專利名稱：：一種適于巰基標記的極性敏感熒光探針及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種可用于標記蛋白分子中巰基的極性敏感熒光探針及其制備方法與應用。
背景技術：
：光學分析法，特別是熒光光譜法，因具有簡便性、高靈敏度和高時空分辨能力而成為目前應用最廣泛、最有效的研究生物大分子的區域結構與功能的手段之一。在熒光光譜法中，能與目標物質發生標記反應并引起熒光性質的變化，從而可對目標物質進行分析與測定的一類光學分子，稱為熒光探針。應用具有特殊性質的熒光探針，可以對蛋白質的區域結構和性能的關系進行詳細研究，所以性能優良的熒光探針是構筑和發展熒光光譜法的基石，因而一直受到關注。在蛋白組學研究中，大部分蛋白質中的巰基比較活潑，易形成二硫鍵，有的巰基處于活性位點，對蛋白的空間構型以及生物功能有著特殊的作用。因此，巰基的選擇性標記及其附近結構和性質的研究是蛋白組學研究中的重要課題之一。可用于蛋白質中巰基定位標記的熒光探針雖然已有一些報道，但能夠用于研究蛋白質巰基附近物理性能(包括極性、pH等)的熒光探針，尤其是對極性敏感且適于巰基標記的熒光探針還比較少見。Prendergast等人(TheJournalofBiologicalChemistry1983,258:7541-7544)曾設計了可用于巰基選擇性標記的極性敏感探針丙烯酰丹(Acrylodan)，但其熒光發射波長小于550nm。Kenyon等人(MethodsinEnzymology1977，47:407-430)利用芘在373nm和384nm處的發射強度的比值(A/A)與溶劑的極性之間的線性關系曾設計了馬來酰亞胺基芘來測定巰基附近的極性，但是由于發射波長較短，不能完全消除蛋白分子的背景熒光，所以測定的準確性有待改進。到目前為止，波長在550nm以上而且適合于巰基標記的極性敏感熒光探針還沒有文獻報道過。
發明內容本發明的目的是提供一種能夠用于含有巰基的化合物選擇性標記的極性敏感探針及其制備方法與應用。該熒光探針為3-(4-氯-6-對馬來酰亞胺苯酚基-l，3,5-三嗪氨基)-7-二甲基氨基-2-甲基口分嗪(3-(4-chloro-6-p-maleimidylphenoxyl-l，3，5誦triazinylamino)隱7-dimethylamino-2-methyl-phenazine;縮寫為:CMTDP)，其結構如式I，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>該CMTDP分子由三部分組成中性紅作為極性敏感熒光團；三聚氰氯作為橋聯劑；馬來酰亞胺基團作為標記基團。CMTDP的制備是利用三聚氰氯分子中的三個氯原子的在不同溫度下反應活性的差別而實現的，在05。C下先取代三聚氰氯的第一個氯原子，在室溫下取代第二個氯原子。具體的，首先，中性紅與三聚氰氯中的第一個氯原子在05。C的冷丙酮中反應，然后再與對馬來酰亞胺苯酚在室溫下發生第二個氯的取代反應，從而得到CMTDP。本發明涉及的熒光探針CMTDP具有以下特點1)在絕大多數溶劑中熒光性質穩定；2)具有長的熒光發射波長(>550nm)，有利于避免來自普通生物大分子的小于500nm背景熒光的干擾；3)最大熒光發射峰位對環境極性十分敏感，極性增加導致發射波長發生紅移，更重要的是，這種漂移只對極性敏感，而不受環境的溫度和pH值的影響。因而，該探針能在熱和酸的變化情況下對極性進行準確的測定。CMTDP由于具有上述性質，而且具有適于巰基標記的選擇性基團一馬來酰亞胺基團，因此，可用于含巰基化合物分析，特別是，用于含巰基的蛋白質的分析，這也屬于本發明的保護范圍。本發明制備出一種能夠用于含有巰基的化合物的選擇性標記的極性敏感探針，該探針由于馬來酰亞胺基團的引入，可以用于含有巰基的生物大分子的標記及巰基附近區域極性變化情況的測定和研究，特別是蛋白質中巰基的選擇性標記和巰基附近極性變化情況的研究。圖1為CMTDP在不同溶劑中的熒光發射光譜圖2為CMTDP的最大發射波長位移值與溶劑介電常數線性關系圖3為CMTDP在不同pH下的熒光發射光譜圖；圖4為CMTDP在不同溫度下的熒光發射光譜圖5為CMTDP標記的y-乳球蛋白及蛋白、探針的吸收光譜圖;圖6為CMTDP標記的^乳球蛋白的熒光發射光譜具體實施例方式實施例1、CMTDP的制備反應過程用以下反應流程表示:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>將三聚氰氯(548.8mg,3mmol)溶解于20mL冷丙酮(05°C)中，向其中慢慢滴加中性紅(576mg，2mmol)的冷丙酮(80mL)懸浮液，約30min加完。然后，再向反應體系中滴加碳酸鈉的水溶液(212mg,4mL),在冰浴冷卻下攪拌反應40min。之后，向反應體系中加入冰塊(約25g)以停止反應。待冰完全溶解后，過濾生成的沉淀產物，并用適量的水和少量的冷丙酮依次洗滌濾餅，得到棕色沉淀產物。將該產物進一步用硅膠柱色譜提純，得到產物3-(4，6-二氯-l,3,5-三嗪氨基)-7-二甲胺基-2-甲基吩嗪(DTDP)。在100mL的三頸燒瓶中加入1.96g馬來酰酐(20mmol)，用10mLDMF(二甲基甲酰胺)溶解。向其中加入2.18g對氨基苯酚，常溫攪拌2小時。另取DMF約20mL，并加入0.25mL濃硫酸以及約2g五氧化二磷。在攪拌下，將此溶液用50mL恒壓滴液漏斗在45min內滴加到上述三頸燒瓶中。然后加熱反應體系到70。C，并攪拌反應2小時。將反應液倒入碎冰中，再加入約20mL的蒸餾水。用乙酸乙酯萃取，分出有機相，并用無水硫酸鈉干燥。過濾，并用旋轉蒸發儀除去濾液中的溶劑，殘渣用異丙醇重結晶，得到純的對馬來酰亞胺苯酚。在100mL圓底燒瓶中加入1.41g對馬來酰亞胺苯酚、25mL重新蒸餾過的呋喃，于常溫下攪拌此懸浮液并反應36小時。之后，加入5mL丙酮，繼續攪拌反應12小時，析出白色沉淀產物。抽濾，干燥，得到中間產物l。將DTDP(200mg，0.5mmol)，中間產物l(129mg，0.5mmol)和無水碳酸鉀(138mg，lmmol)加入到50mL三頸燒瓶中。然后加入20mL_DMF，于室溫下攪拌反應12小時。然后向體系中加入碎冰(約10g)以終止反應。待冰溶化后用乙酸乙酯進行萃取，分出有機相，并用無水硫酸鈉干燥。過濾，在旋轉蒸發儀上于低溫(40°C)除去濾液中的乙酸乙酯。殘渣用硅膠柱色譜[不同比例的乙酸乙酯/石油醚混合液(1/3-1/1)作淋洗液]提純，得到中間產物2。在100mL的三頸燒瓶中加入中間產物2(186mg,0.3mmol)和40mL甲苯。反應體系加熱到110。C回流3小時。用旋轉蒸發儀除去反應體系的溶劑，并在真空干燥器中干燥，得到棕色粉末產物CMTDP(總產率約20%)。實施例2、CMTDP的光譜性質將CMTDP溶解在不同溶劑中(濃度為IO(iM)，測定其熒光發射光譜，結果如圖1所示。熒光發射光譜測定時以相應的最大激發波長去激發；激發和發射的狹縫寬度為10nm。圖中，(a)水(0.1M磷酸鹽緩沖溶液，pH7.4);(b)二甲基亞砜；(c)乙腈；(d)丙酮。CMTDP(10)iM)在不同溶劑的光譜數據如表1，其最大發射波長位移值(A^O與溶劑介電常數(D)線性關系圖如圖2所示，熒光最大發射波長位移值與介電常數間的線'性方禾呈A;Um=59.6—0.67xD。表l.CMTDP在不同溶劑中的光譜數據<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>a熒光量子產率(<D)的測定是采用熒光素為內標(熒光素在0.1M的氫氧化鈉溶液中的量子產率為0.95);b各種溶劑的介電常數(D);￡熒光發射的測定是以各種介質的相應的最大激發波長激發；"最大發射波長位移值a;u=;u沐)-(有機溶劑)。圖3為CMTDP在不同pH下的熒光發射光譜圖。CMTDP的濃度為10pM(包括0.1MNaCl，pH值由鹽酸和氫氧化鈉溶液進行調節)，圖中，(a)pH5.0，(b)pH5.8，(c)pH6.4，(d)pH7.4，(e)pH8.4，(f)pH9,4，(g)pH10.6。激發波長為512nm，激發和發射的狹縫寬度為10nm，激發電壓為700V。圖4為CMTDP在不同溫度下的熒光發射光譜圖。各光譜的測定是將CMTDP溶液加熱到相應的溫度后降到室溫后進行的。圖中，CMTDP的濃度為10pM，(a)0。C，(b)25。C，(c)45。C，(d)60。C，(e)70。C，(f)80。C，(g)90。C。激發波長為512nm，激發和發射的狹縫寬度為10nm，激發電壓為700V。以上結果表明，CMTDP具有以下特點1)在絕大多數溶劑中熒光性質穩定；2)具有長的熒光發射波長(>550nm)，有利于避免來自普通生物大分子的小于500nm背景熒光的干擾；3)最大熒光發射峰位對環境極性十分敏感，極性增加導致發射波長發生紅移，更重要的是，這種漂移只對極性敏感，而不受環境的溫度和pH值的影響。因而，該探針能在熱和酸的變化下對極性進行準確的測定。實施例3、CMTDP在含巰基蛋白質分析中的應用取CMTDP(0.48(imol)溶于0.1MNa2HP04-NaH2P04緩沖溶液中(pH為5.6，含有6M尿素)，然后加入/-乳球蛋白(2.2mg,0.12pmol)。在室溫下攪拌反應6小時后，反應體系用0.1MNa2HP04-NaH2P04緩沖溶液透析，然后用SephadexG-25柱進行分離，標記的蛋白組分通過280nm和508nm處的吸收監控。最后，標記的/-乳球蛋白再用0.03MNH4HC03溶液透析后凍干，在4。C下儲存備用。圖5為CMTDP標記的/-乳球蛋白以及蛋白、探針本身的吸收光譜。從圖中可以看出，在280nm和508nm附近的吸收峰的同時出現，證明^乳球蛋白已成功地被CMTDP所標記。其中a為CMTDP，b為/-乳球蛋白，c為CMTDP標記的,乳球蛋白。CMTDP對》-乳球蛋白的標記率為74%。圖6為CMTDP標記的々-乳球蛋白的熒光發射光譜。其中，a為^乳球蛋白，b為CMTDP標記的"-乳球蛋白，c和d分別為被標記蛋白加熱30分鐘和60分鐘后，冷卻到室溫后的熒光光譜，a，為CMTDP。通過此譜圖，我們發現A-乳球蛋白被CMTDP標記后，CMTDP的熒光發射峰從621nm藍移到573nm。按照得到的熒光最大發射波長位移值與介電常數間的線性方程AAem=59.6-0.67xD，我們可以計算出y9-乳球蛋白被標記位點Cysl21附近區域的介電常數為17.3，其極性與丙酮極性接近，屬于中等極性。應用本發明極性敏感熒光探針CMTDP，首次實現了對A乳球蛋白巰基附近極性的準確測定，在理論上和實際應用上具有很大的意義。權利要求1、式I結構的3-(4-氯-6-對馬來酰亞胺苯酚基-1，3，5-三嗪氨基)-7-二甲基氨基-2-甲基吩嗪。2、3-(4-氯-6-對馬來酰亞胺苯酚基-l,3,5-三嗪氨基)-7-二甲基氨基-2-甲基吩嗪的制備方法，其制備路線如下3、根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于式II結構的中性紅與三聚氰氯中的反應在05°C的冷丙酮中完成；式III結構的化合物與式IV結構的化合物的反應在室溫的二甲基甲酰胺中完成。4、3-(4-氯-6-對馬來酰亞胺苯酚基-l,3，5-三嗪氨基)-7-二甲基氨基-2-甲基吩嗪在含巰基化合物分析中的應用。5、根據權利要求4的應用，其特征在于所述含巰基化合物為含巰基的蛋白質。全文摘要本發明公開了一種熒光探針及其制備方法與應用。本發明所提供的熒光探針為式I結構的3-(4-氯-6-對馬來酰亞胺苯酚基-1，3，5-三嗪氨基)-7-二甲基氨基-2-甲基吩嗪。本發明制備出一種能夠用于含有巰基的化合物的選擇性標記的極性敏感探針，該探針由于馬來酰亞胺基團的引入，可以用于含有巰基的生物大分子的標記及巰基附近區域極性變化情況的測定和研究，特別是蛋白質中巰基的選擇性標記和巰基附近極性變化情況的研究。文檔編號G01N33/68GK101289446SQ20071006556公開日2008年10月22日申請日期2007年4月16日優先權日2007年4月16日發明者王曉春,董素英,馬會民申請人:中國科學院化學研究所
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