專利名稱：C3a及其衍生物作為結腸直腸腺瘤/或結腸直腸癌的生物標志的用途；使用同樣生物標志 ...的制作方法
技術領域：
本發明涉及檢測結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的領域。
在世界范圍內，結腸直腸癌是第三大常見(9.4％)的癌。在2003年內，全世界診斷出了將近945000個新的結腸直腸癌病例并且大約492000個人死于該疾病。結腸直腸癌的發病率在增加而結腸直腸癌的死亡率在降低。結腸直腸癌的發病率隨著年齡增加，開始于大約40歲，并且男性的發病率比女性高(每年每100000人中，男性為40.6而女性為30.6)(世界癌癥報告(World cancer report)，2003，Ed.BW.Stewart和P.Kleihues.IARC Press，Lyon)。
在大多數患者中，結腸直腸癌的發展經歷了多級進展，從癌變前的腺瘤到具有轉移傾向的侵染性惡性腫瘤。有證據表明，降低結腸直腸癌的發病率和死亡率可以通過檢測和治療早期結腸直腸癌以及鑒定并除去作為結腸直腸癌前體的結腸直腸腺瘤性息肉來實現。
目前已經表明只有侵入性結腸直腸篩選測試如結腸鏡檢查法能夠實現對早期結腸直腸癌及其前體(即腺瘤性息肉和/或扁平的瘤區域)的檢測。多種測試可作為用于結腸直腸癌篩選的選擇。該篩選測試包括糞便潛血試驗(FOBT)、軟乙狀結腸鏡檢查法、FOBT和軟乙狀結腸鏡檢查與結腸鏡檢查法的組合。各種篩選測試在施行、效力、可能的篩選頻率、測試復雜性、成本和患者的接受上是不同的。
在成本-效力方面，現在認為用糞便潛血試驗篩選是最好的篩選方法。通過血紅素卟啉(hemeporphyrin)或免疫方法，用化學劑如愈創樹脂檢測糞便中的潛血。獲自SmithKline Diagnostics的愈創樹脂載玻片測試潛血檢測試紙(Hemoccult)(II)使用最廣泛。
多種技術因素影響了它的臨床施行。對于結腸直腸癌，潛血檢測試紙具有大約50％的靈敏度以及98％的特異性，但是其對于息肉的靈敏度卻很低，大約為10％(Simon JB.(1998)Gastroenterologist 666-78.Review)。潛血篩選的另一個大缺點是預測的精確性很差，只有10％的陽性反應證明是由于結腸直腸癌(Simon JB.(1998)Gastroenterologist 666-78.Review；Mandel JS等人(1999)J.Natl.Cancer Inst.91434-437；Hardcastle JD等人(1996)Lancet 3481472-1477；Kronborg O等人(1996)Lancet3481467-71；Winawer SJ等人(1997)Gastroenterology 112594-642；Fletcher RH(1998)N.Engl.J.Med.3381153-1154)。
此外，糞便潛血檢測實驗只有在疾病發展到某些階段后才能提供結果。希望有允許在更早的時間檢測結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的測試系統。
最近開發的免疫測試通常具有高靈敏度，但是其較差的特異性仍是嚴要的問題。其他方法如對糞便樣品KRAS癌基因和p53蛋白質的遺傳測試還不是成本有效的，并且靈敏度低(Calistri D等人(2003)Clin.Gastroenterol.Hepatol.1377-383；Schoen RE(2002)Nat.Rev.Cancer265-70)。
內窺鏡檢查法(Kavanagh AM(1998)Cancer Causes Control9455-462)(使用軟乙狀結腸鏡或結腸鏡)(Lieberman DA(1997)Gastroenterol.Clin.N.Am.2671-83)是最確定的檢測方法，但是具有局限性。
已認識到對于扁平瘤病變的假陰性率，并且其保持較高(Kudo S(1997)Gastrointest.Endosc.Clin.N.Am.787-98.)。結腸鏡檢查法允許對直徑為至少10mm的息肉狀病變進行結腸檢查，具有低的假陰性率。因為此原因，在陰性評估或息肉切除后至復查前可有相對較長的間隔，其中陰性評估后間隔高達10年，息肉切除后間隔高達5年。
但是，在結腸鏡檢查后聽從此類復查建議的患者很少。此外，結腸鏡檢查昂貴而麻煩?？紤]到普遍檢查的高成本和人們對結腸鏡檢查的接受性，此類檢查方法具有有限的應用。
通過多種方法可以對收集的分離組織樣品進行結腸直腸癌檢測并對其前體，結腸直腸腺瘤進行測試。DE 197 11 111A公開了體外確定上皮內結腸細菌、其成分及反應產物的方法。使用組織樣品中HERG基因表達的另一種方法公開在DE 102 24 534中。
血液樣品中CEA-(癌胚抗原)-水平已經用來檢測結腸癌。但是CEA水平并非在結腸癌中特異性升高，已經表明其還在患有其他惡性疾病(例如胃、胰、乳房和肺的癌)以及患有多種非惡性病癥(例如酒精肝疾病、炎性腸疾病、嚴重煙癮、慢性支氣管炎和胰腺炎)的患者中升高。(PosnerMR，Mayer RJThe use of serologic tumor markers in gastro intestinalmalignancies.Hematol Oncol Clin North Am 8533，1994)。此外，在結腸腺瘤中CEA水平不升高。
本發明的目的是提供可用于結腸腺瘤和/或結腸癌早期檢測的方法。
另一個目的是提供通過非侵入方法，可用于選擇性和特異性檢測結腸腺瘤和/或結腸癌的方法。
另一個目的是提供可用于結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌檢測中的生物標志。
本發明的另一個目的是提供成本有效并可廣泛使用的檢測結腸直腸腺瘤或結腸直腸癌的測試系統。
此外，該測試系統應當是易于操作的，并且對于待檢測結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的個體來說是更加方便的。
本發明另一個的目的是提供用于確定化合物在治療結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌中是否有效的篩選系統。
本發明的主要目的是通過使用C3a或其衍生物作為在個體中檢測結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的生物標志來解決的。檢測可以在體內和體外進行。根據優選的實施方案，檢測在體外進行。
該目的另外通過檢測結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的方法來解決，其包括下列步驟a)提供取自個體的分離的樣品材料，b)確定所述分離的樣品材料中C3a或其衍生物的水平，
c)比較確定的C3a或其衍生物的水平和一個或多個參考值。
該目的另外通過區分結腸直腸腺瘤和結腸直腸癌的方法來解決，其包括下列步驟a)提供取自個體的分離的樣品材料，b)確定所述分離的樣品材料中C3a或其衍生物的水平，c)比較確定的C3a或其衍生物的水平和一個或多個參考值。
該目的另外通過監控結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的發展和/或過程和/或治療的方法來解決，其包括下列步驟a)提供取自個體的分離的樣品材料，b)確定所述分離的樣品材料中C3a或其衍生物的水平，c)比較確定的C3a或其衍生物的水平和一個或多個參考值。
在優選的實施方案中，調控手術或治療方法的效力來決定是否完全除去結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌。在另一個實施方案中，調控用一種或多種化學物質、抗體、反義RNA、輻射例如X射線，或其組合對結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌患者的治療，從而調控治療的效力。
該目的也可通過提供用于在個體樣品中檢測結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的測試系統來解決，該測試系統包括a)結合到C3a或其衍生物的表位的抗體或受體，b)支持所述的抗體或受體的固相支持物，c)檢測所述C3a或其衍生物的表位與所述抗體或受體的結合的試劑。
該目的另外通過提供陣列來解決，所述陣列包含用于在個體中檢測結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的檢測分子，該解決方法包含下列作為檢測分子a)固定到固相支持物上的核酸探針，所述核酸探針用于結合和檢測編碼C3a或其衍生物的mRNA，和/或結合和檢測C3a蛋白質或其衍生物，或b)固定到固相支持物上用于結合和檢測C3a或其衍生物表位的抗體，或c)固定到固相支持物上用于結合和檢測C3a或其衍生物表位的受體，其中每種不同量的檢測分子優選固定到固相支持物上，以增加量化的精確性。
核酸探針例如選自單鏈或雙鏈DNA或RNA、適配體及其組合。適配體是單鏈的寡核苷酸，其采取了特異性的、序列依賴的形狀，并且高特異性和親和性的結合蛋白質靶標。使用SELEX方法鑒定適配體(Tuerk C.和Gold L.(1990)Science 249505-510；Ellington AD和Szostak JW.(1990)Nature 346818-822)。
該目的另外通過確定化合物在治療結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌中是否有效的方法來解決，其包括下列步驟a)用化合物治療結腸直腸腺瘤或結腸直腸癌，b)在所述患者的樣品材料中確定C3a或其衍生物的水平，并且c)比較確定的C3a或其衍生物的水平和一個或多個參考值。
優選的實施方案在從屬權利要求中詳細說明。
根據本發明，術語“樣品材料”也稱作“樣品”。
根據本發明，術語“生物標志”意指結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌發病的蛋白質或蛋白質片段或核酸。這意指“生物標志”用作檢測結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的方法。
術語“個體”意指哺乳動物。優選的，哺乳動物是例如作為患者的人。
術語“健康個體”意指未患結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的個體。那就是說，術語“健康個體”僅用在結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的病理情況方面，但是不排除患有除結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌之外的其他疾病的個體。
術語“其衍生物”意指在DNA、mRNA或蛋白質水平上的任何修飾，包括例如截短的基因、所述基因的片段、突變的基因或修飾的基因。術語“基因”包括核酸序列，如DNA、RNA、mRNA或者蛋白質序列或寡肽序列或肽序列。衍生物可以是作為基因缺失、置換或插入的結果的修飾?；蛐揎椏梢允翘烊淮嬖诘幕蜃儺惖慕Y果。術語“天然存在的基因變異”是指不是基因工程結果的修飾?；蛐揎椏梢允亲鳛榧庸んw內和/或降解產物中基因或基因產物的結果。蛋白質水平的修飾可以是由于體內的酶促修飾或化學修飾。例如修飾可以是糖基化或磷酸化或法尼基化。優選的，衍生物編碼或包括未修飾蛋白質的至少5個氨基酸、更優選包括10個氨基酸，最優選包括20個氨基酸。在一個實施方案中，衍生物編碼各自蛋白質的至少一個表位。
本發明中所使用的術語“C3a或其衍生物”還包括截短的C3a、C3a的片段、突變的C3a、修飾的C3a或前體C3(
圖1，SEQ ID No.1)或C3的片段。在一個實施方案中，衍生物和序列SEQ-ID-No.2(圖2A，SEQ IDNo.2)的蛋白質序列同一性為80％、優選為90％，更優選為98％。“C3a”的修飾可以是酶促修飾或化學修飾。具體地，術語C3a或其衍生物特別包括截短的C3a蛋白質，其優選具有范圍在8,950±25Da內的分子量，更優選具有范圍在8,950±20Da內的分子量。在優選的實施方案中，截短的C3a蛋白質具有8,939Da的分子量。優選的，C3a蛋白質沒有C端精氨酸并且其任選具有范圍在8,950±20Da內的分子量。在一個實施方案中，C3a衍生物是C3a-desArg(圖2B，SEQ ID No.3)。在一個實施方案中，C3a衍生物是通過肥大細胞-類胰凝乳蛋白酶切割C3a得到的。在另一個實施方案中，C3a是通過C3轉變酶切割C3得到的。
C3a屬于過敏毒素類。C3a、C4a和C5a是補體系統的絲氨酸蛋白酶的蛋白水解產物。C3a(SEQ-ID-No.2)衍生自補體激活過程中血液補體系統的第三個成分(C3)(SEQ-ID-NO.1)。C3a是具有局部效力的激素。C3a中大約40％的氨基酸殘基包括在螺旋構象中。血清過敏毒素參與多種細胞免疫應答，并且是有效的促炎劑。C3a產物有效作用于血管壁、平滑肌的收縮和血管通透性的增加上。C3a中的C端精氨酸對其生物活性非常重要。過敏毒素受到在幾秒內移除羧基端精氨酸的羧基肽酶N(過敏毒素滅活劑)的調控。此機制將完整的過敏毒素轉變為活性較低的C3a-desArg形式(SEQ ID No.3)。
術語“表位”意指允許抗體、抗體片段、蛋白質、肽結構或者受體特異性結合于蛋白質或肽的任何結構元件，或者任何蛋白質結構。
本發明的方法用樣品材料如已經從人體分離的體液或組織樣品來進行。隨后將樣品材料分級分離和/或純化。例如，可以將待測樣品材料儲存在冷凍設備中，并且在適當的時間點解凍各個樣品材料后進行本發明的方法。
本發明人驚訝的發現蛋白質C3a或其衍生物可用作檢測結腸直腸腺瘤/或結腸直腸癌的生物標志。發明人現在已經驚訝的發現體液中蛋白質C3a或其衍生物的水平在患有結腸直腸腺瘤/或結腸直腸癌的個體中升高。此外，體液中蛋白質C3a或其衍生物水平可以用來將健康人從患有結腸直腸腺瘤/或結腸直腸癌的人中區分出來，并且將患有結腸直腸腺瘤的人從患有結腸直腸癌的人中區分出來。
根據本發明，樣品材料可以是組織、細胞或體液。優選的樣品材料是體液，例如血液、血漿、血清、骨髓、糞便、滑液、淋巴液、腦脊液、唾液、尿、母乳、精液、溢沁物及其混合物。在優選的實施方案中，體液用陰離子交換層析分級分離。例如C3a蛋白質在pH9.0下洗脫。例如運甲狀腺素蛋白(p13,776)在pH 4.0下洗脫。
優選的，體液在進行本發明的方法前已經分離。本發明的方法優選是由實驗室技術人員在體外進行。
根據本發明優選的實施方案，C3a在血漿或血清中測量。可以通過從待醫學檢查的個體中取得血液，并且從凝固血中分離上清液來容易的得到血清。
體液(優選是血清)中C3a或其衍生物的水平隨著結腸直腸腺瘤的漸進形成而更高。結腸直腸腺瘤是可以變成惡性的良性腫瘤。當從良性結腸直腸腺瘤發展為結腸直腸癌時，體液(優選是血清)中C3a或其衍生物的水平進一步升高。
在結腸直腸腺瘤轉化成結腸直腸癌后，患病個體的病理情況會通過轉移的形成而進一步惡化。
本發明提供了可用于檢測在早期并且仍處于良性期的瘤疾病、早期或良性期和/或腫瘤早期的瘤疾病的早期生物標志。早期檢測能夠使醫生及時移除結腸直腸腺瘤并且顯著增加個體存活的幾率。
此外，本發明可用于長時期(例如幾年)監測體液如血清中C3a或其衍生物的水平。
長期監示可用于區分健康個體和結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌?？梢猿Ｒ?如一年一次或兩次)檢測C3a或其衍生物的水平。如果檢測到了C3a或其衍生物水平增加，這就指示了結腸直腸腺瘤和/或早期結腸直腸癌。之后C3a或其衍生物水平的進一步增加指示轉化為惡性結腸直腸癌。
此外，可以監測疾病和/或治療的過程。如果C3a或其衍生物的水平進一步增加，例如在移除結腸直腸腺瘤后，即這指示了病理情況的惡化。
這意味著C3a或其衍生物的水平是檢測和/或監測結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的重要的臨床參數。在結腸直腸腺瘤發病后體液中的C3a或其衍生物的水平就升高。因此，C3a或其衍生物水平是可用于疾病的早期診斷以及隨后的早期治療的重要的臨床參數。在優選的實施方案中，具有升高的C3a或其衍生物水平的患者隨后用結腸鏡檢查法來檢查。
用于檢測結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的本發明方法包括以下步驟提供取自個體的分離的樣品材料，之后確定在分離的樣品材料中C3a或其衍生物的水平，并且最終比較確定的C3a或其衍生物的水平和一個或多個參考值。在一個實施方案中，可以在取自個體的分離的樣品材料中另外檢測一個或多個其他的生物標志，確定生物標志的水平并將其和一個或多個不同的參考值對比。
參考值可計算為在健康個體或患有結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的個體的多個分離的樣品中確定的C3a或其衍生物的平均水平?？梢詫⒃搮⒖贾翟O立為認為是健康個體，或患有結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌個體的標準值的范圍。然后，范圍內的特定值可以指示健康情況或結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的病理情況?？梢园凑战⑷魏纹渌t學參數如血糖范圍的方法，通過取得健康個體體液樣品(如血清樣品)的統計相關數來建立參考值的這個范圍。優選的，計算出稱作陰性對照和陽性對照1的2個參考值。陰性對照的參考值從健康個體中計算出來，并且陽性對照的參考值從患有結腸直腸腺瘤或結腸直腸癌的個體中計算出來。更優選的，計算出稱作陰性對照、陽性對照1和陽性對照2的三個參考值。陽性對照1可以從患有結腸直腸癌的個體中計算出來，并且陽性對照2可以從患有結腸直腸腺瘤的個體中計算出來。
在本發明的另一個實施方案中，參考值可以是個體參考值，所述個體參考值計算為一定時期內，取自個體的多個分離的樣品中所確定的C3a或其衍生物的平均水平。
當長時期(如幾月或幾年)監控C3a或其衍生物水平時，可以建立個體平均水平。例如可以從與測量血糖相同的血清樣品中測量C3a或其衍生物的水平，并且使用它來建立用于特異性檢測任何個體C3a或其衍生物水平增加的個體校準曲線。
其他生物標志的參考值也可以按照為C3a所描述的同樣的方式計算。C3a或其他生物標志的平均水平可以是平均數水平或中值水平。
在本發明的另一方面，還提供了檢測個體的分離的樣品材料中結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的測試系統。此測試系統是基于抗體或受體特異性結合到C3a或其衍生物或其片段的表位或適當的結構元件的特異性。受體可以是能特異性結合到C3a或其衍生物的任何結構。受體可以是，例如抗體片段如Fab或F(ab’)2片段，或能夠特異性結合到C3a或其衍生物的任何其他蛋白質或肽結構。
將抗體、抗體片段或受體結合到固相支持物如塑料表面或小珠上，以允許結合和檢測C3a或其衍生物。例如，常規微量滴定板可以用作塑料表面。例如通過使用可檢測基團標記的二級抗體來實現對C3a或其衍生物結合的檢測?？蓹z測基團可以是例如放射性同位素，或者通過添加適當的底物以產生例如顏色或熒光信號來檢測的酶，如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。
測試系統可以是免疫測定，如酶聯免疫吸附測定(ELISA)或放射免疫測定(RIA)或發光免疫測定(LIA)。但是也可以使用任何其他的使用抗體或抗體片段特異性的免疫測試系統，如Western印跡或免疫沉淀法。
本發明還提供了包含用于檢測個體中結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的檢測分子的陣列，其中檢測分子可以是固定到固相支持物的核酸探針，所述核酸探針用于結合和檢測編碼C3a、片段、突變、變體或其衍生物的mRNA，或固定到固相支持物用于結合和檢測C3a或其衍生物表位的抗體，或者固定到固相支持物用于結合和檢測C3a或其衍生物表位的受體。優選的，陣列另外包括作為檢測結腸直腸腺瘤和結腸直腸癌的生物標志的檢測分子。
核酸探針可以是任何天然存在或合成的寡核苷酸或化學修飾的寡核苷酸，以及cDNA、cRNA、適配體等。
備選的，本發明還包括逆陣列，其包含固定到固相支持物上的患者樣品，所述患者樣品可以被上述定義的檢測分子檢測。
優選的，陣列包含固定到固相表面可識別的位置上的檢測分子。
本發明所用的術語“陣列”指的是組合或排列，而不必是規律的排列。陣列優選包含至少2套、更優選包含5套不同的檢測分子或患者樣品。優選的，本發明的陣列至少包含50套檢測分子或患者樣品，更優選包含至少100套檢測分子或患者樣品。根據本發明的另一個實施方案，本發明的陣列至少包含500套檢測分子或患者樣品。檢測分子可以是例如核酸探針或抗體或受體。
描述的陣列可以用于本發明的測試系統。陣列可以是微陣列或巨陣列。
將檢測分子固定到固相表面或支持體或固相支持物表面。然后通過雜交從患者樣品制備的核酸探針，或者通過將陣列與從患者樣品制備的蛋白質探針接觸，來篩選此陣列或微陣列。
支持體可以是聚合材料如尼龍或塑料或者無機材料如硅，例如硅片或陶瓷。根據優選的實施方案，玻璃(SiO2)可用作固相支持物材料。玻璃可以是玻璃載玻片或玻璃芯片。根據本發明的另一個實施方案，玻璃底物具有原子平面。
例如，陣列可以包含能特異性結合到C3a或其衍生物的mRNA的固定的核酸探針，或者特異性結合存在于體液(如血清)中的C3a蛋白質或其衍生物的抗體。另一個優選的實施方案是通過編碼C3a的mRNA或編碼C3a衍生物的mRNA的逆轉錄來產生cDNA，并且用所述的陣列特異性檢測各自cDNA的量。該陣列技術是技術人員已知的。可以通過對比所測量的值與已知量的C3a或其衍生物的mRNA或cDNA或蛋白質的標準曲線或校準曲線，分別量化所測量的mRNA或cDNA或蛋白質。
優選的，將每種不同量的檢測分子固定在固相支持物上，以用于對C3a或其衍生物水平的精確量化。
根據本發明的另一個實施方案，通過質譜分析來確定C3a或其衍生物的水平。
根據C3a或其衍生物的分子量，質譜分析可用于特異性的檢測C3a或其衍生物，并且非常容易的量化C3a或其衍生物的量。
本領域已知的質譜分析中的任何適當的離子化方法可以用來離子化C3a或其衍生物分子、片段、突變、變體或其衍生物。離子化方法包括電子碰撞(EI)、化學電離(CI)、場致離子化(FDI)、電噴射離子化(ESI)、激光解吸離子化(LDI)、基質輔助激光解吸離子化(MALDI)和表面增強激光解吸/電離(SELDI)。
本領域已知的質譜分析中的任何適當檢測方法可以用來確定C3a或其衍生物的分子量。檢測方法包括四級質譜分析(QMS)、傅里葉變換質譜分析(FT-MS)和飛行時間質譜分析(TOF-MS)。
優選的，質譜分析是表面增強激光解吸電離-飛行時間-質譜分析(SELDI-TOF-MS)。在進行SELDI-TOF-MS之前，優選將分離的樣品中的C3a或其衍生物固定到具有活化表面的芯片或固相支持物上。活化表面優選包括固定的抗C3a或其衍生物的抗體，如兔多克隆抗體。在C3a或其衍生物結合到抗體上后，在SELDI-TOF質譜儀中進行飛行時間分析，它給出了用于確定C3a或其衍生物水平的強度信號。
此外，質譜分析可用于同時檢測與結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌檢測相關的其他蛋白質。
在本發明的實施方案中，可以通過另外檢測其他生物標志來增強結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌檢測的靈敏度和/或特異性。具體地，在一個實施方案中，通過檢測另一個蛋白質或核酸與C3a或其衍生物的組合來增強結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌檢測的靈敏度和/或特異性。
優選的，通過檢測C3a及其衍生物與運甲狀腺素蛋白及其衍生物的組合來增加本發明方法、陣列、測試系統和用途的靈敏度和特異性。
本發明所用的術語“運甲狀腺素蛋白或其衍生物”還包括截短的運甲狀腺素蛋白、運甲狀腺素蛋白的片段、突變的運甲狀腺素蛋白或修飾的運甲狀腺素蛋白。“運甲狀腺素蛋白”的修飾可以是由于酶促修飾或化學修飾。此外，術語“運甲狀腺素蛋白”還用來表示運甲狀腺素蛋白的單體形式或多聚體形式。例如，術語“運甲狀腺素蛋白”特別包涵通常作為同型四聚體蛋白質運甲狀腺素蛋白的一部分的單體蛋白質鏈。
運甲狀腺素蛋白還可以稱作前白蛋白。運甲狀腺素蛋白是分子量為大約54,000Da，主要在肝臟中合成的四聚體蛋白質。運甲狀腺素蛋白通常是包含了四條蛋白質鏈(每條具有分子量為大約14,000Da)的同型四聚體。使用質譜分析，發明人已經檢測出了具有分子量為13,776Da、13,884Da或14,103Da等的運甲狀腺素蛋白蛋白質鏈的多個變體。發明人已經發現，在結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌發病的情況下，體液(如血清)中具有分子量為13,776Da和13,884Da的運甲狀腺素蛋白分子變體的水平尤其降低。
在本發明的另一實施方案中，通過另外檢測p53、CEA(癌胚抗原)和/或CA 19-9、CA15-3、Kras、突變的E-鈣黏著蛋白、β-聯蛋白或其衍生物與C3a或其衍生物的組合來增強結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌檢測的靈敏度和/或特異性。
在本發明另一實施方案中，通過另外檢測在DNA錯配基因(例如MSH2、MSH3、MLH1、PMS1、PMS2、MSH6)中的突變、例如MHL1或MSH2之類的微衛星不穩定性、SNP(單核苷酸多態性)或C-反應蛋白血漿濃度來增強檢測結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的靈敏度和/或特異性。
在本發明的另一實施方案中，通過檢測CA15-3、CA-125和/或Her-2/neu與C3a或其衍生物的組合來任選增強結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌檢測的靈敏度和/或特異性。CA15-3是癌胚抗原，在多種癌中表達，并且通常及其他腫瘤標記一起測量。CA 15-3和CA-125主要是乳腺癌(但是也有內臟轉移)的前兆指示物。乳腺癌中的Her-2/neu的擴增與不良預后、短的無瘤間隔和短的存活時間相關。至今，關于Her-2/neu的擴增起始點和進展知之甚少。
在優選的實施方案中，通過生物標志C3a與運甲狀腺素蛋白或其衍生物組合來檢測結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌。這可以使得結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的檢測具有增加的靈敏度和/或特異性。此外，由于檢測方法是非侵入性的，患者很好的接受該檢測方法。
按照下列定義靈敏度和特異性靈敏度是真正陽性患者的數量(％)相對于所有患者數量(100％)?；颊呤蔷哂薪Y腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的個體。
特異性是真正陰性個體的數量(％)相對于所有健康個體的數量(100％)。
備選的，靈敏度和特異性可以按照下列公式定義診斷+ -測試+ TPFP- FNTNTP真正陽性(測試陽性，診斷正確)；FP假陽性(測試陽性，診斷不正確)；TN真正陰性(測試陰性，診斷正確)；
FN假陰性(測試陰性，診斷不正確)；靈敏度按照下列公式計算TP/(TP+FN)而特異性按照下列公式計算TN/(TN+FP)對選自健康個體、結腸直腸腺瘤患者和/或結腸直腸癌患者的多個分離的樣品，計算選自TP、FP、TN、FN的每個分析組的結果。TP、FP、TN、FN涉及分別與真正陽性、假陽性、真正陰性、假陰性狀況相關的個體的數量。
本發明的方法可以和檢測結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的其他診斷方法組合進行，以整體增加靈敏度和/或特異性。C3a的檢測可用于結腸直腸腺瘤的極早期檢測并且可以因此用作極早期標記。
優選的，本發明的方法作為早期檢測和/或監測方法進行。如果本發明方法的結果要指示結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸腺瘤的發病，那么應當進行其他的檢查，如結腸鏡檢查。
當進行本發明時，可以使用下列多克隆抗運甲狀腺素蛋白抗體和C3a抗體·抗運甲狀腺素蛋白來自The Binding Site Ltd.，Birmingham，英格蘭的PC 066和來自DAKO，Hamburg，德國的A 0002。
·抗C3a-desArg可用于Quidel immunoassay(Quidel Corporation，10165 McKellar Court，San Diego，CA 92121，美國)。
本發明還提供了確定化合物在治療結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌中是否有效的方法。
用于確定化合物在治療結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌中是否有效的方法包括下列步驟a)用化合物治療結腸直腸腺瘤或結腸直腸癌，b)確定所述患者的樣品材料中C3a或其衍生物的水平，
c)比較確定的C3a或其衍生物的水平和一個或多個參考值。
本申請所用術語“患者”包括人以及非人類，如動物。動物優選選自嚙齒動物，例如小鼠、大鼠、倉鼠，以及其他動物如豚鼠、兔、野兔、狗和豬。
為了研究目的，這些動物可用以特異性誘導某些疾病狀態，所述疾病例如結腸直腸腺瘤和結腸直腸癌。所述疾病狀態的誘導可例如通過處理動物(例如用已知的放射性物質或化學物質來誘導結腸直腸癌或結腸直腸腺瘤疾病狀態)來實現。疾病狀態還可以使用病毒轉染系統來誘導。還可以使用遺傳修飾的動物(其中的一個或多個特定的基因功能被改變)，或敲除動物如基因敲除小鼠(其中缺失了特定的基因功能)。
“化合物”可以是一個或多個化學物質、抗體、蛋白質、肽、反義mRNA、小分子藥物或其組合?；衔镞€可以被輻射例如X射線所替代，或者可以使用化合物和輻射的組合。
可以通過上面描述的檢測技術確定在所述患者的樣品材料中，C3a或其衍生物的水平。
下列附圖和實施例僅用于說明目的。本發明不解釋為受到下列實施例的限制。
附1顯示了C3蛋白質的序列。
圖2顯示了(A)C3a蛋白質序列和(B)C3a-desArg蛋白質序列。
圖3顯示了血清樣品的分級分離和分布的示意圖。
圖4顯示了使用ELISA對C3a-desArg的量化。將來自非癌(n＝28)、腺瘤(n＝28)和結腸直腸癌患者(n＝28)的血清樣品在Quidel C3a EnzymeImmunoassay中平行測定。(A＝腺瘤組、N＝健康對照組、T＝癌組)圖5顯示了通過A)ELISA和B)SELDI-TOF MS對C3a-desArg的分析。在腺瘤和癌組中的平均C3a-desAg濃度顯著高于非癌對照組。(A＝腺瘤組、N＝健康對照組、T＝癌組)圖6顯示了通過A)徑向免疫擴散和B)SELDI-TOF MS分析對運甲狀腺素蛋白的量化。腺瘤和癌組中的平均運甲狀腺素蛋白的濃度顯著低于非癌對照組。此外，按照徑向免疫擴散所測量的，在癌組中平均運甲狀腺素蛋白的濃度顯著低于腺瘤組。(A＝腺瘤組、N＝健康對照組、T＝癌組)圖7顯示了SELDI-TOF MS和免疫測定數據的相關性。用ELISA分析C3a-desArg(A)，用徑向免疫擴散分析運甲狀腺素蛋白(B)。
實施例除非另外說明，所有方法按照分析系統廠商的方法進行。
血清收集和血清分級分離收集和研究了來自三組人類患者的血清。
組1由28位患者組成，他們是手術治療了非癌疾病，如腹股溝疝、膽囊結石或憩室炎的患者。組1的這些個體作為健康個體組，即未有患結腸直腸腺瘤和/結腸直腸癌的那些。
組2由28位患者組成，他們都是手術治療了不確定腫瘤(經證實是良性結腸直腸腺瘤)的患者。
組3由28位患者組成，他們是具有結腸直腸腫瘤的患者。所有的這28位患者患有TNM III期(腫瘤(T)、結節(N)、轉移(M)III期)結腸直腸癌。
已經嚴格確定了道德方針和患者的機密性，并且所有的患者書面同意參與此研究。所有患者進行了相似的手術前準備，如禁食時間和手術時用藥。
根據廠商說明，通過陰離子交換層析(血清分級分離試劑盒/QHyperD樹脂，Ciphergen Biosystems，Inc.)，使用96孔形式的自動化方法(Biomek2000，Ciphergen)分級分離來自每個患者的血清，以減少最豐富蛋白質的一些干涉。如在圖3所示，分級分離產生了6個級分，其含有基于蛋白質pI值的粗糙分離蛋白質。C3A-desArg蛋白質(p8,960Da)在pH9.0洗滌溶液(具有0,1％OGP(辛基-β-D-吡喃葡糖苷)的50 mMTris-HCl，pH 9.0)下隨級分1洗脫下來(根據Ciphergen Biosystems Inc.expression difference mapping kit-serum fractionation cat.no K100-0007所定義的條件)。運甲狀腺素蛋白(p13,776)在pH4.0(具有0.1％OGP的100mM乙酸鈉，pH 4.0)下隨著級分4洗脫下來(根據CiphergenBiosystems Inc.expression difference mapping Kit-serum fractionation cat.no K100-0007所定義的條件)。
SELDI-TOF-MS分析根據廠商的方案，將CM10蛋白質陣列在生物處理器(CiphergenBiosystems，Inc.)中處理。用CM10結合緩沖液(Ciphergen Biosystems，Inc.)將芯片平衡2×5分鐘，隨后用血清級分(在CM10結合緩沖液中1∶10稀釋)溫育芯片。45分鐘后移除未結合的材料，將芯片用CM10結合緩沖液洗滌3次并用水洗滌2次。在室溫下干燥10分鐘后，2次加入0.05M的芥子酸(1.0μl)并且用Ciphergen Protein ChipReader(模型PBSII)分析芯片。
Protein ChipReader是飛行時間質譜儀。將所檢測蛋白質的質量值和信號強度轉移到Ciphergen提供的軟件中。所述軟件通過ProteinChipData Analysis Program和Biomarker Wizard Program進一步深入分析。
為了使數據變異性最小化，在2天內，使用隨機分布在芯片上的來自所有患者組的樣品進行測量。作為標準化的標準對照，集中的正常血清用作于所有測量的平行。
通過使用激光強度為185的195個激光噴射的均數，產生蛋白質的質譜。探測器在靈敏度為7下運行。為了獲得數據，設定檢測大小范圍是2,000Da和40,000Da。將激光聚焦在10,000Da。用ProteinChip Data AnalysisProgram(版本3.1，Ciphergen Biosystems)及Biomarker Wizard Program(版本3.1，Ciphergen Biosystems)分析數據。將峰強度標準化為總離子電流。應當注意的是，在測量和測量之間所測量的分子量可以不同，并且它可以取決于所使用的質譜儀器的特定性質。C3desArg所測量的分子量可以在8,950±25Da的范圍內。
C3a ELISA分析為了量化血清中C3a-desArg片段，使用Quidel的酶免疫測定(QuidelCorporation，10165 McKellar Court，San Diego，CA 92121，美國)。根據廠商的說明進行ELISA。
試劑盒中包含的微量滴定帶用對人C3a-desArg特異性的單克隆抗體(包括在Quidel的免疫測定中)包被。1∶500稀釋樣品并且在18-25℃下溫育一小時。在此溫育過程中，樣品中的C3a-desArg將結合到單克隆抗體上。沖洗去未結合的天然C3后，使用過氧化物酶綴合的兔抗C3a檢測結合的C3a-desArg。通過洗滌步驟將過度的綴合移除，并且使用過氧化物酶反應和標準曲線量化血清樣品中C3a-desArg的量。
用于量化運甲狀腺素蛋白的徑向免疫擴散在臨床服務實驗室中進行徑向免疫擴散測定(Tina-QuantPrealbumin assay，Immunoturbidometric assay for the determination ofprealbumin，Roche diagnostics GmbH，Mannheim，德國，目錄號11660519)。將血清加到在凝膠基質中切出的含有均一濃度單特異性抗體的圓拄孔中。置于孔中的抗原徑向擴散，產生了沉淀素環。可以在過夜溫育后的任何時間或終點數出沉淀素環。通過對比樣品產生的沉淀素環和已知濃度的標準品產生的沉淀素環的直徑，測定結果。
數據的統計計算對于三個患者組，通過C&RT(CART)算法，在決策樹分析的基礎上計算出臨界值(Breiman，L.，Friedman，J.H.，Olshen，R.A.，& Stone，C.J.(1984).Classification and regression trees.Monterey，CAWadsworth &Brooks/Cole Advanced Books & Software)。已經計算出了臨界值以選擇和確定不同分析組之間的限制值(limiting value)。用STATSOFT INC的STATISTICA軟件，版本7.1進行計算，用Data-Miner Modulsubprogramm Standard Classification Trees(CAndRT)(StatSoft，Inc.(2005).STATISTICA(數據分析軟件系統)，版本7.1.www.statsoft.com)進行決策樹分析。
在平均值和標準差的基礎上計算統計數據。另外，附圖顯示了平均值±95的置信區間，說明在此區間中有95％的可能性找到預測患者的真正平均值。用T檢驗進行統計計算。在p值p＜0,05時，認為檢驗是顯著的。盒狀圖的觸須線表示標準差。
實施例1在此實驗中，按照上述描述，通過ELISA(Quidel C3a酶免疫測定)和SELDI-TOF MS分析平行鑒定了來自非癌患者(組1，n＝28位患者)血清與來自結腸直腸腺瘤(組2，n＝28位患者)和結腸直腸癌(組3，n＝28位患者)患者的血清之間C3a-desArg的表達。
實施例2用同樣的患者群，按照上述描述，通過徑向免疫擴散和通過SELDI-TOF MS分析量化運甲狀腺素蛋白的表達。
結果和統計計算如圖4所示，三組間C3a-desArg[ng/ml]的濃度強度顯著不同。從健康個體到結腸直腸腺瘤患者到結腸直腸癌患者，C3a-desArg水平增加。
表1顯示了在84個血清樣品中，C3a-desArg[ng/ml]和運甲狀腺素蛋白[g/l]的血清水平分布，使用 SELDI-TOF MS和免疫測定(C3a-desArg-ELISA、運甲狀腺素蛋白免疫擴散)確認。測定了每組中的28個血清樣品。
表1
和非癌對照組相比，在腺瘤和癌患者中ELISA所測量的C3a-desArg的血清濃度明顯更高(圖5A)。根據這些數據，可以從癌患者中區分健康個體。此外，區分健康個體和腺瘤患者也是可能的。該結果和SELDI-TOFMS分析得到的數據(圖5B)非常類似。在圖7中，顯示了兩種方法(SELDI-TOF MS和ELISA)的散點圖，證明了每位患者SELDI-TOF MS所測量的p8,960的強度和ELISA所測量的C3a-desArg的濃度之間有較好的相關性(圖7A；r＝0,7)，并且在每位患者的SELDI-TOF MS所測量的p13,776的強度和ELISA所測量的運甲狀腺素蛋白的濃度之間有較好的相關性(圖7B，r＝0.81)。這表明結果不依賴于分析方法。
通過SELDI-TOF MS分析產生運甲狀腺素蛋白數據(圖6B)并且用徑向免疫擴散確定了此數據(圖6A)。在具有結腸直腸癌患者中，運甲狀腺素蛋白顯著低于非癌患者。此外，腺瘤患者血清中運甲狀腺素蛋白的濃度也顯著低于正常血清。
表2顯示了分別用SELDI-TOF MS和ELISA測量的C3a-desArg的靈敏度和特異性的比較，其用來區分健康對照和腺瘤/腫瘤患者。
表2C3a-desArg(健康對照對比腺瘤+腫瘤患者)
表3顯示了分別用SELDI-TOF MS和徑向免疫擴散測量的運甲狀腺素蛋白的靈敏度和特異性的比較，其用來區分健康對照和腺瘤/腫瘤患者。
表3運甲狀腺素蛋白(健康對照對比腺瘤+腫瘤患者)
表4顯示了兩種生物標志(C3a-desArg/運甲狀腺素蛋白)組合的靈敏度和特異性的比較。通過免疫測定測量C3a-desArg和運甲狀腺素蛋白來區分健康對照和腺瘤/腫瘤患者。括號中顯示了運甲狀腺素蛋白(TTR)和C3a-desArg的臨界值。
表4C3a-desArg和運甲狀腺素蛋白的組合(健康對照對比腺瘤+腫瘤患者)
表5顯示了C3a-desArg作為單獨生物標志的靈敏度和特異性。用ELISA測量C3a-desArg的水平來區分健康對照和腺瘤和/或腫瘤患者。在括號中顯示了臨界值。
表5C3a-desArg
表6顯示了運甲狀腺素蛋白作為單獨生物標志的靈敏度和特異性。用徑向免疫擴散測量運甲狀腺素蛋白的水平來區分健康對照和腺瘤和/或腫瘤患者。在括號中顯示了臨界值。
表6運甲狀腺素蛋白
表7顯示了C3a-desArg和運甲狀腺素蛋白(TTR)組合的靈敏度和特異性。運甲狀腺素蛋白和C3a-desArg的水平分別用ELISA和徑向免疫擴散來測量。在括號中顯示了臨界值。
表7運甲狀腺素蛋白(TTR)和C3a-desArg的組合
這些數據顯示了C3a(任選與運甲狀腺素蛋白組合)是用于檢測結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的優秀生物標志。與已知的生物標志CEA和CA 19-9相比，它可以區分健康個體和腺瘤患者。C3a測試的靈敏度和特異性很高，可用于腺瘤的早期特異性檢測且不用結腸鏡檢查。具體的，生物標志C3a和運甲狀腺素蛋白的組合可用于檢測腺瘤，具有極好的靈敏度和較高的特異性。
權利要求
1.一種檢測結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的方法，其包括以下步驟a)提供取自個體的分離的樣品材料，b)確定所述分離的樣品材料中C3a或其衍生物的水平，c)比較確定的C3a或其衍生物的水平和一個或多個參考值。
2.一種區分結腸直腸腺瘤和結腸直腸癌的方法，其包括以下步驟a)提供取自個體的分離的樣品材料，b)確定所述分離的樣品材料中C3a或其衍生物的水平，c)比較確定的C3a或其衍生物的水平和一個或多個參考值。
3.一種監測結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的發展和/或過程和/或治療的方法，其包括以下步驟a)提供取自個體的分離的樣品材料，b)確定所述分離樣品材料中C3a或其衍生物的水平，c)比較確定的C3a或其衍生物的水平和一個或多個參考值。
4.根據權利要求1到3中任一項的方法，其中與健康個體的樣品材料相比，所述取自結腸直腸腺瘤或結腸直腸癌患者的樣品材料中的C3a或其衍生物的水平較高。
5.根據權利要求1到4中任一項的方法，其中在第一樣品材料中C3a或其衍生物水平的第一次增加指示了結腸直腸腺瘤，并且其中在第二樣品材料中C3a或其衍生物水平的第二次增加指示了結腸直腸癌，所述第二樣品材料在所述第一樣品材料之后的時間點分離自所述個體，條件是所述的第二次增加大于所述的第一次增加。
6.根據權利要求1到5中任一項的方法，其中步驟(b)中，在所述分離的樣品材料中測定用于檢測結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的一個或多個其他生物標志，并且其中在步驟(c)中，確定的所述生物標志的水平與一個或多個各自的參考值比較。
7.根據權利要求1到6中任一項的方法，其中至少一種用于檢測結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的其他生物標志任選選自運甲狀腺素蛋白、p53、CEA、CA 19-9、CA 15-3、CA-125、Kras、β-聯蛋白、Her-2/neu、C-反應蛋白血漿濃度及其衍生物，以及E-鈣黏著蛋白、MSH2、MSH3、MLH1、PMS1、PMS2、MSH6基因中的突變，以及MHL1或MSH2的微衛星不穩定性，以及SNP及其組合。
8.根據權利要求1到7中任一項的方法，其中C3a和/或其衍生物的參考值以及任選的其他生物標志和/或其衍生物的參考值計算為各個個體組的多個分離樣品中C3a和/或其衍生物，以及任選的其他生物標志和/或其衍生物的平均水平，其中個體組是健康個體、結腸直腸腺瘤患者和/或結腸直腸癌患者。
9.根據權利要求1到7中任一項的方法，其中參考值是個體參考值，所述個體參考值計算為一定時期內，取自所述個體的多個分離的樣品材料中所確定的C3a和/或其衍生物以及任選其他生物標志和/或其衍生物的平均水平。
10.根據前述權利要求中任一項的方法，其中分離的樣品材料是體液并且任選選自血液、血漿、血清、骨髓、糞便、滑液、淋巴液、腦脊液、唾液、尿、母乳、精液、溢沁物及其混合物。
11.根據前述權利要求中任一項的方法，其中在DNA、mRNA和/或蛋白質水平上確定所述的樣品材料中C3a和/或其衍生物，以及任選其他生物標志的水平。
12.根據前述權利要求中任一項的方法，其中通過核酸雜交技術、免疫方法或蛋白質組技術，和/或質譜分析確定所述的樣品材料中C3a和/或其衍生物以及任選的其他生物標志的水平。
13.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述方法及其他結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的診斷方法組合進行以增加靈敏度和/或特異性。
14.C3a或其衍生物作為檢測個體或個體的分離的樣品中結腸直腸腺瘤和/或結腸癌的生物標志的用途。
15.根據權利要求14的用途，其用于在個體分離的樣品中早期檢測結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌。
16.根據權利要求14或15中任一項的用途，其與一個或多個其他結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的生物標志組合以增加靈敏度和/或特異性。
17.根據權利要求16的用途，其中至少一種其他生物標志任選選自運甲狀腺素蛋白、p53、CEA、CA19-9、CA15-3、CA-125、Kras、β-聯蛋白、Her-2/neu、C-反應蛋白血漿濃度及其衍生物，以及E-鈣黏著蛋白、MSH2、MSH3、MLH1、PMS1、PMS2、MSH6基因中的突變，以及MHL1或MSH2的微衛星不穩定性，以及SNP及其組合。
18.檢測個體的分離的樣品材料中結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的測試系統，其包括a)結合C3a或其衍生物表位的抗體或受體，b)支持所述的抗體或受體的固相支持物c)檢測所述C3a或其衍生物表位與所述抗體或受體結合的試劑。
19.根據權利要求18的測試系統，其中所述的測試系統包含用于檢測結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的一個或多個其他生物標志的一個或多個抗體或受體。
20.根據權利要求19的測試系統，其中至少一種其他生物標志任選選自運甲狀腺素蛋白、p53、CEA、CA 19-9、CA 15-3、CA-125、Kras、β-聯蛋白、Her-2/neu、C-反應蛋白血漿濃度及其衍生物，以及E-鈣黏著蛋白、MSH2、MSH3、MLH1、PMS1、PMS2、MSH6基因中的突變，以及MHL1或MSH2的微衛星不穩定性，以及SNP及其組合。
21.一種包含用于在個體中檢測結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的檢測分子的陣列，其包含下列檢測分子a)固定到固相支持物上的核酸探針，所述核酸探針用于結合和檢測編碼C3a或其衍生物的mRNA，或b)固定到固相支持物上的抗體，所述抗體用于結合和檢測C3a或其衍生物的表位，或c)固定到固相支持物上的受體，所述受體用于結合和檢測C3a或其衍生物的表位，其中每種不同量的檢測分子優選固定到固相支持物上以增加量化的精確性。
22.根據權利要求21的陣列，其中所述的測試系統包含用于檢測結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的一個或多個其他生物標志的一個或多個抗體或受體。
23.根據權利要求22的陣列，其中至少一種其他生物標志任選選自運甲狀腺素蛋白、p53、CEA、CA 19-9、CA 15-3、CA-125、Kras、β-聯蛋白、Her-2/neu、C-反應蛋白血漿濃度及其衍生物，以及E-鈣黏著蛋白、MSH2、MSH3、MLH1、PMS1、PMS2、MSH6基因中的突變，以及MHL1或MSH2的微衛星不穩定性，以及SNP及其組合。
24.一種確定化合物在治療結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌中是否有效的方法，其包括以下步驟a)用化合物治療結腸直腸腺瘤或結腸直腸癌患者，b)確定所述患者的樣品材料中C3a或其衍生物的水平，以及c)比較確定的C3a或其衍生物的水平和一個或多個參考值。
25.根據權利要求24的方法，其中在步驟b)中確定其他生物標志的水平，并在步驟c)中與一個或多個各自的參考值比較。
26.根據權利要求25的方法，其中至少一種其他生物標志任選選自運甲狀腺素蛋白、p53、CEA、CA 19-9、CA 15-3、CA-125、Kras、β-聯蛋白、Her-2/neu、C-反應蛋白血漿濃度及其衍生物，以及E-鈣黏著蛋白、MSH2、MSH3、MLH1、PMS1、PMS2、MSH6基因中的突變，以及MHL1或MSH2的微衛星不穩定性，以及SNP及其組合。
全文摘要
本發明涉及檢測結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的方法，其包括以下步驟a)提供取自個體的分離的樣品材料，b)確定在所述的分離的樣品材料中C3a或其衍生物的水平，c)比較確定的C3a或其衍生物的水平和一個或多個參考值。本發明還涉及區分結腸直腸腺瘤和結腸直腸癌的方法；以及監測結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的過程，和/或結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的治療的方法。此外，本發明涉及用于這些方法中的測試系統和陣列。此外，本發明涉及C3a作為檢測個體中結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌的生物標志的用途。另外，本發明涉及確定化合物在治療結腸直腸腺瘤和/或結腸直腸癌中是否有效的方法。
文檔編號G01N33/574GK101014861SQ200580027602
公開日2007年8月8日 申請日期2005年8月11日 優先權日2004年8月13日
發明者H·尤爾, K·戴維, A-K·芬茨 申請人:因迪維姆德有限公司
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
