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專利名稱：一種測定腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域脂肪酸組成的方法及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學領(lǐng)域，涉及一種測定腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域脂肪酸組成的方法，本發(fā)明還涉及該方法的應用。
背景技術(shù)：
腸道不僅能消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì)，對腸道細菌及其毒素具有重要的屏障功能。了解腸粘膜屏障損傷及保護的機制，對于控制腸道細菌易位，防治多器官功能衰竭，降低危重病人的死亡率有非常重要的意義。
腸粘膜上皮細胞緊密連接部(TJ)調(diào)節(jié)腸粘膜的屏障功能。TJ是調(diào)節(jié)上皮細胞屏障功能的動力結(jié)構(gòu)，上皮細胞間滲透性屏障主要依靠緊密連接部維持，它還限制膜脂肪和膜蛋白的側(cè)向擴散從而維持細胞的極性。腸上皮細胞的緊密連接部為細胞側(cè)面的漿膜頂層區(qū)域的窄帶樣結(jié)構(gòu)部分，連接相鄰細胞，維持頂層和基底層膜區(qū)域特異蛋白和脂肪組成，也是細胞旁途徑的限速屏障。最近研究認為TJ本身是具有一定特殊結(jié)構(gòu)的膜微區(qū)域，但是關(guān)于TJ膜微區(qū)域脂肪酸組成特征，目前尚無報道，更沒有測定TJ膜微區(qū)域脂肪酸組成的方法的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種準確有效地分離腸粘膜上皮細胞緊密連接微區(qū)域和測定該微區(qū)域脂肪酸組成的方法。
本發(fā)明技術(shù)方案是根據(jù)腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域不溶于非離子活性劑，利用該化學特征，用不同濃度梯度蔗糖超速離心法分離腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域，再進行緊密連接膜微區(qū)域脂類的提取分離，用氣相色譜法測定分析緊密連接膜微區(qū)域脂肪酸的組成。
本發(fā)明的目的是通過下列具體措施實現(xiàn)的一種測定腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域脂肪酸組成的方法，包含下列步驟a.培養(yǎng)人類腸粘膜上皮細胞T84細胞；b.破裂細胞，將腸粘膜上皮細胞緊密連接分離，得細胞裂解液；
c.采用不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心法分離腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域；d.提取經(jīng)分離的腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域的脂肪酸，采用氣相色譜法測定脂肪酸組成。
所述的測定腸粘膜上皮細胞緊密連接部微區(qū)域脂肪酸組成的方法，其中腸粘膜上皮細胞的培養(yǎng)方法為將人類腸粘膜上皮細胞T84細胞加入DMEM/F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加占培養(yǎng)基體積百分比10％的熱滅活胎牛血清、青霉素100U/ml培養(yǎng)基、鏈霉素100U/ml培養(yǎng)基，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，在5％CO2于37℃條件下培養(yǎng)。
所述的測定腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域脂肪酸組成的方法，其中破裂細胞采用非離子活性劑及超聲波共同作用，具體是將T84細胞用PBS洗兩次，收集細胞離心后沉淀重新懸浮在1ml含有1％(v/v)非離子活性劑TritonX-100的緩沖液(40mMNaF，4mM Na3VO4，50mM Tris，25mM KCl，5mM MgCl·6H2O，1mM EDTA，pH7.4)中，并加入占緩沖液體積0.1％(v/v)的蛋白酶抑制劑cocktail，冰上孵育30分鐘，超聲破碎細胞，得細胞裂解液。超聲破碎細胞的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的方法。
所述的測定腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域脂肪酸組成的方法，其中采用不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心法分離腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域的方法是將細胞裂解液與等量的濃度為90％(w/v)的溶解在上述緩沖液的蔗糖溶液混合，用5.5ml濃度為36％(w/v)的溶解在上述緩沖液的蔗糖溶液緩慢覆蓋其上層，然后再用2.5ml濃度為5％(w/v)的溶解在上述緩沖液的蔗糖溶液覆蓋在頂層，250000g于4℃下超速離心18小時，從頂部每次取1mL，收集不同的分離組分，-80℃保存。
所述的測定腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域脂肪酸組成的方法，其中提取腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域脂肪酸的方法是采用萃取法提取腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域總脂。
所述的測定腸粘膜上皮細胞緊密連接部微區(qū)域脂肪酸組成的方法，其中采用氣相色譜法測定分離的腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域的脂肪酸組成是在樣品中加入正十七碳酸內(nèi)標后用HP4890氣相色譜儀測定。(氣相色譜測定步驟及條件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的)。
所述的測定腸粘膜上皮細胞緊密連接部微區(qū)域脂肪酸組成的方法在研究腸屏障功能和腸粘膜屏障損傷情況測定中的應用。
本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明采用蔗糖密度梯度超速離心法從極性腸上皮細胞株(T84細胞)中分離TJ的膜微區(qū)域，并應用氣相色譜首次測定分析了緊密連接部膜微區(qū)域脂肪酸譜。本發(fā)明采用的方法能夠簡單、準確地測定腸粘膜上皮細胞緊密連接部微區(qū)域的脂肪酸組成。腸上皮細胞緊密連接對維持上皮極性及調(diào)節(jié)腸屏障的通透性發(fā)揮著重要作用。臨床上由嚴重創(chuàng)傷、外科感染、膿毒癥等引起TJ發(fā)生變化及所致腸粘膜通透性增高，細菌、毒素移位而發(fā)生腸源性感染的機制也未闡明，對腸粘膜上皮細胞緊密連接部微區(qū)域的研究為深化腸屏障功能的機制和提升基礎(chǔ)科學理論具有重要意義。同時對于了解腸粘膜屏障損傷的機制，控制腸道細菌移位，防治多器官功能衰竭，降低危重病人的死亡率也具有重要意義。


圖1是腸粘膜上皮細胞緊密連接微區(qū)域超微結(jié)構(gòu)示意2是不連續(xù)蔗糖密度梯度超離心法分離腸粘膜上皮細胞緊密連接部微區(qū)域示意圖具體實施方式
以下通過實施例對本發(fā)明做進一步闡述，但不限制本發(fā)明。
實施例11.實驗材料人類腸粘膜上皮細胞T84細胞(American Type Culture Collection，Manassas，VA)，DMEM/F12培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)來源于Invitrogen公司；胎牛血清購自Gibco公司；牛血清白蛋白(組分V)和蛋白酶抑制劑cocktail購于Roche公司。
2.腸粘膜上皮細胞的培養(yǎng)人類腸粘膜上皮細胞T84細胞加入DMEM/F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加占培養(yǎng)基體積百分比10％的熱滅活胎牛血清、青霉素100U/ml培養(yǎng)基、鏈霉素100U/ml培養(yǎng)基，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，在5％CO2于37℃條件下培養(yǎng)。
3.腸粘膜上皮細胞緊密連接部微區(qū)域地分離將T84細胞用冷藏的(4℃)PBS洗兩次，收集細胞離心后沉淀重新懸浮在1ml含有1％(v/v)TritonX-100的緩沖液(40mMNaF，4mM Na3VO4，50mM Tris，25mMKCl，5mM MgCl.6H2O，1mM EDTA，pH7.4)中，并加入占緩沖液體積0.1％(v/v)的蛋白酶抑制劑cocktail(每ml含0.12mg antipain-HCl，20μg bestatin，40μg chymostatin，0.12mgE-64，20μg leupeptin，20μg pepstatin，0.12mg phosphoramidon，0.8mg pefabloc，40μgaprotinin)，冰上孵育30分鐘，超聲破碎細胞。細胞裂解液與等量的濃度為90％(w/v)的溶解在上述緩沖液的蔗糖溶液混合，用5.5ml濃度為36％w/v的溶解在上述緩沖液的蔗糖溶液緩慢覆蓋其上層，然后再用2.5ml濃度為5％w/v的溶解在上述緩沖液的蔗糖溶液覆蓋在頂層，250000g于4℃下超速離心18小時，從頂部每次取1mL，收集不同的分離組分，-80℃保存。
4.氣相色譜法分析緊密連接膜微區(qū)域脂肪酸組成取分離的腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域組分，凍干后加入1mL甲醇(含0.9％苯駢三氮唑抗氧劑)混勻后，加入4mL氯仿，混勻，再加入1mL的甲醇使氯仿和甲醇的最終體積比為2∶1，混懸后，加入1mL 50mM KCl，混勻后2000g下離心15分鐘。收集有機相，水相用1.5mL氯仿洗滌2次，轉(zhuǎn)移有機相，合并3次的有機相，通過有機膜過濾(去除大于0.45μm的物質(zhì))，38℃旋轉(zhuǎn)蒸干。
在樣品中加入10μg正十七碳酸內(nèi)標和1mL三氯化硼一乙醚∶甲醇溶液(1∶3，v/v)。置于75℃水浴30分鐘，冷卻，再加入0.5mL水和1.5mL正己烷，震蕩混勻后，2000g離心15分鐘。收集上清液，氮氣吹干，溶解于25μl氯仿中，2μl進樣。使用HP4890氣相色譜儀(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)，該系統(tǒng)配備火焰離子化檢測器(FID)，HP3398A色譜工作站和HP-FFAP石英毛細管色譜柱(30m長，內(nèi)徑0.32mm，涂層厚度為0.25μm)(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)。載氣為高純氮氣，進樣器溫度是250℃，檢測器溫度為300℃，載氣流速為10psi，程序升溫起始溫度110℃，以8℃/分升溫至180℃，保持10分鐘，再以6℃/分升溫至230℃，保持8分鐘后，10℃/分升溫至250℃，保持3分鐘。
常規(guī)比色法測定磷的含量(用于校正)。
測定結(jié)果見表1。
表1是緊密連接膜微區(qū)域脂肪酸測定結(jié)果


(注表中脂肪酸表示方式a:b(n-c)中a代表碳原子數(shù)，b代表雙鍵數(shù)，c代表雙鍵位置)
權(quán)利要求
1.一種測定腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域脂肪酸組成的方法，其特征在于包含下列步驟a.培養(yǎng)人類腸粘膜上皮細胞T84細胞；b.破裂細胞，將腸粘膜上皮細胞緊密連接分離，得細胞裂解液；c.采用不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心法分離腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域；d.提取經(jīng)分離的腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域的脂肪酸，采用氣相色譜法測定脂肪酸組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域脂肪酸組成的方法，其特征在于腸粘膜上皮細胞的培養(yǎng)方法為將人類腸粘膜上皮細胞T84細胞加入DMEM/F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加占培養(yǎng)基體積百分比10％的熱滅活胎牛血清、青霉素100U/ml培養(yǎng)基、鏈霉素100U/ml培養(yǎng)基，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，在5％CO2于37℃條件下培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域脂肪酸組成的方法，其特征在于破裂細胞采用非離子活性劑及超聲波共同作用，具體是將T84細胞用PBS洗兩次，收集細胞離心后沉淀重新懸浮在1ml含有1％(v/v)非離子活性劑TritonX-100的緩沖液(40mM NaF，4mM Na3VO4，50mM Tris，25mM KCl，5mMMgCl·6H2O，1mM EDTA，pH7.4)中，并加入占緩沖液體積0.1％(v/v)的蛋白酶抑制劑cocktail，冰上孵育30分鐘，超聲破碎細胞，得細胞裂解液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域脂肪酸組成的方法，其特征在于采用不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心法分離腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域的方法是將細胞裂解液與等量的濃度為90％(w/v)的溶解在上述緩沖液的蔗糖溶液混合，用5.5ml濃度為36％(w/v)的溶解在上述緩沖液的蔗糖溶液緩慢覆蓋其上層，然后再用2.5ml濃度為5％(w/v)的溶解在上述緩沖液的蔗糖溶液覆蓋在頂層，250000g于4℃下超速離心18小時，從頂部每次取1mL，收集分離組分，-80℃保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域脂肪酸組成的方法，其特征在于提取腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域脂肪酸的方法是采用萃取法提取腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域總脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域脂肪酸組成的方法，其特征在于采用氣相色譜法測定分離的腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域的脂肪酸組成是用HP4890氣相色譜儀測定。
7.權(quán)利要求1所述的測定腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域脂肪酸組成的方法在研究腸屏障功能和腸粘膜屏障損傷情況測定中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種測定腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域脂肪酸組成的方法及其應用。該方法的步驟為培養(yǎng)人類腸粘膜上皮細胞T84細胞，破裂細胞，將腸粘膜上皮細胞緊密連接分離，采用不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心法分離腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域，提取經(jīng)分離的腸粘膜上皮細胞緊密連接膜微區(qū)域的脂肪酸，采用氣相色譜法測定脂肪酸組成。該方法能夠簡單、有效、準確地測定腸粘膜上皮細胞緊密連接部微區(qū)域的脂肪酸組成，為深入研究腸屏障功能的機制和提升基礎(chǔ)科學理論具有重要意義，可用于研究腸屏障功能和腸粘膜屏障損傷情況測定。
文檔編號G01N1/28GK1821775SQ20061000553
公開日2006年8月23日 申請日期2006年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月9日
發(fā)明者李秋榮, 譚力, 黎介壽 申請人:中國人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院