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專利名稱：一種用電化學活性開關分子信標檢測核酸的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用電化學活性開關分子信標檢測核酸的方法，屬于化學分 析方法的技術領域。
背景技術：
分子信標技術是生物分子探針研究的重點。它可以對PCR擴增產(chǎn)物進 行定量檢測和對PCR擴增過程(real-time PCR)作實時在線檢測[文獻Tyagi, F. R. Kramer,NatBiotechnol, 1996， 14,303 — 308; (b) Alsmadi OA, Al-Kayal F, Al-Hamed M， and Meyer BF ,BMC Med Genet 2006, 7, 43-49.];用于 基因的定量、定性檢測和用于基因點突變等的分析和雙鏈DNA的檢測[文獻 Du H， Disney MD, Miller BL， Krauss TD , J.Am. Chem. Soc., 2003， 125，4012-4013;(d) Marras，S.A.E.， Kramer，F(xiàn).R. and Tyagi，S. Genet. Anal. Biomol. E,1999,14, 151-156;進行基礎醫(yī)學研究和直接應用于臨床醫(yī)學中對腫 瘤、SARS、乙肝病毒及艾滋病病毒等各種疾病的檢測與診斷[文獻Fan，C.， Plaxco， K. W., Heeger， A.， J. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003, 100, 9134-9137; (f) Douglas Horejsh, Federico Martini, Fabrizio Poccia, Giuseppe Ippolito， Nucleic Acids Res, 2005, 33, e13在醫(yī)學、分子生物學、環(huán)境科學等諸多領域的 發(fā)展有著非常重要的意義。
多數(shù)分子信標為熒光分子信標。由于熒光分子信標技術需要比較龐大、貴 重的檢測儀器，不適用于一些比較簡陋的工作場所及在野外應對突發(fā)事件如 生化襲擊等需要野外作業(yè)的場合等。而電化學檢測技術具有靈敏度高、選擇性 好、簡便價廉和易攜帶等優(yōu)點。目前電化學分子信標通常采用以一端固定于電 極表面的電化學分子信標。其方法主要是通過改變電化學活性分子與電極表面 的距離來實現(xiàn)生物分子/電化學信號的轉換[文獻Fan, C. et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 2003, 100, 9134—9137; Wang， J.，Li, J.，Baca， A. J.，Hu， J.,Zhou, F.， Yan， W., Pang, D,W.， Anal.Chem., 2003， 75, 3941-3945; S. S. W. Yeung, T. M. H. Lee.， I. M.Hsing.， J. Am. Chem. Soc.， 2006， 128， 13374-13375; A. E.Radi， J. L. A. Sa'nchez, E. Baldrich， C. K. O'Sullivan， J. Am. Chem. Soc., 2006， 128, 117-124.]，具有背景電流高，檢測靈敏度低并且需要采用固定的方式，對大容 量的樣品檢測有困難等
發(fā)明內容
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針對已有檢測技術存在的不足，本發(fā)明的目的在于推出一種用電化學活性 開關分子信標檢測核酸的方法。該方法以電化學活性開關分子信標為檢測探 針，無試劑，不需要固定，選擇性好、靈敏、簡便、快速直接均相測定核酸等 生物分子。
本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現(xiàn)。該技術方案包括電化學活性開關分 子信標的合成和檢測樣品中特定序列的核酸分子的兩個步驟。所述的分子信標 無電化學活性，但與目標分子結合后，因其莖環(huán)結構發(fā)生改變而具有電化學活 性，產(chǎn)生與溶液中的核酸的濃度呈線性關系的氧化峰電流。由此還可計算核酸 目標分子的含量。
現(xiàn)詳細描述本發(fā)明的技術方案。 一種用電化學活性開關分子信標檢測核酸 的方法，其特征在于，具體操作步驟
第一步電化學活性開關分子信標的合成
每1.0 O.D核酸量合成時取30pL 3.3xl(T3！11011/1的胭脂紅酸溶液和加入 20mg咪唑，調節(jié)該溶液的pH值至6.5，室溫下羧基活化30分鐘，在偶聯(lián)劑 12mgEDC和27mgNHS存在下，加入含1.0 O.D兩端修飾有氨基的具有莖環(huán)結 構特定序列核酸的PBS溶液，調節(jié)該PBS溶液的pH值至7.3和溶液體積為 400pL，在冰水浴下攪拌24小時，透析袋于PBS溶液中透析48小時，去除未 與核酸偶聯(lián)的胭脂紅酸，用HPLC方法提純，得到濃度不低于lxl(rSmo11/1的 電化學活性丌關分子信標，4'C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> 第二步檢測樣品中特定序列的核酸分子
在含有待測的特定序列核酸溶液的樣品中，加入50fiL lxlO-5molL—1的第 一步得到的電化學活性開關分子信標，控制溶液的雜交條件為PBS溶液的pH =7.3和[Na+] = 1.8mol/L， 50°C下雜交反應30分鐘，采用羧基化碳納米管修飾 電極在0.2 0.9V范圍掃DPV，記錄0.7V處的氧化峰電流值，該氧化峰電流 值與樣品中特定序列核酸濃度呈線性關系。
本發(fā)明的優(yōu)點
1、 采用電化學活性開關分子信標作為檢測探針，無需其他試劑，不要固 定，方法簡單、便捷。
2、 釆用電化學檢測，具有靈敏、選擇性好，背景信號低，對樣品無濁度 要求，所需儀器簡單，價格便宜，適用于野外等簡陋場合使用。
3、 可在水溶液中對特定序列的核酸進行檢測，并且檢測的線性范圍寬， 適用于目標量變化大的樣品檢測。
具體實施例方式
現(xiàn)結合實施例進一步說明本發(fā)明的技術方案和工作原理。實施例完全按照 上述檢測核酸的方法的具體操作步驟進行操作。
實施例溶液中人體生長因子促進劑(porpholilinogen deaminase from 170 to 142)序列的核酸測定
第一步按3.0 O.D.核酸量的合成，取90pL 3.3x10—3mo11/1的胭脂紅酸 溶液，加入約60mg咪唑，調節(jié)該溶液的pH值至6.5，室溫下羧基活化30分 鐘，在偶聯(lián)劑12mgEDC和27mgNHS存在下，加入3.0 O.D.的兩端修飾有氦 基的含porpholilinogen deaminase from 170 to 142互補序列的特定核酸片段 PBS溶液(pH=7.3),溶液體積為1200pL，混合液在冰水浴下攪拌24小時， 透析袋(分子量為7000)于PBS溶液中透析48小時，除去過量的未與核酸偶 聯(lián)的胭脂紅酸，用HPLC方法提純，制得1100pL濃度為1.5x10—5111011/1的電 化學活性開關分子信標，4'C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 第二步在分別含有0.1， 0.3， 0.6, 0.9， 1.5 pmoll/1人體生長因子促進 齊ij ( porpholilinogen deaminase from 170 to 142)的特定序列目標核酸溶液中， 分別加入50nL lxl0—SmolL'1的的第 一 步得到的電化學活性開關分子信標，控 制溶液的雜交條件為pH=7.3 PBS和[Na+] = 1.8mol/L， 50。C下雜交反應30分 鐘，采用羧基化碳納米管修飾電極在0.2 0.9V范圍掃DPV，記錄0.7V處的 氧化峰電流值，該氧化峰電流值分別為0.32， 0.64， 1.16， 1.62， 2.75pA。經(jīng) 計算，其線性方程為Y= 0.122+1.83C,式中Y為峰電流)iiA， C為目標核酸 濃度pmolL—1，相關系數(shù)為0.9986。 工作原理
胭脂紅酸為羥基蒽醌類化合物，在正、負電位下都有電化學響應。分別為-位于-0.4V附近的一對氧化還原峰，對應著胭脂紅酸的蒽醌基團被還原成氫醌 及其逆反應，以及位于+0.720V的氧化峰，對應氫醌基團被氧化成二醌式結構 的過程。
當電化學活性開關分子信標以環(huán)莖結構形式存在時，其處于閉合狀態(tài)時， 由于其莖部末端的兩個胭脂紅酸分子靠得很近，其氫醌基團間形成穩(wěn)定的分子 間氫鍵，從而使兩個胭脂紅酸分子締合，締合后的胭脂紅酸分子處于更加穩(wěn)定 的狀態(tài)，不表現(xiàn)出電化學活性；而當電化學活性開關分子信標與互補的特定序 列核酸鏈作用并打開后，其構型的變化使末端的胭脂紅酸分子被分開，此時胭 脂紅酸分子的締合狀態(tài)被破壞，故能夠表現(xiàn)出電化學活性。將胭脂紅酸作為電 化學活性開關分子信標的信號分子，利用電化學活性開關分子信標與互補的特 定序列的核酸鏈作用后發(fā)生的構型改變，使胭脂紅酸分子可在締合狀態(tài)和解離 狀態(tài)間變化，從而令其具有在電化學非活性/活性間轉換的能力。
權利要求
1、一種用電化學活性開關分子信標檢測核酸的方法，其特征在于，具體操作步驟第一步電化學活性開關分子信標的合成每1. 0 O.D核酸量合成時取30μL 3.3×10-3molL-1的胭脂紅酸溶液和加入20mg咪唑，調節(jié)該溶液的pH值至6.5，室溫下羧基活化30分鐘，在偶聯(lián)劑12mg EDC和27mg NHS存在下，加入含1.0O.D兩端修飾有氨基的具有莖環(huán)結構特定序列核酸的PBS溶液，調節(jié)該PBS溶液的pH值至7.3和溶液體積為400μL，在冰水浴下攪拌24小時，透析袋于PBS溶液中透析48小時，去除未與核酸偶聯(lián)的胭脂紅酸，用HPLC方法提純，得到濃度不低于1×10-5molL-1的電化學活性開關分子信標，4℃冰箱中保存?zhèn)溆?；第二步檢測樣品中特定序列的核酸分子在含有待測的特定序列核酸溶液的樣品中，加入50μL 1×10-5molL-1的第一步得到的電化學活性開關分子信標，控制溶液的雜交條件為PBS溶液的pH＝7.3和[Na+]＝1.8mol/L，50℃下雜交反應30分鐘，采用羧基化碳納米管修飾電極在0.2～0.9V范圍掃DPV，記錄0.7V處的氧化峰電流值，該氧化峰電流值與樣品中特定序列核酸濃度呈線性關系。
全文摘要
一種用電化學活性開關分子信標檢測核酸的方法，屬于化學分析方法的技術領域，包括電化學活性開關分子信標的合成和檢測樣品中特定序列的核酸分子的兩個步驟。所述的分子信標無電化學活性，但與目標分子結合后，因其莖環(huán)結構發(fā)生改變而具有電化學活性，產(chǎn)生與溶液中的核酸的濃度呈線性關系的氧化峰電流。由此還可計算核酸目標分子的含量。該方法以電化學活性開關分子信標為檢測探針，無試劑，不需要固定，選擇性好、靈敏、簡便、快速直接均相測定核酸等生物分子，檢測的線性范圍寬，特別適于檢測目標量變化大的樣品和野外等簡陋場合使用。
文檔編號G01N27/416GK101382517SQ200810201229
公開日2009年3月11日 申請日期2008年10月15日 優(yōu)先權日2008年10月15日
發(fā)明者何品剛, 吳繼魁, 帆 張, 方禹之, 莉 林, 程圭芳, 黃翠華 申請人:華東師范大學