完整的微生物。所屬領域的技術人員已知的過濾器孔徑，即，直徑在0.4511!11、0.2211111、0.1 um之間的孔徑是足夠的。然而，取決于微生物以及不同細胞碎片的尺寸可濾性，這些有效的孔徑也可以是小于0.1或者大于0.45的。各種條件包括但不限于清潔劑、蛋白酶、離液劑、變性劑以及核酸酶的優化組合以獲得期望的效果。
[0038]微生物特異性原位過濾在本文中被定義為采用物理的以及生化的細胞壁溶解方法，在過濾器進料側捕獲微生物以及/或者隨后在原位應用的微生物特異性分析物試驗。此外，本文中“原位”是指溶解以及/或者隨后的分析是發生在不期望的干擾細胞(即，血細胞)的差異性分離之后，而期望的微生物細胞則仍然保留在過濾器的進料側。因此，預期所捕獲的微生物很有可能懸浮在用于加載和洗滌過濾器的殘余進料過濾器溶液中。用于溶解這些現在為分離的、完整的以及進行了過濾的微生物所采用的物理力是所屬領域的技術人員所熟知的那些，包括但不限于細胞壁酶消化。此外，根據本發明，所有微生物的原位過濾器聲波降解法是通過直接探針接觸殘余液體，所述殘余液是由含有分離的微生物的過濾側上的表面張力保留的，替代性地通過聲波探針接觸過濾器的距離微生物的相對側，并且通過孔而非通過固體過濾材料來傳遞其溶解能。此外，還意外地發現細菌和酵母的原位濾珠磨機微生物溶解的效能也發生在封閉的微離心管中，如同在捕獲刺入到血液中的微生物之后直接作用在過濾器進料表面上，其中血細胞被分化溶解并且單獨地進行了過濾。通過這種方式，本文中所定義的原位過濾是敗血癥樣品制備的精致的簡化，帶來了具有較少的操作、較少的潛在污染風險、手動的以及自動裝置設計的更加靈活的模式的更加有效的處理。
[0039]如下文的實例中所使用，過濾是作為所屬領域中常用的術語來使用，即，用于將固體從流體(液體或氣體)中分離的機械或物理操作，方法是插入一種介質使得只有流體能夠通過。在典型的簡單過濾中，被過濾的液體中的過大尺寸的顆粒無法通過過濾器的晶格結構，而流體以及小顆粒可以通過，成為濾過物。
[0040]實例I
[0041]進行實驗以對通過DNA聚合酶(PolMA)的原位濾珠磨機微生物溶解和分析物的分析，以及通過量化基因特異性PCR的基因組DNA進行比較。所得結果示于附圖的圖1中描繪的表格中。
[0042]如同本文中所采用的，在比較相對qPCR值時，δ Ct值必須大于2才能夠作為顯著
性差異。
[0043]結果和結論:
[0044]起始輸入微生物刺入值與對應的過濾后獲得的樣品之間的相對qPCR差值通常示出了刺入到血液中的多種微生物的非常高的％恢復率，所述多種微生物隨后在過濾器的進料側被捕獲，然后在所述過濾器的進料側被濾珠磨機溶解，這在本文中稱作“原位過濾器磨機”。在PCR可以測量的14種不同的微生物中，只有四種(所有的假絲酵母)(28%)示出了顯著的PCR恢復差異。對于這些酵母，在這些相同的樣品中存在可測量的DNA聚合酶活性的增強。總體上，這表明了帶來了較高的DNA聚合酶活性以及可以擴大的基因組DNA的良好的恢復以及高效率的原位過濾器磨機。出乎意料的是，用加粗的紅色表示的顯著性負值表明根據本發明的依賴于原位過濾器的PolMA可以是微離心管中的顯著改進的標準研磨。
[0045]根據本發明溶解產物中的微生物的檢測策略可以總結在本文的附圖，即圖2中。
[0046]實例2
[0047]本發明的一項實施例的該實例表明本發明的規避了傳統的DNA分離技術的必要性，并且能夠確保使用基于微生物溶解產物直接探針的PCR技術的執行的適用性。
[0048]a.將金黃色葡萄球菌刺入到標準的血液培養基中(假絲酵母共有試驗，大腸桿菌、屎腸球菌)，隨后是WBC清潔劑+底物溶解、制成小球以及洗滌。
[0049]b.發現的是在使用T.aqMan探針以及SYBR的直接溶解產物PCR之后，根據本發明的直接探針流程在每種情況下就PCR中％溶解產物的較高的容限(高達17%)而言具有優勢，且在30ul PCR中在5ul研磨溶解產物中的至少5000個微生物中沒有檢測到抑制。
[0050]血液培養基陽性瓶將含有培養基的大約4000個微生物/ml，在準備過程中放置2ml將獲得8000個微生物/50ul溶解產物，其中30ul PCR反應中的5ul=PCR中的160個微生物(上限BC水平所需要的試驗容限)。目前估計BC檢測的限制為500個微生物/瓶或者10個微生物/ml，因此5ul=2。如果10個微生物/瓶(通常)，那么5ul=0.2微生物，那么需要翻6翻的子代數以達到=640/瓶，該數目是可以檢測到的。
[0051]c.相應地，根據本發明示出了 SA微生物通過了(離液劑+清潔劑)Mc^Ysis緩沖物以及DNA酶處理，隨后是ITE小球以及洗滌，它們與磨機直接探針PCR兼容。本發明的新穎的改進的方法的是通過在所使用的血液磨機直接系統中的改進示出的，是就優于傳統技術的敏感度以及％血液的容限而言的，方法是對沒有變性劑的血液培養珠磨機系統(貝克頓迪金森(Becton Dickinson)葡萄球菌S/R試劑盒,可從貝克頓迪金森公司購得),其中只有1/10e6th的樣品在PCR中，與具有變性劑(DoE:胍/吐溫，氚核/NaOH，吐溫/氚核等)的本發明的改進所提供的系統進行比較。
[0052]實例3
[0053]在本發明的發展期間進行的實驗表明胰蛋白酶以及DNA水解酶的添加確保了在根據本發明對兩種“困難的”臨床樣品進行處理期間觀察到的堵塞的顯著減少，如同本文所附的圖3中的流程圖所示。
[0054]對于所屬領域的技術人員而言應理解的是本發明的廣泛的基本原理以及教示能夠應用于對多種生物組織樣品(包括，但不局限于，血液、體液，以及軟組織)的啟用變性劑的原始分解產物(珠磨機以及超聲波)直接探針/SYBR-PCR的所有變體進行優化，所針對的不僅是上文具體描述的SA，還可以針對多種病原體，例如，任何細菌、真菌、病毒、寄生蟲等。
[0055]上述實例還表明本發明所提供的實踐可以有效地壓制特定的信號，所述信號是來自界定的混合物中被殺死的細胞或者是穿刺有活細胞以及被殺死的細胞的界定的混合物的環境樣品。還值得注意的是根據本發明的樣品處理是將細胞膜受損的細胞排除于分析之外的較好的方式。
[0056]綜上所述，本發明提供了能夠確保在進一步的下游分析之前的細菌種群的快速且易于執行的預處理的新穎的方法。雖然對于所屬領域的技術人員而言本發明的多種潛在的應用是顯而易見的，但是本發明所提供的方法可以對多個領域中的基于DNA的診斷造成重大的影響，包括病原體診斷、生物恐怖主義以及微生物生態學。
[0057]在本發明的優選實施例的實踐中，顯而易見的是由于細胞不會生長，使用來自單個血細胞培養基的單獨的但是相等的整除數的示出了微生物目標信號的顯著的增長的在至少兩個單獨的時間點處的任何PCR測量結果，一定是由于微生物生長造成的，從而指示了活性微生物的存在(不考慮污染的影響)。應理解在活性細胞溶解以及PCR建立(排除了任何由PCR過程造成的污染)之前，當所有的死細胞DNA已被清除時，血液的基于非生長的單個點陽性PCR分析將指示活性微生物的存在。這可以通過DNA酶解以及洗滌掉死細胞DNA來說明。
[0058]雖然本文是專門參考PCR的，但是還應理解本發明的改進并不局限于PCR或者類似的方法。在本發明中使用的構思出的擴增試驗包括，但不局限于，其他熟知的核酸類技術，例如，DNA擴增試驗、并入熱穩定聚合酶的PCR試驗以及恒溫擴增方法。應理解所屬領域的技術人員可以構思出可用于本發明的實踐中的多種適當的擴增方法，因此本發明并非意圖局限于此。
[0059]應理解本發明可以應用于涉及DNA診斷的所有方法、流程以及過程中。此類應用的實例包括，但不局限于那些涉及食品、水安全、生物恐怖主義、醫學/藥學以及/或者任何涉及病原體檢測的應用。在食品工業中，本發明可以用于監測防腐劑的功效。本發明所述的方法具有應用到所有細胞中的潛能。雖然在實例中列舉的是細菌細胞，但是所屬領域的技術人員可以輕易地發現本發明的方法可以應用到多種其他細胞類型中。本發明還可以用于對干擾細胞膜和/或殺死細胞，例如，細菌細胞，的物質進行鑒別。由于多藥耐藥性生物體的繁盛以及在衛生機構與病人中的傳播，新的消毒劑和/或抗生素的鑒別已成為目前的優選考慮事項。
[0060]還應理解本發明的方法與量化PCR結合起來形成的一種工具，能夠快速且成功地識別消毒劑和/或抗生素的影響，而無需花費時間培養細胞并且等待細胞生長。在一些實例中，可能需要花費很多天甚至很多周來培養生物體，因此將要花費大量的時間來觀察候選物質是否能夠殺死微生物等細胞。在其他實例中，某些生物體不會在細胞培養基中生長，因此難以確定某一物質是否是有效的。因此，采用本發明的新穎的方法可以節省鑒別新型的消毒劑和/或抗生素的時間以及資源。
[0061]根據本發明的新穎的方法的另一優勢在于易于使用。例如，通過使用這些方法，可以輕易地針對活性細胞(例如，細菌)的存在對大量的樣品進行檢測。例如，可以針對具有完整的細胞膜的潛在存活的細菌的存在來對樣品進行檢測。在另一實施例中，可以針對活性細胞(例如，細菌)的存在對環境樣品進行測試。這些樣品可以是，例如，從土壤或者植物的一部分中收集的。根據本發明的方法還可以用于在排放之前和之后對處理過的污水進行檢測。
[0062]根據本發明的方法還可以用于檢測醫藥學樣品，例如，糞便樣品、血液培養物、唾液、組織樣品(以及切片)、創傷材料、尿液、以及來自呼吸道、植入物和導管表面的樣品。
[0063]根據本發明的方法的另一應用領域可以是食品控制。在其他實施例中，食物樣品是從牛奶或乳制品(酸奶、乳酪、甜乳酪、黃油以及脫脂乳)、飲用水、飲料(梓檬水、啤酒以及果汁)、焙烤產品或者肉制品中獲得的。本發明的方法可以確定食物中的防腐劑或者食物的殺菌處理(例如，巴氏殺菌)能否能夠阻止細胞的生長。根據本發明的方法的另一應用領域是藥學產品以及化妝品的分析，例如，軟膏、乳膏、酊劑、汁液、溶液、液滴等。
[0064]本發明的方法解決了較長的培養時間(在許多天的范圍內)的問題，使得老式的方法不適于及時的警告以及防范措施。此外，基于當前PCR的方法可以給出假陽性的結果(針對某一生物體測試出陽性，但是該生物體并不是活性的)。此外，近期的研究表面一些生物體可以在某些情況下喪失復制的能力，即使它們仍然是活性的。這些“存活但是無法進行培養”(VBNC)的細菌是無法使用傳統的培養方法來檢測的，但是如果將它們轉移到更加合適的環境中，那么它們可能重新獲得生長的能力。這些缺點的解決可以通過采用分子學方法，基于對這些生物體的基因材料/DNA的檢測并結合本發明的方法。因此，涉及例如，污染的水、廢水、食物、藥品和/或化妝品等樣品中的活性生物體的快速和精確的結果，可以防止被污染的物質被釋放到公共環境中。與目前耗時較多的方法相比，本發明的方法可以節約資源，通過的是將假陽性(針對某一病原體測試結果為陽性，盡管該病原體并非是活性的)結果最小化以及樣品的快速檢測。
[0065]此外，本發明的方法可以識別用于生態學研究、農業上特定土壤的健康以及/或者生態系統的微生物群落的潛在的具有活性成員。傳統上，細菌群落的識別是使用基于培養的方法或者平板計數來進行 的。計數的種群越多，則會在原始的樣品中估計出越多的細菌，然而，有時由于較長的培養時間(在很多天的范圍內)引發的問題使得這種方法不適于即使的且精確的結果。需要使用本發明的方法來克服這些缺點。
[0066]可以使用本發明的方法來進行分析的或者使用本發明的方法在樣品中檢測潛在活性的細菌的非限制性實例，除了上文描述的SA之外，還包含:百日咳桿菌、鉤端螺旋體波莫納群、甲、乙、丙型副傷寒沙門菌、白喉桿菌、破傷風桿菌、肉毒菌、產氣莢膜桿菌、氣腫疽梭菌以及其他氣性壞疽細菌、炭疽桿菌、鼠疫桿菌、敗血性巴氏桿菌、腦膜炎雙球菌、奈瑟氏淋球菌、流感嗜血桿菌、放線菌(例如，諾卡氏菌)、不動桿菌、芽孢桿菌(例如，炭疽桿菌)、擬桿菌(例如，脆弱擬桿菌)、芽生菌、博德氏桿菌、疏螺旋體(例如，伯氏疏螺旋體)、布魯氏菌、彎曲桿菌、衣原體、球孢子菌、棒狀桿菌(例如，白喉桿菌)、大腸桿菌(例如，腸毒性大腸桿菌以及腸出血性大腸桿菌)、腸桿菌(例如，產氣腸桿菌)、腸桿菌(克雷伯氏菌)、沙門氏菌(例如，傷寒桿菌、腸炎沙門氏菌、沙雷氏菌、耶爾森氏菌、志賀氏桿菌)、丹毒絲菌、嗜血桿菌(例如，B型流感嗜血桿菌)、螺桿菌、軍團桿菌(例如，嗜肺軍團桿_、鉤端螺旋體、李斯特菌(例如，單核細胞增生李斯特菌)、支原體、分枝桿菌(例如，麻風分枝桿菌以及結核分枝桿菌)、弧菌(例如，霍亂弧菌)、巴斯德氏菌、變形桿菌、假單孢菌(例如，綠膿桿菌)、立克次氏體、螺旋體(例如，密螺旋體屬、鉤端螺旋體屬、疏螺旋體屬)、志賀氏桿菌屬、腦膜炎球菌、肺炎球菌以及所有的鏈球菌(例如，肺炎鏈球菌以及A3、B，以及C類鏈球菌)、脲原體、梅毒螺旋體、金黃色葡萄球菌、溶血性巴式桿菌、棒狀桿菌、白喉類毒素、腦膜炎球菌多糖、百日咳桿菌、肺炎鏈球菌、破傷風桿菌類毒素，以及牛型結核桿菌。上述列表僅僅是說明性的，而并非意圖將本發明限制為檢測這些特定的細菌生物體。
[0067]本發明的一項尤其優選的實施例使用的是PCR。PCR的常規的流程教示于第4，683，195號美國專利申請案(穆利斯等人)以及第4，683，202號美國專利申請案(穆利斯等人)。然而，用于每次擴增反應的最佳PCR條件通常是根據經驗確定的或者是使用所屬領域的技術人員通常采用的計算機軟件來評估的。多種參數都會影響反應的成功。它們中的一些是退火溫度和時間、延伸時間、Mg2+、pH以及引物、模板、脫氧核苷酸的相對濃度。通常，模板核酸的變性是通過在聚合酶反應之前在至少大約95°C下加熱I至10分鐘進行的。執行大約20-99個擴增循環，使用的是在90°C至96°C的范圍內的大約0.05分鐘至I分鐘的變性，在48°C至72°C的溫度范圍內的大約0.05分鐘至2分鐘的退火，以及具有最佳末循環的在68°C至75°C的范圍內的至少01分鐘的延伸。在一項實施例中，PCR反應可以含有大約IOOng模板核苷酸、20uM的上游引物和下游引物，以及每種類型的0.05至0.5mm dNTP，以及0.5至5單元的可購得的熱穩定DNA聚合酶。
[0068]傳統的PCR的一項變體是逆轉錄PCR反應(RT-PCR)，其中逆轉錄酶首先將RNA分子轉化為單鏈的cDNA分子，隨后將該cDNA作為模板用于聚合酶鏈反應中隨后的擴增。RNA的分離是所屬領域中所熟知的。為了執行RT-PCR，通常在目標核酸經加熱變性之后將逆轉錄酶添加到反應樣品中。隨后將反應維持在適當的溫度(例如，30-45°C)下足夠的時間(10-60分鐘)以在計劃的擴增循環開始之前生成cDNA模板。所屬領域的一般技術人員會理解如果期望獲得定量的結果，那么必須小心地使用一種方法以維持或者控制擴增的核酸的相對的拷貝。“定量”擴增的方法是所屬領域的技術人員所熟知的。例如，定量PCR可以涉及使用相同的引物的同時對已知量的對照序列進行共同擴增。這提供了可以用于校準PCR反應的內部標準。
.[0069]PCR的另一替代方案是定量PCR (qPCR)。qPCR可以使用競爭性技術來進行，采用的是通過小片段的插入或者刪除而與目標產物尺寸不同的內部同源對照。然而，也可以使用非競爭性以及動態定量PCR。實時的動態PCR檢測與可以和目標序列同時進行檢測的內部同源對照的組合會是非常有利的。
[0070]PCR、RT-PCR和/或qPCR的引物是從某些區域或者特定的細菌中選擇的，所述引物僅對為特定的生物體選擇的DNA區域進行擴增。或者，所選擇的引物會對所有生物體通用的DNA部分進行雜交和擴增。引物的選擇和構建是所屬領域所熟知的。通常，一種引物位于待擴增的序列的每一端。此類引物的長度通常在10至35個核苷酸的范圍內，并且具有的優選的長度在18至22個核苷酸的范圍內。可以進行擴增的最小的序列的長度為大約50個核苷酸(例如，正向引物和反向引物的長度都為20個核苷酸，所述引物在序列中的位置至少由10個核苷酸隔開)。可以對更長的序列進行擴增。一種引物被稱作“正向引物”并且位于待擴增的區域的左端。正向引物的序列與DNA的上游鏈的區域中的序列相同(當按照慣例描繪雙鏈DNA時，其中上游鏈被示為具有5’到3’方向的極性)。所述正向引物的序列使得它與同DNA的上游鏈互補的DNA鏈雜交。另一種引物被稱作“反向引物”并且位于待擴增的區域的右端。反向引物的序列使得它在序列上互補于DNA的上游鏈中的一個區域，即，它是DNA的上游鏈中的一個區域中的序列的反向互補。反向引物與DNA的上游端雜交。還可以根據多種其他條件來選擇PCR引物。PCR引物應該足夠長(優選地為10到30個核苷酸長)，以對雜交進行最小化，使其大于模板中的一個區域。如果可能的話，應該避免具有較長的單個堿基的引物。引物優選地具有大約在40%至60%之間的百分G+C含量。如果可能的話，引物的3’端的百分G+C含量應該大于引物的5’端的百分G+C含量。引物不應具有可以在該引物中與另一序列雜交的序列(即，回文序列)。在相同的PCR反應中使用的兩個引物不應具有彼此雜交的能力。雖然優選地為根據上述推薦內容來選擇PCR引物，但是引物也不一定必須符合于這些條件。其他引物也可能是可行的，但是獲得較好結果的幾率較低。
[0071 ] 可以用于在給定的序列中擴增DNA的PCR引物的選擇可以使用能夠獲得的多種計算機程序中的一種。此類程序可以選擇出用于給定序列的擴增的最佳引物(即，此類程序根據上述條件，外加可以使PCR引物的功效最大化的其他條件來選擇引物)。一種計算機程序是遺傳學計算機組(Genetics Computer Group) (GCG最近成為Accelry)分析程序包,其具有用于選擇PCR引物的例程。
[0072]下文所披露的寡核苷酸引物和探針可以按多種方式制備。制備這些寡核苷酸的一種方式是使用可購得的核酸合成儀來合成它們。存在多種此類合成儀，并且它們是所屬領域的技術人員所熟知的。
[0073]可以用于與本發明結合使用的PCR的另一種替代物是用于檢測特定DNA或RNA目標的恒溫核酸擴增試驗。核酸的恒溫擴增的非限制性實例是均一實時鏈取代擴增、用于DNA測序的模板的基于Phi29DNA聚合酶的滾環擴增，由PNA開放劑協助的雙螺旋DNA序列的滾環擴增或者DNA分析物的環介導恒溫擴增。
[0074]還可以通過雜交方法類檢測核酸。在這些方法中，可以將標記的核酸添加到含有標記的或者未標記的核酸探針的底物中。或者，可以將未標記的核酸添加到含有標記的核酸探針的底物中。雜交方法披露于，例如，馬克?索那(Marc Schena)的微陣列分析(MicroArray Analysis),約翰?威利父子出版公司(John Wiley and Sons),新澤西州霍博肯,2003。
[0075]檢測核酸的方法可以包括標記的使用。例如，可以使用感光膜或者磷光影像分析儀(用于對并入的放射性磷進行檢測和量化)來檢測放射性同位素標記。可以使用光探測器對熒光標記進行檢測和量化以檢測發射的光(參見第5，143，854號美國專利，作為示例性儀器)。酶標記的檢測通常是通過提供與底物一起的酶，并且對所述酶在底物上的反應所生成的反應產物進行測量。通過簡單的 將彩色的標記可視化就可以檢測出比色標記。在一項實施例中，擴展的核酸分子的可視化是通過直接用核酸嵌入染料對擴增產物進行染色。對于所屬領域的技術人員而言顯而易見的是，示例性染料包括，但不局限于，SYBR green,SYBR blue、DAP1、碘化丙錠、Hoeste, SYBR gold以及溴化乙錠。嵌入到擴增的DNA分子中的發光染料的量與擴增產物的量成正比，可以方便地使用Flurolmager (分子動力學)或者根據制造商說明書的其他等效的裝置來量化所述染料。這種方法的一個變體為擴增產物的凝膠電泳，隨后是選定的嵌入染料的染色和可視化。或者，標記的寡核苷酸雜交探針(例如，熒光共振能量轉移(FRET )探針以及比色探針等熒光探針)可以用于檢測擴增。如果需要的話，那么代表被檢測的生物實體的基因組序列的特異性擴增的證實，可以通過測序或者表明擴增產物具有預測的大小、展現出預測的限制性降解模式，或者與正確的克隆的核苷酸序列進行雜交。
[0076]本發明還包含試劑盒。例如，所述試劑盒可以包含用于對與特定的生物體或通常的生物體對應的核酸分子進行擴增的引物、用于分離DNA的緩沖液和試劑，以及用于PCR的試劑。所述試劑盒還可以包括可以檢測到的標記的寡核苷酸，所述寡核苷酸被雜交到一條核酸序列上，所述核酸序列對與關注的生物體相對應的多肽進行編碼。所述試劑盒還可以包含一種對照樣品或者一系列對照樣品，可以對所述對照樣品進行分析并且與所含有的測試樣品進行比較。所述試劑盒的每種組分都可以封裝在獨立的容器中，并且所有這些容器與用于理解使用所述試劑盒所進行的分析的結果的說明書一起可以存在于一個單個的包裝中。
[0077]本申請文件中引用的所有的參考、專利案以及公開專利申請案的內容在本文中以引用的方式并入，如同每個獨立的公開案、專利案或專利申請案都是特定的且獨立的以參考文件的方式并入的。
[0078]上述細節描述僅僅是出于便于理解的目的而給出的，而不應從中理解出任何不必要的限制，而對其進行的修改對于所屬領域的專業人員而言是顯而易見的。不應認為本文所提供的任何信息為現有技術或者關聯于當前主張的發明，或者任何明確的或者暗示的參考的公開案為現有技術。
[0079]除非另外界定，否則本文中所使用的所有技術和科技術語具有本發明所屬領域的技術人員通常所理解的相同含義。
[0080]雖然本發明是結合其特定的實施例來描述的，但是應理解可以做出進一步的修改，并且本申請文件意圖涵蓋大體上遵照本發明的原理的本發明的任何變體、應用，或者調整，并且包括本披露的此類擴展內容，即在本發明所涉及的領域內的已知的或者慣常的實踐的范圍內的、可以應用到上文提出的基本特征并且遵照所附權利要求書的范圍的。
[0081]并且，雖然上文描述了且具體實例化了本發明的某些優選實施例，但是這并非意圖將本發明限制于此類實施例，并且任何此類的限制僅包含在上文的權利要求書中。
【權利要求】
1.一種利用分子檢測從含有活細胞和死細胞的混合物中選擇性排除死細胞DNA的方法，所述方法包含除去死亡微生物細胞，隨后從核酸擴增試驗中獲得陽性未污染結果，從而指示存在活細胞；從所述擴增試驗中測量到兩個或更多個時間點的微生物特異性信號增強作為活微生物存在的指示；通過添加化學變性劑從所述混合物中清除擴增試驗抑制劑；以及確定所述混合物中存在的活微生物和死微生物的比率。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述混合物中存在的活微生物與死微生物的比率的確定可以用作治療有效性或治療功效的量度。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述化學變性劑包含一種或多種化學試劑的混合物。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述擴增試驗為PCR試驗。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述混合物包含血液以及其他體液。
6.根據權利要求4所述的方法，其中執行所述PCR試驗提供與菌血癥以及真菌血癥樣品中的活微生物細胞的相關性以便診斷敗血癥。
7.根據權利要求1所述的方法，其中抑制所述混合物中死細胞的信號，并且從分析中排除所述混合物中的膜 受損細胞。
【文檔編號】G01N33/48GK103476945SQ201180065315
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2011年12月27日 優先權日:2010年12月31日
【發明者】肖恩·馬克·奧哈拉 申請人:宙斯科技公司