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專利名稱：發光和不發光多重檢測的制作方法
相關申請的交叉參考本申請要求保護2004年1月22日提交的美國專利申請序號10/762,836的提交日權益，該專利申請的公開內容通過引用結合到本文中。
背景技術：
某些生物由于熒光素酶介導的氧化反應而發光。各種各樣的大量不同物種的熒光素酶基因，具體地說是螢火蟲(Photinus pyralis)和北美螢火蟲(Photuris pennsylvanica)、牙買加叩頭蟲(Pyrophorusplagiophthalamus)、海腎(Renilla renformis)和幾種細菌(例如發光致病桿菌(Xenorhabdus luminescens)和弧菌(Vibrio spp))的熒光素酶基因，是極為普及的發光報告基因。螢火蟲熒光素酶也是測定ATP濃度的通用報告分子，其借此作用廣泛用于檢測生物質。其它酶在與某些合成底物(例如堿性磷酸酶和磷酸金剛烷基二氧雜環丁烷或辣根過氧化物酶和魯米諾)混合時也發光。
由于發光檢測的非放射性性質、敏感性和極為線性的范圍，熒光素酶基因廣泛用作基因報告分子。例如，可檢測少至10-20mol的螢火蟲熒光素酶。因此，實際上基因活性的熒光素酶檢測用于每個實驗生物系統，包括原核和真核細胞培養物、轉基因植物和動物以及無細胞表達系統。同樣，用于測定ATP濃度的熒光素酶檢測是高度敏感性的，能檢測至10-16mol以下。
熒光素酶可通過氧化酶特異性底物(例如熒光素)而產生光。對于螢火蟲熒光素酶和所有其它甲蟲熒光素酶來說，在存在鎂離子、氧和ATP時出現光發生。對于珊瑚蟲熒光素酶(包括海腎熒光素酶)來說，僅需要氧以及底物腔腸素(Coelentrazine)。一般來說，在測定基因活性的發光檢測中，將反應底物和其它激發發光的試劑導入到預期表達報告酶的生物系統中。如果有發光，則使用發光計或任何合適的輻射能檢測裝置檢測產生的發光。檢測非常快速和敏感，快速且容易地提供基因表達數據，不需要放射性試劑。
熒光素酶是眾多報告分子之一，例如螢火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶、氯霉素乙酰轉移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(lacZ)、β-葡糖醛酸酶(GUS)和各種磷酸酶，例如已組合并用作基因活性共同報告分子的分泌性堿性磷酸酶(SEAP)和子宮運鐵蛋白(Uf；酸性磷酸酶)。雙酶報告分子系統涉及使用、表達和檢測單個系統中的兩種獨立的報告分子酶。在基因報告時，雙報告分子檢測對在遺傳操作以在單個細胞或細胞群(例如分散在培養物、分離組織或整個動物中的細胞)中同時表達兩種不同報告基因的檢測特別有用。更時常發生是，一種基因活性報告特定實驗條件的影響，而第二種報告基因的活性提供了通過其標準化全部實驗值集的內控。雙酶報告分子技術還可用于無細胞重組系統，例如得自編碼實驗和對照報告酶的獨立遺傳材料的同時翻譯或偶合其轉錄與翻譯的細胞裂解物。同樣，免疫檢測可設計用于單個樣品中的實驗值和對照值二者的雙重報告。
任何雙酶報告分子檢測的性能都基于組成酶化學特征和關聯其各自產生的數據集的能力。各種報告酶完全不同的酶動力學、檢測化學和溫育要求可使兩種報告酶組合成一體化單管或單孔雙報告分子檢測形式復雜化。一種整合雙報告分子檢測的方法述于美國專利第5,744,320號，其具體公開了用于甲蟲和海腎熒光素酶檢測的一般性或特異性猝滅劑，并闡述了用于依次測定螢火蟲熒光素酶然后海腎熒光素酶發光的代表性雙報告分子檢測。類似地，美國專利第6,586,196號公開了幾種雙報告分子檢測系統。同公開于′320專利中的雙報告分子系統一樣，在′196專利中發光是兩個反應中的每一個的可檢測產物。在Liu等(2000)和Qazi等(2002)中描述了多重化報告分子檢測的方法，該方法不僅加入了不同的底物，而且加入了不同的檢測技術。例如，Liu等報告了在同一生物中的熒光素酶和GFP活性，其中酶活性以分步方式分別經發光和熒光檢測測定。
報告分子還可用于檢測細胞或上清液中分子的存在或活性。例如，蛋白酶構成了大且重要的一類酶，其涉及各種不同的生理過程，例如在血液凝集、炎癥、生殖、纖維蛋白溶解和免疫反應中的蛋白轉換。眾多病癥起因于或特征在于特定蛋白酶或其抑制劑的活性改變。在研究或臨床處置中檢測這些蛋白酶的能力對病癥的研究、治療和管理意義重大。例如，胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-7是半胱氨酸天冬氨酰特異性蛋白酶(也稱為天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶“ASCP”)家族的成員，在哺乳動物細胞的細胞死亡中起關鍵效應子作用(Thornberry等，1992；Nicholson等，1995；Tewari等，1995；和Fernandes-Alnemri等，1996)。
但是，蛋白酶用其天然底物不易檢測。而且，許多目前可得到的合成底物昂貴、不敏感且無選擇性。
業已使用眾多發色和熒光底物檢測蛋白酶(Monsees等，1994；Monsees等，1995)，修飾熒光素提供了對熒光指示劑的替代(美國專利第5,035,999和5,098,828號)。Miska和Geiger(1989)首先描述了使用具有水解酶識別位點的修飾熒光素作為前底物(pro-substrate)的方法，其中通過將修飾熒光素與水解酶溫育特定的一段時間，然后將等份混合物轉移至含熒光素酶的溶液，進行非均相檢測。Masuda-Nishimura等(2000)報道了使用β-半乳糖苷酶底物-修飾熒光素的單管(均相)檢測的應用。
酶反應的熒光或發光底物或產物業已用于蛋白檢測多重化。例如，使用具有多達15種不同細胞因子配體的熒光珠檢測兩種或更多種不同細胞因子(DeJager等，2003)，使用熒光素二磷酸和酪蛋白BODIPY-FL檢測堿性磷酸酶和某些蛋白酶(Nolkrantz等，2002)。
但是，需要的是改進的檢測，例如均相檢測，以使用不同的檢測技術檢測兩種或更多種蛋白。
發明概述本發明提供不發光(例如熒光或比色)檢測和發光檢測的多重檢測(例如在同一孔中)，以檢測樣品中一種或多種成分的量(例如活性)和存在，這些成分包括用于酶反應的輔因子，例如ATP；結合和/或改變分子構象的蛋白(肽或多肽)，例如修飾或切割肽或多肽底物的蛋白；或蛋白結合和/或改變的分子。本文使用的“發光檢測”包括其中第一種分子(例如第一種酶的肽或多肽底物)、第一種分子和合適(第一種)蛋白之間的反應產物和/或不同蛋白和第一種反應產物之間的反應產物發光的反應。因此，發光檢測可直接或間接檢測(例如測量)反應輔因子、蛋白結合和/或改變的分子或該蛋白的量或存在。例如，在一個實施方案中，可在發光檢測中使用甲蟲熒光素酶和合適的熒光素底物檢測ATP濃度，而在另一個實施方案中，可在發光檢測中使用經修飾含蛋白酶識別位點(例如經共價鍵修飾)的熒光素酶底物檢測蛋白酶，即在存在熒光素酶時。發光檢測包括化學發光和生物發光檢測，其包括但不限于使用或檢測熒光素酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、β-內酰胺酶、蛋白酶、堿性磷酸酶或過氧化物酶和合適的對應底物(例如修飾形式的熒光素、腔腸素、魯米諾、肽或多肽、二氧雜環丁烷、二氧雜環丁烷酮和相關吖啶酯)的檢測。本文使用的“發光檢測試劑”包括用于發光反應的底物以及輔因子或其它分子，例如蛋白，如酶。在一個實施方案中，發光檢測試劑可為Z-DEVD-氨基熒光素、Z-LETD-氨基熒光素、Z-LEHD-氨基熒光素，或者可為連接至氨基熒光素、二氫熒光素、熒光素6′甲醚或熒光素6′氯乙醚的其它底物，例如肽或多肽底物。發光檢測是其中發光反應產生的光比對應的不發光檢測強至少1％(例如至少10％)的檢測。
“不發光檢測”包括其中第一種分子(例如蛋白(肽或多肽))、第一種分子和合適(第一種)蛋白(肽或多肽)之間的(第一種)反應產物或不同蛋白和第一種產物之間的反應產物不發光但可用其它方式檢測的反應，例如使用直接或間接檢測反應輔因子、分子或與該分子相互作用的蛋白的量或存在的熒光或比色實驗檢測底物和/或產物。例如，可修飾酶底物以含熒光團，該熒光團僅在酶與底物反應且熒光團接觸(暴露于)一定波長或波長范圍的光后發射一定波長的光，例如(Z-DEVD)2-羅丹明-110是胱天蛋白酶的底物，通過羅丹明-110的熒光可監測胱天蛋白酶切割底物。本文使用的“熒光檢測試劑”包括熒光反應的底物以及輔因子或其它分子，例如蛋白。不發光檢測是其中不發光反應產生的發光信號為對應發光反應發光信號的約10％以下(例如約1％以下或更少)的檢測。
在一個實施方案中，用于本發明檢測的分子，例如蛋白結合和/或改變的分子，包括修飾以含報告分子的分子，即例如在一個或多個隨后反應后可檢測或能夠檢測的分子。例如，在一個實施方案中，用于本發明發光檢測的底物包括待檢測的酶底物，該底物共價連接至發光反應底物，而在另一個實施方案中，用于熒光檢測的底物可包括待檢測的酶底物，該底物共價連接至一個或多個熒光團。在某些實施方案中，蛋白結合和/或改變的分子不包含報告分子。
如本文所述，使用至少兩種不同的底物檢測樣品中一種以上蛋白酶的量或存在，一種底物具有發光示值讀數，一種或多種底物具有熒光示值讀數。例如，使用更敏感的發光方法，例如用底物Z-LETD-氨基熒光素檢測胱天蛋白酶-8，接著使用另一種底物檢測另一種蛋白酶(例如用(Z-DEVD)2-羅丹明-110檢測胱天蛋白酶-3)，實現低豐度細胞蛋白酶的檢測。因此，該檢測兼有熒光試劑的強度和熒光素酶介導的發光反應的敏感性。而且，令人驚奇的是，熒光素(一種具有熒光特性并經常以相對大量存在于發光檢測中的分子)的存在在組合的熒光/發光檢測中未產生明顯干擾。此外，令人驚奇的是，在同一反應混合物中檢測兩種胱天蛋白酶和熒光素酶，混合物包含胱天蛋白酶-8底物(Z-LETD-氨基熒光素)和兩種胱天蛋白酶-3底物，即(Z-DEVD)2-羅丹明-110和Ac-DEVD-AMC。本發明因此為要用于多重檢測的分子提供了更大的靈活性，例如發光檢測底物與熒光檢測底物組合。而且，如果兩種酶介導的反應具有相容的試劑條件，則檢測可為一步檢測。
因此，本發明的組合發光/不發光檢測形式允許多重檢測一種或多種肽或多肽(例如酶)、肽或多肽(例如各種酶的肽或多肽底物)結合和/或改變的一種或多種分子和/或各個檢測的一種或多種輔因子或其組合。因此，在一個實施方案中，本發明提供檢測第一種酶介導反應的第一種分子的存在或量和第二種酶介導反應的第二種分子的存在或量的方法。該方法包括使預期具有第一種和/或第二種分子的樣品與第一種和第二種酶介導反應的反應混合物(其沒有第一種和/或第二種分子)接觸。然后檢測第一種和第二種分子的存在或量。使用包含發光檢測的多重檢測為使用發光實驗檢測的分子提供了增加的敏感性。在一個實施方案中，由第一種酶介導的反應產生發光產物，而由第二種酶介導的反應產生不發光產物。在一個實施方案中，提供組合的發光/熒光檢測，包括其中一種檢測提供內控的檢測。本文描述的檢測可與其它檢測聯用，其他檢測包括報告分子檢測、基于核酸的檢測或基于免疫的檢測以及其它不相關酶檢測。
本發明還提供檢測樣品中至少一種分子的活性或存在的方法。該方法包括提供可包含酶介導反應的至少一種分子的樣品，例如樣品可包含酶，使樣品和無該分子的酶介導反應的反應混合物(例如含酶底物的反應混合物)接觸，以產生反應混合物，其中分子的存在或量能通過發光實驗檢測。在一個實施方案中，樣品和/或反應混合物還與試劑接觸，以檢測第二種酶介導反應的分子，其中第二種酶介導反應的分子的存在或量能通過不發光檢測檢測。
在一個實施方案中，本發明提供檢測樣品中第一種酶和/或該酶介導反應的輔因子的存在或量的方法。該方法包括使樣品與第一種酶的第一種底物、第二種酶的第二種底物以及任選的第三種酶接觸，以產生反應混合物。在一個實施方案中，至少第一種酶和第二種酶是不相同的，例如基本上不識別相同底物，即它們不結合相同底物，或者如果它們與相同底物結合或反應，則其中一種酶與另一種酶底物的反應達不到相同程度(效率)，即當兩種酶的底物都存在時，其中一種酶基本上不與另一種酶底物反應。本文使用的基本上不與第二種酶底物反應的酶(第一種酶)包括這樣的酶在具有第二種酶和等量的第一種酶底物和第二種酶底物的反應中，相對于第一種酶和第一種酶底物之間的反應，其與第二種酶底物的交叉反應不超過25％，例如交叉反應15％、10％或5％或更低。第一種底物、第一種底物和第一種酶之間的反應產物和/或第一種酶和第一種底物的產物與第三種酶之間的反應產物發光。第二種底物、第二種底物和第二種酶之間反應的(第二種)產物和/或另一種酶和第二種產物之間的反應產物不發光但可以其它方式檢測。檢測或測定第一種酶和/或輔因子的存在或量。在一個實施方案中，還檢測或測定第二種酶和/或第二種酶介導反應的輔因子的存在或量。在一個實施方案中，至少第一種酶和第二種酶不相同。待檢測的酶可為天然酶或重組酶，例如包括融合蛋白。加入到樣品中的任選酶也可為天然酶或重組酶。
在另一個實施方案中，本發明提供檢測樣品中第一種酶和/或該酶介導反應的輔因子的存在或量的方法。該方法包括使樣品與第一種酶的第一種底物、第二種酶的第二種底物以及任選的第三種酶接觸，以產生反應混合物，其中任選至少第一種酶和第二種酶不相同。第一種底物、第一種底物和第一種酶之間的反應產物和/或第一種酶和第一種底物的產物與第三種酶之間的反應產物不發光但可以其它方式檢測。第二種底物、第二種底物和第二種酶之間反應的第二種產物和/或另一種酶和第二種產物之間的反應產物發光。檢測或測定第一種酶和/或輔因子的存在或量。在一個實施方案中，還檢測或測定第二種酶的存在或量。在反應混合物中待檢測或使用的酶可為天然酶或重組酶。
本發明進一步提供檢測酶介導發光反應以檢測第一種酶或該酶介導反應的輔因子的方法。該方法包括使樣品與第一種酶的第一種底物、第二種酶的第二種底物以及任選的第三種酶接觸，以產生反應混合物，其中第一種酶和第二種酶不相同。第一種底物、第一種底物和第一種酶之間的反應產物和/或第一種酶和第一種底物的產物與第三種酶的產物發光。第二種底物、第二種底物和第二種酶之間反應的第二種產物和/或第二種產物和另一種酶之間的反應產物不發光但可以其它方式檢測。然后檢測發光。該方法可進一步包括檢測第二種酶的存在或量，例如通過檢測不發光底物或產物的存在或量。在一個實施方案中，第二種酶不與第一種底物結合或反應，而在另一個實施方案中，第一種酶不與第二種底物結合或反應。在一個實施方案中，至少第一種酶和第二種酶不相同。在反應混合物中待檢測或使用的酶可為天然酶或重組酶。
本發明還提供檢測酶介導發光反應以檢測第一種酶或該酶介導反應的輔因子的方法。該方法包括使樣品與第一種酶的第一種底物、第二種酶的第二種底物以及第三種酶接觸，以產生反應混合物。第一種底物、第一種底物和第一種酶之間的反應產物和/或第一種酶和第一種底物的產物與第三種酶的產物不發光但可以其它方式檢測。第二種底物、第二種底物和第二種酶之間反應的第二種產物和/或第二種產物和另一種酶之間的反應產物發光。然后檢測發光。該方法可進一步包括檢測第一種酶或第一種酶和第一種底物的產物的存在或量。在一個實施方案中，第二種酶基本上不與第一種底物結合或反應，而在另一個實施方案中，第一種酶基本上不與第二種底物結合或反應。在一個實施方案中，至少第一種酶和第二種酶不相同。在反應混合物中待檢測或使用的酶可為天然酶或重組酶，例如包括融合蛋白。
本發明進一步提供檢測樣品中至少兩種分子的存在或量的方法。該方法包括使樣品與第一種酶的第一種底物、第二種酶的第二種底物以及任選的第三種酶接觸，以產生反應混合物，其中至少第一種酶和第二種酶不相同。第一種酶和第一種底物之間的反應或第一種底物和第一種酶之間的反應產物與第三種酶之間的反應產生發光產物。第二種底物、第二種底物和第二種酶之間反應的第二種產物和/或第二種產物和不同酶之間的反應產物不發光。然后檢測第一種酶和第二種酶和/或輔因子的存在或量。在一個實施方案中，發光用于檢測第一種酶和/或輔因子，熒光或比色用于檢測至少一種其它酶和/或輔因子。在一個實施方案中，兩種不同酶的底物同時與樣品組合，以產生反應混合物。一種底物和一種酶之間的反應直接或間接產生發光信號，而另一種底物和酶之間的反應直接或間接產生熒光信號。在溫育期后，使用熒光信號檢測一種酶和/或輔因子的存在或量，使用發光信號檢測另一種酶和/或輔因子的存在或量。具體緩沖條件可隨待檢測的酶和/或輔因子變化，可由體外檢測(例如酶檢測)領域技術人員確定。或者，檢測可為兩步檢測，在第一個和第二個檢測之間包含試劑調節。例如，試劑調節可包括加入第一種反應的猝滅劑和/或第二種反應的增強劑。
在一個實施方案中，為檢測第一種酶或第一種酶介導反應的輔因子和第二種酶或第二種酶介導反應的輔因子，使樣品與第一種底物和第二種底物同時接觸。在另一個實施方案中，樣品在接觸第一種底物前接觸第二種底物，或在接觸第二種底物前接觸第一種底物。在一個實施方案中，可與一種或多種底物一起、在一種或多種底物之前或在一種或多種底物之后加入第三種或不同的酶。
在一個實施方案中，為檢測第一種酶介導反應的第一種底物或輔因子和第二種酶介導反應的第二種底物或輔因子，使樣品與第一種酶和第二種酶同時接觸。在另一個實施方案中，樣品在接觸第一種酶前接觸第二種酶，或在接觸第二種酶前接觸第一種酶。
在一個實施方案中，為檢測第一種酶或第一種酶介導反應的輔因子和第二種酶介導反應的第二種底物或輔因子，使樣品與第一種底物和第二種酶同時接觸。在另一個實施方案中，樣品在接觸第一種底物前接觸第二種酶，或在接觸第二種酶前接觸第一種底物。在一個實施方案中，為檢測第一種酶介導反應的第一種底物或輔因子和第二種酶或第二種酶介導反應的輔因子，使樣品與第一種酶和第二種底物同時接觸。在另一個實施方案中，樣品在接觸第一種酶前接觸第二種底物，或在接觸第二種底物前接觸第一種酶。
用于本發明方法的樣品可為細胞裂解物、體外轉錄/翻譯反應物、細胞培養上清液、生理液樣品(例如血液、血漿、血清、腦脊髓液、淚液或尿液樣品)，并可包括完整細胞。細胞、細胞裂解物或上清液可得自原核細胞或真核細胞。
本發明還提供同時或依次檢測第一種和第二種蛋白(例如酶)或其中至少一種蛋白介導反應的輔因子的存在或量，例如提供同時反應或依次反應，任選沒有猝滅其中一種反應或增強/加速其中一種反應。在一個實施方案中，將第一種和第二種底物同時加入到樣品中，并檢測第一種酶和/或輔因子的量或存在，然后檢測第二種酶和/或輔因子的量或存在。在另一個實施方案中，將第一種和第二種底物同時加入到樣品中，并檢測第二種酶和/或輔因子的量或存在，然后檢測第一種酶和/或輔因子的量或存在。或者，將第一種和第二種底物同時加入到樣品中，并同時檢測第一種和第二種酶和/或輔因子的存在或量。優選在單個反應中檢測酶和/或輔因子的存在或量，例如所有反應都在單個容器(例如孔)中進行。
在另一個實施方案中，本發明提供檢測酶介導反應分子的存在或量的方法，其中所述酶介導反應伴有熒光蛋白(例如綠色熒光蛋白)表達。例如，可通過熒光實驗檢測瞬時或穩定表達熒光蛋白或可在細胞中被標記而發熒光的蛋白(例如脫鹵素酶)的細胞中熒光蛋白的存在或量，以及通過發光實驗檢測至少一種另外的分子，例如酶、底物或該酶介導反應的輔因子，該分子存在于細胞中或由細胞分泌。在一個實施方案中，還例如在不發光實驗中檢測或測定不同分子的存在或量。然后可使用由熒光蛋白產生的數據對該分子的存在或量進行標準化。
因此，本發明提供檢測第一種酶介導反應的分子的存在或量的方法。該方法包括使含熒光蛋白表達細胞的樣品與沒有該分子的第一種酶的反應混合物和任選的第二種酶接觸。第一種酶介導反應產生發光產物。然后檢測分子的存在或量和熒光蛋白的存在或量。
在一個實施方案中，對于產生具有不同特征(例如不同顏色)的產物的發光和/或熒光檢測，可使用進一步的多重檢測(即用其它底物)。例如，進一步的多重檢測可包括使用由基于不同熒光素酶的反應或底物散發的不同顏色或具有不同激發/發射光譜的熒光檢測。
本發明還提供測定細胞群(例如細胞培養群)中活細胞和/或死細胞的存在或數目的方法。該方法基于與細胞膜穿透性和完整性相關的差異性蛋白水解活性。該方法的優勢包括用于下游多重應用和群響應標準化的檢測示值讀數的敏感性、簡單性、靈活性。基于一種蛋白酶底物的相對不可滲入性和細胞環境釋放的蛋白酶的對另一種蛋白酶底物的較差酶活性，預測存活力的差異化檢測。用于該實施方案的底物包括外切或內切蛋白酶的底物，包括在N-末端或C-末端被封閉的底物。在一個實施方案中，使用至少兩種不同的熒光底物(熒光檢測試劑)，其中一種底物基本上不能滲入細胞，并對在胞外環境中有活性的蛋白酶(例如遍在化、保守、釋放性蛋白酶)是特異性的。另一種底物基本上可滲入細胞，并對在活細胞中有活性但在存在于胞外環境中時基本無活性的胞內蛋白酶是特異性的。基本上不能滲入細胞的蛋白酶底物是這樣的底物在死細胞檢測中一般用于測定終點的時間段內，例如蛋白酶底物加入樣品后少于5、4、3、2或1.5小時的時間，在活細胞中不可檢出的底物。基本上可滲入細胞的蛋白酶底物是這樣的底物在活細胞檢測中一般用于檢測終點的時間段內，例如底物加入樣品后5、15、30、60或120分鐘以上或更長的時間，進入活細胞的底物。在某些條件下基本無活性的蛋白酶是活性在該蛋白酶最佳活性約10％以下的蛋白酶。在一個實施方案中，基本上不能滲入細胞的熒光底物包括三肽或四肽底物。在一個實施方案中，基本上可滲入細胞的熒光底物包括氨基酸或二肽或三肽底物。使樣品與兩種底物接觸，任選用一種或多種測試條件或物質以不會導致細胞裂解或產生細胞裂解物的量(一般來說“非破壞性的”)處理該樣品。兩種熒光底物中的熒光團具有不同光譜，由與熒光底物接觸的樣品獲得的相對熒光單位(RFLU)使得可以檢測樣品中的活細胞和死細胞。
在另一個實施方案中，使用熒光蛋白酶底物和發光蛋白酶底物檢測或測定樣品中活細胞和死細胞的存在或量。一種底物基本上不能滲入細胞，并對在胞外環境中有活性的蛋白酶是特異性的，另一種底物基本上可滲入細胞，并對在活細胞中有活性但在存在于胞外環境中時基本無活性的胞內蛋白酶是特異性的。在一個實施方案中，基本上不能滲入細胞的蛋白酶底物包括三肽或四肽底物。在一個實施方案中，基本上可滲入細胞的蛋白酶底物包括氨基酸或二肽或三肽底物。例如在不存在導致細胞裂解的條件下使樣品與兩種底物接觸，檢測由蛋白酶切割產生的熒光產物和發光產物(RFLU和RLU)，這使得可以測定樣品中的活細胞和死細胞。例如，可將不引起細胞裂解的熒光素酶檢測試劑加入到孔中，與發光底物接觸。
例如可使用熒光計或熒光計/發光計設備檢測釋放和保留的蛋白酶活性在光譜上不同的信號。這樣的檢測是成反比的，因而是互補的(complimentary)。存活力和細胞毒性檢測可用于標準化、控制和改進數據。
如本文所述，將Ala-Ala-Phe-AMC(釋放性蛋白酶底物)和Gly-Phe-AFC(活細胞保留蛋白酶)與活細胞和細胞裂解物的一定百分比混合物合并。通過凍/融循環、變性劑處理以及誘導凋亡的物質(例如星形孢菌素、rTRAIL和抗-Fas mAb)處理，損害細胞存活力。而且，細胞存活力的這些檢測還與其它細胞存活力檢測(CellTiter-GloTM、CellTiter-BlueTM或CytoTox-ONETM)或凋亡細胞毒性的特異性檢測(胱天蛋白酶-GloTM3/7、-8、-9或Apo-ONETM)復合。另如本文所述，其它底物，例如其它熒光底物(如含羅丹明110的熒光底物)或發光底物(如氨基熒光素型底物)，可用于蛋白酶釋放和/或蛋白酶保留檢測。
因此，本文描述的活細胞和/或死細胞檢測的使用提供細胞健康的反向和互補檢測，并可用于檢測條件改變(例如化合物處理)的作用，而不需要裂解步驟。而且，因為底物具有可忽略或非固有的顏色，所以在成對終點檢測中沒有可觀測的信號猝滅作用。此外，蛋白酶釋放和保留活性組分都具有實用敏感性(檢測10,000細胞/孔的存活力差異小于2-5％)，此敏感性可在少至15分鐘內達到。另外，底物可混合入細胞孔中，而沒有急劇改變孔容量，這增加了下一步終點化學的靈活性。例如，使用偶聯dsDNA嵌入劑或其它合適終點的活細胞/死細胞檢測，可用于檢測或測定死細胞相對對照的百分率、活細胞相對對照的百分率、相對于對照的總細胞數和/或細胞死亡機制(胱天蛋白酶活化)或其它終點報告分子檢測測定。
因此，本發明提供基于單一非破壞性熒光或非破壞性發光蛋白酶的檢測，或基于非破壞性熒光和/或非破壞性發光蛋白酶的活細胞/死細胞檢測的多重檢測，或基于非破壞性熒光蛋白酶的檢測與其它檢測的組合(例如在同一孔中)。在一個實施方案中，在活細胞/死細胞檢測中待檢測或測定的蛋白酶不相同，例如基本上不識別相同底物，即它們不結合相同底物，或者如果它們與相同底物結合或反應，則其中一種蛋白酶與另一種蛋白酶底物的反應達不到相同程度(效率)，即當兩種蛋白酶的底物都存在時，其中一種蛋白酶基本上不與另一種蛋白酶的底物反應。
本發明因此提供檢測樣品中的活細胞和/或死細胞的方法。該方法包括使樣品與第一種蛋白酶的底物和第二種蛋白酶的底物接觸。由一種蛋白酶介導的與一種底物的反應產生熒光產物，由另一種蛋白酶介導的與另一種底物的反應產生發光或熒光產物。一種底物基本上可滲入細胞，另一種底物基本上不可滲入細胞。然后檢測和測定樣品中的熒光和/或發光，其再檢測或測定樣品中活細胞和/或死細胞的數目或存在。
在一個實施方案中，兩種不同蛋白酶的底物同時與樣品混合。在另一個實施方案中，樣品在接觸第一種底物前接觸第二種底物，或在接觸第二種底物前接觸第一種底物。在一個實施方案中，檢測可為兩步檢測，任選在第一個和第二個檢測之間具有試劑調節。本發明還提供第一種和第二種蛋白酶的存在或量的同時或依次檢測。在一個實施方案中，將第一種和第二種底物同時加入到樣品中，并檢測一種蛋白酶的量或存在，然后檢測另一種蛋白酶的量或存在。或者，將第一種和第二種底物同時加入到樣品中，并同時檢測第一種和第二種蛋白酶的存在或量。優選在單個反應中檢測蛋白酶的存在或量，例如所有反應都在單個容器(例如孔)中進行。
本發明提供檢測樣品中活細胞的方法。該方法包括使樣品與基本上可滲入細胞的熒光底物接觸，該底物為結合蛋白酶體的蛋白酶、氨肽酶或組織蛋白酶的底物，檢測或測定樣品中的熒光，由此檢測或測定樣品中活細胞的數目或存在。
本發明還提供檢測樣品中死細胞的方法。該方法包括使樣品與基本上不能滲入細胞的熒光或發光底物接觸，該底物為三肽基肽酶、鈣蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的底物，檢測或測定樣品中的熒光或發光，由此檢測或測定樣品中死細胞的數目或存在。
本發明還提供含一種或多種用于本發明檢測的試劑的試劑盒。在一個實施方案中，本發明提供用于檢測樣品中活細胞和/或死細胞的試劑盒。例如，本發明提供包含組合物和說明書的試劑盒，該組合物具有第一種蛋白酶的基本上不能滲入細胞的第一種熒光或發光底物，以及第二種蛋白酶的基本上可滲入細胞的第二種熒光底物；該說明書用于指導用戶使用該組合物檢測樣品中的活細胞和/或死細胞。在一個實施方案中，組合物為溶液，例如其中底物以0.005至約1.0M(例如0.05至約0.2M)存在于溶劑(例如有機溶劑)中的溶液。在另一個實施方案中，本發明包括含組合物的試劑盒，該組合物包含Ala-Ala-Phe-AMC、(Ala-Ala-Phe)2-R110、Ala-Ala-Phe-氨基熒光素、Gly-Phe-AFC、Gly-Phe-AMC、Gly-Gly-Leu-AMC或其任意組合。在一個實施方案中，組合物為溶液，例如其中底物以0.005至約1.0M(例如0.05至約0.2M)存在的溶液。
本發明的檢測還具有作為藥物開發工具的用途。許多藥物測試化合物具有可干擾熒光/發光多重檢測的熒光特性。本發明提供檢測假結果的檢測。如本文所述，將胱天蛋白酶-3的相同共有底物序列連接至具有不同光譜示值讀數的不同報告分子，例如具有熒光示值讀數的兩種分子和具有發光示值讀數的一種分子。在有和沒有胱天蛋白酶-3抑制劑或熒光素酶抑制劑的情況下檢測胱天蛋白酶-3和熒光素酶。數據表明，三種報告分子之間的干擾非常小，熒光素酶可用于控制假結果的標準化檢測。
因此，可使用本發明的多重檢測，例如組合的熒光/發光檢測，檢測酶調節劑(例如抑制劑)的存在或量。在一個實施方案中，該方法包括提供含第一種酶的不發光底物、第一種酶的第二種底物、用于發光檢測的第二種酶和測試劑的反應混合物。不發光底物和第一種酶而不是第二種底物和第一種酶的反應產生不發光產物，第二種底物和第一種酶反應產生第二種酶的底物，例如熒光素酶底物。第二種酶的底物和第二種酶反應產生發光產物。比較測試和對比反應中發光產物和不發光產物的存在或量。兩個結果的對比表明調節劑對用于發光檢測的酶的作用，這可排除假結果。
附圖簡述

圖1A-B。在發光和熒光檢測試劑二者存在下檢測胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-8酶活性的多重檢測。A)相對光單位(RLU)對時間。B)相對熒光單位(RFU對時間。
圖2A-C。胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-8的多重檢測。A)AMC的信號對背景熒光。B)羅丹明-110的信號對背景熒光。C)信號對背景發光。
圖3A-C。檢測胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-8和胰蛋白酶活性的三重檢測。A)羅丹明-110的RFU；B)AMC的RFU；C)RLU。
圖4A-D。檢測蛋白酶(胱天蛋白酶-3)和非蛋白酶(β-半乳糖苷酶)的多重檢測。A)和C)分別為1/2小時和18小時的RLU。B)和D)分別為2小時和18小時的RFU。
圖5A-C。熒光素(A)、氨基熒光素(B)和Z-LETD-氨基熒光素(C)的激發和發射光譜。
圖6。在胱天蛋白酶-3檢測中三個通道-羅丹明-110、AMC和發光的信號對背景比率。
圖7A-D。檢測乳酸脫氫酶(LDH)活性和腺苷三磷酸(ATP)的多重熒光和發光檢測。A)和C)RLU對ATP濃度。B)和D)RFU對LDH稀釋度。
圖8A-D。檢測LDH和胱天蛋白酶-3的多重熒光和發光檢測。A)和C)RLU對胱天蛋白酶-3濃度。B)和D)RFU對LDH稀釋度。
圖9A-D。檢測蛋白激酶A(PKA)和胱天蛋白酶-3的多重熒光和發光檢測。A)和C)RLU對胱天蛋白酶-3濃度。B)和D)RFU對PKA濃度。
圖10。檢測胱天蛋白酶-3和海腎熒光素酶(luc)的多重熒光和發光檢測。A)和C)RLU對星形孢菌素濃度。B)和D)RFU對胱天蛋白酶-3濃度。
圖11A。RFLU對用變性劑或載體和蛋白酶釋放檢測試劑處理的HL-60細胞數的作圖。
圖11B。熒光(AMC)蛋白酶釋放檢測的敏感性。
圖12A。RFLU對用蛋白酶釋放檢測試劑處理的Jurkat細胞存活百分率的作圖。
圖12B。熒光((Ala-Ala-Phe)2-R110)蛋白酶釋放檢測的敏感性。
圖13A。發光對用發光蛋白酶釋放檢測試劑處理的Jurkat細胞存活百分率的作圖。
圖13B。信噪比對用發光蛋白酶釋放檢測試劑處理的Jurkat細胞存活百分率的作圖。
圖14A。在有或沒有超聲情況下，RLU對用不同蛋白酶釋放檢測試劑處理的HL-60細胞數的作圖。
圖14B。用不同底物進行的發光蛋白酶釋放檢測的敏感性。
圖15A。在蛋白酶釋放(細胞死亡)檢測(AN32504)和CytoTox-ONETM檢測中，信號-背景比率對星形孢菌素接觸時間的作圖。
圖15B。RFLU對星形孢菌素接觸時間、對LDH釋放的作圖。
圖16。在有或沒有裂解和不同pH情況下，RFLU對用蛋白酶釋放檢測試劑處理的HL-60細胞數的作圖。
圖17。與Ala-Ala-Phe-氨基熒光素接觸，并經受不同裂解處理的HL-60細胞釋放的蛋白酶。
圖18。ATP發光和蛋白酶保留檢測試劑的RFLU對rTRAIL濃度的作圖。
圖19A。RFLU對用三種不同蛋白酶保留檢測試劑處理的Jurkat細胞數的作圖。
圖19B。三種不同底物在蛋白酶保留檢測中的敏感性。
圖20。皂苷處理后釋放的蛋白酶的蛋白酶活性的半壽期。
圖21A。基于蛋白酶的活細胞/死細胞檢測。
圖21B。在具有活細胞、死細胞或活細胞/死細胞檢測的依次多重應用中的ATP存活力檢測。
圖21C。熒光活細胞或死細胞檢測和發光ATP檢測的依次多重檢測。
圖22A。活細胞RFLU和胱天蛋白酶3/7活性的RFLU對SK-MEL-28細胞中離子霉素或星形孢菌素逐漸增加的濃度。
圖22B。活細胞RFLU和胱天蛋白酶3/7活性的RFLU對ACHN細胞中星形孢菌素逐漸增加的濃度。
圖23。死HeLa細胞發光和活HeLa細胞熒光對他莫昔芬處理小時數的作圖。
圖24A。用他莫昔芬處理和用PicoGreenTM染色的HeLa細胞的基于蛋白酶的活細胞/死細胞檢測。
圖24B。用離子霉素處理和用PicoGreenTM染色的Hep2G細胞的基于蛋白酶的活細胞/死細胞檢測。
發明詳述本發明提供一種多重檢測方法，其中在反應混合物中同時或依次提供至少兩種蛋白(例如肽或多肽)結合和/或改變的不同分子，以檢測一種或多種成分，包括蛋白(肽或多肽)，例如酶或底物或反應的輔因子。例如，在有效將至少一種酶底物轉變成底物和酶之間的反應產物的條件下，進行一種或多種酶介導的反應。優選反應混合物中的每種分子(例如底物)或反應產物都具有與其它分子或產物不同的特征，在一個實施方案中，至少一種分子包括能夠直接或間接產生可檢測信號的報告分子。產生的信號與待檢測分子的存在或量相關。在一個實施方案中，該方法包括在有效將各種底物轉變成對應產物的條件下，在至少兩種不同酶底物存在下，進行兩種或更多種酶反應，其中至少底物或每個反應的產物和/或一種產物和第三種(例如不同的)酶之間反應的產物具有與其它底物和/或產物不同的可檢測特征，例如不同的光學特征。在進行反應后，同時或依次檢測或測定一種或多種底物或一種或多種反應產物的存在或量。由此可測定對應酶和/或輔因子的存在或量。
因此，設想了兩種通用類型的多重檢測。首先，檢測同一反應混合物中的多種成分，例如一種或多種酶、一種或多種底物和/或酶介導反應的一種或多種輔因子。每種酶都能將至少一種底物轉變成對應產物，其中底物和/或對應產物或一種對應產物和另一種酶之間的反應產物具有不同的可檢測特征，使底物和/或產物在存在于同一反應混合物中時可單獨被檢測。本發明檢測中加入分子的順序可改變。因此，可同時或依次啟動和/或進行各個反應。如果依次啟動和進行，不同的可檢測特征可能需要不同的檢測方法，和/或可進行反應條件調節(例如試劑濃度、溫度或另外的試劑)。例如，可在反應間加入猝滅劑或增強劑(參見例如美國專利第5,774,320和6,586,196號，其公開內容通過引用明確地結合到本文中)。在一個優選實施方案中，在單一反應混合物中同時進行兩種或更多種反應，其中每種酶都有效將反應混合物中的一種底物轉變成產物。該實施方案例如可用于測定細胞、細胞裂解物或細胞上清液中至少兩種不同的酶和/或輔因子的存在或量。另外，反應可包含一種或多種測試劑，例如酶抑制劑或活化劑，和/或不同濃度的抑制劑、活化劑或底物。
任選該檢測作為均相檢測使用，例如混合一種或多種底物和其它組分，然后將混合物加入到樣品中。可在沒有另外試劑轉移的情況下讀出結果。
在第二種檢測類型中，串聯進行兩種或更多種酶介導的反應。可同時或于不同時間進行單獨的反應。反應可包含一種或多種相同或不同的酶、一種或多種相同或不同的測試劑(例如酶抑制劑或活化劑)和/或不同濃度的抑制劑、活化劑或底物。在一個實施方案中，每種反應混合物都包含至少兩種能夠轉變成產物的底物，其中底物和/或對應產物和/或一種酶/底物對的產物和不同酶之間的反應產物具有不同的可檢測特征。
本發明的檢測因此允許檢測樣品中的多種酶或輔因子，所述樣品例如為含真核細胞(例如酵母細胞、鳥類細胞、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞，哺乳動物細胞包括但不限于人、猿、鼠、犬、牛、馬、貓、綿羊、山羊或豬細胞)、或原核細胞、或兩種或更多種不同生物的細胞、或其細胞裂解物或上清液的樣品。細胞可未通過重組技術進行遺傳修飾(非重組細胞)，或可為重組細胞，其用重組DNA瞬時轉染和/或其基因組用重組DNA穩定增加或其基因組已被修飾以破壞基因，例如破壞了啟動子、內含子或讀框，或一個DNA片段被另一個置換。重組DNA或置換DNA片段可編碼通過本發明方法檢測的分子、改變待檢測分子的水平或活性的成分和/或與分子或改變分子的水平或活性的成分不相關的基因產物。
在一個實施方案中，本發明方法提供同時或依次檢測單個樣品(例如等份細胞或其裂解物)中的多種成分(包括酶)的快速高敏感性方法。在一個實施方案中，該方法包括在發光檢測中定量第一種酶、底物或輔因子的存在或量(活性)，在不發光檢測(例如熒光檢測)中定量第二種酶、底物或輔因子的存在或量。在一個實施方案中，可一起或依次加入每個反應的試劑，例如底物。在另一個實施方案中，該方法包括在熒光檢測中定量第一種酶、底物或輔因子的存在或量，在發光檢測中定量第二種酶、底物或輔因子的存在或量。因此，在另一個實施方案中，該方法包括在發光檢測中定量輔因子的存在或量，在不發光檢測中定量不同的分子。在再另一個實施方案中，該方法包括在不發光檢測中定量輔因子的存在或量，在發光檢測中定量不同的分子。發光或不發光信號的強度是相應分子的存在或量的函數。
本發明進一步提供單重或多重檢測方法，其中為樣品(例如未經歷細胞裂解的樣品)提供一種或多種外切和/或內切蛋白酶的一種或多種底物，這些底物用于檢測或測定樣品中活細胞和/或死細胞的數目或存在。
在一個實施方案中，本發明涉及檢測單等份細胞或其裂解物中一種或多種酶的存在或量的方法。在一個實施方案中，至少一種酶是內切酶。例如，在一個實施方案中，本發明提供監測含蛋白酶和其它酶的制品中至少一種蛋白酶和任選另一種酶的活性的改進型敏感方法，所述制品包括得自原核細胞或真核細胞的純化制品、細胞(例如培養的真核細胞，如哺乳動物細胞)的細胞裂解物或上清液。對于在不同細胞區域中存在的酶，例如分泌性蛋白酶和胞內蛋白酶，可將每種酶的底物加入到含完整細胞的孔中。可在檢測分泌性蛋白酶的存在或量之后檢測胞內蛋白酶，例如在細胞裂解后，例如胞內蛋白酶檢測可與分泌性蛋白酶檢測在同一容器(例如相同孔)中進行。在一個實施方案中，將胞內蛋白酶的非細胞滲入性底物和分泌性或釋放性蛋白酶的底物加入到含細胞的樣品中，然后任選裂解細胞。可在細胞裂解前或細胞裂解后檢測分泌性或釋放性蛋白酶。在另一個實施方案中，將胞內蛋白酶或分泌性或釋放性蛋白酶的非細胞滲入性底物和第二種胞內酶的細胞滲入性底物加入到含細胞的樣品中。可在不裂解的情況下，檢測第二種胞內酶和分泌性或釋放性蛋白酶的存在。在再另一個實施方案中，進行三重檢測，以檢測分泌性或釋放性蛋白酶、胞內酶(使用細胞滲入性底物或非細胞滲入性底物)和另一種分子(例如DNA或ATP)或第二種酶(例如胞內酶(使用細胞滲入性底物或非細胞滲入性底物))。在一個實施方案中，使用熒光、發光或分光光度法檢測分泌性或釋放性蛋白。
本發明方法可用于檢測任何分子，包括任意酶或任意酶組。可由任意酶組合(包括重組酶和內源(天然)酶)中選擇用于該方法的酶，該酶是待檢測的酶或者是用于檢測底物或輔因子的酶。在一個實施方案中，所有待檢測的酶都是內源酶。在另一個實施方案中，兩種待檢測的酶是內源酶，另一種酶是重組酶。在另一個實施方案中，一種酶是內源酶，另一種酶是重組酶。其它組合對本領域技術人員是顯而易見的，可用于本文教導的本發明檢測和方法。所述酶包括但不限于蛋白酶、磷酸酶、過氧化物酶、磷酸酯酶、肽酶和糖苷酶。所述酶可基于催化反應性質來自不同組別，這些組別包括但不限于水解酶、氧化還原酶、裂解酶、轉移酶、異構酶、連接酶或合成酶，或者它們可來自相同組別，只要至少一種酶相對與至少一種其它酶具有部分重疊或優選基本不同的底物特異性。特別令人感興趣的是具有生理意義的酶類別。這些酶包括蛋白激酶、肽酶、酯酶、蛋白磷酸酶、異構酶、糖基化酶、合成酶、蛋白酶、脫氫酶、氧化酶、還原酶、甲基化酶等。目的酶包括參與形成或水解酯(有機酯和無機酯)、糖基化和水解酰胺的酶。在任一種類型中都可進行進一步細分，如對于激酶，激酶可特異性磷酸化肽或蛋白中的絲氨酸、蘇氨酸和/或酪氨酸殘基。因此，所述酶可為例如不同激酶功能組別的激酶，包括受環狀核苷酸調節的蛋白激酶、蛋白激酶C、受Ca2+/CaM調節的激酶、細胞周期蛋白依賴性激酶、ERK/MAP激酶和蛋白-酪氨酸激酶。激酶可為在信號轉導通路中有效磷酸化寡肽底物的激酶，例如ERK激酶、S6激酶、IR激酶、P38激酶和AbI激酶。對于這些激酶，底物可包括寡肽底物。其它目的激酶可包括例如Src激酶、JNK、MAP激酶、細胞周期蛋白依賴性激酶、P53激酶、血小板衍生的生長因子受體、表皮生長因子受體和MEK。
具體地說，用于本發明的酶包括任何具有酶活性的蛋白，例如脂酶、磷脂酶、硫酸酯酶、脲酶、肽酶、蛋白酶和酯酶，包括酸性磷酸酶、葡糖苷酶、葡糖醛酸酶、半乳糖苷酶、羧酸酯酶和熒光素酶。在一個實施方案中，一種酶是水解酶。在另一個實施方案中，至少兩種酶是水解酶。水解酶的實例包括堿性和酸性磷酸酶、酯酶、脫羧酶、磷脂酶D、P-木糖苷酶、β-D-巖藻糖苷酶、硫葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、α-D-半乳糖苷酶、α-D-葡糖苷酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-葡糖苷酸酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、β-D-呋喃果糖苷酶和β-D-葡糖苷酸酶。
任何特定酶介導反應的底物或輔因子都是本領域技術人員所已知的。表1列出了某些蛋白酶的代表性切割位點。
表1
X是一個或多個氨基酸。
對于堿性磷酸酶，優選底物包括含磷酸的二氧雜環丁烷，例如3-(2′-螺金剛烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧雜環丁烷二鈉鹽，或3-(4-甲氧基螺[1，2-二氧雜環丁烷-3，2′(5′-氯)-三環-[3.3.1.13，7]癸]-4-基]苯基磷酸二鈉，或2-氯-5-(4-甲氧基螺{1，2-二氧雜環丁烷-3，2′-(5′-氯)-三環{3.3.13，7]癸}-4-基)-1-苯基磷酸二鈉或2-氯-5-(4-甲氧基螺{1，2-二氧雜環丁烷-3，2′-三環[3.3.1.13，7]癸}-4-基)-1-苯基磷酸二鈉(分別為AMPPD、CSPD、CDP-Star和ADP-StarTM)。
對于半乳糖苷酶，底物優選包括含半乳糖苷酶可切割基團或吡喃半乳糖苷基團的二氧雜環丁烷。檢測中的發光由酶切割二氧雜環丁烷底物的糖部分產生。這種底物的實例包括3-(2′-螺金剛烷)-4-甲氧基-4-(3″-β-D-吡喃半乳糖)苯基-1，2-二氧雜環丁烷(AMPGD)、3-(4-甲氧基螺[1，2-二氧雜環丁烷-3，2′-(5′-氯)三環[3.3.1.13，7]-癸]-4-基-苯基-β-D-吡喃半乳糖(Galacton)、5-氯-3-(甲氧基螺[1，2-二氧雜環丁烷-3，2′-(5′-氯)三環[3.3.13，7]癸-4-基-苯基-β-D-吡喃半乳糖(Galacton-Plus)和2-氯-5-(4-甲氧基螺[1，2-二氧雜環丁烷-3，2′(5′-氯)-三環-[3.3.1.13，7]癸]-4-基)-苯基-β-D-吡喃半乳糖(Galacton-Star)。
在β-葡糖醛酸酶和β-葡糖苷酶檢測中，底物包括含β-葡糖醛酸酶可切割基團(例如葡糖苷酸)的二氧雜環丁烷，例如3-(4-甲氧基螺{1，2-二氧雜環丁烷-3，2′-(5′-氯)-三環[3.3.1.13，7]癸}-4-基)苯基-β-D-葡糖醛酸鈉(GlucuronTM)。在羧酸酯酶檢測中，底物包含結合至二氧雜環丁烷的合適酯基。在蛋白酶和磷脂酶檢測中，底物包含結合至二氧雜環丁烷的合適酶可切割基團。
優選檢測中每種酶的底物都不同。對于包括一種含二氧雜環丁烷底物的檢測，底物任選包含取代或未取代的金剛烷基、可取代或未取代的Y基團和酶可切割基團。二氧雜環丁烷的優選實例包括上文提及的二氧雜環丁烷，例如稱為Galacton、Galacton-Plus、CDP-Star、GlucuronTM、AMPPD、Galacton-Star和ADP-StarTM的二氧雜環丁烷，以及3-(4-甲氧基螺{1，2-二氧雜環丁烷-3，2′-(5′-氯)-三環[3.3.1.13，7]癸-4-基)苯基-β-D-吡喃葡糖苷(GluconTM)、CSPD、3-氯-5-(4-甲氧基螺{1，2-二氧雜環丁烷-3，2′-(5′-氯)-三環[3.3.1.13，7]癸-4-基)-1-苯基磷酸二鈉(CDP)。
優選將至少一種待檢測酶的底物修飾以含報告分子。報告分子是任何這樣的分子其允許連接至該分子的底物、酶和該底物之間反應產生的產物或該產物和另一種酶之間的反應產物差異化檢測，優選定量檢測。報告分子包括但不限于光學分子(例如熒光團)、吸收性有色顆粒或染料、放射性標記、酶(例如在合適反應組分存在下有效催化可檢測反應的催化部分)、當與其它亞單位或片段結合時有功能的酶的亞單位或片段，或后續反應的底物，例如其中該反應產物可檢測的底物。本文使用的“熒光團”包括能在某個波長范圍吸收能量并能在該吸收范圍以外的波長范圍釋放能量的分子。術語“激發波長”指熒光團吸收能量的波長范圍。術語“發射波長”指熒光團釋放能量或熒光的波長范圍。
在一個實施方案中，報告分子發熒光。熒光劑的一個基團是呫噸染料，其包含熒光素、Rosamine和羅丹明。可市售獲得在苯基上具有取代基的這些化合物，其可用作鍵合位點或鍵合官能團。例如，可獲得氨基和異硫氰酸酯取代的熒光素化合物。
另一組熒光化合物是在α或β位(通常在α位)具有氨基的萘胺。在萘胺化合物中包括1-二甲基氨基萘基-5-磺酸鹽、1-苯胺基-8-萘磺酸鹽和2-對-甲苯胺基-6-萘磺酸鹽。某些萘化合物被發現具有一些非特異性蛋白結合，致使其應用需要使用其中蛋白量最小化的檢測介質。其它熒光劑是多齒配位體，包括含氮大環，其具有帶π電子的共軛環系統。這些大環任選被取代，包括橋碳或氮上的取代。合適的大環包括卟啉、氮雜卟啉、咕啉、Sapphyrin和葉琳烯(porphycene)以及其它類似大環的衍生物，其包含廣泛離域的電子。氮雜卟啉衍生物包括酞菁、苯并三氮雜卟啉和萘菁及其衍生物。
在某些情況下，可使用熒光融合蛋白，例如融合至多肽底物的綠色、紅色或藍色熒光蛋白或其它熒光蛋白。在其它實施方案中，熒光蛋白自身可為水解酶的底物。“熒光蛋白”是全長熒光蛋白或其熒光片段。
表2顯示了用于本發明的化學熒光團的非限制性清單以及其激發和發射波長。激發和發射值可根據反應條件(例如pH、緩沖體系或溶劑)改變。
表2
在一個實施方案中，使用含氨基修飾熒光素或其羧基受保護衍生物的底物檢測其中一種酶，該修飾包括酶底物。在一個實施方案中，修飾是含蛋白酶識別位點的一個或多個氨基酸殘基。在一個實施方案中，底物通過肽鍵共價連接至氨基熒光素或其羧基修飾衍生物的氨基。在一個實施方案中，例如使用氨基末端保護基修飾肽或蛋白底物的N-端，以防止被氨肽酶降解。在沒有合適酶或輔因子時，由于存在極少量氨基熒光素，含此底物和熒光素酶的混合物產生極少量光。在存在合適酶時，該酶可切割連接底物和氨基熒光素的鍵，產生熒光素酶底物氨基熒光素。因此，在存在熒光素酶(例如天然、重組或突變熒光素酶)和任何輔因子和合適反應條件時，產生光，其與酶的存在或活性成比例。
在一個實施方案中，使用含熒光團的底物檢測其中一種酶。在一個實施方案中，底物包括一個或多個含蛋白酶識別位點的氨基酸殘基。在一個實施方案中，底物共價連接至一個或多個熒光團。在沒有合適酶或輔因子時，由于例如通過鄰近的猝滅基團猝滅熒光團的熒光特性，使得底物-熒光團綴合物的特性被改變，導致綴合物的熒光特性相對于單獨的熒光團被改變(例如降低)，含此底物的混合物于發射波長產生極少量光。在存在合適酶時，綴合物的切割產生熒光團。在另一個實施方案中，在切割前，綴合物發熒光，但在酶切割后，產物具有改變的光譜。
在一個實施方案中，至少兩個反應的條件相容。例如，至少2種酶的條件，優選3種酶或更多種酶(例如4種酶或更多種酶)的條件相容。一組相似酶一般具有相容的反應條件，例如pH和離子強度，但是，涉及具有相對低質量濃度的檢測組分(例如輔因子)的輔因子要求、金屬離子要求等，不需要相同。相同條件包括在反應過程中使每種酶提供可檢測速率的條件，一般是每種酶具有其特定底物最大轉換率的至少約10％，通常至少約20％，優選至少約50％，不受加入的用于其它酶的組分的明顯干擾。
或者，一個反應的條件可與另一個反應不相容，盡管兩個反應的底物都存在。在這樣的實施方案中，一種酶有活性，但不能與其底物反應。例如，在一個實施方案中，當兩個反應的條件不相容時，依次和/或在單獨的反應混合物中進行各個酶檢測反應。在酶檢測后，反應混合物(或其部分)可與另一個反應組合。各單獨的反應混合物可包含一種或多種酶和一種或多種底物。就其最簡單形式而言，各反應混合物中有一種待檢測的酶和該酶的一種底物。反應中使用的底物組具有和在單反應多重檢測中所要求特性相同的一般特性。即，每種底物和/或對應產物具有獨特特性，使其彼此之間可被區分。
反應中分子的檢測順序可以改變。在一個實施方案中，不論反應是否同時開始，都檢測通過發光實驗檢測的分子，然后檢測通過不發光實驗檢測的分子。或者，不論反應是否同時開始，都檢測通過不發光實驗檢測的分子，然后檢測通過發光實驗檢測的分子。在其它實施方案中，基本上同時檢測兩種或更多種分子的存在或量。在一個實施方案中，顯著降低待檢測的一種分子的存在或活性，然后檢測第二種分子的存在或量，例如通過等待直至第一種信號消失，例如消失至少50％，或通過加入第一種反應的猝滅劑。因此，在某些實施方案中，例如通過在檢測前抑制反應中的酶，終止一個或多個反應。優選一個檢測產生的信號基本上不干擾至少一個其它檢測產生的信號的量。
本發明還提供檢測樣品(例如含完整細胞、細胞裂解物如至少部分純化的裂解物或細胞上清液的樣品)中一種或多種肽或蛋白、肽或蛋白結合和/或改變的分子或輔因子的存在或活性的試劑盒。這樣的試劑盒包括至少一種試劑，用于定量至少一種肽和/或蛋白、肽和/或蛋白結合和/或改變的分子或輔因子，例如至少一種酶的底物。
本發明將通過以下的非限制性實施例進一步描述。對于所有實施例，本領域技術人員都容易設計合適的對照反應。
實施例I熒光/發光多重檢測A.在單孔多重實驗中檢測胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-8評價胱天蛋白酶-GloTM8試劑(胱天蛋白酶-GloTM8檢測系統，Promega，Corp.)允許多重化均相發光胱天蛋白酶-8酶檢測和不發光胱天蛋白酶-3酶檢測的能力。胱天蛋白酶-GloTM8試劑由胱天蛋白酶-GloTM8緩沖液和發光底物Z-LETD-氨基熒光素組成。對于圖1A中的發光檢測，使用胱天蛋白酶-GloTM8試劑(菱形)或還含有50-胱天蛋白酶-3熒光底物(Z-DEVD)2-羅丹明-110的胱天蛋白酶-GloTM8試劑(方形)，表明多重發光和不發光檢測的靈活性。對于圖1B中的熒光檢測，使用含50μM(Z-DEVD)2-羅丹明-110和10mM DTT(菱形)或50μM(Z-DEVD)2-羅丹明-110和Z-LETD-氨基熒光素(方形)的胱天蛋白酶-GloTM8緩沖液。
在RPMI 1640(Sigma Corporation)中制備終濃度為100單位/ml的胱天蛋白酶-8酶、胱天蛋白酶-3酶和組合的胱天蛋白酶-8和胱天蛋白酶-3酶(Biomol Research Laboratories)的稀釋液。將100μl胱天蛋白酶-8稀釋液、胱天蛋白酶-8和胱天蛋白酶-3稀釋液的混合物或胱天蛋白酶-3稀釋液加入到96孔板的各個孔中。加入100μl有或沒有50μM(Z-DEVD)2-羅丹明-110的胱天蛋白酶-GloTM8試劑(圖1A)或100μl有或沒有Z-LETD-氨基熒光素、補加(Z-DEVD)2-羅丹明110和DTT的胱天蛋白酶-GloTM8緩沖液(圖1B)，至終體積為200μl/孔。反應板在板振蕩器上于室溫溫育至少10分鐘。
在溫育后，使用DYNEX Laboratories MLXTM板發光計測定相對發光，使用配備485EX/530EM濾光片組的CytoFluor II熒光板讀數器檢測相對熒光。
結果圖1A顯示了單個孔中兩種蛋白酶熒光和發光的同時檢測。由圖1A可見，在胱天蛋白酶-8發光檢測(方形)中存在胱天蛋白酶-3及其熒光底物(Z-DEVD)2-羅丹明-110沒有很大地改變發光反應。同樣，由圖1B可見，在胱天蛋白酶-3熒光檢測(方形)中存在胱天蛋白酶-8及其發光底物Z-LETD-氨基熒光素未影響胱天蛋白酶-3熒光檢測。
B.胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-8多重檢測的背景測定混合各種濃度的發光和不發光試劑(包括胱天蛋白酶酶及其底物)和緩沖組分，以確定各種成分對熒光和/或發光的影響。熒光底物(Z-DEVD)2-羅丹明-110在羅丹明通道(485EX/520EM)報告胱天蛋白酶-3活性，熒光底物Ac-DEVD-AMC在AMC通道(360EX/460EM)報告胱天蛋白酶-3活性，而底物Z-LETD-氨基熒光素在發光檢測中報告胱天蛋白酶-8活性。表III描述了用于12種不同反應條件的各種組分的量(μl)，獲得總體積約500μl的總混合物，或每種反應條件100μl的總混合物/反應(n＝4)。對于‘加入的胱天蛋白酶’行，該行中的數字規定了過多加入的胱天蛋白酶的類型，沒有描述體積。
表3
1.胱天蛋白酶-8luc對照2.胱天蛋白酶-3羅丹明-110對照3.胱天蛋白酶-3 AMC對照4.多重對照和羅丹明-1105.多重對照和羅丹明-110+抑制劑6.多重對照和AMC7.胱天蛋白酶-3和氨基熒光素混合物8.胱天蛋白酶-3和氨基熒光素混合物+抑制劑9.胱天蛋白酶-8和羅丹明-11010.胱天蛋白酶-3和氨基熒光素混合物11.胱天蛋白酶-8和氨基熒光素混合物+抑制劑12.胱天蛋白酶-3和羅丹明-110，沒有氨基熒光素混合物將表III的組分加入至雙份孔中，于室溫溫育反應物2小時。使用的緩沖液得自胱天蛋白酶-GloTM8檢測系統。DMSO得自Sigma-Aldrich，DTT得自Amersco。底物和抑制劑得自Promega Corp。
使用DYNEX Laboratories MLXTM板發光計測定相對發光。使用CytoFluor II熒光板讀數器，配備485EX/530EM濾光片組用于羅丹明-110，接著配備360EX/460EM濾光片組用于AMC通道，檢測相對熒光。
結果對于圖2A、B和C，所有的carat都代表在該情況下預期熒光或發光指示酶活性。圖2A顯示了每個反應的AMC熒光信號。僅在存在Ac-DEVD-AMC和胱天蛋白酶-3的合適底物/酶組合(反應條件3和6)時，才出現背景之上的熒光。圖2B顯示了每個反應的羅丹明-110熒光信號。除了存在胱天蛋白酶-3抑制劑(反應條件5)以外，當存在(Z-DEVD)2-羅丹明-110/胱天蛋白酶-3的底物/酶組合(反應條件2、4、10和12)時，出現背景之上的熒光。對于背景以上的發光信號(圖2C)，具有Z-LETD-氨基熒光素/胱天蛋白酶-8的合適底物/酶組合的反應表現出背景以上的信號(反應條件1、4、6、7、9和10)，例外是存在胱天蛋白酶抑制劑的反應條件(反應條件5、8和11)。因此，數據表明，在這些條件下，反應組分對背景熒光和發光檢測的影響可忽略不計。
C.在單孔三重實驗中檢測胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-8和胰蛋白酶在Dulbecco磷酸緩沖鹽水(Sigma Corp.)中制備可檢測水平的胱天蛋白酶-8(150單位/ml，Biomol Research Laboratories)、胱天蛋白酶-3(Pharmingen Corp.)、胰蛋白酶(Sigma Corp.)以及全部三種酶組合的稀釋液。將100μl各種酶稀釋液加入到96孔板的孔中，適當時將100μl各種底物單獨或組合加入到對應孔中胱天蛋白酶-3底物(Z-DEVD)2-羅丹明-110、胰蛋白酶底物Z-PRNK-AMC(如美國專利申請序號09/955,639所述為β-類胰蛋白酶底物，但具有公認較小的胰蛋白酶效用，其通過引用整體結合到本文中)、胱天蛋白酶-8底物Z-LETD-氨基熒光素。當胱天蛋白酶-GloTM8緩沖液和底物一起用于熒光檢測時，包含10mM DTT。板在板振蕩器上于室溫溫育至少10分鐘。
在溫育后，使用BMG Fluorostar(BMG Labtechnologies Ltd.)檢測胱天蛋白酶-8活性的相對發光。使用Labsystems Fluoroskan Ascen板讀數器測定相對熒光。對于胱天蛋白酶-3活性，使用485EX/527EM濾光片組。對于胰蛋白酶活性，使用360EX/460EM濾光片組。
結果如圖3A所示，在采用混合的三種不同底物和對應酶的反應(三重檢測)中，用于檢測胱天蛋白酶-3的條件產生相對比對照條件高的熒光。當對比三重檢測(所有底物和所有酶)中的胱天蛋白酶-3活性和單獨的胱天蛋白酶-3活性時，胱天蛋白酶-3活性高于胱天蛋白酶-3處于和其它三重酶反應相同反應中時的背景。對胰蛋白酶(圖3B)和胱天蛋白酶-8(圖3C)觀察到相似的結果，雖然與胱天蛋白酶-3的程度不同。
D.以單孔多重形式檢測胱天蛋白酶-3和β-半乳糖苷酶通過用Beta-Glo緩沖液(Beta-Glo檢測系統，Promega Corp.)重構Beta-Glo凍干底物，或向Beta-Glo緩沖液中加入(Z-DEVD)2-羅丹明-110(50μM)，或用Beta-Glo緩沖液重構Beta-Glo凍干底物并加入(Z-DEVD)2-羅丹明-110(50μM，制備試劑。用RPMI 1640稀釋胱天蛋白酶-3(2μl/ml，Pharmingen Corp)或β-半乳糖苷酶(0.1μl/ml)或胱天蛋白酶-3和β-半乳糖苷酶，并向96孔白板孔中加入100μl。向96孔板孔中加入100μl合適試劑，將板于室溫溫育。在30分鐘時使用DYNEX Laboratories MLXTM板發光計檢測發光。在溫育后2小時，用具有485EX/530EM濾光片組的CytoFluor II熒光板讀數器測定熒光。所有的測定都在18小時時在CytoFluor II熒光計上以不同的增益調整重復1次，以補償增加的熒光。
結果圖4A和C表明，在存在檢測胱天蛋白酶-3的熒光試劑時，β-半乳糖苷酶發光檢測是可用的。圖4B和D表明，在檢測β-半乳糖苷酶的發光試劑存在時，檢測胱天蛋白酶-3的的熒光檢測是可用的。由圖4B和4D可見，發光試劑組分對背景熒光具有較小的影響。但是，熒光試劑組分對發光的影響幾乎沒有(圖4A和4C)。
E.發光檢測底物的光譜掃描用含0.1M Tris pH7.3、2mM EDTA和10mM MgSO4的緩沖液，將熒光素、氨基熒光素和Z-LETD-氨基熒光素稀釋至約2μM。在配備1.25mm激發和發射狹縫濾光片的情況下，用SPEX Fluorolog-2分光發光計以1mm波長間隔和0.2秒積分時間掃描樣品。所有的掃描都使用石英比色皿進行。
結果對于熒光素和氨基熒光素，于325mn激發，并捕獲375-750nm的發射，捕獲280-550nm的激發，于600nm檢測發射(圖5A和5B)。對于Z-LETD-氨基熒光素，于325mn激發，并捕獲375-750nm的發射，捕獲280-550nm的激發，于525nm檢測發射(圖5C)。令人感興趣的是，當肽綴合至氨基熒光素時(圖5C)，綴合物的發射峰藍移至較短的波長。這令人意外，因此可進行雙重發光/熒光檢測，具體地說是使用的熒光團以與氨基熒光素發射相同的波長范圍發射時。
實施例II檢測假結果的方法方法在胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-3抑制劑(Ac-DEVD-CHO，10μM)或熒光素酶抑制劑(白藜蘆醇(Resveratol)，5μM)存在下，將含Z-DEVD-氨基熒光素的胱天蛋白酶-GloTM3/7試劑(胱天蛋白酶-GloTM3/7檢測，Promega，Corp.)與(Z-DEVD)2-羅丹明-110或Ac-DEVD-AMC組合。在30分鐘時對胱天蛋白酶-3切割Z-DEVD-氨基熒光素的發光信號讀數，而在2小時時使用合適的AMC或羅丹明110濾光片組對胱天蛋白酶-3切割活性的熒光信號讀數。
結果發光獲得最大的信號對背景比率，接著是羅丹明-110，然后是AMC(圖6)。加入已知的胱天蛋白酶-3抑制劑一致且負面地影響用于檢測胱天蛋白酶-3的全部三種底物。這提示可組合發光和熒光試劑，例如用于控制進行任一種檢測時潛在的假結果干擾。因此，如果一種物質是特定酶的真正抑制劑，則多重信號可用于測定。
實施例III另外的代表性多重檢測A.單孔形式的乳酸脫氫酶(LDH)和腺苷三磷酸(ATP)多重檢測制備以下檢測試劑1)使用LDH試劑(30mM HEPES，pH7.4、10mM NaCl、20mM MgSO4、250μM刃天青(Aldrich))重構CytoTox-ONETM均相膜完整性檢測(Promega Corp，技術公告306)的凍干底物組分；2)使用ATP試劑(30mM HEPES，pH7.4、10mM NaCl、20mMMgSO4)重構CellTiter-GloTM發光細胞存活力檢測(Promega Corp，技術公報288)的凍干底物；3)使用LDH/ATP組合試劑(30mM HEPES，pH7.4、10mM NaCl、20mM MgSO4、250μM刃天青(Aldrich))重構CytoTox-ONETM的凍干底物組分，其再用于重構CellTiter-GloTM的凍干底物。
用10mM HEPES，pH7.5、0.1％Prionex(PentaPharma Corp)溶液制備LDH(0、1∶8000、1∶4000、1∶2000，菱形)、ATP(0、1.25、2.5和5μM，方形)和LDH/ATP組合(分別為0/0μM、1∶8000/1.25μM、1∶4000/2.5μM和1∶2000/5μM，三角形)的樣品稀釋液，向96孔白板孔中加入100μl稀釋液(n＝4)。向樣品中加入合適的檢測試劑(100μl)，保護板避光，混合30秒，于室溫溫育。在8分鐘溫育后，用具有560EX/590Em濾光片組的Labsystems Fluoroskan Ascent板讀數器檢測熒光。在溫育后30分鐘，使用Dynex MLX板發光計記錄發光。
結果和對照反應(圖7C)相比，LDH及其熒光檢測試劑對ATP發光檢測(圖7A)具有較小影響；但是，ATP檢測仍是有可能的。向LDH熒光檢測中加入發光檢測試劑不影響背景熒光(圖7B)，盡管和對照反應(圖7D)相比總熒光下降，但LDH活性仍可檢測。
B.單孔形式的LDH和胱天蛋白酶-3多重檢測制備以下試劑1)LDH試劑-使用補加238-刃天青的胱天蛋白酶-GloTM3/7緩沖液重構CytoTox-ONETM凍干底物；2)胱天蛋白酶-3試劑-按照Promega技術公告323使用胱天蛋白酶-GloTM3/7緩沖液重構胱天蛋白酶-GloTM3/7凍干底物；3)LDH/胱天蛋白酶-3組合試劑-使用LDH試劑(如上制備)重構凍干胱天蛋白酶-GloTM3/7底物。LDH/胱天蛋白酶-3組合試劑的LDH檢測試劑化合物不穩定，原因是在胱天蛋白酶-GloTM3/7凍干底物中存在DTT，所以該試劑在加入樣品前立即制備。
用10mM HEPES pH7.5、0.1％Prionex(PentaPharma Corp)溶液制備樣品稀釋液LDH的0、1∶8000、1∶4000、1∶2000稀釋液(菱形)；0、5、10和20U/ml胱天蛋白酶-3(BIOMOL Laboratories，方形)和LDH/胱天蛋白酶-3組合(分別為0/0U/ml、1∶8000/5U/ml、1∶4000/10U/ml和1∶2000/20U/ml，三角形)。向96孔白板中加入100μl稀釋液(n＝4)。向樣品中加入合適的檢測試劑(100μl)，保護板避光，混合30秒，于室溫溫育。在于室溫溫育6分鐘后，用具有560EX/590Em濾光片組的Labsystems Fluoroskan Ascent板讀數器檢測熒光。在溫育后45分鐘，使用Dynex MLX板發光計記錄發光。
結果和對照反應相比，向多重反應中加入熒光LDH檢測試劑降低了發光(分別為圖8A和8C)。盡管在圖8A中總發光信號下降，但存在熒光LDH檢測試劑時發光胱天蛋白酶-3檢測是可用的。圖8B表明，和對照相比，當將發光胱天蛋白酶-3檢測試劑加入到多重反應中時，熒光背景增加(圖8D)；但是，圖8A表明，在存在胱天蛋白酶-3發光檢測試劑時，LDH熒光檢測是可用的。LDH對背景發光沒有影響(圖8C)，胱天蛋白酶-3對背景熒光沒有影響(圖8D)。
C.單孔形式的胱天蛋白酶-3和蛋白激酶A(PKA)多重檢測制備以下的檢測試劑1)PKA試劑-制備含100mM Tris pH7.3、100mM MgCl2、1∶1000稀釋度的PKA羅丹明-110底物(ProFluorTMPKA檢測，Promega Corporation，技術公告315)和400μMATP的1X反應緩沖液；2)胱天蛋白酶-3試劑-制備含100mM Tris pH7.3、100mM MgCl2、150μg/ml重組熱穩定熒光素酶、80-Z-DEVD-氨基熒光素(Promega Corp)、400μM ATP、100μM DTT(Promega Corp)、2.5mM CaCl2(Fisher)、40mM MgS04(Fisher)和0.2％Tergitol NP-9(Sigma)的1X反應緩沖液；3)激酶/胱天蛋白酶-3組合試劑-制備含100mM Tris(pH7.3)、100mM MgCl2、1∶1000稀釋度的PKA羅丹明-110底物、150μg/ml重組熱穩定熒光素酶、80μMZ-DEVD-氨基熒光素、400μM ATP、100μM DTT、2.5mM CaCl2、40mM MgSO4和0.2％Tergitol NP-9的1X反應緩沖液；4)蛋白激酶終止試劑-制備含100mM Tris pH7.3、100mM MgCl2、1∶50稀釋度的蛋白酶試劑(ProFluorTMPKA實驗)、30μM星形孢菌素(BIOMOL Laboratories)的1X終止試劑。
制備樣品在10mM HEPES pH7.5、0.1％Prionex(PentaPharmaCorp)溶液中的稀釋液0、1、2和4U/ml PKA(菱形)；0、5、10和20U/ml胱天蛋白酶-3(方形)和PKA與胱天蛋白酶-3組合(分別為0/0U/ml、1/5U/ml、2/10U/ml和4/20U/ml，三角形)，將40μl稀釋液(n＝4)加入到96孔白板中。向樣品中加入合適的檢測試劑(40μl)，保護板避光，混合30秒，于室溫溫育20分鐘。在溫育后，將40μl蛋白激酶終止試劑加入到含單獨的激酶試劑或組合激酶/胱天蛋白酶-3試劑的孔中。再將板混合30秒，保護避光，于室溫溫育30分鐘以上。用具有485EX/527Em濾光片組的Labsystems Fluoroskan Ascent板讀數器檢測熒光。使用Dynex MLX板發光計記錄發光。
結果和存在PKA但沒有全部PKA檢測試劑的對照反應(圖9C)相比，加入熒光PKA實驗檢測試劑引起發光背景增加(圖9A)。但是，胱天蛋白酶-3活性產生的反應發光成比例增加，條件似乎沒有影響發光胱天蛋白酶-3反應自身。和存在胱天蛋白酶-3但沒有全部胱天蛋白酶-3檢測試劑的熒光對照反應(圖9D)相比，向PKA熒光檢測中加入胱天蛋白酶-3檢測試劑(圖9B)降低總熒光超過50％。使用這些多重條件可檢測背景以上的胱天蛋白酶-3和PKA活性。
D.單孔形式的海腎熒光素酶和胱天蛋白酶-3多重檢測制備以下的檢測試劑1)將海腎熒光素酶的細胞滲入性修飾腔腸素底物EnduRenTM(Promega Corp.)在補加10％胎牛血清和500μg/ml G-418硫酸鹽的F-12組織培養基中稀釋至600μM；2)胱天蛋白酶-3底物將(Z-DEVD)2-羅丹明-110(Promega Corp.)在補加10％胎牛血清和500μg/ml G-418硫酸鹽的F-12組織培養基中稀釋至250μM；3)熒光素酶/胱天蛋白酶-3組合底物用補加10％胎牛血清和500μg/ml G-418硫酸鹽的F-12組織培養基稀釋EnduRenTM(600μM)和(Z-DEVD)2-羅丹明-110(250μM)。
將穩定表達海腎熒光素酶的CHO-K1細胞(ATCC)(CHO-K1hRL25)保持在10％胎牛血清和500μg/ml G-418硫酸鹽中，用于基于細胞的實驗。利用這些細胞的實驗條件包括1)歸因于星形孢菌素加入的熒光素酶活性水平變化，2)歸因于星形孢菌素和胱天蛋白酶-3酶加入的熒光素酶活性水平變化，和3)未加星形孢菌素但加入胱天蛋白酶-3酶的熒光素酶活性。
收獲CHO-K1 hRL25細胞，并以20,000細胞/孔的密度平板接種入96孔透明底、白壁組織培養板中，于37℃在5％CO2中溫育過夜。將星形孢菌素以終濃度0、0.5、1、2μM(10μl/孔)加入到合適的孔中，以啟動細胞死亡，由此改變熒光素酶活性。再于37℃在5％CO2中溫育細胞3.5小時。在組織培養基(10μl/孔)中以0、5、10和20U/ml將各種濃度的胱天蛋白酶-3(BIOMOL Laboratories)加入到合適的孔中。因此，數據點的組合星形孢菌素/胱天蛋白酶-3濃度分別為0μM/0U/ml、0.5μM/5U/ml、1μM/10U/ml和2μM/20U/ml。在加入胱天蛋白酶-3酶后立即將10μl/孔的熒光素酶底物、胱天蛋白酶-3底物或熒光素酶/胱天蛋白酶-3底物加入到合適孔中。在加入檢測試劑后，簡短地混合平板，于37℃在5％CO2中溫育2小時。用具有485EX/527Em濾光片組的Labsystems Fluoroskan Ascent板讀數器檢測熒光。使用Dynex MLX板發光計記錄發光。
結果海腎熒光素酶活性在這些檢測中用作細胞死亡的內控。因此，隨著星形孢菌素濃度增加，熒光素酶活性應下降。圖10A表明，和對照反應(圖10C)相比，加入胱天蛋白酶-3底物沒有負面影響熒光素酶反應。圖10B表明，加入熒光素酶底物對背景熒光沒有作用，盡管和圖10D相比總熒光稍微增加。在存在胱天蛋白酶-3或胱天蛋白酶-3底物時海腎熒光素酶的發光檢測是完全可用的，在存在海腎熒光素酶或海腎熒光素酶底物時，胱天蛋白酶-3的熒光檢測僅稍微受影響，但完全可用。
實施例IV蛋白酶保留和釋放細胞存活力多重檢測活細胞和死細胞檢測廣泛用于監測響應特定化學、生物或物理處理的細胞存活力改變。存活力和細胞毒性檢測一般是相反的，檢測不同的生物標記。從歷史上講，通過細胞毒性評價細胞存活力一般變化的方法與外膜滲透性變化相關。檢測受損膜結構的經典方法包括錐蟲藍排除、核酸染色和乳酸脫氫酶釋放(Riss等，2004；Myers等，1998)。評價細胞功能或增殖的檢測包括氚化胸苷摻入、ATP含量、四唑染料轉變或二乙酸熒光素(Cook等，1989)。假定完整細胞膜不允許大的帶電分子或肽由胞外空間進入胞質。相反，受損的膜允許染料或化合物自由滲透入細胞內或細胞內容物滲出細胞外。這種滲透性現象是染料標記(“生命”染料、DNA嵌入劑或酯酶修飾的熒光素)和LDH釋放檢測二者的基礎。然而，雖然測定細胞存活力的現有技術仍然是有用和成本有效的應用，它們具有許多技術或實操缺陷，這限制了其在高含量、多重化或高通量形式中的應用。例如，目前通過LDH釋放(CytoTox-ONETM)或染料還原能力(CellTiter-BlueTM)檢測細胞膜完整性不能被配對(標準化數據的一種方法)，原因是共用刃天青底物和Ex/Em光譜重疊。而且，用于兩種檢測的有色刃天青底物限制了采用其它終點實驗檢測(顏色猝滅)的第二檢測信號窗強度(和敏感性)，濃度和形式對第二檢測試劑對不是最佳的(例如限制體積)。
現有的活細胞/死細胞形式使用羧基熒光素和溴化乙錠同二聚體，后者是已知的有效誘變劑。該形式需要清洗和置換細胞培養基。而且，羧基熒光素在水溶液中表現出自發水解，而染色DNA的溴化乙錠同二聚體插入可干擾下游數據標準化。
培養的哺乳動物細胞包含富蛋白酶、酯酶、脂酶和核酸酶的環境。例如，以4種一般類型的蛋白酶(天冬氨酸、半胱氨酸、絲氨酸和金屬依賴性)為代表，其與內穩態保持的特殊功能相關。這些胞質、溶酶體和跨膜結合蛋白酶參與胞內蛋白降解、產生免疫原性肽、翻譯后修飾和細胞分裂(Tran等，2002，Constam等，1995，Vinitsky等，1997)。這些酶的活性受各種機制調節，包括特異性區室化(Bond等，1987)。響應極端壓力、環境惡化或凋亡程序的持續進展(committedprogression of the apoptotic program)，觀察到區室化和膜完整性同等程度的損失(Syntichaki等，2003，Haunstetter等，1998)。因此，在體外細胞模型中將穩定的蛋白水解介導物釋放到細胞培養基中代表了細胞死亡的潛在替代。相反，保留的蛋白水解酶的細胞酶學染色與細胞健康的表型觀察結果相對應。總之，這樣的蛋白水解活性可能有助于確定細胞培養群中存活或受損細胞的相對數目，例如“活/死”檢測。
在一個實施方案中，對基于蛋白酶的活細胞/死細胞檢測，一種底物(用于死細胞)是相對大量、有活性和保守蛋白酶的底物，其在胞質pH(例如7.0-7.2)穩定且有活性，并具有不同光譜讀數示值(R/O)的標志。優選該底物的切割動力學與LDH釋放平行，活性條件不包括毒性或膜改變物質，例如鹽或硫醇，獲得快速的檢測時間。另一種底物(用于活細胞)是相對大量和保守蛋白酶的底物，其對于活細胞是可滲入細胞的，蛋白酶在活細胞胞質環境中有活性，但在胞外環境中不穩定。該底物具有不同光譜R/O的標志，進行切割反應，以獲得快速的檢測時間。在非破壞性檢測中使用兩種底物可檢測不需要的增殖事件，由于使用了處于不同光譜的互補和獨立性替代，所以可減少錯誤結論和減少由于細胞聚集或移液產生的錯誤，因為存活力對細胞毒性比率與該孔中的存活細胞數無關。
A.采用AMC或R110熒光報告分子或氨基熒光素發光報告分子的蛋白酶釋放檢測形式2倍連續稀釋HL-60細胞，然后通過加入Triton X至最終0.2％裂解或通過加入載體保持。將1/10體積的200μM Ala-Ala-Phe-AMC底物在100mM乙酸鈉pH 4.5中的溶液加入到裂解物或細胞中，并于37℃再溫育1小時。然后使用CytoFluor II于Ex.360 Em.460檢測與裂解或活細胞有關的熒光。
通過錐蟲藍排除計數進行活躍倍增的Jurkat細胞，發現95％以上存活。以RPMI 1640+10％FBS將細胞調節至100,000細胞/ml，并分成兩等份。使用裝備有微探頭的Misonix 3000以30％功率、3×5秒脈沖對1等份超聲。另一部分在超聲過程(總共約5分鐘)中于37℃水浴中溫育。然后通過代表0-100％存活度的比率混合將細胞懸浮液和裂解物組分混合成各種存活度。然后將混合的細胞樣品以100μl體積加入到白壁、透明底96孔板(Costar)中。用RPMI-1640將(Ala-Ala-Phe)2-R110稀釋至1000μM，并以1/10體積加入到板中。將板溫育30分鐘，然后使用CytoFluor II于Ex 485 Em 530檢測熒光。
通過錐蟲藍排除計數進行活躍倍增的Jurkat細胞，發現95％以上存活。用RPMI 1640+10％FBS將細胞調節至100,000細胞/ml，并分成兩等份。使用裝備有微探頭的Misonix 3000以30％功率、3×5秒脈沖對1等份超聲。另一部分在超聲過程(總共約5分鐘)中于37℃水浴中溫育。然后通過代表0-100％存活度的比率混合將細胞懸浮液和裂解物組分混合成各種存活度。然后將混合的細胞樣品以100μl體積加入到白壁、透明底96孔板(Costar)中。通過用10ml 10mM Hepes(pH7.5)再水合熒光素檢測試劑塊(Promega V859A)，并補加Ala-Ala-Phe-氨基熒光素至100μM終濃度，制備發光蛋白酶釋放檢測試劑。將100μl發光蛋白酶釋放檢測試劑加入到板的孔中，使用BMGFLUOstar Optima以動力學模式檢測發光。
計算AMC熒光形式的實際敏感性約為240個細胞(圖11)，這是和CytoTox-ONETM相當的敏感性值。R110形式(圖12)的檢測敏感性相似，提供了再另一個用于多重檢測應用的熒光團。值得注意的是，這些檢測的敏感性在沒有熒光猝滅的情況下獲得，熒光猝滅是CytoTox-ONETM或其它基于刃天青的檢測用于下游多重應用的主要障礙。發光形式的精確直線性和范圍(圖13)使得可統計學檢測9800個活細胞的群中少至200個細胞。非裂解發光形式提供了對細胞毒性檢測的另一種替代。
B.具有不同酶靶的蛋白酶釋放檢測形式將活躍倍增的HL-60細胞調節至100,000細胞/ml，并分成兩等份。使用微探頭Misonix 3000以30％功率、3次5秒脈沖對1等份超聲。另一等份保持于37℃。然后用RPMI 1640+10％FBS將細胞懸浮液和裂解物連續2倍稀釋至100μl體積。單獨的培養基用作無細胞對照。將熒光素檢測試劑塊(Promega V859A)重懸浮在2.0ml 10mMHepes pH7.5中。然后將熒光素檢測試劑分開，與Z-Leu-Leu-Val-Tyr-氨基熒光素或Ala-Ala-Phe-氨基熒光素一起制成1mM。將每種試劑以1/10體積加入板的獨立雙份孔中，并使其在Me′Cour熱夾套水浴儲存器中于37℃溫育15分鐘，然后使用BMG FLUOstar Optima進行發光檢測。
盡管進行Z-LLVY-氨基熒光素檢測沒有AAF-氨基熒光素序列適宜，但其表明，其它蛋白酶可用作受損完整性的替代(圖14)。在此情況下，LLVY活性可歸因于蛋白酶體的胰凝乳蛋白酶活性。
C.蛋白酶釋放時程在透明底、白壁96孔板(Costar)中，在37℃、5％CO2下，在7小時時程內，用10μM星形孢菌素或匹配的DMSO載體對照處理HL-60細胞(25,000/孔)。制作200μM Ala-Ala-Phe-AMC底物在100mM乙酸鈉(pH4.5)中的溶液。將10μl體積的底物(樣品的1/10體積)加入到孔中，并再溫育1小時。在CytoFluor II上以Ex.360 Em.460檢測“蛋白酶釋放”活性。在平行組孔中，CytoTox-ONETM試劑起膜完整性檢測對照的作用。在于Ex.560 Em.580檢測熒光前10分鐘加入試劑。
細胞滲透性的動力學，即LDH和蛋白酶釋放，彼此映襯，與細胞群中繼發性壞死的形態學觀察結果一致(圖15)。在酸性乙酸鈉制備物中提供氨肽酶底物(樣品的終pH約為6.5)，以適應潛在的溶酶體蛋白酶活性。
D.蛋白酶釋放活性pH要求使用調節至pH2.5、3.5和4.5的100mM乙酸鈉研究蛋白酶釋放活性的pH要求，并對比未調節的培養基(水載體)。在這些緩沖液中加入Ala-Ala-Phe-AMC至200μM。將1/10體積的溶液加入到板中，并通過回轉振蕩簡短混合。將板于37℃溫育40分鐘，然后使用CytoFluor II于Ex.360 Em.460檢測熒光。
加入1/10體積的乙酸鈉(pH4.5)將培養基最終pH降低至約6.5。沒有測試其它降低pH的溶液/培養基組合的最終pH，但先前的實驗提示，加入1/10體積的乙酸鈉(pH2.5)將細胞培養基pH降低至約5.5。發現未調節pH的載體被證實對蛋白酶釋放活性最有利(圖16)。該活性與胞質氨肽酶一致，可能不是溶酶體蛋白酶(組織蛋白酶等)。這是有意義的，因為檢測蛋白酶釋放活性不需要有害或潛在細胞毒性的添加劑。這使溫育時限更靈活，更經得起可能的發光型檢測的檢驗。
E.蛋白酶釋放酶亞細胞定位將HL-60細胞調節至100,000細胞/ml，并分成兩等份。使用微探頭Misonix 3000以30％功率、3次5秒脈沖對1等份超聲。將100μl該裂解物(形態學證實)加入到透明底96孔板的多個孔中，以RPMI1640+10％FBS連續2倍稀釋。同樣，加入100μl未超聲的細胞懸浮液，在板的多個孔中連續稀釋。分別以0.2％和30μg/ml終濃度向單獨的孔中加入NP-9和洋地黃皂甙。未處理的對照由活細胞和匹配體積的水載體組成。用2ml 10mM Hepes(pH7.5)再水合熒光素檢測塊(Promega V859A)，與Ala-Ala-Phe-氨基熒光素(Promega)一起制成500μM。將20μl此促發光蛋白酶釋放溶液加入到所有孔中，在于37℃溫育15分鐘后使用BMG FLUOstar Optima檢測發光。
已知具有以上參數和濃度的超聲和NP-9不僅破壞外膜，而且破壞溶酶體內容物(據組織蛋白酶釋放檢測)(圖17)。洋地黃皂甙的選擇性破壞使得可進行錐蟲藍染色，沒有溶酶體破裂的證據。因此，因為超聲或不同變性劑裂解之間的活性是相似的，在和pH優化合在一起考慮時，人們可猜測在蛋白酶釋放檢測中檢測的蛋白酶可能在胞質中，在完整細胞器外。
F.蛋白酶釋放或保留酶底物選擇性由Promega獲得Ala-Ala-Phe-AMC。Z-Leu-Leu-Val-Tyr-氨基熒光素、Z-Leu-Arg-氨基熒光素、Z-Phe-Arg-氨基熒光素、Ala-Ala-Phe-氨基熒光素、(Ala-Ala-Phe)2-R110和(Gly-Phe)2-R110由PromegaBiosciences合成。Suc-Ala-Ala-Phe-AMC、H-Phe-AMC、H-Tyr-AMC、Glutyl-Ala-Ala-Phe-AMC、H-Gly-Phe-AMC、Z-Gly-Ala-Met-AMC、Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC、D-Ala-Leu-Lys-AMC、H-Gly-Ala-AMC、H-Gly-Gly-AMC、Suc-Ala-Ala-Phe-AMC、Z-Arg-Leu-Arg-Gly-Gly-AMC、Z-Leu-Arg-Gly-Gly-AMC和Ac-Ala-Ala-Tyr-AMC來源于Bachem。Gly-Phe-AFC、Pro-Phe-Arg-AMC、Gly-Gly-Leu-AMC和Ser-Tyr-AFC得自Calbiochem。Z-Phe-Arg-AMC和Suc-Arg-Pro-Phe-His-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC購自Sigma。
根據固有溶解性，將所有底物以10-100mM溶解在DMSO中。以10mM Hepes pH7.5或匹配培養基細胞+10％血清將熒光底物稀釋至100μM-1mM，并以1/10體積加入至白壁、透明底96孔板中的裂解(冷凍破碎、超聲或變性劑)或未處理活細胞中。HL-60或Jurkat由于其易于操作的懸浮表型而在實驗中可互換使用。板于37℃溫育15-30分鐘，然后利用CytoFluor II檢測熒光。
將發光底物加入到熒光素檢測塊(Promega V859A)中，該檢測塊在2ml 10mM Hepes pH7.5中重懸至500μM。將1/5體積的促發光反應混合物加入到白壁、透明底96孔板中的裂解(冷凍破碎、超聲或變性劑)或未處理活細胞中。此外，HL-60或Jurkat在實驗中可互換使用。板在由Caron 2050W交換器控制的MeCour循環加熱組合單元中于37℃溫育。檢測15-30分鐘之間的發光(信號穩態)。
檢驗了廣泛的蛋白水解底物，以致力于表征潛在底物對在受損或活細胞中的蛋白酶釋放或保留的偏好(參見表4)。選擇氨基末端封閉的底物(Z、Suc-或Ac-)，以闡述是內切肽酶活性還是外切肽酶活性占優勢。檢驗未封閉的底物(H-等)，以納入氨肽酶活性的貢獻。由此名單可見，至少呈現出3種蛋白水解模式優選未封閉Ala-Ala-Phe三肽的氨肽酶樣活性，依據封閉Leu-Leu-Val-Tyr肽的釋放檢測的蛋白酶體(胰凝乳蛋白酶樣)活性，以及Gly-Phe、Gly-Ala、Phe-、Tyr-或Gly-Gly-Leu底物的非常不穩定活性。后面的活性僅在活的完整細胞中才能檢測到。更有意義的是幾個熒光團或促發光標記可用于檢測這些活性，最終允許增強下游多重檢測的靈活性。
表4
無代表沒有高于對照群的統計學活性。
(+)至(+++++)代表對照群以上的活性范圍，由中到強。
G.蛋白酶保留活性和活細胞要求將Jurkat細胞以20,000細胞/孔密度、50μl體積接種入白壁、透明底96孔板中。以RPMI 1640+10％FBS制備凋亡誘導劑rTRAIL(BioMol)的連續稀釋液，由500ng/ml開始，并以50μl體積雙份平行加入到細胞中。加入50μl培養基用作載體對照。將板于37℃在5％CO2中溫育4小時。用RPMI 1640將Gly-Phe-AFC稀釋至1mM，并以10μl體積加入到所有孔中。接著將板置于MeCour循環加熱組合單元上30分鐘，然后用CytoFluor II于Ex.405 Em.530檢測熒光。接下來，向孔中加入等體積的CellTiter-GloTM試劑，利用FLUOstar Optima通過發光檢測檢查細胞中剩余的ATP含量。
相對ATP水平和蛋白酶保留活性實際上是可疊加的，提示最佳保留酶活性對細胞存活力或原狀細胞膜的要求(圖18)。因為破壞膜完整性對保留活性有害，所以該活性可與釋放活性偶聯，用于檢測群存活力的“活/死”形式。
H.使用不同肽序列和報告分子的蛋白酶保留檢測形式在白壁、透明底96孔板中，以100μl體積的RPMI 1640+10％FBS將活躍倍增的Jurkat細胞由37,500細胞/孔開始連續稀釋。加入TritonX至0.2％終濃度，裂解一半板中的細胞。另一半板孔接受匹配體積(5μl)的水載體。將Tyr-AMC、Phe-AMC和Gly-Phe-AFC在DMSO中全部再水合至100mM，然后以RPMI 1640稀釋至1mM。將1/10體積的稀釋底物加入到孔中，通過回轉振蕩簡短混合，然后于37℃在5％CO2中溫育達1.5小時。在30和90分鐘于Ex.360 Em.460和Ex.405 Em.500檢測產生的熒光。
良好區分活細胞和死細胞(活細胞靶向和利用)的肽序列是未封閉的單肽或二肽底物，推測其可自由進入活細胞的胞質(圖19)。侯選底物(Gly-Phe)2-R110明顯不能有效地穿過細胞膜，或不能被侯選蛋白酶有效切割。
I.蛋白酶釋放活性半壽期將Jurkat細胞以20,000細胞/孔密度、100μl體積接種入白壁、透明底96孔板中。在8小時時程中，每小時向雙份平行孔中加入皂苷(Sigma)至0.2％終濃度(加入5μl)，并通過回轉振蕩簡短混合。在此相同時限內，向對照孔中加入等體積的RPMI 1640+10％FBS。用RPMI 1640+10％FBS將Ala-Ala-Phe-AMC稀釋至500μM，并以10μl體積加入到孔中，通過回轉振蕩簡短混合，然后于37℃在5％CO2中溫育1小時。用CytoFluor II檢測產生的熒光。
當外推至活性衰減(圖20)時，釋放的蛋白酶活性半壽期接近10小時。有利的是，在細胞培養物裂解物中這種延長的活性與估計半壽期約為9小時的乳酸脫氫酶(LDH)不相上下。就此蛋白酶活性作為處理群中細胞死亡的替代而言，此觀察結果是有意義的。簡單地說，信號半壽期越長，檢測在以通常的體外方案報告細胞死亡(而不降低活性，低估反應)方面的應用性就越大。
J.蛋白酶保留和釋放活性抑制/強化模式嘌呤霉素、E-64、苯基甲磺酰氟(PMSF)、腺苷5′-三磷酸(ATP)、N-(α-鼠李吡喃糖基氧羥基膦酰基)-Leu-Trp二鈉鹽(膦酰二肽(phosphoramidon))、鹽酸N-[(2S，3R)-3-氨基-2-羥基-4-苯基丁酰基-L-亮氨酸(倍司他汀)、1，10-菲咯啉、3，4-二異香豆素、4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟(AEBSF)、1，4-二硫-DL-蘇糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸二鈉二水合物(EDTA)、異戊酰-L-纈氨酰-L-纈氨酰-[(3S，4S)-4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酰基]-L-丙氨酰[93S，4S]-4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸(抑胃肽酶A)、氯化鈉、抑肽酶、N-乙酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酸半硫酸鹽(亮抑酶肽)均購自Sigma。將抑制劑懸浮在DMSO中，以將母液濃度改變為在有/無Mg++或Ca++的Dulbecco磷酸緩沖鹽水(DPBS)中200μM或200μg/ml的高靶濃度，用于加入裂解物或活細胞群中。DTT、NaCl、EDTA和ATP也稀釋在DPBS中。全部化合物都與受損細胞或活細胞于37℃溫育至少30分鐘的一段時間(最多60分鐘)，然后評價活性。
如前所述，使用100μM終濃度的Gly-Phe-AFC對超聲、皂苷裂解或活HL-60和/或U937進行蛋白酶保留實驗抑制劑/添加劑檢測。使用Ala-Ala-Phe-AMC或(Ala-Ala-Phe)2-羅丹明110對超聲、皂苷裂解或活HL-60、SK-MEL-28和/或U937進行蛋白酶釋放實驗抑制劑/添加劑檢測。
在各種類型的抑制劑或添加劑存在下的蛋白酶保留活性模式表明，觀測到的大部分活性涉及氨肽酶(嘌呤霉素、EDTA和倍司他汀敏感性)(參見表5和6)。該活性是ATP和DTT非依賴性的(活性未恢復)，對鹵化物(Cl-)不敏感。該活性確實表現出與半胱氨酸或絲氨酸蛋白酶類酶相關。
蛋白酶釋放活性模式似乎對絲氨酸蛋白酶抑制劑敏感，但對具有胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶樣活性選擇性的酶抑制劑不敏感。對硫醇沒有明顯要求(強烈表明為半胱氨酸類)，天冬氨酸和金屬蛋白酶的特異性抑制劑在控制活性方面無效。
負責蛋白酶保留活性的酶需要活細胞，不能在受損細胞外檢測。相反，加強蛋白酶釋放反應不需要混合添加劑。這使得可以組合無毒、非裂解形式的檢測，以根據其不同蛋白酶活性檢測活細胞和死細胞。
表5采用Gly-Phe-AFC和HL-60和/或U937的保留檢測
表6用Ala-Ala-Phe-AMC和HL-60、SK-MEL-28、U937的釋放檢測
K.多重蛋白酶釋放和保留檢測1.Jurkat劑量反應將活躍倍增的Jurkat細胞以20,000細胞/孔的細胞密度、50μl體積接種入96孔板中。用RPMI 1640連續稀釋凋亡誘導配體rTRAIL，以另外的50μl體積將其以250ng-244pg/ml終濃度加入雙份平行孔中。單獨的RPMI用作未誘導對照。將板于37℃在5％CO2中溫育4小時。用RPMI將Gly-Phe-AFC和Ala-Ala-Phe-AMC同時稀釋至1mM，并以1/10體積加入到板中，再于37℃溫育30分鐘。用CytoFluor II于Ex 360 Em 460和Ex 405 Em 530檢測產生的熒光。在完成熒光檢測后，向孔中等量加入CellTiter-Glo，用BMGFLUOstar Optima檢測發光。
以微量滴定板形式多重化細胞健康的兩種獨立非破壞性替代檢測方法(蛋白酶釋放和保留)，以報告群體存活力(圖21)。獲得的數據與細胞群健康檢測相反。這種關系使得可使用對照，并提供標準化水平。而且，可以依次多重檢測形式加入第三種存活力檢測(ATP含量)，沒有干擾或猝滅，以進一步增強數據解釋的置信度。
2.SK-MEL-28和ACHN細胞將SK-MEL-28或ACHN細胞以10,000細胞/孔密度、100μl體積接種入白壁、透明底96孔板中，并使其于37℃在5％CO2中附著2小時。在附著后，小心去除50μl培養基，并代以在MEM+10％FBS中連續稀釋的離子霉素或星形孢菌素。單獨的培養基用作對照。將板再溫育5小時。在MEM中制備1mM Gly-Phe-AFC溶液，并以1/10體積加入到孔中。用CytoFluor II檢測產生的熒光。然后加入胱天蛋白酶-GloTM3/7試劑，用BMG FLUOstar Optima檢測發光。
蛋白酶保留底物報告了孔中的一般存活力，而胱天蛋白酶特異性試劑報告了細胞毒性的特異性通路(圖22)。就此而言，胱天蛋白酶活化(以及由此而來的凋亡誘導)是星形孢菌素作用于SK-MEL-28的證據，而離子霉素啟動了壞死型模式。用星形孢菌素處理的ACHN也觀察到凋亡模式。
3.HeLa細胞和他莫昔芬處理將HeLa細胞以10,000細胞/孔密度、100μl體積接種入白壁、透明底96孔板中，并使其于37℃在5％CO2中附著2小時。在附著后，在24、7、5、3、1和0小時的接觸時間小心去除50μl培養基，并代以50μM在MEM+10％FBS中的他莫昔芬。單獨的培養基用作對照。通過用2ml 10mM Hepes pH7.5再水合熒光素檢測試劑塊，制備蛋白酶保留和釋放試劑。然后與Ala-Ala-Phe-氨基熒光素和Gly-Phe-AFC一起制備500μM溶液。將1/5體積的溶液加入到所有孔中，并在Me′Cour熱處理單元中于37℃溫育15分鐘。用BMG FLUOstarOptima檢測發光，用CytoFluor II檢測熒光。
該實施例表明，在設定的蛋白酶保留和釋放檢測中，混合平臺(熒光和發光)是有可能的(圖23)。要注意的是，這些試劑是非裂解性的，并明顯無毒，這提示其適合于光譜不同的其它下游應用，例如利用Apo-ONETM實驗檢測胱天蛋白酶-3/7。
4.采用DNA染色的活/死蛋白酶檢測的應用將HeLa或HepG2細胞以10,000細胞/孔密度、100μl體積接種入白壁、透明底96孔板中，并使其于37℃在5％CO2中附著2小時。在附著后，小心去除50μl培養基，并代以在MEM+10％FBS中連續稀釋的他莫昔芬或離子霉素。單獨的培養基用作對照。再繼續與化合物溫育5小時。通過用2ml 10mM Hepes pH7.5再水合熒光素檢測試劑塊(Promega V859A)，制備蛋白酶保留和釋放試劑。然后與Ala-Ala-Phe-氨基熒光素和Gly-Phe-AFC一起制備500μM溶液。將1/5體積的溶液加入到所有孔中，并在Me′Cour熱處理單元中于37℃溫育15分鐘。用BMG FLUOstar Optima檢測發光，用CytoFluor II檢測熒光。接著，通過加入0.4％NP-9變性劑裂解剩余的活細胞。在回轉振蕩器上簡短混合后，以另外的1/10體積加入1∶20稀釋度的PicoGreen(Molecular Probes)的MEM溶液。使用CytoFluor II于Ex.485 Em.530檢測與DNA/染料結合相關的熒光。
該實施例不僅擴展基于蛋白酶的存活力測試至另外兩種粘附細胞型篩選偏好的應用，而且將DNA染色并入“總”檢測(圖24)。因為光譜差異性和混合平臺讀數，所有的檢測都是無干擾和無猝滅的。
討論藥物開發和主要的研究努力都繼續利用逐漸成熟的細胞模型系統。已充分認識到在實驗操作后必須檢測這些體外系統中的細胞數和存活力。這種要求必須要確認在復雜生物系統背景中檢測和標準化這些反應的有效性。
不幸的是，當前確定細胞存活力和細胞毒性的化學方法還沒有跟上生物學研究的新方法和技術的步伐，因此限制了實驗選擇。例如，多重檢測技術的出現，即在同一孔中組合檢測，必須要求匹配且光譜不同的檢測組合，同時對檢測效力沒有顯著降低。對細胞健康的一般尋常檢測和更特異性事件(例如胱天蛋白酶活化或報告基因調節)組合而言，這種要求特別重要。
細胞存活力和/或細胞毒性報告分子檢測的前述方法與許多下游檢測應用相容。這可利用具有各種激發和發射光譜的不同熒光團或通過整合其它報告分子平臺(例如發光)來實現。值得注意的是，這可在非裂解和推定無毒環境中完成，允許終點測定的檢測窗靈活性。而且，該技術的敏感性和成本有效性足以適應通量、小型化和自動化。表7列出了各種檢測所提供的優勢的對比。
表7
總之，迄今為止，權衡在哺乳動物蛋白酶研究中所公開的成就，主要圍繞著容易純化、分泌或這二者的蛋白酶。而這些研究所提供的信息提供了蛋白水解機制、結構和功能的了解，幾乎沒人知曉由蛋白質組學預測所推測的蛋白酶以外的其它蛋白酶。簡單地說，需要對胞內蛋白酶的功能、調節、亞細胞分布、豐度和重要性進行更多的工作。
越來越多的證據提示，許多胞質蛋白酶參與細胞穩態機制。盡管蛋白酶體明顯涉及胞質肽的釋放，但若干發現提示了其它保守胞質蛋白酶的作用(Vititsky等，1997；Constam等，1995)。
本文公開的各個蛋白酶檢測和基于蛋白酶的活細胞/死細胞檢測由于光譜的獨特性而對于多重檢測更靈活，使得可進行檢測互補或與其它終點檢測組合，例如AMC、AFC、R110、甲酚紫或發光，無染料猝滅，不限制體積，不后加工檢測化學物，溫育時間短，實際敏感性(在篩選環境中細胞存活力的變化百分率)相似或更好，不干擾下游DNA結合檢測，不需要清洗或離心，例如同相檢測。而且，當以比率(細胞毒性指數)使用時，基于蛋白酶的活細胞/死細胞檢測的數據可標準化，與細胞數無關，可擴展細胞化合物接觸窗，以記錄化合物作用動力學差異，例如在與其它檢測(例如DNA嵌入)組合時(可鑒別原發性或繼發性壞死的潛在結果)，DNA嵌入和胱天蛋白酶活性可鑒別細胞周期藥物反應性，例如在孔中的非均一群中。此外，蛋白酶底物可相對簡單，例如為二或三肽，利用眾所周知的化學方法偶聯至熒光或發光底物，無毒和/或無誘變性，穩定，可以各種形式提供，例如在DMSO中或為干燥形式。
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Vitnitsky等，J.Immunol..159554(1997)Yamamoto等，Forensic Science International 113143(2000)所有的出版物、專利和專利申請都通過引用結合到本文中。盡管在前述說明書中已就其某些優選實施方案描述了本發明，為描述目的提出了很多細節，但對本領域技術人員顯而易見的是，本發明容許其它實施方案，本文描述的某些細節可在在相當程度上改變而不偏離本發明的基本原則。
序 列 表<110>Promega CorporationRiss，Terry L.
Niles，AndrewMoravec，Richard A.
<120>發光和不發光多重檢測<130>341.029WO1<140>PCT/US2005/002158<141>2005-01-24<150>10/762,836<151>2004-01-22<160>34<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>1Asp Glu Val Asp1<210>2<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>2Trp Glu His Asp1
<210>3<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>3Leu Glu His Asp1<210>4<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>4Val Glu Ile Asp1<210>5<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>5Val Glu Val Asp1<210>6<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>6
Val Glu His Asp1<210>7<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>合成底物<400>8Ala Glu Val Asp1<210>9<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<220>
<221>SITE<222>3<223>Xaa＝任意氨基酸<400>9Leu Glu Xaa Asp1<210>10
<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<220>
<221>SITE<222>3<223>Xaa＝任意氨基酸<400>10Val Glu Xaa Asp1<210>11<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>11Ile Glu His Asp1<210>12<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>12Pro Glu His Asp1<210>13<211>4<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>合成底物<400>13Glx Glu Val Asp1<210>14<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>14Leu Glu Thr Asp1<210>15<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<220>
<221>SITE<222>1<223>Xaa＝Z，Y，D，L，V，I，A，W或P<220>
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<221>SITE<222>3<223>Xaa＝任意氨基酸<400>15Xaa Xaa Xaa Asp1
<210>16<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>16Ala Ala Phe Ala Ala Phe1 5<210>17<400>17000<210>18<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>18Leu Leu Val Tyr1<210>19<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<220>
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<221>SITE<222>5<223>Xaa＝一個或多個氨基酸<400>19Xaa Glu His Asp Xaa1 5<210>20<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<220>
<221>SITE<222>3<223>Xaa＝一個或多個氨基酸<220>
<221>SITE<222>5<223>Xaa＝一個或多個氨基酸<400>20Asp Glu Xaa Asp Xaa1 5<210>21<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<220>
<221>SITE<222>1<223>Xaa＝L或V<220>
<221>SITE
<222>3<223>Xaa＝一個或多個氨基酸<220>
<221>SITE<222>5<223>Xaa＝一個或多個氨基酸<400>21Xaa Glu Xaa Asp Xaa1 5<210>22<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<220>
<221>SITE<222>5<223>Xaa＝一個或多個氨基酸<400>22Ile Glu Gly Arg Xaa1 5<210>23<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<220>
<221>SITE<222>3<223>Xaa＝一個或多個氨基酸<220>
<221>SITE<222>5
<223>Xaa＝一個或多個氨基酸<220>
<221>SITE<222>7<223>Xaa＝S或G<400>23Glu Asn Xaa Tyr Xaa Gln Xaa1 5<210>24<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<220>
<221>SITE<222>5<223>Xaa＝一個或多個氨基酸<400>24Pro Arg Asn Lys Xaa1 5<210>25<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<220>
<221>SITE<222>6<223>Xaa＝K或N<220>
<221>SITE<222>7<223>Xaa＝M或L<400>25
Glu Ile Ser Glu Val Xaa Xaa Asp Ala Glu Phe Arg His Asp1 5 10<210>26<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>26Ser Glu Val Asn Leu Asp Ala Glu Phe Arg1 5 10<210>27<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>27Pro Arg Asn Lys1<210>28<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>28Gly Phe Gly Phe1<210>29<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>29Arg Leu Arg Gly Gly1 5<210>30<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>30Leu Arg Gly Gly1<210>31<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>31Arg Pro Phe His Leu Leu Val Tyr1 5<210>32<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>32Glu Ala Ala Phe1<210>33<400>33
000<210>34<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>34Ser Arg Pro Phe His Leu Leu Val Tyr1 權利要求
1.一種檢測方法，所述方法檢測第一種酶介導反應的第一種分子和第二種酶介導反應的第二種分子的存在或量，所述方法包括a)使樣品與第一種反應和第二種反應的反應混合物接觸，其中第一種酶介導的反應產生發光產物，其中第二種酶介導的反應產生產生不發光產物；和b)檢測樣品中第一種和第二種分子的存在或量。
2.權利要求1的方法，其中第一種分子是第一種酶介導反應的底物。
3.權利要求1的方法，其中第二種分子是第二種酶介導反應的底物。
4.權利要求1的方法，其中第一種分子是第一種酶介導反應的酶。
5.權利要求1的方法，其中第二種分子是第二種酶介導反應的酶。
6.權利要求1的方法，其中第一種分子是第一種酶介導反應的輔因子。
7.權利要求1的方法，其中第二種分子是第二種酶介導反應的輔因子。
8.權利要求1的方法，其中發光用于檢測第一種分子。
9.權利要求1的方法，其中熒光用于檢測第二種分子。
10.權利要求1的方法，其中依次檢測第一種和第二種分子的存在或量。
11.權利要求1的方法，其中樣品為細胞裂解物。
12.權利要求1的方法，其中樣品在接觸第二種反應的反應混合物之前接觸第一種反應的反應混合物。
13.權利要求1的方法，其中樣品在接觸第一種反應的反應混合物之前接觸第二種反應的反應混合物。
14.權利要求1的方法，其中樣品同時接觸第一種反應和第二種反應的反應混合物。
15.一種檢測方法，所述方法檢測第一種酶介導反應的第一種酶或輔因子的存在或量，其包括a)使樣品與第一種酶的第一種底物、第二種酶的第二種底物以及任選的第三種酶接觸，其中第一種底物和第一種酶之間的反應或第一種酶和第一種底物之間的反應產物與第三種酶之間的反應產生發光產物，其中第二種底物和/或第二種底物和第二種酶之間的反應產物不發光；和b)檢測第一種酶介導反應的第一種酶或輔因子的存在或量。
16.一種檢測方法，所述方法檢測酶介導的發光反應，以檢測第一種酶介導反應的酶或輔因子的存在或量，其包括a)使樣品與第一種酶的第一種底物、第二種酶的第二種底物以及任選的第三種酶接觸，其中第一種底物和第一種酶之間的反應或第一種酶和第一種底物之間的反應產物與第三種酶之間的反應產生發光產物，其中第二種底物和/或第二種底物和第二種酶之間的反應產物不發光；和b)檢測發光。
17.權利要求15的方法，其中檢測發光。
18.權利要求15或16的方法，其中在第一種酶或輔因子存在下發光增加。
19.權利要求15或16的方法，其中在第一種酶或輔因子存在下發光降低。
20.權利要求15或16的方法，所述方法進一步包含檢測第二種酶的存在或量。
21.權利要求20的方法，其中熒光用于檢測第二種酶的存在或量。
22.權利要求20的方法，其中依次檢測第一種酶或輔因子的存在或量和第二種酶的存在或量。
23.權利要求20的方法，其中同時檢測第一種酶或輔因子的存在或量和第二種酶的存在或量。
24.權利要求20的方法，其中以比色法檢測第二種酶的存在或量。
25.權利要求20的方法，其中通過使樣品與第四種酶和第三種底物接觸，檢測第二種酶的存在或量，第四種酶和第三種底物與第二種底物和第二種酶之間的反應產物反應，產生熒光產物。
26.權利要求15或16的方法，所述方法進一步包括檢測不發光的第二種底物或第二種底物和第二種酶之間的不發光產物的存在或量。
27.權利要求15或16的方法，其中第二種酶基本上不與第一種底物反應。
28.權利要求15或16的方法，其中第一種酶基本上不與第二種底物反應。
29.權利要求15或16的方法，其中第二種底物或第二種底物和第二種酶之間的反應產物發熒光。
30.權利要求29的方法，其中第二種底物或第二種底物和第二種酶之間的反應產物包括溴化乙錠、熒光素、Cy3、BODIPY、對甲氨基酚、Rox、5-羧基熒光素、6-羧基熒光素、蒽、2-氨基-4-甲氧基萘、phenalenone、吖啶酮、氟化呫噸衍生物、α-萘酚、β-萘酚、1-羥基芘、香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(AFC)、Texas Red、四甲基羅丹明、羧基羅丹明或羅丹明、羥甲苯基、羅丹明-110或試鹵靈。
31.權利要求15或16的方法，其中一種酶是糖苷酶、磷酸酶、激酶、脫氫酶、過氧化物酶、硫酸酯酶、肽酶或水解酶。
32.權利要求15或16的方法，其中一種酶是蛋白酶。
33.權利要求32的方法，其中一種酶是胱天蛋白酶。
34.權利要求33的方法，其中所述胱天蛋白酶包括胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-7或胱天蛋白酶-8。
35.權利要求15或16的方法，其中一種底物包含DEVD、WEHD、LEHD、VEID、VEVD、VEHD、IETD、AEVD、LEXD、VEXD、IEHD、PEHD、ZEVD或LETD。
36.權利要求15或16的方法，其中一種底物包含X1-X2-X3-D，其中X1是Z、Y、D、L、V、I、A、W或P，X2是V或E，X3是任意氨基酸。
37.權利要求15或16的方法，其中一種底物是胰蛋白酶或類胰蛋白酶底物。
38.權利要求15或16的方法，其中一種酶切割含精氨酸或賴氨酸的底物。
39.權利要求15或16的方法，其中樣品是細胞裂解物。
40.權利要求39的方法，其中樣品是在裂解前用細胞死亡誘導劑處理的細胞樣品。
41.權利要求15或16的方法，其中樣品包含完整細胞。
42.權利要求15或16的方法，其中第三種酶是熒光素酶。
43.權利要求42的方法，其中熒光素酶是甲蟲熒光素酶。
44.權利要求15或16的方法，其中第二種底物是乳酸脫氫酶底物。
45.權利要求15或16的方法，其中樣品在接觸第二種底物前接觸第一種底物。
46.權利要求15或16的方法，其中樣品同時接觸第一種和第二種底物。
47.權利要求15或16的方法，其中樣品在接觸第一種底物前接觸第二種底物。
48.權利要求15或16的方法，其中通過使樣品與第一種酶接觸檢測輔因子的存在或量。
49.一種檢測樣品中至少兩種分子的存在或量的方法，所述方法包括a)使樣品與第一種酶的第一種底物、第二種酶的第二種底物以及任選的第三種酶接觸，其中第一種底物和第一種酶之間的反應或第一種酶和第一種底物之間的反應產物與第三種酶之間的反應產生發光產物，其中第二種底物和/或第二種底物和第二種酶之間的反應產物不發光，其中第一種酶和第二種酶不相同；和b)檢測由第一種或第二種酶介導的反應的第一種和第二種酶或輔因子的存在或量。
50.權利要求49的方法，其中檢測發光。
51.權利要求49的方法，其中至少一種酶是蛋白酶。
52.權利要求49的方法，其中第二種酶與第一種底物基本不反應。
53.權利要求49的方法，其中第一種酶與第二種底物基本不反應。
54.權利要求49的方法，其中第二種底物或第二種底物與第二種酶之間的反應產物發熒光。
55.權利要求49的方法，其中熒光用于檢測第二種酶或輔因子的存在或量。
56.權利要求49的方法，其中至少一種酶是胱天蛋白酶。
57.權利要求49的方法，其中一種底物是胰蛋白酶或類胰蛋白酶底物。
58.權利要求49的方法，其中樣品為細胞裂解物。
59.權利要求58的方法，其中樣品為在裂解前用細胞死亡誘導劑處理的細胞樣品。
60.權利要求49的方法，其中樣品包含完整細胞。
61.權利要求49的方法，其中第三種酶是熒光素酶。
62.權利要求61的方法，其中熒光素酶是甲蟲熒光素酶。
63.權利要求62的方法，其中第二種底物或第二種底物和第二種酶之間的反應產物發熒光。
64.權利要求49的方法，其中樣品在接觸第二種底物前接觸第一種底物。
65.權利要求49的方法，其中樣品在接觸第一種底物前接觸第二種底物。
66.權利要求49的方法，其中樣品同時接觸第一種和第二種底物。
67.權利要求49的方法，其中在檢測第二種酶或第二種輔因子的存在或量之前檢測第一種酶或第一種輔因子的存在或量。
68.權利要求49的方法，其中在檢測第一種酶或第一種輔因子的存在或量之前檢測第二種酶或第二種輔因子的存在或量。
69.權利要求68的方法，其中第二種底物或第二種底物和第二種酶之間的反應產物發熒光。
70.權利要求69的方法，其中第二種底物或第二種底物和第二種酶之間的反應產物包括溴化乙錠、熒光素、Cy3、BODIPY、對甲氨基酚、Rox、5-羧基熒光素、6-羧基熒光素、蒽、2-氨基-4-甲氧基萘、phenalenone、吖啶酮、氟化呫噸衍生物、α-萘酚、β-萘酚、1-羥基芘、香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(AFC)、Texas Red、四甲基羅丹明、羧基羅丹明或羅丹明、羥甲苯基、羅丹明-110或試鹵靈。
71.權利要求15、16或49的方法，其中所述輔因子是ATP。
72.權利要求49的方法，其中通過使樣品與第四種酶和第三種底物接觸，檢測第二種酶的存在或量，第四種酶和第三種底物與第二種底物和第二種酶之間的反應產物反應，產生熒光產物。
73.一種檢測第一種酶介導反應的分子的存在或量的方法，所述方法包括A)使含熒光蛋白表達細胞的樣品與第一種酶介導反應的反應混合物接觸，其中第一種酶介導的反應產生發光產物；和b)檢測樣品中分子的存在或量和熒光蛋白的存在或量。
74.權利要求73的方法，其中所述分子是底物。
75.權利要求73的方法，其中所述分子是輔因子。
76.權利要求73的方法，其中所述分子是酶。
77.一種試劑盒，所述試劑盒包含不發光底物；和發光底物。
78.權利要求77的試劑盒，所述試劑盒進一步包含能夠介導與發光底物的發光反應的酶。
79.權利要求77的試劑盒，所述試劑盒進一步包含在單個反應容器中進行發光反應和不發光反應的說明書，所述容器包含不發光底物和發光底物。
80.一種試劑盒，所述試劑盒包含不發光底物；和能夠介導發光反應的酶。
81.權利要求80的試劑盒，所述試劑盒進一步包含酶的發光底物。
82.權利要求77或80的試劑盒，其中不發光底物是熒光底物。
83.權利要求78或80的試劑盒，其中所述酶是熒光素酶。
84.權利要求80的試劑盒，所述試劑盒進一步包含在單個反應容器中進行發光反應和不發光反應的說明書，所述容器包含不發光底物和酶。
85.一種檢測樣品中活細胞和/或死細胞的方法，所述方法包括a)使樣品與第一種蛋白酶的底物和第二種蛋白酶的底物接觸，其中一種蛋白酶介導的與一種底物的反應產生熒光產物，由另一種蛋白酶介導的與另一種底物的反應產生發光或熒光產物，其中一種底物基本上可滲入細胞，另一種底物基本上不可滲入細胞，其中如果兩個反應都產生熒光產物，則兩種底物上的熒光團光譜不同；和b)檢測或測定樣品中的熒光和/或發光，由此檢測或測定樣品中活細胞和/或死細胞的數目或存在。
86.權利要求85的方法，其中每種蛋白酶介導的反應都產生熒光產物。
87.權利要求85的方法，其中一種蛋白酶介導的反應產生發光產物，另一種蛋白酶介導的反應產生熒光產物。
88.權利要求85的方法，其中基本上可滲入細胞的底物是與蛋白酶體結合的蛋白酶、氨肽酶或組織蛋白酶的底物。
89.權利要求85的方法，其中基本上不可滲入細胞的底物是三肽基肽酶、鈣蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的底物。
90.權利要求85的方法，其中所述樣品包含哺乳動物細胞。
91.權利要求85的方法，其中兩種底物在與樣品接觸前混合。
92.權利要求87的方法，其中依次檢測或測定熒光和發光。
93.權利要求86的方法，其中同時檢測或測定每種熒光產物的熒光。
94.權利要求85的方法，所述方法進一步包括檢測或測定分子的存在或量。
95.權利要求94的方法，其中所述分子是DNA。
96.權利要求94的方法，其中所述分子是酶。
97.權利要求94的方法，其中所述分子是ATP。
98.權利要求85的方法，所述方法進一步包括使樣品經受裂解細胞的條件。
99.權利要求85的方法，所述方法進一步包括使樣品在接觸底物前接觸一種或多種物質。
100.一種檢測樣品中活細胞的方法，所述方法包括a)使樣品與基本上可滲入細胞的熒光底物接觸，所述熒光底物是和蛋白酶體結合的蛋白酶、氨肽酶或組織蛋白酶的熒光底物；和b)檢測或測定樣品中的熒光，由此檢測或測定樣品中活細胞的數目或存在。
101.權利要求100的方法，其中所述底物是Gly-Phe-AFC、Gly-Phe-AMC、Gly-Gly-Leu-AMC、Z-Gly-Gly-Leu-AMC、Phe-AMC或Tyr-AMC。
102.一種檢測樣品中死細胞的方法，所述方法包括a)使樣品與基本上不可滲入細胞的熒光或發光底物接觸，所述熒光或發光底物是三肽基肽酶、鈣蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的底物；和b)檢測或測定樣品中的熒光或發光，由此檢測或測定樣品中死細胞的數目或存在。
103.權利要求102的方法，其中所述底物是Ala-Ala-Phe-AMC、(Ala-Ala-Phe)2-R110、Ala-Ala-Phe-氨基熒光素、Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC或Z-Leu-Leu-Val-Tyr-氨基熒光素。
104.一種試劑盒，所述試劑盒包含一種組合物，其含有第一種蛋白酶的第一種基本不可滲入細胞的熒光或發光底物，和第二種蛋白酶的第二種基本可滲入細胞的熒光底物；以及用于指導用戶使用組合物檢測樣品中活細胞和/或死細胞的說明書。
105.權利要求104的試劑盒，其中第一種底物是Ala-Ala-Phe-AMC、(Ala-Ala-Phe)2-R110、Ala-Ala-Phe-氨基熒光素、Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC或Z-Leu-Leu-Val-Tyr-氨基熒光素。
106.權利要求104的試劑盒，其中第二種底物是Gly-Phe-AFC、Gly-Phe-AMC、Gly-Gly-Leu-AMC、Z-Gly-Gly-Leu-AMC、Phe-AMC或Tyr-AMC。
107.權利要求104的試劑盒，所述試劑盒進一步含有一種或多種用于發光反應的試劑。
108.權利要求107的試劑盒，其中至少一種試劑被凍干。
109.權利要求104的試劑盒，其中所述組合物為其中所述底物在有機溶劑中的溶液。
110.權利要求109的試劑盒，其中所述組合物被凍干。
111.權利要求104的試劑盒，其中所述組合物為其中底物濃度為約0.005-1M的溶液。
112.一種含組合物的試劑盒，所述組合物包含Ala-Ala-Phe-AMC、(Ala-Ala-Phe)2-R110、Ala-Ala-Phe-氨基熒光素、Gly-Phe-AFC、Gly-Phe-AMC、Gly-Gly-Leu-AMC或其任意組合。
113.權利要求112的試劑盒，其中所述組合物包含溶劑。
114.權利要求113的試劑盒，其中Ala-Ala-Phe-AMC、(Ala-Ala-Phe)2-R110、Ala-Ala-Phe-氨基熒光素、Gly-Phe-AFC、Gly-Phe-AMC或Gly-Gly-Leu-AMC的濃度為約0.005-1M。
全文摘要
提供一種在多重發光/不發光實驗中檢測酶介導反應中的至少一種分子的存在或量的方法。
文檔編號G01N33/53GK101084437SQ200580008682
公開日2007年12月5日 申請日期2005年1月24日 優先權日2004年1月22日
發明者T·L·里斯, A·尼爾斯, R·A·莫拉維克 申請人:普羅美加公司