專利名稱：尿中粒子分析儀及其方法
技術領域：
本發明涉及尿中粒子分析儀及其分析方法。更具體地說是涉及應用流式細胞術光學測定、分析尿中所含成份的尿中粒子分析裝置及其分析方法。
背景技術：
尿中粒子的一般測定項目有紅細胞、白細胞、上皮細胞、管型及細菌，但其中所謂管型是指Tomm-Horsfall粘蛋白在少量血漿蛋白(白朊)存在的環境下在腎小管內凝集，以此為基質，血液細胞和腎小管上皮細胞等包含其中形成的圓柱狀物。管型有的大小可達數十μm以上，從其形狀上又被稱為圓柱體尿(cylinder)，由于以腎小管為鑄模而形成，故被稱為管型(cast)(管型的存在意味著腎小管曾被一時性堵塞，是暗示腎實質有病理性變化的重要依據，特別是血液細胞和上皮管型等包入其中的管型很有臨床意義)。
上皮細胞由偏平上皮細胞和移行上皮細胞組成。偏平上皮細胞是圓形或多角形的極薄的細胞，是尿道部分剝離而形成。而移行上皮細胞則有梨形和紡織形等多種形狀，是構成腎盂、尿道膀胱甚至內尿道口的細胞。大小從數十μm到表層型100μm以上不等。
紅細胞的測定對判斷腎小球到尿道有無出血十分重要，特別是腎泌尿系統疾病、出血性疾病、白血病等患者的尿液中多見。紅細胞大小一般為8μm左右，兩面呈凹形圓盤狀，但在尿中往往被破壞。特別是來源于腎小球的紅細胞都變形，大小也變小。被破壞的紅細胞溶血、有析出物。
白細胞多見于腎、尿道感染癥、腎結核等患者的尿液中。因此，通過測定尿中白細胞可以早期發現炎癥和感染癥。白細胞大小為6～14μm。測定細菌是調查有無感染的檢查。該細菌有球菌和桿菌。球菌是0.5～2μm左右的球形菌，桿菌是長徑為2～10μm左右的菌。球菌增殖則形成單列排列呈念珠狀的連鎖型和不規則排列呈葡萄房狀的葡萄型等集塊。
一直以來，尿中粒子的分析一般在檢查室主要用顯微鏡目測。這種方法首先離心分離尿液，對其濃縮，視情況染色后，將其沉渣置于顯微鏡載玻片上，在顯微鏡下進行分類和計數。這種鏡檢首先是在100倍的低倍率視野(LPF)中把握尿中有無粒子和尿液標本的狀態，再在400倍的高倍率視野(HPF)進行成份分類。檢測項目中，管型即使出現，個數也很少，但其檢出在臨床上非常有用，因此，以低倍率視野(LPF)尋找。其他粒子以高倍率視野(HPF)分類，紅細胞和白細胞個數以高倍率視野(HPF)報告。這種尿中粒子檢查具備定性檢查(比如關于細菌“++”)、定量檢查(比如關于紅細胞“5個/HPF”)和形態檢查(比如關于紅細胞“確認存在異形細胞”)三個要素。
作為尿中粒子檢查的自動化發明了自動顯微鏡裝置。流式自動顯微鏡分析裝置使用UA-2000(SYSMEX公司制)，這種裝置不必濃縮尿液標本即可將尿液標本流入扁平形流動池，拍攝在流動池流動的狀態并存儲下來。存儲的影像以粒子大小區分，用戶根據該影像對各種粒子進行分類。
近年，在這種自動顯微鏡方式的基礎上又提出了自動分類粒子的裝置，但是尿中粒子形態多種多樣，被破壞的粒子也很多，高精度地分類影像有困難。特別是小型粒子紅細胞(尤其紅細胞碎片)、細菌和結晶精確分類很難，使用戶不得不再分類。
作為檢查尿中粒子的自動分類裝置，有應用流式細胞儀的全自動尿有形成份分析裝置UF-100(SYSMEX公司生產)。此裝置用染色劑對尿中粒子染色，結合散射光信號和熒光信號，對紅細胞、白細胞、上皮細胞、管型和細菌進行分類。分類試劑由使用對各種粒子的膜和核進行染色的色素和保持尿中粒子形態的組分構成(比如參照專利公開平成8-170960號公報)。如上所述，尿中粒子形態多樣，被破壞的粒子也很多，僅靠將流式細胞儀測得的散射光信號強度和熒光信號強度組合起來很難精確分類。于是，通過將散射光信號的強度和脈沖幅度、熒光信號強度和脈沖幅度組合起來分別對尿中粒子進行分類(如可參照美國專利No.5,325,168)。這種采用流式細胞儀的尿中粒子測定裝置想盡辦法提供尿中粒子的分類和形態報告。比如，通過對紅細胞散射光信號的分析，提供尿中紅細胞來源(來源于腎小球或非腎小球)的信息(如可參照美國專利No.6,118,522)。用此裝置可以自動分類尿中粒子，對尿液檢查的自動化作出了巨大貢獻。
有些標本即使用如此想盡辦法分析散射光信號和熒光信號的裝置也會妨礙高精度的測定。其原因之一是有的標本難以對白細胞和上皮細胞正確分類。大多數上皮細胞是扁平上皮細胞和移行上皮細胞中來自表層的細胞。他們比白細胞大。但是，移行上皮細胞中來自中層或深層的細胞以及尿管上皮細胞中存在有被稱為小管型上皮細胞的小型上皮細胞。他們個頭與白細胞差不多，且與白細胞一樣為有核細胞，因此，受熒光色素染色的程度也一樣，出現區域重疊。
有的尿標本中含有結晶。結晶一般不被染色，故大部分分布于比紅細胞熒光強度低的區域。但是也有的結晶比如尿酸結晶因自身帶有熒光，會分布到熒光強度高的區域。尿中的結晶數有時會比紅細胞數等多得多，因此，有的標本難以正確測定紅細胞。于是，比如，專利公開平成11-23446號公報中建議檢測紅細胞出現區域的側向散射光信號來評價該區域紅細胞數的可靠性。
另一方面，尿的細菌檢查根據臨床目的也要求更高靈敏度的檢查。但是，用顯微鏡的目測檢查很難檢出數量少的細菌特別是小型細菌，沒有用于高靈敏度的檢查。在這種情況下，培養試樣檢測細菌的培養檢查與尿中粒子檢查分開，另行在細菌檢驗室進行。培養檢查需要培養天數，因此，人們呼喚不培養即可進行高靈敏度細菌檢查。
于是，用流式細胞儀分析細菌、即用染色劑對細菌染色、用散射光信號和熒光信號測定細菌的方法應運而生。比如，歐洲專利申請公告No.EP1136563和美國專利申請公告No.US2002/0076743記載的方法是用含陽離子型表面活性劑的染色劑以便溶解細菌外的雜質，即使試樣含有和細菌同樣大小的雜質也能精確測定。
發明內容
本發明的范圍只由后附權利要求書所規定，在任何程度上都不受這一節發明內容的陳述所限。
本發明首先涉及的尿中粒子分析儀包括以下部分用尿液標本和染色劑制備測定試樣的制樣系統；光學檢測系統，其包括照射上述所制測定試樣的光源、檢測該試樣產生的前向散射光的前向散射光采集器、檢測該試樣產生的側向散射光的側向散射光采集器和檢測該試樣產生的熒光的熒光采集器；以及根據上述光學檢測系統檢測出的前向散射光、側向散射光和熒光測定尿中白細胞的測定系統。
其中所述測定系統根據所述前向散射光和所述熒光對尿中白細胞和上皮細胞進行第一分析，根據所述前向散射光和所述側向散射光對尿中白細胞和上皮細胞進行第二分析；及所述測定系統根據上述第一分析結果和上述第二分析結果區分白細胞和上皮細胞。
其中所述測定系統進一步包括在上述第一分析中劃定尿中白細胞和上皮細胞出現區域的第一特定系統；以及在第二分析中劃定尿中白細胞和上皮細胞出現區域的第二特定系統。
其中所述測定系統測定尿中上皮細胞。
其中所述測定系統測定尿中紅細胞。
其中所述測定系統測定尿中細菌。
其中所述制樣系統將第一染色劑和第二染色劑添加進所述尿液標本中制備所述測定試樣；所述測定系統具有根據所述光學檢測系統檢測出來的前向散射光、側向散射光和熒光測定至少含白細胞的尿中粒子的第一測定系統；根據所述光學檢測系統檢測出來的前向散射光和側向散射光之一及熒光測定尿中細菌的第二測定系統。
其中所述制樣系統具有將尿液標本分配為第一等分和第二等分的標本分配器；所述制樣系統還具有在上述第一等分混入第一染色劑制備第一試樣的第一制樣系統和在上述第二等分混入第二染色劑制備第二試樣的第二制樣系統；所述第一測定系統根據上述光學檢測系統從上述第一測定試樣檢測到的前向散射光、側向散射光和熒光測定上述至少含白細胞的尿中粒子；及所述第二測定系統根據上述光學檢測系統從上述第二測定試樣檢測到的前向散射光和側向散射光之一及熒光測定上述尿中細菌。
其中所述第二制樣系統在所述第二等分中混入表面活性劑制備所述第二測定試樣。進一步包括將上述制樣系統所制測定試樣提供給上述光學檢測系統的供樣系統，其中上述供樣系統向上述光學檢測系統供應所述第一測定試樣后，向上述光學檢測系統供應所述第二測定試樣。
本發明還提供一種尿中粒子分析方法，包括a)混合尿液標本和染色劑，制備測定試樣；b)用光束照射上述制備的測定試樣，檢測該試樣產生的前向散射光、側向散射光和熒光；以及
c)根據上述檢測出的前向散射光、側向散射光和熒光，測定尿液中的白細胞。
其中所述步驟c)包含以下步驟根據所述前向散射光和所述熒光對尿中白細胞和上皮細胞進行第一分析的第一分析步驟；根據所述前向散射光和所述側向散射光對尿中白細胞和上皮細胞進行第二分析的第二分析步驟；及根據上述第一分析步驟的分析結果和上述第二分析步驟的分析結果區分白細胞和上皮細胞的區分步驟。
其中上述第一分析步驟包含劃定尿中白細胞和上皮細胞出現區域的第一特定步驟；及上述第二分析步驟包含劃定尿中白細胞和上皮細胞出現區域的第二特定步驟。
其中所述步驟c)包含測定尿中上皮細胞的步驟。
其中所述步驟c)包含測定尿中紅細胞的步驟。
其中所述步驟c)包含測定尿中細菌的步驟。
其中所述步驟a)包含在所述尿液標本加入第一染色劑和第二染色制備所述測定試樣的步驟；所述步驟c)包括根據在所述步驟b)檢測出的前向散射光、側向散射光和熒光測定至少含白細胞的尿中粒子的第一測定步驟，以及根據在所述步驟b)檢測出的前向散射光和側向散射光之一及熒光測定尿中細菌的第二測定步驟。
其中所述步驟a)包含將所述尿液標本分配為第一等分和第二等分的標本分配步驟；所述步驟a)還包含在上述第一等分加入第一染色劑混合制備第一試樣的第一制樣步驟和在上述第二等分加入第二染色劑混合制備第二試樣的第二制樣步驟；所述步驟b)還包括從所述第一測定試樣檢測前向散射光、側向散射光和熒光的第一檢測步驟和從所述第二測定試樣檢測前向散射光和側向散射光之一以及熒光的第二檢測步驟；所述第一測定步驟含根據在上述第一檢測步驟從所述第一測定試樣檢測出的前向散射光、側向散射光和熒光測定上述至少含白細胞的尿中粒子的步驟；及所述第二測定步驟含根據在上述第二檢測步驟從所述第二測定試樣檢測出的前向散射光和側向散射光之一及熒光測定尿中細菌的步驟。
其中在所述第二制樣步驟向所述第二等分中添加表面活性劑。
其中所述第一檢測步驟在所述第二檢測步驟之前進行
圖1為本發明尿中粒子分析儀一個實施方式及其附屬個人電腦的斜視示意圖；圖2為尿中粒子分析儀的制樣系統及光學檢測系統的功能略圖；圖3為光學檢測系統的結構圖；圖4為顯示第一染色劑一例的吸收波長和吸光度關系的附圖；圖5為顯示第二染色劑一例的吸收波長和吸光度關系的附圖；圖6為圖1所示尿中粒子分析儀的整體結構框圖；圖7為尿中粒子分析儀的定量機構及制樣系統的斜視略圖；圖8為尿中粒子分析儀的定量機構及制樣系統的說明圖；圖9為使用本發明一個實施方式的尿中粒子分析儀分析尿液的步驟流程圖(前半部分)；圖10為使用本發明一個實施方式的尿中粒子分析儀分析尿液的步驟流程圖(后半部分)；圖11(a)-圖11(e)為在本發明一個實施方式的尿中粒子分析儀獲得的散射圖一例的例示圖；圖12為本在發明一個實施方式的尿中粒子分析儀獲得的細菌類的散射圖一例的例示圖；圖13為本在發明一個實施方式的尿中粒子分析儀獲得的細菌類的散射圖一例的例示圖。
具體實施例方式下面根據附圖，詳細說明本發明尿中粒子分析儀的實施方式。圖1為本發明一個實施方式的尿中粒子分析儀及其附屬個人電腦的斜視說明圖。圖1中，為簡單明了，部分省略了收納尿中粒子分析儀組件的機殼。
在圖1中，尿中粒子分析儀U具有制備試樣的制樣系統2、運送樣品架(試管架)3的樣品架臺4、從試樣中檢測尿中粒子和細菌信息的光學檢測系統5和電路部分14。機殼側面通過旋臂15裝配操作臺16，上面放置有個人電腦13。個人電腦13與尿中粒子分析儀U的電路部分14局域網連接。
圖2是上述制樣系統2及光學檢測系統5的功能概要圖。圖中，放入試管T內的尿液(標本)被無圖示的注射式泵通過吸移管17抽取，用標本分配器1注入制樣系統。本實施方式的制樣系統由制樣系統(第一制樣系統)2U和制樣系統(第二制樣系統)2b組成，標本分配器1將尿液(標本)等分定量，分配給制樣系統2U和制樣系統2b。
制樣系統2U的尿液等分部分與稀釋液19U和染色液(染色劑)18U混合后被該染色液(染色劑)18U中所含色素染色。此染色試樣成為分析紅細胞、白細胞、上皮細胞和管型等較大尿中粒子(尿沉渣)的懸浮液。另一方面，制樣系統2b的尿液等分部分與稀釋液19b和染色液(染色劑)18b混合后被該染色液(染色劑)18b中所含色素染色。此染色試樣成為分析細菌的懸浮液。
如上制備的2種懸浮液(試樣)中，首先制樣系統2U的懸浮液(第一試樣)被導入光學檢測系統5，在鞘液流動池51中形成被鞘液包裹的細流，受激光照射。然后同樣，制樣系統2b的懸浮液(第二試樣)被導入光學檢測系統5，在鞘液流動池51中形成被鞘液包裹的細流，受激光照射。這種動作由后述微處理器11(控制裝置)控制無圖示的驅動器和電磁閥等自動進行。
圖3是光學檢測系統5的結構示意圖。圖中聚光鏡52將光源半導體激光器53發出的激光聚光到鞘液流動池51，聚光鏡54將尿中粒子的前向散射光聚光到作為散射光采集器的發光二極管55。另一個聚光鏡56將上述粒子的側向散射光和側向熒光聚光至分色鏡57。分色鏡57將側向散射光反射到作為散射光采集器的光電倍增管58，濾出側向熒光輸送到熒光采集器光電倍增管59。這些光信號反映了尿中粒子的特征。發光二極管55、光電倍增管58和光電倍增管59將光信號轉換成電信號，再分別輸出前向散射光信號(FSC)、側向散射光信號(SSC)和側向熒光信號(SFL)。這些輸出信號被無圖示的前置放大器放大后，供下一步處理。
作為光源也可以用氣體激光器取代半導體激光器，但從低成本、小型化且低耗電量來說，還是采用半導體激光器為好，采用半導體激光器不僅可以降低產品成本，還可期待裝置的小型化和節電化。半導體激光器中，以紅色半導體激光器為宜，因為紅色半導體激光器成本低、壽命長、廠家供貨穩定。
圖6為顯示尿中粒子分析儀U的整體結構的框圖。圖中，尿中粒子分析儀U具有前述標本分配器1、制樣系統2和光學檢測系統5、對經前置放大器放大的光學檢測系統5的輸出信號進行放大和濾波處理的模擬信號處理電路6、將模擬信號電路6的輸出轉換為數字信號的A/D轉換器7、對數字信號進行所定波形處理的數字信號處理電路8、連接數字信號處理電路8的存儲器9、與模擬信號處理電路6及數字信號處理電路8連接的微處理器11和接在微處理器11上的網卡12。外部的個人電腦13(分析器)通過網卡12與尿中粒子分析儀U形成局域網連接，用此個人電腦13可以對在尿中粒子分析儀U取得的數據進行分析。上述模擬信號處理電路6、A/D轉換器7、數字信號處理電路8和存儲器9構成了對光學檢測系統5輸出的電信號進行信號處理的信號處理電路10。
尿中粒子分析儀U的結構為從尿液標本和染色劑混合而成的測定試樣中采集2種散射光(前向散射光和側向散向光)和熒光，再根據這些前向散射光、側向散向光和熒光測定尿中白細胞。一般認為，前向散射光反映粒子(尿中有形成份)的大小，側向散向光反映粒子的內容。即，這些散射光強度可以作為顯示粒子不同特性的參數用于尿中粒子的分析。另一方面，熒光強度反映白細胞的核的狀態。這樣，通過分別使用三種不同的信息(前向散射光強度、側向散向光強度和熒光強度)就可非常精確地對白細胞進行分類。
(尿中粒子測定試劑)關于測定這些尿中粒子的試劑，專利公告平成8-170960有詳細說明。此試劑的一個實施方式是染料選擇的是能對膜染色的色素，以便也能對無核的粒子染色。作為試劑，為了達到防止紅細胞溶血的目的和取得穩定的熒光強度，應加入滲透壓補償劑，將濃度調整為100～600mOSm/kg，以使滲透壓適于分類測定。尿中粒子的細胞膜和核(核膜)被此試劑染色。作為含可對膜染色的色素的染色劑，可以使用縮合苯衍生物，比如可使用花青系色素NK-529(商品名。林原生物化學研究所制)。此染色劑不僅染色細胞膜，還對核膜染色。使用這種染色劑，白細胞和上皮等有核細胞細胞質(細胞膜)中的染色強度和核(核膜)中的染色強度重合，以此可以將白細胞和上皮等有核細胞與紅細胞等無核尿中粒子區別開。
(細菌分析用試劑)
歐洲專利申請文件No.EP1136563對能從含有同樣大小的雜質的試樣中精確測定細菌的試劑有詳細說明。此試劑的一個實施方式是使用能染色核酸的色素作為染料。作為含有核染色色素的染色劑比如可以使用以下結構式(化1)中所示美國專利申請公告No.US2002/0076743記載的花青類色素。
(化1)其中，特別是以下結構式(化2)所示花青類色素更為適用。
(化2)在這種情況下，最好在用于測定至少含紅細胞的尿中粒子的尿液標本中加入的染色劑(第一染色劑)含有膜染色色素，而在用于測定細菌的尿液標本中加入的染色劑(第二染色劑)最好含有染色核酸的色素。尿中粒子中含有象紅細胞那樣沒有核的細胞，由于第一染色劑含有膜染色的色素，包括這種無核的細胞在內，尿中粒子都可以檢測出來。又由于第二染色劑含有核染色的色素，細菌的核被有效地染色，即使很小的細菌也可以很精確地測定。
上述第一染色劑和第二染色劑其吸收波長的峰值最好存在于上述半導體激光器的發光波長附近。通過選擇靠近上述半導體激光器的發光波長的第一染色劑和上述第二染色劑的吸收波長峰值，可以通過半導體激光器測定被染色的尿中粒子和細菌。圖4顯示了這種第一染色劑一例(含有NK-529(商品名，林原生物化學研究所制)的染色劑)的吸收波長和吸光度的關系，其吸收波長的峰值存在于紅色半導體激光器發光波長(635nm)附近的640nm處。圖5顯示了第二染色劑一例(含上述(化2)所示美國專利申請公告No.US2002/0076743上記載的花青系列色素的染色劑))的吸收波長和吸光度的關系，其吸收波長的峰值存在于紅色半導體激光器發光波長(635nm)附近的636nm處。此外，圖5還顯示了在試劑溫度為15℃和35℃的情況下吸光度的變化，但可以知道，只要是常溫左右的溫度，試劑的吸光度沒有大的變化。
細菌測定用試劑含有陽離子型表面活性劑，其目的是使染料透過膜盡快染色以及收縮粘液絲和紅細胞碎片等雜質。在此情況下，由于表面活性劑可以破損細菌的細胞膜，因此通過使用第二染色劑所含色素可以高效地對細菌的核酸染色。其結果是經過短時間的染色處理即可更精確地進行上述細菌的測定。在第二等分部分加入表面活性劑混合的情況下，最好細菌測定在尿中粒子測定結束后進行。第二試樣含表面活性劑，如果在測定細菌后測定尿中粒子，由于試樣攜帶，表面活性劑會混入第一試樣，有可能破壞含紅細胞的尿中粒子細胞膜，影響該尿中粒子的測定。而測定完尿中粒子再測定細菌，可以防止第一試樣中混入表面活性劑，精確地測定尿中粒子。
本實施方式的結構是，從一個尿液標本分別制備測定至少含紅細胞的尿中粒子用的第一試樣和測定細菌用第二試樣，用上述第一試樣測定至少含紅細胞的尿中粒子，用上述第二試樣測定細菌。這樣，一個分析裝置可以分別精確地測定至少含紅細胞的尿中粒子和細菌。又因第一試樣和第二試樣共用一個光學檢測系統，可以簡化裝置結構，可以在降低產品成本的同時，實現裝置小型化。
圖7為本實施方式尿中粒子分析儀的定量機構及制樣系統的斜視略圖；圖8是其說明圖。本實施方式采用常用的進樣閥30作為將一定量的尿液標本分配到制樣系統(第一制樣系統)2U和制樣系統(第二試樣設備器)2b的定量機構。此進樣閥30由2個圓盤形的固定元件和兩個固定元件夾著的可動元件組成，上述可動元件受電動機31操作轉動。
上述進樣閥30有互相重疊的2個礬土陶瓷制的圓盤30A、30b。圓盤30A、30b內部形成供試樣流通的流路，其中一個圓盤30b以其中心軸為旋轉中心旋轉，上述流路被分斷，以此定量試樣。此進樣閥30通過內部有試樣用流路32的流體盒33與上述制樣系統2b連為一體。即，進樣閥30、流體盒33和制樣系統2b互相緊密地配置，使之在熱度上成為一體，進樣閥30的溫度與制樣系統2b的溫度基本一致。與此相反，制樣系統2U則留有一定空隙S用螺釘35固定在固定于機殼上的安裝板34，因此，制樣系統2U處于與上述進樣閥30和制樣系統2b在熱度上基本隔離的狀態。
上述制樣系統2U和制樣系統2b分別由構成調溫系統的加熱器36U、36b加熱。以此將制備上述第一試樣的制樣系統2U的溫度調節為第一溫度，將制備上述第二試樣的制樣系統2b的溫度調節為比第一溫度略高的第二溫度。具體而言，制樣系統2U調為35±2℃，制樣系統2b調為比此略高的42±2℃。試樣溫度越高，該試樣所含紅細胞和細菌等所定部位(膜和核等)越能快速染色，從而縮短測定時間，但另一方面，紅細胞易因高溫受損，溫度過高，可能無法正確測定。因此，將用于測定比其他尿中粒子更耐熱的細菌的第二試樣的溫度調節得高于用于測定尿中粒子的第一試樣，換言之，通過將制樣系統2U和制樣系統2b分別調節到適于各自的測定溫度，即可精確地測定含紅細胞的尿中粒子和細菌。制樣系統2U和制樣系統2b的溫度比如可以用電熱調節器測定。然后根據此測定結果開關加熱器36U、36b，即可將制樣系統2U和制樣系統2b調節到上述所定范圍的溫度。
由于進樣閥30和制樣系統2b連為一體，熱度一樣，可以防止在進樣閥30調溫的試樣在運送到制樣系統2b時冷卻。如此可以減少調溫的浪費。此時，供應給溫度低于制樣系統2b的制樣系統2U的試樣由于從進樣閥30運送時試樣流路通過上述空隙S，可以使其自然下降。
下面按照圖9～10所示流程，說明使用本發明一實施方式的尿中粒子分析儀進行尿液分析的步驟。
首先，預先從主計算機中取得在該機中管理的標本號、與該標本號相關的患者的姓名、年齡、性別和門診科等患者信息以及測定項目等標本信息(步驟S1)。接著，通過個人電腦13的鍵盤和鼠標等輸入手段下達實施測定的指示(步驟S2)。根據這一指示，裝有試樣的試管T的樣品架3被樣品架臺4運送至所定的吸移位置(步驟S3)。在此吸移位置，上述試管T旋轉，讀取該試管T外面貼的ID標簽上的條形碼(步驟S4)。以此可知道試樣的標本號，通過與在步驟S1取得標本號的標本信息作比照，即可特定該試樣的測定項目。
然后，吸移管17下降，其前端插入試管T內的試樣中，在這種狀態下反復輕輕抽吐上述試樣，使試樣充分攪拌(步驟S5)。攪拌后，吸樣所定量(800μL)，用進樣閥30分別向制備測定至少含紅細胞的尿中粒子(SED)用試樣的制樣系統2U和制備測定尿中細菌(BAC)用試樣的制樣系統2b各以150μL和62.5μL頻率加樣(步驟S7和步驟S11)。
制樣系統2U中一定量染色液(染色劑)和稀釋液與上述試樣一道定量加入(步驟S8和步驟S9)。另一方面，制樣系統2b中也同樣，一定量染色液(染色劑)和稀釋液與上述試樣一道定量加入(步驟S12和步驟S13)。制樣系統2U和制樣系統2b分別用加熱器36U、36b加溫至一定溫度，在此狀態下用螺旋槳狀的攪拌器(無圖示)攪拌試樣(步驟S10和步驟S14)。另外，在步驟S9中加入制樣系統2U的稀釋液含有表面活性劑，可以破壞細菌膜，從而高效對細菌的核染色。
接下來，向光學檢測系統5的鞘液流動池51中加入鞘液(步驟S15)，然后，先將測定尿中粒子(SED)用試樣導入光學檢測系統5，在上述鞘液流動池51中形成被鞘液包裹的細流(鞘液流)(步驟S16)。再用半導體激光器53發出的激光束照射形成的鞘液流(步驟S17)。之所以先測定尿中粒子是因為細菌測定用試樣中含有表面活性劑，如果測定細菌后再測定尿中粒子，試樣攜帶會使表面活性劑混入尿中粒子測定用試樣，從而破壞含紅細胞的尿中粒子細胞膜，影響該尿中粒子的測定。
上述激光束照射產生的尿中粒子的前向散射光、熒光和側向散射光分別被光電二極管55、光電倍增管59和光電倍增管58采集并轉換為電信號，作為前向散射光信號(FSC)、熒光信號(FL)和側向散射光信號(SSC)輸出(步驟S18～20)。這些輸出信號通過前置放大器放大(步驟S21～23)。
另一方面，用測定尿中粒子(SED)用試樣測定結束后，繼續用在步驟S14制備的試樣測定尿中細菌。此時，用測定尿中粒子時使用的光學檢測系統5與上述步驟S15～23同樣操作，輸出前向散射光信號(FSC)和熒光信號(FL)并放大。
放大的上述前向散射光信號(FSC)、熒光信號(FL)和側向散射光信號(SSC)在上述信號處理電路10(參照圖6)被轉換為數字信號并施以一定的波形處理(步驟S24～27)，通過網卡12輸送到個人電腦13。另外，步驟S25中的“FLH”是用高增益放大熒光信號(FL)的高靈敏度物質，步驟S26的“FLL”是同樣熒光信號(FL)用低增益放大的低靈敏度物質。
個人電腦13匯總尿中粒子(SED)原始數據(步驟S28)，同時根據這些數據繪制散射圖(步驟S29)。再通過運算分析對散射圖進行分類(步驟S30)，統計每類各粒子的數量(步驟S31)。
關于細菌也同樣，放大的上述前向散射光信號(FSC)和熒光信號(FL)在上述信號處理電路10被轉換為數字信號并施以一定的波形處理(步驟S32～34)。步驟S32中的“FSCH”是用高增益放大前向散射光信號(FSC)的高靈敏度物質，步驟S33的“FSCL”是同樣前向散射光信號(FSC)用低增益放大的低靈敏度物質。
然后，通過網卡12輸送到個人電腦13。在個人電腦13算出細菌(BAC)的原始數據(步驟S35)同時根據這些數據繪出散射圖(步驟S36)。再通過計算分析對上述繪制的散射圖進行分類(步驟S37)，統計每類各粒子的數量(步驟S38)。如上得出的測定結果顯示在個人電腦13的顯示器熒光屏上(步驟S39)。
作為尿中粒子(SED)的測定結果，根據前向散射光、側向散射光和熒光各信號繪出散射圖。圖11A是以熒光強度(低靈敏度)(FLL)為橫軸、以前向散射光強度(FSC)為縱軸時的散射圖。熒光信號強度大的區域出現有核的大細胞--上皮細胞(EC)和白細胞(WBC)。大半上皮細胞比白細胞大，比白細胞出現在熒光強度大的區域，但小型上皮細胞也有的會出現在和白細胞交迭的區域。為了識別二者使用側向散射光信號。圖11b為以側向散射光強度(SSC)為橫軸、以前向散射光強度(FSC)為縱軸時的散射圖。上皮細胞出現在比白細胞側向散射光強度大的區域，因此從此散射圖可以識別上皮細胞。
圖11c為以熒光強度(高靈敏度)(FLH)為橫軸、以前向散射光強度(FSC)為縱軸時的散射圖，顯示熒光強度低的區域。紅細胞(RBC)無核，故分布于熒光強度弱的區域。結晶(X′TAL)有的出現在紅細胞出現的區域，因此使用側向散射光信號確認結晶的出現。圖11b為以側向散射光強度(SSC)為橫軸、以前向散射光強度(FSC)為縱軸時的散射圖。結晶不一定分布于側向散射光強度中心，也會出現在強度大的區域，因此通過此散射圖可以將其與紅細胞區分開。
圖11d是以熒光寬度(FLLW)為橫軸、以熒光寬度2(FLLW2)為縱軸時的散射圖。FLLW表示捕捉到細胞膜被染色的粒子的熒光信號寬度，FLLW2表示強度高于核的熒光信號的寬度。如圖所示，管型(CAST)的FLLW大，有內容物的管型(P.CAST)FLLW2大。無內容物的管型(CAST)出現在FLLW2低的區域。在此，信號的寬度指在以信號強度為縱軸、以時間為橫軸的脈沖形信號波形中反映測出光信號的時間長短。
另一個細菌測定結果是從前向散射光信號和熒光信號生成的散射圖。圖11e是以熒光強度(B-FLH)為橫軸、前向散射光信號強度(高靈敏度)(B-FSC)為縱軸的散射圖。在尿中粒子測定中如圖11c所示，細菌的出現區域與粘液絲(MUCUS)、酵母樣真菌(YLC)和精子(SPERM)的出現區域重疊。但在細菌測定中由于細菌測定試劑將粘液絲和紅細胞碎片等雜質收縮，顯示的區域內只有細菌獨立出現，同時比在尿中粒子測定時靈敏度提高了大約10倍，因此，小型細菌也能精確地檢測出來，從而能夠提出正確的細菌檢測報告。
在本實施例中，細菌是單獨測定的，由此可阻止起因于細菌自動分類裝置中的可信度低(細菌由大到小個頭不一，且分布無規則可循，因此畫面上會和其他白細胞和紅細胞等成份混淆，從而難以正確區分成份)的情況。而且，在判斷是否需要指示用顯微鏡復檢(Review)時，在發出復檢指令時，能夠附以測定結果可信度低的理由。
圖11e顯示了細菌(BACT)的標準出現區域，但實際出現區域因細菌而異。圖13是球菌大量連鎖型出現的標本的測定例。該散射圖中，細菌(BACT)出現的區域以對橫軸(熒光強度)約呈45度分布。即，細菌(BACT)出現在前向散射光強度(FSC)高的區域。在這種標本中，測定尿中粒子(SED)時細菌廣泛出現，一直到紅細胞出現區域中的前向散射光強度(FSC)低的區域都有細菌出現。對于這種標本，紅細胞測定的可信度較低。另一方面，圖12是含桿菌的標本的測定例。在此散射圖中，細菌(BACT)出現區域以對橫軸(熒光強度)呈低角度(約5～10度)分布。即，細菌(BACT)出現在前向散射光強度(FSC)低的區域。這種標本即使含大量桿菌，細菌出現的區域是比紅細胞出現區域前向散射光強度(FSC)低的區域，紅細胞的測定不會受細菌的影響。同樣，在尿中粒子(SED)測定中細菌對白細胞(WBC)出現區域的影響也可以從細菌測定(BAC)中的細菌分布確認。這種根據細菌分布傾向判斷有無影響其他粒子測定結果工作通過個人電腦13(分析器)中的計算分析進行，該判斷結果在上述步驟S39中與其他結果一起顯示在屏幕上。
如此從細菌測定(BAC)獲得細菌分布信息，以此推斷細菌在尿中粒子(SED)測定中的出現區域，即可確認其他粒子測定的可信度。因此，根據細菌測定(BAC)的分布可以判斷是否需要指示用顯微鏡復檢(Review)，可以減少假陽性判斷，下達適宜的復檢指令。還可以減少由于無法進行可信度高的區分而作出復檢判斷的次數。
本實施方式當尿中的細菌濃度超過5×103個/mL時，即可測定該尿液中的細菌。具體而言，將測定時間設長一些、多設定測定試樣的量，即可測定5×103個/mL這種低濃度的細菌。由于尿中細菌濃度超過5×103個/mL時即可測定該尿液細菌，因此，可以根據尿檢中求得的敏感度測定細菌。
如上所示，本發明一個實施方式的尿中粒子分析儀U從尿液標本和染色劑混合而成的測定試樣中采集2種散射光(前向散射光和側向散向光)和熒光，再根據這些前向散射光、側向散向光和熒光測定尿中白細胞。如此，通過分別使用三種不同的信息(前向散射光強度、側向散向光強度和熒光強度)可以對白細胞進行精確分類。
在尿中粒子分析儀U中，附屬電腦13是分析從尿液各粒子測得的數據進行測定的測定系統。電腦13還具備以下功能作為第一特定系統根據上述前向散射光和上述熒光信號，劃定尿中白細胞和上皮細胞的出現區域；作為第二特定系統，根據上述前向散射光和上述側向散射光劃定尿中白細胞和上皮細胞的出現區域。以此即可根據上述第一特定系統劃定的結果和上述第二特定系統劃定的結果高精度地區分白細胞和上皮細胞。
尿中粒子分析儀U在一個尿液標本可以混合第一染色劑和第二染色劑制備試樣，通過上述第一測定系統測定至少含白細胞的尿中粒子，通過上述第二測定系統測定細菌。因此，用一個分析儀器即可高精度地分別測定至少含白細胞的尿中粒子和細菌。
尿中粒子分析儀U還具備將尿液標本分為第一等分和第二等分的標本分配器。以此分別制備用于測定至少含白細胞的尿中粒子的第一試樣和用于測定細菌的第二試樣，用上述第一試樣測定至少含白細胞的尿中粒子，用上述第二試樣測定細菌。因此，可以更精確地測定尿中粒子和細菌。且，第一試樣和第二試樣共用一個光學檢測系統，能夠簡化儀器結構，降低產品成本，并實現儀器的小型化。
前述的詳細說明及附圖是通過文字解釋和圖示來進行的，其目的不在于限定權利要求的保護范圍。本說明書中的具體實施方式
的各個變種對于普通技術人員來說顯而易見，并處于權利要求及其等同技術的保護范圍內。
本實施方式檢測在照射測定試樣的激光光束的光軸延長線附近散射的光作為前向散射光。將對于照射測定試樣的激光光束的光軸略呈直角地散射的散射光作為側向散射光檢測。但是本發明中的前向散射光和側向散射光并非嚴格限定于上述方向散射的散射光。在上述實施方式中，前向散射光強度是作為反映粒子(尿中有形成份)大小的信息使用的，只要能達到此目的，稍微偏離上述光軸延長線某種程度散射的散射光也可以作為前向散射光使用。另外，在上述實施方式中，側向散射光強度是作為反映粒子內容的信息使用的，只要能達到此目的，某種程度偏離對上述光軸略呈直角方向散射的散射光也可以作為側向散射光使用。
前向散射光和側向散射光的性質不一定要限定于上述說明的內容。比如側向散射光強度不僅可以反映粒子的內容，有時也能反映粒子的大小和粒子表面狀態。因此，本實施方式雖然在細菌測定(BAC)中使用前向散射光和熒光，也可以用側向散射光代替上述前向散射光。
本實施方式在測定粒子時繪制散點圖。但散點圖也可以不繪制。尿中粒子分析儀U繪制的散點圖是以從尿中各種粒子相對應的信號數據中抽取的數個參數為座標軸繪制的分布圖。這是作為算法分析的一種手法繪制的，它具有用戶可以親眼確認測定結果的優點。但是，只要用各粒子對應的信號數據進行分析，不繪制散點圖也可以對粒子進行分類和計數。只要決定各粒子相應的信號數據在什么范圍內該粒子應歸類于哪種粒子即可。在本說明書中，不管是否繪制散點圖，均將從各粒子所得數據分布的范圍稱為出現區域。
在本實施方式的尿中粒子分析儀U中，分析數據用電腦13與尿中粒子分析儀U主機的機殼是分開的，但也可以將這些都物理性地連為一體。
權利要求
1.一種尿中粒子分析儀，包括用尿液標本和染色劑制備測定試樣的制樣系統；光學檢測系統，其包括照射上述所制測定試樣的光源、檢測該試樣產生的前向散射光的前向散射光采集器、檢測該試樣產生的側向散射光的側向散射光采集器和檢測該試樣產生的熒光的熒光采集器；以及根據上述光學檢測系統檢測出的前向散射光、側向散射光和熒光測定尿中白細胞的測定系統。
2.如權利要求1所述的尿中粒子分析儀，其中所述測定系統根據所述前向散射光和所述熒光對尿中白細胞和上皮細胞進行第一分析，根據所述前向散射光和所述側向散射光對尿中白細胞和上皮細胞進行第二分析；及所述測定系統根據上述第一分析結果和上述第二分析結果區分白細胞和上皮細胞。
3.如權利要求2所述的尿中粒子分析儀，其中所述測定系統進一步包括在上述第一分析中劃定尿中白細胞和上皮細胞出現區域的第一特定系統；以及在第二分析中劃定尿中白細胞和上皮細胞出現區域的第二特定系統。
4.如權利要求1-3中任意一項所述的尿中粒子分析儀，其中，所述測定系統測定尿中上皮細胞。
5.如權利要求1-3中任意一項所述的尿中粒子分析儀，其中，所述測定系統測定尿中紅細胞。
6.如權利要求1-3中任意一項所述的尿中粒子分析儀，其中，所述測定系統測定尿中細菌。
7.如權利要求1-3中任意一項所述的尿中粒子分析儀，其中，所述制樣系統將第一染色劑和第二染色劑添加進所述尿液標本中制備所述測定試樣；所述測定系統具有根據所述光學檢測系統檢測出來的前向散射光、側向散射光和熒光測定至少含白細胞的尿中粒子的第一測定系統；根據所述光學檢測系統檢測出來的前向散射光和側向散射光之一及熒光測定尿中細菌的第二測定系統。
8.如權利要求7所述的尿中粒子分析儀，其中所述制樣系統具有將尿液標本分配為第一等分和第二等分的標本分配器；所述制樣系統還具有在上述第一等分混入第一染色劑制備第一試樣的第一制樣系統和在上述第二等分混入第二染色劑制備第二試樣的第二制樣系統；所述第一測定系統根據上述光學檢測系統從上述第一測定試樣檢測到的前向散射光、側向散射光和熒光測定上述至少含白細胞的尿中粒子；及所述第二測定系統根據上述光學檢測系統從上述第二測定試樣檢測到的前向散射光和側向散射光之一及熒光測定上述尿中細菌。
9.如權利要求8所述的尿中粒子分析儀，其中，所述第二制樣系統在所述第二等分中混入表面活性劑制備所述第二測定試樣。
10.如權利要求9所述的尿中粒子分析儀，其中進一步包括將上述制樣系統所制測定試樣提供給上述光學檢測系統的供樣系統，其中上述供樣系統向上述光學檢測系統供應所述第一測定試樣后，向上述光學檢測系統供應所述第二測定試樣。
11.一種尿中粒子分析方法，包括a)混合尿液標本和染色劑，制備測定試樣；b)用光束照射上述制備的測定試樣，檢測該試樣產生的前向散射光、側向散射光和熒光；以及c)根據上述檢測出的前向散射光、側向散射光和熒光，測定尿液中的白細胞。
12.如權利要求11所述的尿中粒子分析方法，其中，所述步驟c)包含以下步驟根據所述前向散射光和所述熒光對尿中白細胞和上皮細胞進行第一分析的第一分析步驟；根據所述前向散射光和所述側向散射光對尿中白細胞和上皮細胞進行第二分析的第二分析步驟；及根據上述第一分析步驟的分析結果和上述第二分析步驟的分析結果區分白細胞和上皮細胞的區分步驟。
13.如權利要求12所述的尿中粒子分析方法，其中上述第一分析步驟包含劃定尿中白細胞和上皮細胞出現區域的第一特定步驟；及上述第二分析步驟包含劃定尿中白細胞和上皮細胞出現區域的第二特定步驟。
14.如權利要求11-13所述的尿中粒子分析方法，其中所述步驟c)包含測定尿中上皮細胞的步驟。
15.如權利要求11-13所述的尿中粒子分析方法，其中所述步驟c)包含測定尿中紅細胞的步驟。
16.如權利要求11-13所述的尿中粒子分析方法，其中所述步驟c)包含測定尿中細菌的步驟。
17.如權利要求11-13所述的尿中粒子分析方法，其中所述步驟a)包含在所述尿液標本加入第一染色劑和第二染色制備所述測定試樣的步驟；所述步驟c)包括根據在所述步驟b)檢測出的前向散射光、側向散射光和熒光測定至少含白細胞的尿中粒子的第一測定步驟，以及根據在所述步驟b)檢測出的前向散射光和側向散射光之一及熒光測定尿中細菌的第二測定步驟。
18.如權利要求17所述的尿中粒子分析方法，其中所述步驟a)包含將所述尿液標本分配為第一等分和第二等分的標本分配步驟；所述步驟a)還包含在上述第一等分加入第一染色劑混合制備第一試樣的第一制樣步驟和在上述第二等分加入第二染色劑混合制備第二試樣的第二制樣步驟；所述步驟b)還包括從所述第一測定試樣檢測前向散射光、側向散射光和熒光的第一檢測步驟和從所述第二測定試樣檢測前向散射光和側向散射光之一以及熒光的第二檢測步驟；所述第一測定步驟含根據在上述第一檢測步驟從所述第一測定試樣檢測出的前向散射光、側向散射光和熒光測定上述至少含白細胞的尿中粒子的步驟；及所述第二測定步驟含根據在上述第二檢測步驟從所述第二測定試樣檢測出的前向散射光和側向散射光之一及熒光測定尿中細菌的步驟。
19.如權利要求18所述的尿中粒子分析方法，其中在所述第二制樣步驟向所述第二等分中添加表面活性劑。
20.如權利要求19所述的尿中粒子分析方法，其中所述第一檢測步驟在所述第二檢測步驟之前進行。
全文摘要
本發明涉及一種包含以下結構的尿中粒子分析儀用尿液標本和染色劑制備測定試樣的制樣系統；光學檢測系統，包括照射上述所制測定試樣的光源、檢測該試樣產生的前向散射光的前向散射光采集器、檢測該試樣產生的側向散射光的側向散射光采集器和檢測該試樣產生的熒光的熒光采集器；以及根據上述光學檢測系統檢測出的前向散射光、側向散射光和熒光測定尿中白細胞的測定系統。同時，本發明還提供一種尿中粒子分析方法，包括如下步驟a)混合尿液標本和染色劑，制備測定試樣；b)用光束照射上述制備的測定試樣，檢測該試樣產生的前向散射光、側向散射光和熒光；以及c)根據上述檢測出的前向散射光、側向散射光和熒光，測定尿液中的白細胞。
文檔編號G01N21/84GK101074914SQ20071010209
公開日2007年11月21日 申請日期2007年5月17日 優先權日2006年5月18日
發明者田中庸介, 內藤貴道, 小篠正繼, 高田瑠美 申請人:希森美康株式會社
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
