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專利名稱：溶液中膽紅素的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水溶液主要是生物流體中的膽紅素的測定方法。
現(xiàn)有大量文獻(xiàn)述及為臨床和醫(yī)療目的測定(檢測、濃度測定等)膽紅素的方法。例如專利文獻(xiàn)DE-C-2，240，471;DE-A-2，007，013;DE-A-2，364，844;DE-A-2，013，558報導(dǎo)了可以利用諸如鹵化重氮苯等重氮鹽。但這類試劑在通常的溫度和濕度條件下穩(wěn)定性差，因此貯存過程中可能會失效。
另一些膽紅素測定技術(shù)涉及到膽紅素經(jīng)酶催化的空氣氧化而轉(zhuǎn)變成膽綠素。這種技術(shù)在下列文獻(xiàn)中有報道R.BRODERSENetal.，EuropeanJournalofBiochemistry10468，1969;日本專利公開11.194(1983);日本專利申請141.783(1983)，1799(1984);B.T.DOUMASetal.，Clin.Chem.331349-1353，(1987);C.J.P.MULLONetal.，出處同上，1822-1825。
膽紅素是一種非極性的黃色色素，它作為血紅素細(xì)胞外分解代謝的產(chǎn)物而存在于血漿中，經(jīng)這一分解代謝后，血紅蛋白的血紅素基被酶促氧化成膽紅素。膽紅素由于與血漿中的清蛋白緊密結(jié)合及與肝臟中的二葡糖苷酸結(jié)合而獲得了水溶性。血漿中膽紅素水平異常是肝臟疾病的指征。其正常水平約為6-18微摩爾/升(3.5-10毫克/升)，并幾乎完全為未結(jié)合形式。該色素在無水條件下在暗中是較為穩(wěn)定的，但在溶液中，尤其是在光照下，它逐漸氧化成膽綠素，因此其濃度不能通過測量它在黃色譜帶中(例如460nm)光密度的絕對值來直接測量。此外，在處理血清樣品時，直接測定就更為復(fù)雜化，因為樣品中存在有其它化合物，而這些化合物在與膽紅素相同的或相鄰的光譜范圍內(nèi)吸光強(qiáng)度不定。因此用光學(xué)方法測定溶液中的膽紅素必須依賴于光吸收的變化速率，即膽紅素的黃色隨時間的變化率，在已知的給定條件下，它取決于血清(或其它水溶液)樣品中膽紅素的初始濃度。
另外，已知膽紅素(BR)被空氣氧化成膽綠素(BV)的反應(yīng)受得自某些真菌和植物的膽紅素氧化酶(BOX)催化。膽紅素氧化酶(酶學(xué)委員會編號EC1.3.3.5)是一種含銅的酶，最近曾被用來做血漿中膽紅素的定量測定(GB-A-2，146，997)。該酶可從許多不同類型的植物中提取，并且該酶本身隨提取方法的不同而顯然有若干類型。膽紅素催化氧化成膽綠素的過程中形成何種產(chǎn)物(H2O2還是H2O)取決于所用的BOX的類型。在此所報導(dǎo)的實驗中，并未使用所有形式的BOX。優(yōu)選的一種BOX得自漆斑菌屬真菌。先有技術(shù)通過在該酶存在下BR溶液在460nm處的光吸收迅速下降證實了BOX的作用。這便構(gòu)成了膽紅素分析測試的基礎(chǔ)(具體參見GB-A-2，146，997及其中引用的有關(guān)參考文獻(xiàn))。但這一測試法在靈敏度和應(yīng)用上有局限性，如果所要分析的溶液在460nm附近有固有光吸收，或者這些溶液不透明，就更受到限制。因此，人們在不斷尋找適應(yīng)面更廣、更靈敏的方法。
此外，如上所述，460nm測試有賴于測定吸光度的下降速率，而且該技術(shù)需要特別慎重地保護(hù)樣品在進(jìn)行測定和記錄測定結(jié)果之前不被降解(即過早氧化)。這就較為復(fù)雜化了。如果能找到一些試驗條件，使血紅素樣品至少在一個適當(dāng)?shù)念A(yù)備期內(nèi)保持對氧化和顏色變化不敏感，在此期間處理樣品可以不必特別謹(jǐn)慎地避免褪色，那么將是非常可取的。
本發(fā)明人經(jīng)研究有了下面公開的發(fā)現(xiàn)，這一發(fā)現(xiàn)構(gòu)成了一種全新方法的基礎(chǔ)，該方法克服了上述缺陷，還具有后面將提到的許多優(yōu)點。
這種新分析方法是一種測定水溶液特別是生物流體中的膽紅素的方法，該方法包括以下步驟a.在膽紅素氧化酶和過量的一種還原性化合物存在下，將膽紅素氧化成膽綠素，所述還原性化合物能夠?qū)⒛懢G素還原回初始的膽紅素;
b.測定該還原性化合物的消耗速率，從而確定水溶液中存在的膽紅素的量。
更具體地說，業(yè)已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，在BR經(jīng)BOX催化氧化成BV的反應(yīng)中，如果還存在有一種或數(shù)種經(jīng)選用的還原劑(R)，則可誘導(dǎo)產(chǎn)生一個快速的逆反應(yīng)，使膽綠素反轉(zhuǎn)化為膽紅素。因此本方法依賴于一個閉合正逆反應(yīng)的存在，而不僅僅依賴一個強(qiáng)烈向左移動的簡單平衡。這可以表示如下
該反應(yīng)式中“產(chǎn)物”指氧的還原產(chǎn)物，RO指R的氧化產(chǎn)物。
這一反應(yīng)式不僅得到了460nm處的吸光度基本不變這一現(xiàn)象的支持，而且得到了下列現(xiàn)象的支持，即(a)該反應(yīng)中確實消耗了氧;
(b)最終消耗了R，即當(dāng)R耗盡時，膽紅素轉(zhuǎn)化成了膽綠素。
這樣，如果給定起始大量過量的還原劑(R)，則后者消耗的速率與膽紅素的量成比例(因而也與膽綠素的量成比例)。因此，測定R的消耗速率便構(gòu)成了一種普遍適用于測定水溶液及生物流體中膽紅素的試驗方法。
實現(xiàn)這一目的的方式之一是，選擇其氧化態(tài)(RO)能給出可測信號的R。
例如，選用某些體系或化合物就有可能實現(xiàn)上述目的，這些體系或化合物的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電勢大致在Fe2+/Fe3+電對和H+/H2電對的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電勢之間，即在pH 7時大致在0.42和-0.60V之間(見H.R.Mahler and E.H.Cordes，Equilibria and Thermodynamics in Biochemical Transformations Biological Chemistry，Harper Internat.Ed.1969，New-York，London)。在這些可在氧化后給出顏色信號的體系中，可以舉出的有細(xì)胞色素a和c、泛醌、黃酶FMN、核黃素、NAD+/NADH、鐵氧還蛋白。優(yōu)選的化合物為4-氨基安替比林(4-AAP)，該化合物氧化后可與苯酚偶聯(lián)生成有色復(fù)合物。這種測定法實際上是常規(guī)性的，例如如果是利用生成過氧化氫的氧化酶(例如葡萄糖氧化酶)的體系，則后者是以苯酚的過氧化物酶催化氧化來測定的。重要的是要注意，許多類型的膽紅素氧化酶都適用于本體系，包括在催化膽紅素空氣氧化成膽綠素過程中不生成H2O2的氧化酶。
根據(jù)另一方案，業(yè)已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，如果在4-AAP存在下使用鹵代苯酚或鹵代苯胺，則鹵化物的釋放量與該試驗中膽紅素的量成比例。適宜的鹵代化合物(RHal)包括4-氟苯酚、4-氟苯胺、四氟苯酚和五氟苯酚(定義為RF化合物)。
因此，關(guān)鍵反應(yīng)的反應(yīng)式如下
F-的釋放由BOX催化，并且速度很快，所以F-的釋放速率是由4-AAP的氧化速率控制的，而4-AAP的氧化速率本身又取決于膽紅素的初始濃度。
F-可以用常規(guī)手段來測定，一種合適的方法是利用F-離子選擇性電報。
在由酶催化的生化反應(yīng)中應(yīng)用F-選擇性電報先前已有報導(dǎo)，參見例如美國專利申請4，353，983;4，607，010。
適用于本發(fā)明的膽紅素氧化酶(BOX)有若干種類型，其中包括從各種種屬的真菌，如裂褶菌屬真菌、粗皮屬真菌(Trachyderma)、漆斑菌屬真菌中提取的BOX(參見例如KOSAKA et al.，Clin.Biochem.16，October 1983)。本發(fā)明優(yōu)選來自疣狀漆斑菌(Myrothercium Verucaria)的BOX。BR的氧化反應(yīng)形成副產(chǎn)物過氧化氫還是水取決于BOX的來源，但本方法不論是否形成H2O2都是適用的。此外，與先前的工作(見美國專利申請4，353，983)不同的是，加入過氧化物酶對本方法沒有可察覺的影響，而先前的工作卻是用過氧化物酶催化有機(jī)氟化合物釋放F-離子。
從實用的角度講，實施本方法就是測定合適緩沖液中的血清樣品中F-的釋放。
簡言之，為測定未知樣品反應(yīng)后F-離子的釋放速率，最好求助于一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定一組含已知濃度膽紅素的樣品即可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。在體系穩(wěn)定后，速度曲線為直線時，記錄每個樣品的F-離子釋放速率并測量動力學(xué)曲線的斜率(當(dāng)然，每個樣品都同時測量)。注意，只要氟化合物和4-AAP的濃度過量，速度曲線就是直線(零級反應(yīng))。然后以各曲線的斜率對膽紅素濃度做圖，就得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。制作動力學(xué)曲線時所測量的電位參數(shù)，可以是所用的電位測量體系及氟化物電極的電壓讀數(shù)(mV)，或者最好是〔F-〕的相應(yīng)數(shù)值，這可用能斯特方程來計算。能斯特方程在這里具有下列形式E＝Eo-S·ln[F-]其中E為所測的電壓，Eo為實驗確定的體系本身的常數(shù)，包括活度系數(shù)和液體接界電勢。S為“能斯特斜率”，此常數(shù)在F-濃度變化范圍為10單位時，在Tris緩沖液中約等于57mV(在pH為7.0的卡可酸鹽緩沖液中其數(shù)值更高一些)。F-濃度則是以毫摩爾數(shù)/升表示的。如果將由上述方程式計算的〔F-〕的值以毫克/升表示并用來“繪圖”，則所得曲線為近乎完美的直線，其斜率能夠很容易地計算出來。
下列實例說明本發(fā)明，最好參照附圖來理解。


圖1為一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，顯示F-釋放速率對標(biāo)準(zhǔn)水溶液中膽紅素濃度的斜率。
實例1膽紅素分析標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作在Tris緩沖液(200毫摩爾/升)，pH7，5微摩爾/升NaF中制備下列試劑溶液。
a)膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液在10毫升100毫摩爾/升碳酸鈉溶液中制備含2.5克/升膽紅素的貯液。用蒸餾水稀釋該貯液即制得下列濃度(以毫克/升表示)的標(biāo)準(zhǔn)液10、20、40、50、100。
b)膽紅素氧化酶(BOX)溶液由冰凍干燥的市售緩沖制劑制備2.5毫升含10單位/毫升的溶液。采用兩種來源的市售BOX(ⅰ)疣狀漆斑菌的BOX(Calbiochem＃201105);(ⅱ)疣狀漆斑菌的BOX(Sigma＃BO390)。優(yōu)選Calbiochem公司的試劑。
c)五氟苯酚(PFP)溶液100毫摩爾/升的水溶液。
d)4-氨基安替比林(4APP)溶液50毫摩爾/升的緩沖溶液。
儀器采用Orion氟化物復(fù)合電極(96-09)。該電極與一個微分放大器相連。該放大器的輸出端與Keithley197多量程電位計相連，并經(jīng)IEEE488總線與AppleⅡ電腦接口以得到數(shù)據(jù)。
實驗實驗在Linbro組織培養(yǎng)平板(FlowLaboratoriesLtd.，Scotland)中進(jìn)行。每個培養(yǎng)平板中有24個平底小孔(17×16毫米)，每個小孔的容量為3.5毫升。
在Linbro平板的一個小孔中加入下列試劑溶液Tris緩沖液(500微升)、氨基安替比林溶液(10微升)氟苯酚溶液(50微升)、蒸餾水(370微升)。將氟化物電極降入溶液中，使其電極電勢穩(wěn)定(3-5分鐘)。然后加入50微升BOX溶液，并重新使該電極穩(wěn)定(3-5分鐘)。最后加入膽紅素工作標(biāo)準(zhǔn)溶液(20微升)啟動反應(yīng)。監(jiān)測F-釋放5分鐘。然后用通常的方法計算出F-的釋放速率(微摩爾/升·分)，以所測得的數(shù)值對相應(yīng)的BR濃度作圖。
測定含10.20.50和100毫克/升膽紅素的標(biāo)準(zhǔn)液及空白樣品(膽紅素濃度為0)的速率(微摩爾/升·分)，其斜率圖示于圖1。
應(yīng)當(dāng)指出，在這些試驗中，在約20分鐘或更長的時間內(nèi)速率不變。由于氟化合物和4AAP的摩爾濃度約比濃度為100毫克/升的膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液高1700倍，并且從測得的數(shù)據(jù)來看反應(yīng)速度為約0.5-4微摩爾/分，因此有證據(jù)表明，只是在所供給的試劑幾乎耗盡之后，膽紅素才有效地轉(zhuǎn)化為膽綠素。這一令人驚奇的觀察結(jié)果進(jìn)一步證實了，決速步驟是膽綠素在4-AAP存在下隨著還原劑的消耗而反轉(zhuǎn)化為膽紅素的反應(yīng)。分光光度分析也獲得了證據(jù)，表明在一種疚乃幕乖鏈嬖諳陸械腂OX催化的氧化反應(yīng)中，膽紅素在460nm處的光吸收基本不變。例如，在BOX存在下使用50毫克/升的膽紅素溶液，在頭10分鐘內(nèi)觀察到的光吸收變化約為15%。如果有更多的4AAP，則同樣時間內(nèi)的變?yōu)樾∮?%。
還應(yīng)該指出，除五氟苯酚外，還可應(yīng)用帶有給電子取代基的其它含氟的芳香化合物。在這類化合物中，可以舉出下列化合物4-氟苯酚(FP)、4-氟苯胺(FA)和四氟苯酚(TFP)也可用于上述測試。
實例2在類似條件下重復(fù)實例1的方法，得到下列結(jié)果并以每分鐘釋放的F-離子濃度(微摩爾/升/分)表示(兩次試驗結(jié)果的平均值)。
膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液結(jié)果〔F-〕(毫克/升)(微摩爾/升/分)00，176(本底)1，00，1795，00，29210，00，44220，00，73840，01，292用上表作對比數(shù)據(jù)，測定作同樣分析的正常血清(NS)和病理血清(PS)。結(jié)果為NS14毫克/升，PS32毫克/升，這與由通常方法得到的數(shù)值確實相一致。
實例3前一實例的結(jié)果表明，即使在完全沒有膽紅素時(空白)，電位參數(shù)的讀數(shù)也不為零。
雖然這種情況僅在血紅素濃度很低時才會成為問題，我們?nèi)匀谎芯苛藴p少這種誤差的手段，包括改變反應(yīng)介質(zhì)和pH。
例如，除了pH7的Tris緩沖液(Tris＝三(羥甲基)氨基甲烷)外，研究了pH7和pH5.5的卡可酸鹽(二甲基次胂酸鈉)緩沖液及pH5.5的乙酸鹽緩沖液。
這三種緩沖液都為0.1M，并用0.1NNaOH或0.1N酸(對Tris和卡可酸鹽用HCl，對乙酸鹽用乙酸)調(diào)至所要求的pH。如前面的實例所述，利用濃度為0(空白)和20毫克/升的膽紅素進(jìn)行試驗。
空白(即膽紅素濃度為0)的結(jié)果示于下表，為方便起見，結(jié)果以占對20毫克/升樣品記錄的相應(yīng)數(shù)值的百分比表示。
下表給出兩組結(jié)果，一組是用4-氟苯酚(4-FP)作還原劑時的結(jié)果，另一組是用4-氟苯胺(4-FA)作還原劑時的結(jié)果。
緩沖液(pH)結(jié)果(%)4-FP4-FATris(7)9333卡可酸鹽(7)1633卡可酸鹽(5.5)920乙酸鹽(5.5)2550上面的數(shù)據(jù)表明，在用pH5.5的卡可酸鹽時出現(xiàn)最小本底，而且4-FP比4-FA結(jié)果更好。
實例4還進(jìn)行了一些實驗來測試若干氟化合物在本方法中的優(yōu)劣。測試的化合物為4-氟苯酚(4-FP)、4-氟苯胺(4-FA)和五氟苯酚(PFP)。如前面的實例所述，用濃度為0的膽紅素相對于低濃度膽紅素(在此為5毫克/升)進(jìn)行測試。緩沖液為pH為5.5和7的卡可酸鹽。下表給出的是0膽紅素的測試結(jié)果哉 毫克/升膽紅素測試結(jié)果的百分比表示。
氟化合物結(jié)果(%)pH5.5pH74-FP20284-FA6，2520PFP156應(yīng)當(dāng)注意，如果實例3和4所公開的實驗在不加4-AAP(4-氨基安替比林)的情況下進(jìn)行，則只記錄本底，而不管膽紅素的量是多少。
以前曾認(rèn)為，本發(fā)明的方法并不依賴于經(jīng)過氧化氫氧化后F-的釋放，而膽紅素在某些種類的BOX存在下進(jìn)行氧化時可能會生成過氧化氫。以前這樣認(rèn)為是用不生成H2O2的膽紅素氧化酶來證實的。為了進(jìn)一步進(jìn)行檢驗，加(或不加)催化量的辣根過氧化物酶(POD)進(jìn)行試驗。已知POD催化H2O2對有機(jī)氟化合物的氟碳鍵的斷裂反應(yīng)(見本申請中及別處引用的先前的工作)。
如前面的實例所述，測試在加(5單位/毫升)或不加POD的情況下，用0和5毫克/升膽紅素在pH7的卡可酸鹽緩沖液中進(jìn)行。
0試驗的結(jié)果仍以占5毫克/升測試結(jié)果的百分比表示。結(jié)果表明，POD的存在與否無關(guān)緊要。例如，對4-FA結(jié)果為23%(加POD)和24%(不加POD)。對4-FP結(jié)果都為13%。
權(quán)利要求
1.一種水溶液中膽紅素的測定方法，包括以下步驟a.在膽紅素氧化酶和過量的一種還原性化合物存在下，將膽紅素氧化成膽綠素，所述還原性化合物能夠?qū)⒛懢G素還原回初始的膽紅素；b.測定該還原性化合物的消耗速率，從而確定水溶液中存在的膽紅素的量。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于其中的水溶液為生物流體。
3.權(quán)利要求2的方法，其特征在于，其中的還原劑為一種化合物，其標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電勢處在Fe2+/F3+電對和H+/H2電對的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電勢之間，并且該還原劑能夠產(chǎn)生一個指示該還原劑消耗的信號。
4.權(quán)利要求3的方法，其特征在于，其中的還原劑為4-氨基安替比林;此外，膽綠素的還原反應(yīng)在選定的鹵代化合物存在下進(jìn)行，這些選定的鹵代化合物能夠在氧化態(tài)4-氨基安替比林存在下產(chǎn)生游離的鹵離子，鹵離子的產(chǎn)生速率由氧化態(tài)4-安基安替比林的生成速率控制;對鹵離子進(jìn)行分析，以測定水溶液中存在的膽紅素的量。
5.權(quán)利要求4的方法，其特征在于，用離子選擇性電極測量水溶液中所述鹵離子的生成速率。
6.權(quán)利要求4的方法，其特征在于，其中的鹵代化合物選自對氟苯酚、對氟苯胺、四氟苯酚、五氟苯酚、及帶有給電子取代基的含氟芳香化合物。
7.權(quán)利要求6的方法，其特征在于，其中的鹵代化合物選自對氟苯酚、對氟苯胺、四氟苯酚和五氟苯酚。
8.一種水溶液樣品中膽紅素的測定方法，包括以下步驟a.在膽紅素氧化酶存在下，將膽紅素定量氧化為膽綠素;b.利用還原劑定量還原膽綠素，其中所用還原劑的摩爾數(shù)相對于膽紅素過量;c.測定還原劑的消耗速率，以確定水溶液樣品中存在的膽紅素的量。
9.權(quán)利要求8的方法，其特征在于，其中的水溶液為生物流體。
10.權(quán)利要求9的方法，其特征在于，其中的還原劑為一種化合物，其標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電勢處在Fe2+/Fe3+電對和H+/H2電對的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電勢之間，并且該還原劑能夠產(chǎn)生一個指示該還原劑消耗的信號。
11.權(quán)利要求10的方法，其特征在于，其中的還原劑為4-氨基安替比林;此外，膽綠素的還原反應(yīng)在選定的鹵代化合物存在下進(jìn)行，這些選定的鹵代化合物能夠在氧化態(tài)4-氨基安替比林存在下產(chǎn)生游離的鹵離子，鹵離子產(chǎn)生的速率由氧化態(tài)4-氨基安替比林的生成速率控制;對鹵離子進(jìn)行分析，以測定水溶液中存在的膽紅素的量。
12.權(quán)利要求11的方法，其特征在于，用離子選擇性電極測量水溶液中所述鹵離子的生成速率。
13.權(quán)利要求11的方法，其特征在于，其中的鹵代化合物選自對氟苯酚、對氟苯胺、四氟苯酚、五氟苯酚和帶有給電子取代基的含氟芳香化合物。
14.權(quán)利要求13的方法，其特征在于，其中的鹵代化合物選自對氟苯酚、對氟苯胺、四氟苯酚、五氟苯酚。
全文摘要
生物流體中膽紅素的新分析方法。在膽紅素氧化酶(BOX)存在下，將膽紅素催化氧化為膽綠素，后者反過來又在適當(dāng)?shù)倪€原劑存在下反轉(zhuǎn)化為初始的膽紅素。所述還原劑的相應(yīng)氧化產(chǎn)生一種信號，監(jiān)測此信號即得到所需的分析數(shù)據(jù)。如果利用選定的有機(jī)氟化合物，則所述信號由F
文檔編號G01N27/416GK1034999SQ8910047
公開日1989年8月23日 申請日期1989年1月28日 優(yōu)先權(quán)日1988年1月28日
發(fā)明者伊巴爾·西迪基, 西亞蘭·曼根 申請人:電核物理有限公司