国产自产21区,亚洲97,免费毛片网,国产啪视频,青青青国产在线观看,国产毛片一区二区三区精品

專利名稱：測定血斑中血漿銅藍(lán)蛋白濃度的方法及肝豆?fàn)詈俗冃圆『Y選試劑盒和診斷試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測量全血漿銅藍(lán)蛋白(holoceruloplasmin)濃度的方法，特別涉及使用全血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體和全血漿銅藍(lán)蛋白特異性單克隆抗體，利用通過酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)或解離強(qiáng)化的時(shí)間分辨熒光免疫測定法(dissociation-enhanced time-resolved fluoroimmunoassy)得到的標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線，測定全血漿銅藍(lán)蛋白濃度的方法。
背景技術(shù)：
測定全血漿銅藍(lán)蛋白濃度的方法，對Wilson病的診斷有非常重要的作用。
Wilson病又稱肝豆?fàn)詈俗冃圆?Wilson′s disease)，1912年第一次被報(bào)道，是現(xiàn)今全世界以25,000-30,000名中1名的頻率發(fā)生的一種常染色體隱性疾病，其遺傳攜帶率為90/1，是較為常見的遺傳疾病之一。對銅代謝過程引起障礙的Wilson病伴有通過膽管的銅排泄減少、銅吸收于血漿銅藍(lán)蛋白中有異常等特點(diǎn)。因銅膽管排泄的障礙，銅沉積于肝、腦、角膜、紅血球、腎脹等器官，引起肝炎、肝硬變等肝功能障礙，說話障礙等神經(jīng)障礙，溶血性貧血、腎小管功能異常等現(xiàn)象。
大部分Wilson病患者們都是以發(fā)生肝硬化、神經(jīng)血損傷等疾病之后才發(fā)現(xiàn)，因此，需要肝移植或無法治療，甚至引起死亡，是一種致命的疾病。但如能早期發(fā)現(xiàn)，利用D-青霉胺(D-phenicillamine)，三亞乙基四胺等螯合劑等試劑，進(jìn)行早期的適當(dāng)治療，就不能引起并發(fā)病，能謀求正常生活，因此，Wilson病的早期診斷和治療對患者的治療有非常重要的意義。
血液內(nèi)的血漿銅藍(lán)蛋白濃度是Wilson病診斷中重要的指標(biāo)之一。血漿銅藍(lán)蛋白是一種分子量為132,000道爾頓，且具有每一個(gè)分子能與6個(gè)銅原子結(jié)合的結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，是一種在正常情況下，含生物體內(nèi)銅量的95％左右的血漿蛋白質(zhì)，起著把銅運(yùn)輸?shù)浇M織內(nèi)，提高芳香族胺氧化酶的活性，抗拴化作用，除去自由基及過氧化氫，調(diào)節(jié)炎癥性反應(yīng)等作用。血漿銅藍(lán)蛋白在正常人血清內(nèi)的含量為20-50mg/dl(200-500μg/ml)左右。但在Wilson病患者的血清內(nèi)的含量特別少。通常，血漿銅藍(lán)蛋白大部分有氧化酶活性，以含銅的全血漿銅藍(lán)蛋白形態(tài)存在；正常人可有效地排泄掉銅，并且在體內(nèi)沒有氧化酶活性的脫輔基血漿銅藍(lán)蛋白(apoceruloplasmin)的數(shù)量很少(3.3±3.1mg/dl33±31μg/ml)。與之相反，盡管Wilson病患者的脫輔基血漿銅藍(lán)蛋白的量與正常人基本相同，其全血漿銅藍(lán)蛋白數(shù)量很少(2.7±2.0mg/dl27±20μg/ml)。
所以，測定血液內(nèi)的血漿銅藍(lán)蛋白，特別是全血漿銅藍(lán)蛋白的方法對靈敏地診斷Wilson病有重要的意義。同時(shí)，在新生兒時(shí)期，血漿銅藍(lán)蛋白濃度的測定量為很低，因此，篩選檢查效率也比較低。所以，其濃度達(dá)到正常成人水平的3-5水左右為篩選檢查的最佳時(shí)期。
從前的血漿銅藍(lán)蛋白測定方法，是利用血清的通過血漿銅藍(lán)蛋白氧化酶活性(oxydase activity)測定全血漿銅藍(lán)蛋白的方法、利用多克隆抗體的放射性免疫擴(kuò)散法(radial immunodiffusion assay)、免疫濁度測定法(immnunoturbidimetic assay)等。
血漿銅藍(lán)蛋白氧化酶活性的測定方法對血漿銅藍(lán)蛋白沒有特異的酶底物，所以，很難測定血漿銅藍(lán)蛋白。利用多克隆抗體的測定方法中，多克隆抗體，跟全血漿銅藍(lán)蛋白結(jié)合的同時(shí)，也跟脫輔基血漿銅藍(lán)蛋白結(jié)合，所以有特異性低的特點(diǎn)。
而且，要實(shí)現(xiàn)上述方法，得采集大量血液、經(jīng)過另行的血液離心分離過程分離血清、采集后，因血清內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性問題，在保存和搬運(yùn)的過程重要時(shí)刻保持冰凍狀態(tài)，具有很大的不便性。如同上述，現(xiàn)有的方法，在采集、搬運(yùn)、保存等方面都很不方便，且一次能測定的樣品的數(shù)也受限制，因此，此方法在測定大量樣品的全國性的篩選檢查中不易使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供使用全血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體和全血漿銅藍(lán)蛋白特異性單克隆抗體，利用通過酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linkedimmunosorbent assay；ELISA)或解離強(qiáng)化的時(shí)間分辨熒光免疫測定法(dissociation-enhanced time-resolved fluoroimmunoassy)得到的標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線，測定全血漿銅藍(lán)蛋白濃度的方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供利用對全血漿銅藍(lán)蛋白分子的氧化酶活性重要的，能識別跟抗原決定簇(epitope)分子一樣的別的抗原決定簇的兩個(gè)單克隆抗體，或單克隆抗體和多克隆抗體，或兩個(gè)多克隆抗體，以夾心法定量分析血液內(nèi)的全血漿銅藍(lán)蛋白，從而早期診斷Wilson病的方法。
本發(fā)明的再一個(gè)重要的目的是提供用包含全血漿銅藍(lán)蛋白的精制的血漿銅藍(lán)蛋白免疫兔子，得到血清并制造血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體的方法。
本發(fā)明的再一個(gè)重要的目的是提供用包含全血漿銅藍(lán)蛋白的精制的血漿銅藍(lán)蛋白免疫小鼠，得產(chǎn)生抗體的脾臟細(xì)胞，把上述脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合及培育，得單克隆化的雜交瘤細(xì)胞并制造血漿銅藍(lán)蛋白特異性單克隆抗體的方法。
本發(fā)明的再一個(gè)重要的目的是提供以制造標(biāo)準(zhǔn)血液斑點(diǎn)和對照血液斑點(diǎn)的方法，及分別利用偶聯(lián)有辣根過氧化物酶標(biāo)記的血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體及單克隆抗體，通過酶聯(lián)免疫吸附測定法，以夾心法，制作吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法。
本發(fā)明的再一個(gè)重要的目的是提供以制造標(biāo)準(zhǔn)血液斑點(diǎn)和對照血液斑點(diǎn)的方法，及利用以銪(Europium；Eu3+)標(biāo)記的血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體及單克隆抗體，通過解離強(qiáng)化的時(shí)間分辨熒光免疫測定法，以夾心法，制做標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線的方法。
本發(fā)明的再一個(gè)重要的目的是提供使用全血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體和全血漿銅藍(lán)蛋白特異性單克隆抗體，標(biāo)準(zhǔn)血液斑點(diǎn)及對照血液斑點(diǎn)，利用通過酶聯(lián)免疫吸附測定法或解離強(qiáng)化的時(shí)間分辨熒光免疫測定法得到的標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線，測定全血漿銅藍(lán)蛋白濃度的方法。
本發(fā)明的再一個(gè)重要的目的是提供早期診斷Wilson病的篩選檢查試劑盒，從而提供與現(xiàn)今使用的檢測法有區(qū)別的，從血液過濾紙收集的1-7歲幼兒的血液斑點(diǎn)中，通過酶聯(lián)免疫吸附測定法或解離強(qiáng)化的時(shí)間分辨熒光免疫測定法，定量分析把含銅的全血漿銅藍(lán)蛋白的方法。從而，測定血漿銅藍(lán)蛋白時(shí)，不必采集大量血液，用1-2滴血液就可進(jìn)行篩選檢查。
本發(fā)明的最終目的是為了實(shí)現(xiàn)一次性地測定多數(shù)的樣品，提供利用樣品的采集、搬運(yùn)、保存都非常方便的血液斑點(diǎn)，通過使用酶聯(lián)免疫吸附測定法或解離強(qiáng)化的時(shí)間分辨熒光免疫測定法，定量分析把含銅的全血漿銅藍(lán)蛋白的方法，便能早期診斷Wilson病。
在本研究里，開發(fā)兩種方法的原因是現(xiàn)在全世界開發(fā)的其他疾病的篩選檢查用試劑盒(kit)，都采用這兩種方法之一。


圖1表示把包含全血漿銅藍(lán)蛋白的精制的血漿銅藍(lán)蛋白(11)和血漿銅藍(lán)蛋白特異性抗體的混合液，在37℃反應(yīng)，把得到的反應(yīng)物(2)電泳得凝膠體，把這凝膠體用氧化酶活性染色法染色的結(jié)果。
圖2表示利用包含幾種濃度的血漿銅藍(lán)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)血液斑點(diǎn)，使用本發(fā)明開發(fā)的酶聯(lián)免疫吸附測定法得到的標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線。
圖3表示利用包含幾種濃度的血漿銅藍(lán)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)血液斑點(diǎn)，使用本發(fā)明開發(fā)的解離強(qiáng)化的時(shí)間分辨熒光免疫測定法得到的標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線。
圖4表示利用圖2、圖3的標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線，測定5名正常人和12名Wilson病人的全血漿銅藍(lán)蛋白的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供使用全血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體和全血漿銅藍(lán)蛋白特異性單克隆抗體，利用通過酶聯(lián)免疫吸附測定法得到的吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線測定血液斑點(diǎn)中全血漿銅藍(lán)蛋白濃度的方法。
更詳細(xì)的說明，本發(fā)明的利用酶聯(lián)免疫吸附測定法，測定血液斑點(diǎn)中全血漿銅藍(lán)蛋白濃度的方法包括制造血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體的步驟，制造血漿銅藍(lán)蛋白特異性單克隆抗體的步驟，對上述血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體和血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體與辣根過氧化物酶的步驟，
制造除去血漿銅藍(lán)蛋白的血液，在此血液里添加一定濃度的包含精制血漿銅藍(lán)蛋白溶液，制造標(biāo)準(zhǔn)血液斑點(diǎn)和對照血液斑點(diǎn)的步驟，利用上述血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體和血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)血液斑點(diǎn)和對照血液斑點(diǎn)，通過酶聯(lián)免疫吸附測定法制作吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟，和利用上述標(biāo)準(zhǔn)曲線，從病人的血液斑點(diǎn)中，測定全血漿銅藍(lán)蛋白濃度的步驟。
同時(shí)，本發(fā)明提供使用全血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體和全血漿銅藍(lán)蛋白特異性單克隆抗體，利用通過解離強(qiáng)化的時(shí)間分辨熒光免疫測定法得到的標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線測定測定血液斑點(diǎn)中全血漿銅藍(lán)蛋白濃度的方法。
更詳細(xì)的說明，本發(fā)明的利用解離強(qiáng)化的時(shí)間分辨熒光免疫測定法，測定血液斑點(diǎn)中全血漿銅藍(lán)蛋白濃度的方法包括制造血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體的步驟，制造血漿銅藍(lán)蛋白特異性單克隆抗體的步驟，對上述血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體和血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體標(biāo)記銪的步驟，制造除去血漿銅藍(lán)蛋白的血液，在此血液里添加一定濃度的包含精制血漿銅藍(lán)蛋白溶液，制造標(biāo)準(zhǔn)血液斑點(diǎn)和對照血液斑點(diǎn)的步驟，利用上述血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體和血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體，從標(biāo)準(zhǔn)血液斑點(diǎn)和對照血液斑點(diǎn)，通過解離強(qiáng)化的時(shí)間分辨熒光免疫測定法制定標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線的步驟，和利用上述標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線，從病人的血液斑點(diǎn)中，測定全血漿銅藍(lán)蛋白濃度的步驟。
上述血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體是一種抗原，把包含全血漿銅藍(lán)蛋白的精制的血漿銅藍(lán)蛋白免疫兔子而制造；上述血漿銅藍(lán)蛋白特異性單克隆抗體是一種抗原，把包含全血漿銅藍(lán)蛋白的精制的血漿銅藍(lán)蛋白免疫小鼠，得可以產(chǎn)生抗體的脾臟細(xì)胞，把這細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0-Ag14以現(xiàn)為廣泛認(rèn)識的融合法融合，在HAT選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)，用酶聯(lián)免疫吸附測定法，選擇可產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞的方法而制造。
把從上述雜交瘤分泌的包含單克隆抗體的培養(yǎng)上清液，跟血漿銅藍(lán)蛋白反應(yīng)，而確認(rèn)全血漿銅藍(lán)蛋白的中和氧化酶活性的能力，從而篩選產(chǎn)生全血漿銅藍(lán)蛋白特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
同時(shí)，給上述單克隆抗體和多克隆抗體標(biāo)記辣根過氧化物酶(Horseradishperoxidase)，從而制備酶聯(lián)免疫吸附測定所需的抗體；給上述單克隆抗體和多克隆抗體標(biāo)記銪(Europium；Eu3+)，從而制備解離強(qiáng)化的時(shí)間分辨熒光免疫測定所需的抗體。
利用酶聯(lián)免疫吸附測定法或解離強(qiáng)化的時(shí)間分辨熒光免疫測定法，測定全血漿銅藍(lán)蛋白，而確認(rèn)Wilson病患者和正常人之間的差別方法包括制造除去血漿銅藍(lán)蛋白的血液，給上述血液里添加一定濃度的包含全血漿銅藍(lán)蛋白的精制的血漿銅藍(lán)蛋白溶液制造標(biāo)準(zhǔn)血液斑點(diǎn)和對照血液斑點(diǎn)；利用上述標(biāo)準(zhǔn)血液斑點(diǎn)和抗體，以夾心法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線；利用上述標(biāo)準(zhǔn)曲線以同樣的方法從Wilson病患者和正常人的樣品中測定全血漿銅藍(lán)蛋白的濃度的步驟。
以下，通過實(shí)施例更詳細(xì)的說明本發(fā)明。盡管下面敘述是通過本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例說明和解釋的，但不只局限于下述實(shí)施例。
實(shí)施例1血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體的制造本實(shí)施例使用了包含從Sigma公司購買的全血漿銅藍(lán)蛋白的精制的人體血漿銅藍(lán)蛋白。為了生成特異地針對抗原的多克隆抗體，以1mg/ml的濃度，把溶解在磷酸緩沖液中的精制的血漿銅藍(lán)蛋白溶液400μl，用Freund′s佐劑(BRL公司上市)乳化后，給10周大的兔子以14天為間隔，進(jìn)行了3次皮內(nèi)注射。14天后以1mg/ml的濃度，把溶解在磷酸緩沖液中的精制的血漿銅藍(lán)蛋白溶液400μl，注射在耳靜脈內(nèi)，7天后以心脹穿孔法采血。把采集的血液在常溫中放30分鐘，4℃的溫度下放置一個(gè)晚上。當(dāng)完全凝固后，在2,500rpm中離心分離30分鐘，取上清液，的血清。采集到的血清里，為了使最終濃度成為40％，添加硫酸銨，沉淀后，在10mM的磷酸緩沖液中透析一個(gè)晚上。之后，用DEAEAffi-Gel Blue gel(Bio Rad公司上市)精制抗體。
實(shí)施例2血漿銅藍(lán)蛋白特異性單克隆抗體的制造本發(fā)明使用的單克隆抗體是把1mg/ml的濃度的精制的血漿銅藍(lán)蛋白100μl，用同量的Freund′s佐劑硫化后，，以2周為間隔，3次注射6-8周大的BALB/c小鼠腹腔內(nèi)。最后注入后，確認(rèn)抗血漿銅藍(lán)蛋白抗體的生成，2周之后，用1OOμg的血漿銅藍(lán)蛋白進(jìn)行最后的免疫。3天之后，從小鼠抽出脾臟細(xì)胞，與Sp2/0-Ag14骨髓瘤細(xì)胞以10∶1的比率混合，把這混合液放置在50％的聚乙二醇1500溶液中3分鐘，進(jìn)行細(xì)胞融合。之后把這個(gè)在1,200rpm中離心分離8分鐘，得細(xì)胞沉淀物后，使其在包含10％胎牛血清的HAT RPMI-1640培養(yǎng)液里懸浮，使每ml含3.5×1O6的細(xì)胞。之后，分注到96-孔板里，每孔0.1ml，在37℃，5％CO2培養(yǎng)液里培養(yǎng)。3天后，每孔里添加含10％胎牛血清的HAT RPMI-1640培養(yǎng)液O.1ml。用新的培養(yǎng)液，每4天換一半左右的培養(yǎng)液。
HAT選擇培養(yǎng)后，以酶聯(lián)免疫吸附測定法確認(rèn)雜交瘤細(xì)胞的抗體產(chǎn)生與否。即把上述用于免疫的血漿銅藍(lán)蛋白，用0.01M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)稀釋后，每孔里放進(jìn)50μl，在4℃的溫度中涂覆一個(gè)晚上。之后，用磷酸鹽緩沖液PBS(phosphate buffer saline，0.15％Tween 20)，洗滌3次，用1％白蛋白在室溫中反應(yīng)2個(gè)小時(shí)。把細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，每孔里放進(jìn)50μl，在常溫中反應(yīng)2各小時(shí)后，用PBST洗滌3次。把偶聯(lián)有生物素的二級抗體-抗小鼠免疫球蛋白抗體(Biotin conjugated anti-mouse immunoglobulin antibody)，用1％BSA-PBST稀釋到1μg/ml。之后，每孔里放進(jìn)50μl，在37℃的溫度中反應(yīng)1個(gè)小時(shí)。再用PBST洗滌3次后，把Streptavidin-HorseradishPeroxidase，用1％四甲基聯(lián)苯胺(Tetra-Methylbenzidine，TMB)溶液稀釋1000倍，每孔里放進(jìn)50μl，在37℃的溫度中反應(yīng)30分鐘，之后，再次用PBST洗滌4次。作為進(jìn)行酶反應(yīng)的酶底物，每孔里放進(jìn)50μl TMB溶液，在室溫下反應(yīng)后，用2N-硫酸停止反應(yīng)，在450nm波長中，用ELISA讀數(shù)儀測定吸光度。確認(rèn)抗血漿銅藍(lán)蛋白抗體的生成與否，在顯示陽性的孔中得到的細(xì)胞，用限制稀釋法(limiting dilution)亞克隆3次，培養(yǎng)為每孔0.3的細(xì)胞，進(jìn)行單克隆化，得到了生成抗血漿銅藍(lán)蛋白單克隆抗體的雜交瘤。
實(shí)施例3確認(rèn)抗體的血漿銅藍(lán)蛋白氧化酶活性的中和把精制的血漿銅藍(lán)蛋白10μg與在實(shí)施例2得到同樣體積的雜交瘤的培養(yǎng)上清液混合后，在37℃的溫度中反應(yīng)30分鐘，之后，在4℃的溫度中用非參數(shù)(nonparametric)丙烯酰胺凝膠(7.5％)電泳。電泳后，為了確認(rèn)血漿銅藍(lán)蛋白氧化酶活性，作為染色溶液，使用了具有1mg/ml濃度的對苯二胺的醋酸納(0.1M，pH 5.7)緩沖液，在37℃的溫度中染色凝膠體(gel)2個(gè)小時(shí)，在50％乙醇溶液中脫色。(圖1)從圖1的結(jié)果中可知，精制的血漿銅藍(lán)蛋白因自己的氧化酶活性，氧化無色的對苯二胺，形成紫色的帶。相反，在血漿銅藍(lán)蛋白和血漿銅藍(lán)蛋白特異性抗體的混合液中，因抗體中和了血漿銅藍(lán)蛋白的氧化酶活性，沒有形成紫色的帶。以此可知，在實(shí)施例2中制備的單克隆抗體，對具有氧化酶活性的全血漿銅藍(lán)蛋白有特異性。
實(shí)施例4全血漿銅藍(lán)蛋白特異性單克隆抗體的精制把實(shí)施例3中篩選出的、產(chǎn)生全血漿銅藍(lán)蛋白特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，接種在有RPMI培養(yǎng)液的T75燒瓶中，在37℃，5％ CO2培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后，進(jìn)行離心分離，得到培養(yǎng)上清液，添加硫酸銨使最終濃度為50％，進(jìn)行沉淀后，在10mM的磷酸緩沖液(pH7.0)透析過夜。之后，用DEAE Affi-Gel Blue凝膠精制了抗體。
實(shí)施例5氧化酶結(jié)合抗血漿銅藍(lán)蛋白抗體的制造把在實(shí)施例1和實(shí)施例4中精制的抗體5mg，與同量的辣根過氧化物酶，在0.1M的磷酸緩沖液(pH6.8)混合透析一個(gè)晚上。添加以0.1M的磷酸緩沖液稀釋的最終濃度為1％的甲醛溶液，在常溫中慢慢攪拌3個(gè)小時(shí)，同時(shí)，添加2M的甘氨酸，使最終濃度達(dá)到0.1M后，在常溫中放置2個(gè)小時(shí)，再用磷酸緩沖液透析1個(gè)晚上。之后，在10,000中離心分離而得到的上清液中添加同樣體積的甘油，在-20℃儲存。
實(shí)施例6銪(Europium)結(jié)合抗血漿銅藍(lán)蛋白抗體的制造把在實(shí)施例1和實(shí)施例4中精制的抗體1mg，放進(jìn)0.1M的碳酸鈉緩沖液(Na2CO3pH 9.3)里，透析一個(gè)晚上，濃縮到最終濃度為4mg/ml。之后，把250μg的抗體與0.2mg的己螯合銪的N1-(對-異氰酸酯芐基)-二亞乙基三胺-N1，N2，N3-四乙酸酯，[N1-(p-isothiocyanate benzyl)-diethylentriamine-N1，N2，N3-tetraacetate，簡稱為DTTA]慢慢攪拌后，在4℃的溫度中反應(yīng)一個(gè)晚上。之后，用Superdex 200柱(在Amersham公司上市)和TSA緩沖液(50mmol/L，Tris-HCl(pH 7.8)，0.9％ NaCl，0.05％疊氮化鈉)過濾凝膠體后，添加白蛋白，使最終濃度成為0.1％，在-20℃儲存。
實(shí)施例7制造除去血漿銅藍(lán)蛋白的血液的制造把血液在3,000rpm中離心分離10分鐘后，把上層的血漿部分扔掉。之后，添加磷酸緩沖液攪拌后，用同樣的方法分離。反復(fù)洗滌10次后，離心分離，扔掉血漿部分，得除去血漿的紅血球(RBCRed Blood Cell)。
實(shí)施例8標(biāo)準(zhǔn)血液斑點(diǎn)的制造在實(shí)施例7中制造的除去血漿銅藍(lán)蛋白的血液里，添加已知濃度的血漿銅藍(lán)蛋白，決定標(biāo)準(zhǔn)的范圍。0mg/dl、1mg/dl、5mg/dl、20mg/dl、50mg/dl，這5個(gè)為利用在酶聯(lián)免疫吸附測定法的標(biāo)準(zhǔn)血漿銅藍(lán)蛋白的濃度的范圍；0mg/dl、1mg/dl、5mg/dl、10mg/dl、20mg/dl、30mg/dl，這6個(gè)為利用在解離強(qiáng)化的時(shí)間分辨熒光免疫測定法的標(biāo)準(zhǔn)血漿銅藍(lán)蛋白的濃度的范圍。制造標(biāo)準(zhǔn)血液斑點(diǎn)時(shí)，在實(shí)施例6中制造的血液里，以1∶1的比例添加已知的血漿銅藍(lán)蛋白溶液。最后調(diào)整到原來的血細(xì)胞比容。因此，各標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線時(shí)，濃縮2倍，跟實(shí)施例7里制造的血液混合，滴到過濾紙上，在常溫晾干一個(gè)晚上。
實(shí)施例9對照血液斑點(diǎn)的制造對照血液斑點(diǎn)(control blood spot)的制造，與實(shí)施例8同樣的方法進(jìn)行。對照組的血漿銅藍(lán)蛋白的范圍為3mg/dl(1.40-4.80)、7mg/dl(5.0-9.0)、15mg/dl(10.5-19.5)三個(gè)范疇。跟標(biāo)準(zhǔn)血液斑點(diǎn)的制造方法一樣，與血液以1∶1的比例混合，滴到過濾紙上，在常溫晾干一個(gè)晚上。
實(shí)施例10利用酶聯(lián)免疫吸附測定法測定血液斑點(diǎn)中血漿銅藍(lán)蛋白濃度(單克隆抗體-單克隆抗體夾心法)為了測定血液斑點(diǎn)中的血漿銅藍(lán)蛋白的量，首先把在實(shí)施例2和實(shí)施例4制備的抗全血漿銅藍(lán)蛋白特異性單克隆抗體用0.05M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋到2μg/ml，放進(jìn)每孔里100μg，在4℃的溫度中涂覆一個(gè)晚上。之后，用添加0.05％ Tween 20的磷酸緩沖液洗滌4次，用具有3％白蛋白的磷酸緩沖液，在室溫反應(yīng)5-8個(gè)小時(shí)。用同樣的方法洗滌以后，使用沖頭(punch)把血液斑點(diǎn)打孔1.5mm直徑，放進(jìn)各孔里。在這各孔里，放入100μl洗脫液(含1％白蛋白的磷酸鹽緩沖液)，使血液斑點(diǎn)浸泡在溶液里，在4℃反應(yīng)一個(gè)晚上。其后，除掉血液斑點(diǎn)，用具有0.05％ Tween 20的磷酸緩沖液洗滌4次以后，把在實(shí)施例5制備的與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二級單克隆抗體用添加0.05％ Tween 20的磷酸緩沖液(含1％白蛋白)稀釋到500∶1后，每孔里放入100μl，在室溫中反應(yīng)90分鐘。之后，再次用添加0.05％ Tween 20的磷酸緩沖液洗滌6次，作為酶反應(yīng)的酶底物，每孔里放入100μl TMB溶液，在室溫反應(yīng)后，用1N-鹽酸停止反應(yīng)，在450mm波長，用ELISA讀數(shù)儀測定吸光度。
實(shí)施例11利用解離強(qiáng)化的時(shí)間分辨熒光免疫測定血液斑點(diǎn)中血漿銅藍(lán)蛋白濃度(單克隆抗體-單克隆抗體夾心法)為了測定血液斑點(diǎn)中的血漿銅藍(lán)蛋白的量，首先把在實(shí)施例2和實(shí)施例4制備的抗全血漿銅藍(lán)蛋白特異性單克隆抗體用0.05M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋到2μg/ml，放進(jìn)每孔里100μg，在4℃的溫度中涂覆一個(gè)晚上。之后，用添加0.1％ Tween 20和0.9％ NaCl的Tris-HCl緩沖液(50mmol/L Tris-HCl(pH7.8)0.9％ NaCl 0.1％ Tween 20)洗滌4次，用具有3％白蛋白且添加0.1％ Tween 20和0.9％ NaCl的Tris-HCl緩沖液，在室溫反應(yīng)5-8個(gè)小時(shí)。用同樣的方法洗滌以后，使用沖頭把血液斑點(diǎn)打孔1.5mm直徑，放進(jìn)各孔里。在這各孔里，放入100μl的為涌出的DELFIA分析緩沖液(Wallac公司上市)溶液，使血液斑點(diǎn)浸泡在溶液里，在4℃反應(yīng)一個(gè)晚上。其后，除掉血液斑點(diǎn)，用添加0.1％ Tween 20和0.9％ NaCl的Tris-HCl緩沖液洗滌4次以后，把在實(shí)施例6制備的結(jié)合銪的2次單克隆抗體用DELFIA分析緩沖液稀釋到250ng/ml后，每孔里放入100μl，在室溫中反應(yīng)90分鐘。之后，再次用添加0.1％ Tween 20和0.9％ NaCl的Tris-HCl緩沖液洗滌4次，把DELFIA增強(qiáng)溶液(Wallac公司上市)溶液，每孔里放入200μl，過2分鐘后，利用時(shí)間分辨熒光分析儀(time-resolved fluorometry)測定銪的拷貝數(shù)(copy of Europium)。
實(shí)施例12利用酶聯(lián)免疫吸附測定法測定血液斑點(diǎn)中血漿銅藍(lán)蛋白濃度(單克隆抗體-多克隆抗體夾心法)為了測定血液斑點(diǎn)中的血漿銅藍(lán)蛋白的量，與實(shí)施例10同樣的方法測定，只是，二級抗體使用在實(shí)施例1和實(shí)施例5制備的偶聯(lián)有辣根過氧化物酶的多克隆抗體。
實(shí)施例13利用分離-強(qiáng)化時(shí)間分辨熒光免疫測定血液斑點(diǎn)中血漿銅藍(lán)蛋白濃度(單克隆抗體-多克隆抗體夾心法)為了測定血液斑點(diǎn)中的血漿銅藍(lán)蛋白的量，與實(shí)施例11同樣的方法測定，只是，二級抗體使用在實(shí)施例1和實(shí)施例6制備的結(jié)合銪的多克隆抗體。
實(shí)施例14利用酶聯(lián)免疫吸附測定法測定血液斑點(diǎn)中血漿銅藍(lán)蛋白濃度(多克隆抗體-多克隆抗體夾心法)為了測定血液斑點(diǎn)中的血漿銅藍(lán)蛋白的量，與實(shí)施例10同樣的方法測定，只是，涂覆抗體使用在實(shí)施例1和實(shí)施例5制備的偶聯(lián)有辣根過氧化物酶的多克隆抗體。
實(shí)施例15利用分離-強(qiáng)化時(shí)間分辨熒光免疫測定血液斑點(diǎn)中血漿銅藍(lán)蛋白濃度(多克隆抗體-多克隆抗體夾心法)為了測定血液斑點(diǎn)中的血漿銅藍(lán)蛋白的量，與實(shí)施例11同樣的方法測定，只是，涂覆抗體使用在實(shí)施例1制造的多克隆抗體，二級抗體使用在實(shí)施例1和實(shí)施例6制備的結(jié)合銪的多克隆抗體。
實(shí)施例16利用酶聯(lián)免疫吸附測定法的正常人與Wilson病患者的血漿銅藍(lán)蛋白的定量分析采集5名正常人和12名Wilson病患者的血液，制造血液斑點(diǎn)，晾干一天后，按實(shí)施例10的方法，利用圖2的標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線，測定血漿銅藍(lán)蛋白的濃度。
實(shí)施例17利用解離強(qiáng)化的時(shí)間分辨熒光免疫測定法的正常人與Wilson病患者的血漿銅藍(lán)蛋白的定量分析采集5名正常人和12名Wilson病患者的血液，制造血液斑點(diǎn)，晾干一天后，按實(shí)施例11的方法，利用圖3的標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線，測定血漿銅藍(lán)蛋白的濃度。
從圖4可以看出，Wilson病患者的血漿銅藍(lán)蛋白的濃度，與正常人比較，測定為明顯的低。這結(jié)果說明本發(fā)明的診斷試液在診斷Wilson病有很高的篩選力。同時(shí)，從圖4的Wilson病患者12(WD12)可以看出，在全體的Wilson病患者中，也有5％以內(nèi)的，顯示正常血漿銅藍(lán)蛋白數(shù)值得情況。這種情況，不僅在這次開發(fā)的試劑盒(kit)，而且在以前利用血清的檢測法也顯示同樣的數(shù)值。
發(fā)明的效果本發(fā)明提供了早期診斷Wilson病的篩選檢查試劑盒；提供與現(xiàn)今在使用的檢查方法有區(qū)別的，用酶聯(lián)免疫吸附測定法或解離強(qiáng)化的時(shí)間分辨熒光免疫測定法，定量分析用血液過濾紙采集的1-7歲幼兒的血液斑點(diǎn)中含銅的全血漿銅藍(lán)蛋白的方法，從而，測定血漿銅藍(lán)蛋白時(shí)，不必采集大量血液，用1-2滴血液，就能早期診斷Wilson病。
本發(fā)明提供Wilson病診斷試劑及Wilson病診斷用試劑盒，實(shí)現(xiàn)了使用全血漿銅藍(lán)蛋白特異性單克隆抗體和多克隆抗體，標(biāo)準(zhǔn)血液斑點(diǎn)及對照血液斑點(diǎn)，利用通過酶聯(lián)免疫吸附測定法或解離強(qiáng)化的時(shí)間分辨熒光免疫測定法得到的標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線，測定血液斑點(diǎn)中全血漿銅藍(lán)蛋白的濃度。從而，對樣品的采集、搬運(yùn)、保存提供了方便，而且能一次性的測定多量樣品，對以多數(shù)認(rèn)為對象的篩選檢查更為有用。
盡管本發(fā)明是通過參考本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例說明和解釋的，但不只局限于上述實(shí)施例，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，通過熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，可以在形式和細(xì)節(jié)對其進(jìn)行各種修改和改變。
權(quán)利要求
1.一種血液斑點(diǎn)中測定全血漿銅藍(lán)蛋白濃度的方法，其特征在于，使用全血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體和全血漿銅藍(lán)蛋白特異性單克隆抗體，利用通過酶聯(lián)免疫吸附測定法得到的吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線測定。
2.一種血液斑點(diǎn)中測定全血漿銅藍(lán)蛋白濃度的方法，其特征在于，使用全血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體和全血漿銅藍(lán)蛋白特異性單克隆抗體，利用通過解離強(qiáng)化的時(shí)間分辨熒光免疫測定法得到的標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線測定。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，上述血液斑點(diǎn)利用血液過濾紙收集。
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，上述血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體，是通過將用包含全血漿銅藍(lán)蛋白的精制的血漿銅藍(lán)蛋白免疫兔子，而得到的血清制造的。
5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，上述血漿銅藍(lán)蛋白特異性單克隆抗體是如下獲得的用包含全血漿銅藍(lán)蛋白的精制的血漿銅藍(lán)蛋白免疫小鼠，得到產(chǎn)生抗體的脾臟細(xì)胞，把上述脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合及培育，得到單克隆化的雜交瘤細(xì)胞而制造。
6.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，上述通過酶聯(lián)免疫吸附測定法得到吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟包括首先制造標(biāo)準(zhǔn)血液斑點(diǎn)和對照血液斑點(diǎn)后，將偶聯(lián)有辣根過氧化物酶的血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體和血漿銅藍(lán)蛋白特異性單克隆抗體，分別施用于上述標(biāo)準(zhǔn)血液斑點(diǎn)和對照血液斑點(diǎn)。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中，上述吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，以夾心法做成。
8.權(quán)利要求2所述的方法，其中，上述通過解離強(qiáng)化的時(shí)間分辨熒光免疫測定法得到標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線的步驟包括首先制造標(biāo)準(zhǔn)血液斑點(diǎn)和對照血液斑點(diǎn)后，以銪標(biāo)記的血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體和血漿銅藍(lán)蛋白特異性單克隆抗體，分別施用于上述標(biāo)準(zhǔn)血液斑點(diǎn)和對照血液斑點(diǎn)。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中，上述標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線，以夾心法做成。
10.一種利用酶聯(lián)免疫吸附測定法測定血液斑點(diǎn)中全血漿銅藍(lán)蛋白濃度的方法，包括制造血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體的步驟；制造血漿銅藍(lán)蛋白特異性單克隆抗體的步驟；將上述血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體和血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的步驟；制造除去血漿銅藍(lán)蛋白的血液，在此血液里添加一定濃度的包含精制血漿銅藍(lán)蛋白的溶液，制造標(biāo)準(zhǔn)血液斑點(diǎn)和對照血液斑點(diǎn)的步驟；利用上述血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體和血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)血液斑點(diǎn)和對照血液斑點(diǎn)，通過酶聯(lián)免疫吸附測定法制定吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟；和利用上述標(biāo)準(zhǔn)曲線，從病人的血液斑點(diǎn)中，測定全血漿銅藍(lán)蛋白濃度的步驟。
11.一種利用解離強(qiáng)化的時(shí)間分辨熒光免疫測定法測定血液斑點(diǎn)中全血漿銅藍(lán)蛋白濃度的方法，包括制造血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體的步驟；制造血漿銅藍(lán)蛋白特異性單克隆抗體的步驟；對上述血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體和血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體標(biāo)記銪的步驟；制造除去血漿銅藍(lán)蛋白的血液，在此血液里添加一定濃度的包含精制血漿銅藍(lán)蛋白溶液，制造標(biāo)準(zhǔn)血液斑點(diǎn)和對照血液斑點(diǎn)的步驟；利用上述血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體和血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)血液斑點(diǎn)和對照血液斑點(diǎn)，通過解離強(qiáng)化的時(shí)間分辨熒光免疫測定法制定標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線的步驟；和利用上述標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線，從病人的血液斑點(diǎn)中，測定全血漿銅藍(lán)蛋白濃度的步驟。
12.權(quán)利要求10或11所述的血液斑點(diǎn)中測定全血漿銅藍(lán)蛋白濃度的方法，其中，上述病人為肝豆?fàn)詈俗冃圆』颊摺?br> 13.權(quán)利要求10或11所述的方法，其中，上述制造除去血漿銅藍(lán)蛋白的血液的步驟，使用磷酸緩沖液。
14.權(quán)利要求10或11所述的方法，其中，上述制造標(biāo)準(zhǔn)血液斑點(diǎn)和對照血液斑點(diǎn)是通過在除去血漿銅藍(lán)蛋白的血液里添加已知濃度的血漿銅藍(lán)蛋白溶液而制造。
15.權(quán)利要求10或11所述的方法，其中，上述血液里添加的已知濃度的血漿銅藍(lán)蛋白溶液為3種以上。
16.權(quán)利要求10或11所述的方法，其中，在上述制造血漿銅藍(lán)蛋白特異性單克隆抗體的步驟中，還包括步驟篩選可中和全血漿銅藍(lán)蛋白的氧化酶活性的抗體。
17.權(quán)利要求10或11所述的方法，其中，在上述制造血漿銅藍(lán)蛋白特異性單克隆抗體的步驟后，還包括精制其抗體的步驟。
18.一種診斷肝豆?fàn)詈俗冃圆〉脑噭涮卣髟谟冢獫{銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體和全血漿銅藍(lán)蛋白特異性單克隆抗體、標(biāo)準(zhǔn)血液斑點(diǎn)及對照血液斑點(diǎn)。
19.一種肝豆?fàn)詈俗冃圆『Y選檢查用試劑盒，其特征在于，使用全血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體和全血漿銅藍(lán)蛋白特異性單克隆抗體、標(biāo)準(zhǔn)血液斑點(diǎn)及對照血液斑點(diǎn)，通過利用酶聯(lián)免疫吸附測定法制定的吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定血液斑點(diǎn)中全血漿銅藍(lán)蛋白的濃度。
20.一種肝豆?fàn)詈俗冃圆『Y選檢查用試劑盒，其特征在于，使用全血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體和全血漿銅藍(lán)蛋白特異性單克隆抗體、標(biāo)準(zhǔn)血液斑點(diǎn)及對照血液斑點(diǎn)，通過利用解離強(qiáng)化的時(shí)間分辨熒光免疫測定法制定的標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線，測定血液斑點(diǎn)中全血漿銅藍(lán)蛋白的濃度。
21.一種診斷肝豆?fàn)詈俗冃圆〉姆椒ǎ褂美麢?quán)利要求19或20所述的肝豆?fàn)詈俗冃圆『Y選檢查用試劑盒診斷。
全文摘要
本發(fā)明涉及測量全血漿銅藍(lán)蛋白濃度的方法,特別涉及使用全血漿銅藍(lán)蛋白特異性多克隆抗體和全血漿銅藍(lán)蛋白特異性單克隆抗體,利用通過酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme－linked immunosorbent assay;ELISA)或解離強(qiáng)化的時(shí)間分辨熒光免疫測定法(dissociation－enhanced time－resolved fluoroimmunoassy)得到的標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線,測定全血漿銅藍(lán)蛋白濃度的方法。
文檔編號G01N33/68GK1379247SQ01141150
公開日2002年11月13日 申請日期2001年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月31日
發(fā)明者韓始薰, 章暎珠, 李秀英, 申夏澈, 樸善榮, 柳恩善, 韓熙成 申請人:智諾百股份有限公司