專利名稱：缺血修飾白蛋白液體穩定試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫學檢驗測定技術領域，具體涉及一種缺血修飾白蛋白液體穩定試劑
品.O
背景技術：
急性冠狀動脈綜合征(Acute coronary syndromes，ACS)有不同的臨床表現，但均有一個相同的病理生理過程，即動脈粥樣硬化斑塊脫落、血小板聚集和血栓形成，導致冠狀動脈狹窄、阻塞，而引起心肌缺血，如果心肌缺血時間延長會導致心肌細胞壞死和心肌損傷。因此，在心肌壞死之前鑒別出心肌缺血，盡早明確診斷和開始治療對于病人是至關重要的。當前心臟缺血的診斷多依賴于心電圖的ST段和T波的改變，這是心肌缺血最簡便、 最迅速和最廉價的檢查方法，但心梗的病人也可多表現為心電圖未見異常，其靈敏度低于 50%。單光子發射計算機成像顯示的急性心肌灌注異常和超聲心動圖顯示的室壁運動異常是診斷心肌缺血較好的指標，這兩種方法都有很高的敏感性、特異性和陰性預測值，但在實際工作中不能隨時檢查且費用高昂，如果不與以前的檢查結果對比則很難識別新出現的缺血區。目前，臨床應用的心肌缺血標志物中，肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、肌紅蛋白等在心臟受損壞時能從心肌細胞釋放入血，但這些酶也存在于骨骼肌，骨骼肌損傷時這些酶也會釋放入血，故特異性差。心肌肌鈣蛋白I或T具有高特異性，但其在心臟損傷發生6-12 h之后才能從血中檢測出，且對心肌細胞損傷的特異性高，對可逆的心肌缺血多為陰性。因此，為能盡早診斷ACS，需要一種能早期檢測且靈敏度和特異性較高的心肌缺血標志物。人血清白蛋白(HSA)是一種循環蛋白，其氨基酸末端序列為人類所特有，能與金屬鈷、銅和鎳等離子結合，在缺血/再灌注發生時，由于自由基等破壞了血清白蛋白的氨基酸序列，而導致白蛋白與過渡金屬的結合能力改變，這種因缺血而發生與過渡金屬結合能力改變的白蛋白稱為缺血修飾白蛋白(Ischemia Modified Albumin，IMA)。IMA在心肌缺血后數分鐘內即迅速升高，是心肌缺血發生后到發生細胞壞死之前的一個非常早期的指標。研究顯示，IMA在心肌可逆的心肌缺血階段血中濃度即迅速升高，可早期并靈敏的反應心肌缺血狀況，將心肌缺血的診斷窗由原來的缺血發生4-6 h提前到5-10 min0早在1990年，1名急診醫生就發現心肌缺血發作時HSA的化學性質可能會發生改變，并發現HSA和過渡金屬元素如鈷、銅和鎳有很強的結合能力；1997年局部缺血技術公司 (Ischemia Technologies,Denver, Colorado, USA)投入資金對IMA標志物進行商業開發， 生產出適合臨床自動化檢測的試劑盒。2000年美國多中心臨床試驗顯示在診斷ACS時IMA 比心電圖 ECG、cTnl 敏感；2001 年 ACB 試驗通過 IS09001、IS013485, EN46001 認可。2003 年2月美國FDA批準可上市銷售，這是FDA自1994年批準肌鈣蛋白的測定試驗后，首次批準的一個用來評價心肌缺血的生化試驗項目。由于IMA極高的陰性預測值，美國FDA將其推薦為ACS的排除指標，在美國此項檢測己列入醫療報銷范圍。IMA的檢測方法有超濾法、液相色譜法、質譜測定法、核磁共振法、ELISA方法等，均因檢測成本較高或干擾因素多，不適合臨床常規使用。目前，IMA的測定主要是采用白蛋白結合鈷試驗(ACB試驗)，其反應原理如下血清中HSA與Co2+結合后剩余的游離Co2+與有機顯色物反應生成紅褐色產物，在510 nm的波長下比色，其吸光度與Co2+濃度成正比，與標準品進行比較，即可計算出樣本中IMA的濃度。David Bar-Or等最早建立了手工分光光度法，方便簡易，適合基層單位使用，報告單位為吸光度單位(absorbance imit，ABSU)。此種手工方法試劑，國內沒有供應，可用于半自動生化分析儀檢測。第二代ACB試驗為全自動分光光度法。結果可用U/ml或KU/L表示。其基本原理同樣為ACB試驗。美國Ischemia Technologies ^W] (2007 Inverness Medical Professional Diagnostics ^1 ) 該方法最早開發出IMA測定試劑盒，美國食品與藥品管理局(FDA)于2003年批準認證。目前該試劑盒可應用于包括羅氏的 COBAS MIRAePlus, COBAS INTEGRA 700/800, Hitachi 917 及 Roche/Hitachi Modular P，貝克曼庫爾特的 Beckman Coulter Synchron LX 20 等多種儀器，但價格昂貴，而且為干粉試劑，復溶后有效期僅為2個星期。由于IMA測定采用二硫蘇糖醇為顯色劑，其水溶液冷藏或冷凍保存穩定時間相對較短，此外由于二硫蘇糖醇能與樣本中的其他重金屬螯合影響測定的準確性，因此嚴重影響了該試劑的大規模臨床應用。
發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供一種準確度、精密度均較好，穩定性好，2 8°C 避光保存至少可穩定12個月，完全能滿足臨床檢驗要求缺血修飾白蛋白液體穩定試劑盒。為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案為一種缺血修飾白蛋白液體穩定試劑盒，該試劑盒為由試劑1和試劑2組成的液體型雙試劑，其中
試劑1各組分及濃度為
緩沖液(pH 7. 5-8. 5)0. 05 0. 5 M (mol/L)
氯化鈷20 200 mg/L
去干擾劑0. Γ10 g/L
穩定劑0. Γ10 g/L
防腐劑0. ΓΙΟ g/L ；
試劑2各組分及濃度為
緩沖液(pH 7. 0-8. 0)0. 5 10 M
二硫蘇糖醇0. 5 50 g/L
穩定劑0. Γ10 g/L
防腐劑0. ΓΙΟ g/L。本發明上述試劑1中的緩沖液為三羥甲基氨基甲烷緩沖液、3-三羥甲基甲胺-2-羥基丙磺酸緩沖液、4-羥乙基哌嗪丙磺酸緩沖液等中的一種，優選4-羥乙基哌嗪丙磺酸緩沖液。本發明上述試劑1中的去干擾劑為氟化鈉、檸檬酸、半胱氨酸、氨基乙酸等中的一種或幾種(即兩種及以上的混合，當兩種以上的混合時，各組分之間配比關系沒有要求)。本發明上述試劑2中的緩沖液為檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液、咪唑緩沖液、醋酸-醋酸鈉緩沖液等中的一種，優選咪唑緩沖液。本發明的穩定劑為吐溫20、吐溫80、布里杰-35 (Bri j_;35)、曲拉通100 (曲拉通X-100)等非離子表面活性劑中的一種。本發明的防腐劑為疊氮鈉或proclin系列防腐劑(如Proclin300)等。本發明試劑1和試劑2的配制方法為常規方法，即按照上述配方比例，分別將試劑 1和試劑2所述的各組分按照配方比例分別加入蒸餾水后各自混合攪勻即可。本發明試劑盒測定樣本中的IMA的測試條件如下溫度30-37 °C ；比色杯光徑為 1.0 cm。檢測主波長510 nm，副波長700 nm。應用本發明IMA測定試劑盒測定樣本中IMA的方法如下樣品(校準管以校準品做樣品)加試劑1混勻，30-37°C孵育3-5 min后讀取吸光度A0，立即加入試劑2混勻，30-37°C 反應5 min后，讀取吸光度Al，ΔΑ = A1-A0。其中樣本用量30 μ ，試劑1用量200 μ ，試劑2用量100 μ 。
本發明試劑盒測定樣本中IMA含量按以下公式進行計算
權利要求
1.一種缺血修飾白蛋白液體穩定試劑盒，其特征在于該試劑盒為由試劑1和試劑2 組成的液體型雙試劑，其中試劑1各組分及濃度為緩沖液(pH 7. 5-8. 5)0. 05 0. 5 M氯化鈷20 200 mg/L去干擾劑0. Γ10 g/L穩定劑0. ΓΙΟ g/L防腐劑0. ΓΙΟ g/L ；試劑2各組分及濃度為緩沖液(pH 7. 0-8. 0)0. 5 10 M二硫蘇糖醇0. 5 50 g/L穩定劑0. Γ10 g/L防腐劑0. ΓΙΟ g/L。
2.根據權利要求1所述的缺血修飾白蛋白液體穩定試劑盒，其特征在于試劑1中所述的緩沖液為三羥甲基氨基甲烷緩沖液、3-三羥甲基甲胺-2-羥基丙磺酸緩沖液、4-羥乙基哌嗪丙磺酸緩沖液中的一種。
3.根據權利要求2所述的缺血修飾白蛋白液體穩定試劑盒，其特征在于試劑1中所述的緩沖液為4-羥乙基哌嗪丙磺酸緩沖液。
4.根據權利要求1所述的缺血修飾白蛋白液體穩定試劑盒，其特征在于試劑1中所述的去干擾劑為氟化鈉、檸檬酸、半胱氨酸、氨基乙酸中的一種或幾種。
5.根據權利要求1所述的缺血修飾白蛋白液體穩定試劑盒，其特征在于試劑2中的緩沖液為檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液、咪唑緩沖液、醋酸-醋酸鈉緩沖液中的一種。
6.根據權利要求5所述的缺血修飾白蛋白液體穩定試劑盒，其特征在于試劑2中的緩沖液為咪唑緩沖液。
7.根據權利要求1所述的缺血修飾白蛋白液體穩定試劑盒，其特征在于所述的穩定劑為吐溫20、吐溫80、布里杰-35、曲拉通100中的一種。
8.根據權利要求1所述的缺血修飾白蛋白液體穩定試劑盒，其特征在于所述的防腐劑為疊氮鈉或proclin系列防腐劑。
全文摘要
本發明公開一種缺血修飾白蛋白液體穩定試劑盒，該試劑盒為由試劑1和試劑2組成的液體型雙試劑，其中試劑1為緩沖液(pH7.5-8.5)0.05~0.5M，氯化鈷20~200mg/L，去干擾劑0.1~10g/L，穩定劑0.1~10g/L，防腐劑0.1~10g/L；試劑2為緩沖液(pH7.0-8.0)0.5~10M，二硫蘇糖醇0.5~50g/L，穩定劑0.1~10g/L，防腐劑 0.1~10g/L。本發明的的試劑盒具有準確度、精密度均較好，穩定性好，2～8℃避光保存至少可穩定12個月，完全能滿足臨床檢驗要求的優點。
文檔編號G01N33/52GK102507916SQ20111034726
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月7日 優先權日2011年11月7日
發明者沃燕波, 鄒炳德 申請人:寧波美康生物科技股份有限公司
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