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專利名稱：彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤分子病理分型方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血液腫瘤學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地，涉及彌漫性大B細(xì)胞淋巴 瘤的分子分型標(biāo)志物、檢測方法及該檢測方法涉及的試劑盒。
背景技術(shù)：
彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cdl lymphoma, DLBCL)是最常見的 非霍奇金淋巴瘤，約占每年初發(fā)非霍奇金淋巴瘤的40%左右。我國目前非霍奇 金淋巴瘤的發(fā)病率約為3-4/10萬，并以每年2-3%的速度增長，其中彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)最為常見，約占每年所有淋巴瘤的50%，因此，每年全國 新發(fā)病例約為4-5萬。
DLBCL具有顯著的生物學(xué)異質(zhì)性，病人對治療的反應(yīng)差異顯著，常規(guī)的聯(lián) 合化療方案(CHOP，環(huán)磷酰氨、阿霉素、長春新堿和潑泥松)只能使約40%的患 者獲得長期緩解。隨著人-鼠嵌合性抗CD20單克隆抗體(利妥昔單抗，Rituximab) 聯(lián)合化療(R-CHOP)的應(yīng)用，進(jìn)一步提高DLBCL的臨床療效，但是利妥昔單抗 每個(gè)療程治療費(fèi)用為10-15萬元，對于國內(nèi)大部分患者來說是沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。由 于利妥昔單抗并不能提高某些類型患者的療效(具體為如下文所述的GCB型患 者)，故鑒定患者的分子病理分型后，選擇合理的治療方案，有利于節(jié)約這部分 患者的醫(yī)療支出。
因此，加強(qiáng)DLBCL生物學(xué)特性的研究，制定相應(yīng)的治療方案成為目前 DLBCL的研究熱點(diǎn)。當(dāng)前臨床對DLBCL進(jìn)行危險(xiǎn)分層，主要是通過國際預(yù)后 指數(shù)(International Prognostic Index, IPI)，包括年齡、體力狀態(tài)、臨床Ann Arbor 分期、節(jié)外病灶數(shù)目、乳酸脫氫酶水平。由于這種評價(jià)只是臨床參數(shù)的組合， 不能反映腫瘤發(fā)生過程中內(nèi)在的分子生物學(xué)異質(zhì)性，因此對于相當(dāng)一部分病例 的預(yù)后不能進(jìn)行準(zhǔn)確評價(jià)， 一些被分在低危、低中危組的病人5年生存率仍僅 有32%。
基因芯片技術(shù)的應(yīng)用為闡明DLBCL潛在的生物學(xué)異質(zhì)性提供了一個(gè)高通量平臺(tái)，通過DLBCL基因表達(dá)譜(gene expression profiling, GEP)分析，鑒別出 了三種DLBCL亞型，提示腫瘤性B細(xì)胞處在不同的分化階段 一種稱為生發(fā)中 心B細(xì)胞樣DLBCL(germinal center B cell-like DLBCL， GCB)，此亞型因與正常 生發(fā)中心B細(xì)胞表達(dá)的基因標(biāo)志相同而得名；另一種亞型稱為活化B細(xì)胞樣
DLBCL(activated B cell-like DLBCL， ABC)，此亞型表達(dá)的基因型與促有絲分 裂刺激后外周血B細(xì)胞相似，GCB與ABC之間有數(shù)千基因表達(dá)差異。除以上兩 型之外，仍有17。/。-40。/。的DLBCL無法用細(xì)胞起源來分型，被統(tǒng)稱為3型(type3)， ABC和type3統(tǒng)稱為非GCB(non-GCB)。
DLBCL亞型是獨(dú)立于IPI的預(yù)后評價(jià)指標(biāo)，各亞型對傳統(tǒng)的聯(lián)合化療 CHOP方案的反應(yīng)性和療效各不相同，ABC和GCB的五年生存率分別為31。/。和 59%， GCB的生存率明顯好于ABC，而3型本身具有異質(zhì)性，無確定的生存率， 但其總體預(yù)后情況與ABC亞型相似，從而為DLBCL的分子病理分型奠定了基 礎(chǔ)。基因芯片技術(shù)加深了對DLBCL生物學(xué)特性的理解，但因其對標(biāo)本的要求較 高(新鮮標(biāo)本、適宜的冷凍保存等)、操作復(fù)雜、且基因芯片檢測代價(jià)較高，使 用基因芯片檢測費(fèi)用為每例患者7000-9000元，故制約了其臨床實(shí)用性。
因此，本領(lǐng)域迫切需要尋找到DLBCL分子分型與其臨床治療之間的聯(lián)系， 從而采用簡單、低費(fèi)用而可靠分型的分子標(biāo)志物、方法以及相應(yīng)的試劑盒對不 同治療方案的預(yù)后效果進(jìn)行評估比較，并治療方案進(jìn)行選擇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤分子分型的免疫組織化學(xué) 診斷試劑盒。本發(fā)明的另一目的在于為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤臨床治療方案的選 擇以及預(yù)后效果的評估比較提供臨床指導(dǎo)。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種試劑盒，其用于彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的預(yù) 后比較和/或治療方案的選擇，所述試劑盒包括
i) 檢測生物樣品中CD10蛋白表達(dá)的一種或多種試劑；
ii) 檢測生物樣品中Bcl-6蛋白表達(dá)的一種或多種試劑；以及
iii) 檢測生物樣品中MUMl蛋白表達(dá)的一種或多種試劑。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述預(yù)后比較和/或治療方案的選擇是針對聯(lián) 合化療和聯(lián)合化療與利妥昔單抗的聯(lián)合治療的。
在另一優(yōu)選例中，所述聯(lián)合化療為CHOP聯(lián)合化療，即環(huán)磷酰胺-阿霉素-長春新堿-潑尼松聯(lián)合化療。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述試劑盒中的試劑i)、 ii)和iii)分別用于 對生物樣品中CDIO、 Bcl-6和MUM1的表達(dá)進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述生物樣品獲自未經(jīng)臨床治療的彌漫大 B細(xì)胞淋巴瘤患者的的新鮮組織、福爾馬林固定或石蠟包埋組織。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述試劑盒還包含選自下組的一種或多 種陽性對照物、陰性對照物、使用說明書、 一抗稀釋緩沖劑、DAB、抗原修復(fù) 齊廿、封閉液、11202-甲醇、或蘇木精。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述使用說明書中寫明當(dāng)檢測結(jié)果顯示
CD 10(+)、或CD 10(-)/Bcl-6(+)/MUMl (-)則表明該患者為GCB型患者，對該患者采 用聯(lián)合化療方案治療與采用聯(lián)合化療與利妥昔單抗的聯(lián)合治療方案治療預(yù)后 無明顯差異；當(dāng)CD 10(-)/Bcl-6(-)、或CD 10(-)/Bd-6(+)/MUM 1 (+)則表明該患者為非 GCB型患者，對該患者采用聯(lián)合化療與利妥昔單抗的聯(lián)合治療方案治療其預(yù)后 優(yōu)于采用聯(lián)合化療方案。
在另一優(yōu)選例中，所述說明書寫明推薦GCB型患者僅采用傳統(tǒng)CHOP方案 治療，而非GCB患者則推薦采用R-CHOP方案治療。
本發(fā)明的第二方面，提供了 CDIO、 Bcl-6和MUM1的表達(dá)檢測試劑或試劑 組在制備用于彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的治療方案選擇和/或預(yù)后比較的試劑盒中 的途。
在一個(gè)優(yōu)選例中，所述預(yù)后比較和/或治療方案的選擇是針對聯(lián)合化療和聯(lián) 合化療與利妥昔單抗的聯(lián)合治療的。
本發(fā)明的第三方面，提供了CDIO、 Bcl-6和MUM1聯(lián)合作為彌漫大B細(xì)胞淋 巴瘤治療方案選擇和/或預(yù)后比較的分子標(biāo)志物的用途。
本發(fā)明的第四方面，提供了一種對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤預(yù)后效果進(jìn)行體外比較 的方法，所述方法包括
a) 檢測生物樣品中CDIO、 Bcl-6禾口MUM1的表達(dá)情況；
b) 分析由步驟a)所得的檢測結(jié)果；
其中CD10(+)、或CD10(-)/Bcl-6(+)/MUMl(-)則表明對所述彌漫大B細(xì)胞淋巴 瘤患者采用CHOP方案治療與采用R-CHOP方案治療預(yù)后無明顯差異；
CD10(-)/Bcl-6(-)、或CD10(-)/Bcl-6(+)/MUMl(+)則表明對所述彌漫大B細(xì)胞淋 巴瘤患者采用R-CHOP方案治療的預(yù)后優(yōu)于采用CHOP方案治療。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述方法還包括對國際預(yù)后指數(shù)進(jìn)行評估。 在本發(fā)明的第五方面，提供了一種對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的治療方案進(jìn)行 選擇的方法，所述方法包括
a) 檢測生物樣品中CDIO、 Bcl-6和MUM1蛋白的表達(dá)情況；
b) 分析由步驟a)所得的檢測結(jié)果；
其中CD10(+)、或CD10(-)/Bcl-6(+)/MUMl(-)則表明宜對所述彌漫大B細(xì)胞淋 巴瘤患者采用CHOP方案治療；
CD10(-)/Bcl-6(-)、或CD10(-)/Bcl-6(+)/MUMl(+)則表明宜對所述彌漫大B細(xì)胞 淋巴瘤患者采用R-CHOP方案治療。


圖l所示為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤免疫組化分子分型樹示意圖。
圖2所示為DLBCL的免疫組化分子分型。 圖3所示為42例GCB型患者的生存曲線。 圖4所示為62例非GCB型患者的生存曲線。
具體實(shí)施例方式
有報(bào)道通過檢測代表B細(xì)胞不同分化階段的三種基因(CDIO、 Bcl-6和 MUM1)的表達(dá)，可以對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤進(jìn)行分子分型并評估預(yù)后。本發(fā)明 人以該國際上彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤分子病理研究為背景，對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤 病人進(jìn)行基因芯片分析及病理切片上CDIO、 Bcl-6和MUM1的表達(dá)檢測，并將 檢測的這三種標(biāo)志物蛋白表達(dá)的試劑組成試劑盒，以其檢測結(jié)果比較不同治療 方案的預(yù)后效果，并指導(dǎo)治療方案的選擇，完成了本發(fā)明。
具體而言，將檢測CDIO、 Bcl-6和MUM1蛋白表達(dá)水平的試劑組合，同時(shí) 檢測這三種標(biāo)志物蛋白表達(dá)情況，根據(jù)蛋白表達(dá)情況對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤進(jìn) 行分子分型，指導(dǎo)臨床治療方案的選擇。國內(nèi)外尚未與本發(fā)明提出的彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤分子病理試劑盒及相關(guān)治療方案選擇指導(dǎo)相似的研究。
發(fā)明人通過免疫組化的方法對所選的三種標(biāo)志物進(jìn)行了驗(yàn)證將分別針對 以上三種蛋白的單克隆抗體(monoclonal antibody, McAb，可市售獲得)及相關(guān) 二抗和顯色劑組合成試劑盒，利用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry， IHC) 等方法，對104例DLBCL標(biāo)本進(jìn)行了 CD 10 、 Bcl-6和MUM 1蛋白的表達(dá)情況檢測，對結(jié)果進(jìn)行了分析。結(jié)果證明通過檢測三種蛋白表達(dá)情況，可簡便而靈敏地對
彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤進(jìn)行分型并指導(dǎo)臨床治療方案的選擇，采用傳統(tǒng)的CHOP 方案GCB型患者預(yù)后優(yōu)于非GCB型患者；利妥昔單抗(Rituximab)可以使非GCB 型患者受益，而并不能提高GCB型患者的療效。因此，在臨床實(shí)踐中對BCB型 患者宜采用CHOP治療方案，而對非GCB型患者則宜采用R-CHOP治療方案。因 此本發(fā)明的方法和試劑盒對于對于聯(lián)合化療(CHOP)和結(jié)合利妥昔單抗的聯(lián)合 化療(R-CHOP)的選擇和預(yù)后比較尤具重要意義。
在此基礎(chǔ)上，組成了彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤分子病理試劑盒，并建立了使用 此試劑盒進(jìn)行彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤分子分型并指導(dǎo)臨床治療方案的選擇的方 法，完成了本發(fā)明。
彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)的分型
如背景技術(shù)部分所述，彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤可分為GCB型與非GCB型兩個(gè) 大類。利用基因芯片的分型方法復(fù)雜且檢測費(fèi)用較高，以CDIO、 Bcl-6和MUM1 這三個(gè)基因相應(yīng)的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行分子分型，檢測費(fèi)用較低、方便易行。其 中CD10和Bcl-6為生發(fā)中心B細(xì)胞標(biāo)志，而MUM1為后生發(fā)中心B細(xì)胞標(biāo)志。在 本發(fā)明中，術(shù)語"表達(dá)"是指CDIO、 Bcl-6和MUM1基因經(jīng)過、翻譯等步驟， 在細(xì)胞中產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子，即產(chǎn)生CDIO、 Bcl-6和MUM1蛋白。
如本發(fā)明圖1的彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤分子分型樹示意圖所示，CDIO、 Bcl-6 和MUM1蛋白表達(dá)情況與DLBCL分子分型的關(guān)系。
在本發(fā)明中，"分子標(biāo)志物"、"指標(biāo)"可互換使用，均表示本發(fā)明中可 用于指示DLBCL分型、預(yù)后效果和/或?qū)ζ渑R床治療方案選擇具有指導(dǎo)意義的 分子。本發(fā)明的分子標(biāo)志物具體為CDIO、 Bcl-6和MUM1。
本發(fā)明中，"CD10" 、 "Bcl-6"和"MUM1"代表著B細(xì)胞分化的不同階 段的分子基因標(biāo)志，其中CD10和Bcl-6為生發(fā)中心B細(xì)胞標(biāo)志，而MUM1為后生 發(fā)中心B細(xì)胞標(biāo)志。
當(dāng)CD10(+)、或CD10(-)/Bcl-6(+)/MUMl(-)則表明所述彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤為 GCB型；當(dāng)CD10(-)/Bcl-6(-)、或CD10(-)/Bcl-6(+)/MUMl(+)則表明所述彌漫大B細(xì) 胞淋巴瘤為非GCB型。
在本發(fā)明中，"(+)"表示檢測結(jié)果為陽性，"(-)"則表示檢測結(jié)果為陰性。 在本發(fā)明中，術(shù)語"陰性"是指檢測結(jié)果顯示標(biāo)志物分子在樣品中不表達(dá)或與
8陰性對照相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)或組織學(xué)上的差異。反之，術(shù)語"陽性"是指檢測結(jié)果 顯示標(biāo)志物分子在樣品中表達(dá)或與陰性對照相比表達(dá)增加或存在統(tǒng)計(jì)學(xué)或組 織學(xué)上的明顯差異。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)具體的檢測方法、檢測需要和檢測 條件，選擇適當(dāng)?shù)年栃院完幮詫φ铡⑦x擇檢測方法并設(shè)定對照和陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。 在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，采用了免疫組織化學(xué)檢測方法，CD10陽性定
位于細(xì)胞膜，Bcl-6、 MUM1陽性定位于細(xì)胞核，>30%的腫瘤細(xì)胞著色判為陽性。
在本發(fā)明中，如果只標(biāo)明某一基因或某兩個(gè)基因的表達(dá)情況，則表明只要這 一或這兩個(gè)基因符合所述條件，就可以對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤作出分型或預(yù)后評 估或治療方案選擇指導(dǎo)。例如當(dāng)CD10(+)時(shí)表明所述彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤為GCB 型，在本發(fā)明中是指只要測得CD10的表達(dá)為陽性，就表明該彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤 為GCB型，而無需再考慮Bcl-6和MUMl的表達(dá)情況。
用于檢測CDIO、 Bcl-6和MUM1表達(dá)情況的方法優(yōu)選免疫組織化學(xué)檢測，但 也可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它檢測方法。
治療方案選擇及預(yù)后比較
目前國內(nèi)外常用于DLBCL治療的方案為CHOP聯(lián)合化療方案(環(huán)磷酰氨、 阿霉素、長春新堿和潑泥松)、結(jié)合人-鼠嵌合性抗CD20單克隆抗體利妥昔和 CHOP聯(lián)合化療(R-CHOP)。
CHOP聯(lián)合化療方案只能使約40%的患者獲得長期緩解，但其治療費(fèi)用相 對低廉。而利妥昔單抗與CHOP的聯(lián)合治療方案可進(jìn)一步提高DLBCL的臨床 療效，改善患者的預(yù)后，然而該方案每個(gè)療程治療費(fèi)用為10-15萬人民幣，對 于大部分患者而言是沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
因此區(qū)分適用不同治療方案的患者，尤其是僅采用CHOP聯(lián)合化療方案就 可獲得良好預(yù)后的患者和必須采用聯(lián)合利妥昔單抗治療方案的患者，對于提高 DLBCL的臨床治療的效果、改善預(yù)后、減輕醫(yī)患負(fù)擔(dān)均有重要的意義。
采用CD10、 Bcl-6和MUM1可對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤病人進(jìn)行病理分型， 即CD10(+)、或CD10(-)/Bcl-6(+)/MUMl(-)則表明該患者為GCB型患者，而 CD10(-)/Bcl-6(-)、或CD10(-)/Bcl-6(+)/MUMl(+)則表明該患者為非GCB型患者。
本發(fā)明人在研究中意外地發(fā)現(xiàn)CD10、 Bcl-6和MUM1除了可對彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤病人進(jìn)行分型以外，還可用于比較臨床治療方案的預(yù)后效果，對臨床治療方案進(jìn)行選擇指導(dǎo)(尤其是對中國患者而言)。
本發(fā)明證實(shí)了釆用傳統(tǒng)的CHOP方案GCB型患者預(yù)后優(yōu)于非GCB型患 者；利妥昔單抗(Rituximab)可以使非GCB型患者受益，而并不能提高GCB型 患者的療效。因此，在臨床實(shí)踐中對BCB型患者宜采用CHOP治療方案，而 對非GCB型患者則宜采用R-CHOP治療方案。因此本發(fā)明的方法和試劑盒對 于對于聯(lián)合化療(CHOP)和結(jié)合利妥昔單抗的聯(lián)合化療(R-CHOP)的選擇和預(yù)后 比較尤具重要意義。
本發(fā)明的治療方案選擇及預(yù)后評估還可結(jié)合國際預(yù)后指數(shù)(IPI)等其它生 理病理預(yù)后評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行，以進(jìn)一步提高其準(zhǔn)確性。
在本發(fā)明中可采用CDIO、 Bcl-6和MUM1，僅對治療方案進(jìn)行選擇或僅對 預(yù)后進(jìn)行評估，也可同時(shí)將兩者結(jié)合在一起綜合考慮以對指導(dǎo)患者整個(gè)療程的 總體治療。
試劑盒
本發(fā)明中還提供了一種試劑盒，該試劑盒中含有i)檢測生物樣品中CD10蛋 白表達(dá)的一種或多種試劑；ii)檢測生物樣品中Bcl-6蛋白表達(dá)的一種或多種試劑；
以及iii)檢測生物樣品中MUMl蛋白表達(dá)的一種或多種試劑。
本發(fā)明的試劑盒可用于彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的分型、治療方案選擇、和/或預(yù) 后評估。
生物樣品是獲自彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者的淋巴瘤組織。樣品主要以組織 切片形式供檢測，可采用福爾馬林固定、石蠟包埋切片或新鮮組織切片標(biāo)本。 樣品采集優(yōu)選先于患者接受臨床治療。
用于本發(fā)明中的檢測方法優(yōu)選免疫組織化學(xué)檢測法，該方法可極為簡便而 有效地檢測并確定樣品中CDIO、 Bcl-6和/或MUM1表達(dá)的狀況，非常適用于 臨床應(yīng)用。當(dāng)然，本發(fā)明也不排除本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用的其它檢測方法，諸 如蛋白質(zhì)印跡法、ELISA法、流式細(xì)胞法、生物芯片法等，但其操作過程可能 較本發(fā)明中優(yōu)選的免疫組化方法繁瑣，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要進(jìn)行選擇。
可根據(jù)多種檢測原理和方法，按照需要在試劑盒中配備檢測CDIO、 Bcl-6 和域MUM1蛋白表達(dá)的試劑或試劑組。在本發(fā)明中，"試劑組"是指包含了 檢測所需的多種試劑的試劑組合。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所采用的檢測方法是免疫組織化學(xué)檢測法，因此在試劑盒中所包含的檢測CDIO、 Bcl-6和MUM1的試劑包括各自 抗CDIO、 Bcl-6和MUM1蛋白的一抗、二抗、免疫組化所需的其它試劑等。
此外，本發(fā)明的試劑盒還可根據(jù)需要包括容器、對照物(包括陽性或陰性對
照)、使用說明書、緩沖劑、免疫助劑等，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)具體情況對其進(jìn) 行選擇。
有益效果
1. 通過分子分型對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤進(jìn)行危險(xiǎn)分層，揭示其內(nèi)在的分子 異質(zhì)性，有利于及早識別高危患者，以及選擇合理的治療方案。
2. 通過選擇的三種蛋白分子標(biāo)志物組成的試劑盒進(jìn)行彌漫大B細(xì)胞淋巴 瘤分子分型，解決了基因芯片技術(shù)對DLBCL進(jìn)行分型的過程中對標(biāo)本的要求 高、操作復(fù)雜、代價(jià)高的問題，提高了臨床實(shí)用性。使用基因芯片的檢測費(fèi)用 為每例患者7000-9000元，而使用DLBCL分子病理分型診斷試劑盒檢測為每例 患者200-300元，費(fèi)用明顯降低，且檢測效果相似、重復(fù)性好。
3. 利妥昔單抗每個(gè)療程治療費(fèi)用為10-15萬元，對于國內(nèi)大部分患者來說 是沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因?yàn)槔孜魡慰共⒉荒芴岣逩CB型患者的療效，故鑒定患者 的分子病理分型后，選擇合理的治療方案，有利于節(jié)約這部分GCB型患者的醫(yī) 療支出。
實(shí)施例
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方 法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建 議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟 悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于 本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
實(shí)施例1.DLBCL標(biāo)本收集、處理與檢測
1.標(biāo)本收集入選本研究的病例為104例初治DLBCL患者。DLBCL標(biāo)本均以10%中性甲 醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色，由專門從事淋巴瘤研究 的醫(yī)生按新的WHO分類診斷。
2.標(biāo)本處理
(1) 準(zhǔn)備組織切片(石蠟切片脫蠟至水，冰凍切片和細(xì)胞培養(yǎng)片并固定)。
(2) 抗原修復(fù)(微波加熱法，適用石蠟切片)將切片置于耐高溫容器中，注入 抗原修復(fù)液Tris/EDTA(50mMTris， 2mMEDTA， PH9,0)，使切片位于液面以下。 置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保存在92'C-98X:之間并持續(xù)5分鐘，取出容 器，室溫冷卻，30-50分鐘后降至室溫。
實(shí)施例2.彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤分子病理分型的免疫組化檢測及結(jié)果判定
1. 用TBS沖洗切片4-5次，甩干，擦凈，加20iil3XH2O2-甲醇溶液，于室 溫濕盒中封閉30分鐘。
2. 取出切片，用TBS沖洗4-5次，甩干，擦凈。用封閉液20"1覆蓋，室 溫濕盒孵育30分鐘。用吸水紙將封閉液吸去，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的市售 一抗工作液(CDIO，購自Novocastra， 1: 80; Bcl6,購自DAKO， 1: 10; MUM1, 購自DAKO， 1: 40)。 37'C孵育1-2小時(shí)或4。C過夜。
3. TBST沖洗4-5次，甩干，擦凈。滴加二抗(HRP標(biāo)記，ChemMate TMEnVision+/HRP)20 y 1，室溫濕盒孵育l-2小時(shí)。
4. TBST沖洗4-5次，滴加DAB約30u 1/片，著色后迅速(約一分鐘內(nèi))沖洗干凈。
5.20wl蘇木精復(fù)染。
6. 沖洗干凈脫水封片。
7. 鏡檢。
8. CDIO、 Bcl6和MUMl的檢測結(jié)果判定
CD10陽性定位于細(xì)胞膜，Bcl-6、 MUM1陽性定位于細(xì)胞核，>30%的腫瘤 細(xì)胞著色判為陽性，反之為陰性(見圖2)。
實(shí)施例3.彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者分子分型
CD10 、 Bc-6作為生發(fā)中心細(xì)胞來源的標(biāo)志物，CD10(+)或
12CD10(-)/Bcl-6(+)/MUMl(-)'為GCB類；CD10(-)/bd-6(-)，為非GCB類。MUM1 作為后生發(fā)中心細(xì)胞來源的標(biāo)志物，若CD10(-)/bcl-6(+)，則以MUM1來分類 MUMl(+)為非GCB類，MUMl(-)為GCB類(見圖1禾卩圖2)， 即 CD 10(-)/bcl-6(+)/MUMl(+)為非GCB類，CD 10(陽)/bcl國6(+)/MUM 1 (-)為GCB類。
根據(jù)該分子分型方法，依據(jù)前述實(shí)施例中的免疫組化檢測結(jié)果，所采集的 104例初治DLBCL患者中，有42例分型為GCB型患者，而其余62例為非GCB型患者。
實(shí)施例4.彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者病理分型與治療選擇和預(yù)后比較的相關(guān)性分 析
1. 治療分組
實(shí)施例1中的104名入選患者按照院所要求簽定知情同意。患者接受6個(gè)療 程標(biāo)準(zhǔn)劑量的CHOP或R-CHOP方案治療，根據(jù)病情加或不加用放療。
CHOP方案具體組成如下環(huán)磷酰胺750 mg/m2，靜推，第l天；阿霉素50 mg/m2，靜推，第l天；長春新堿1.4mg/m2(最大劑量，2.0 mg)，靜推，第l天； 和潑尼松60mg， 口服，第l-5天。
R-CHOP方案具體組成如下利妥昔單抗375 mg/m2，緩慢靜滴，第l天-, 環(huán)磷酰胺750 mg/m2，靜推，第2天；阿霉素50 mg/m2，靜推，第2天；長春新 堿1.4mg/m2(最大劑量，2.0 mg)，靜推，第2天；和潑尼松60mg， 口服，第2-6 天。
療效評估在6個(gè)療程治療后1個(gè)月進(jìn)行。所有患者必須進(jìn)行頸、胸、腹部CT 掃描的檢查，不論發(fā)病時(shí)這些部位是否受累。根據(jù)國際工作組標(biāo)準(zhǔn)(International Workshop criteria),將治療反應(yīng)分為完全緩解(CR)、臨床完全緩解(Cru)、部分 緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)和疾病進(jìn)展(PD)。總有效率定義為CR， Cru和PR之和。
對病例中可隨訪病例進(jìn)行隨訪截止時(shí)間為2007年12月。本研究的主要研究 終點(diǎn)是不同患者的累積存活率(Cumulated Survival Rate)。 OS定義為初次確診至 死亡或末次隨訪時(shí)間。
2. 結(jié)果與分析
應(yīng)用SPSS13.0軟件，對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者進(jìn)行生存分析，研究不同 亞型、不同治療方案對預(yù)后的影響(P〈0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。結(jié)果顯示，42例分型為GCB型的患者，采用CHOP方案與采用R-CHOP方案 預(yù)后無明顯差異(P二0.26287)(見圖3); 62例分型為非GCB型的患者，釆用 R-CHOP方案治療其預(yù)后顯著優(yōu)于采用CHOP方案治療(P-0.00766)(見圖4)。
以上結(jié)果表明，采用傳統(tǒng)的CHOP方案GCB型患者預(yù)后優(yōu)于非GCB型患者； 利妥昔單抗(Rituximab)可以使非GCB型患者受益，而并不能提高GCB型患者的 療效。因此，在臨床實(shí)踐中對BCB型患者宜采用CHOP治療方案，而對非GCB 型患者則宜采用R-CHOP治療方案。
實(shí)施例5.檢測試劑盒
按如下組成制備本實(shí)施例中的試劑盒 抗CDIO、 Bcl-6和MUMl蛋白的一抗(各50u 1， -2(TC保存)； HRP標(biāo)記的二抗，即用型(5ml， 2-8°C); DAB工作液Fl-濃縮緩沖液100wl(20X)， 2-8。C(避光)； F2-DAB溶液100u 1(20 X) 2-8。C(避光)； F3-濃縮H202 100u 1(20X)， 2-8。C(避光)； 抗原修復(fù)劑(Unmasking Buffer, 5.1g， 2-8°C); 封閉液50ml; 11202-甲醇15ml; 蘇木精15ml。
使用該試劑盒按照實(shí)施例l-3的方法，可檢測樣品中CD-IO、 Bcl-6和MUM1 蛋白的表達(dá)情況。采用本發(fā)明的方法和該試劑盒，根據(jù)所得結(jié)果對患者的預(yù)后 做出評估，評估結(jié)果與臨床實(shí)踐相吻合。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn) 被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后， 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申 請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1. 一種試劑盒，其用于彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的預(yù)后比較和/或治療方案的選擇，其特征在于，所述試劑盒包括i)檢測生物樣品中CD10蛋白表達(dá)的一種或多種試劑；ii)檢測生物樣品中Bcl-6蛋白表達(dá)的一種或多種試劑；以及iii)檢測生物樣品中MUM1蛋白表達(dá)的一種或多種試劑。
2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述預(yù)后比較和/或治療方 案的選擇是針對聯(lián)合化療和聯(lián)合化療與利妥昔單抗的聯(lián)合治療的。
3. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中的試劑i)、 ii) 和iii)分別用于對生物樣品中CDIO、 Bcl-6和MUM1的表達(dá)進(jìn)行免疫組織化學(xué) 檢測。
4. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述生物樣品獲自未經(jīng)臨床 治療的彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者的的新鮮組織、福爾馬林固定或石蠟包埋組織。
5. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含選自下組 的一種或多種陽性對照物、陰性對照物、使用說明書、 一抗稀釋緩沖劑、DAB、 抗原修復(fù)劑、封閉液、11202-甲醇、或蘇木精。
6. 如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述使用說明書中寫明當(dāng) 檢測結(jié)果顯示CD10(+)、或CD10(-)/Bcl-6(+)/MUMl(-)則表明該患者為GCB型患者， 對該患者采用聯(lián)合化療方案治療與采用聯(lián)合化療與利妥昔單抗的聯(lián)合治療方案 治療預(yù)后無明顯差異；當(dāng)CD10(-)/Bcl-6(-)、或CD10(-)/Bcl-6(+)/MUMl(+)則表明該 患者為非GCB型患者，對該患者采用聯(lián)合化療與利妥昔單抗的聯(lián)合治療方案治 療其預(yù)后優(yōu)于采用聯(lián)合化療方案。
7. CDIO、 Bcl-6和MUM1的表達(dá)檢測試劑或試劑組在制備用于彌漫大B細(xì) 胞淋巴瘤的治療方案選擇和/或預(yù)后比較的試劑盒中的用途。
8. CD10、Bcl-6和MUM1聯(lián)合作為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤治療方案選擇和/或預(yù) 后比較的分子標(biāo)志物的用途。
9. 一種對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤預(yù)后效果進(jìn)行體外比較的方法，所述方法包括a)檢測生物樣品中CDIO、 Bcl-6和MUM1的表達(dá)情況；b)分析由步驟a)所得的檢測結(jié)果；其中CD10(+)、或CD10(-)/Bcl-6(+)/MUMl(-)則表明對所述彌漫大B細(xì)胞淋巴 瘤患者采用CHOP方案治療與采用R-CHOP方案治療預(yù)后無明顯差異；CD10(-)/Bcl-6(-)、或CD10(-)/Bcl-6(+)/MUMl(+)則表明對所述彌漫大B細(xì)胞淋 巴瘤患者采用R-CHOP方案治療的預(yù)后優(yōu)于采用CHOP方案治療。
10. —種對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的治療方案進(jìn)行選擇的方法，所述方法包括a) 檢測生物樣品中CDIO、 Bcl-6和MUM1蛋白的表達(dá)情況；b) 分析由步驟a)所得的檢測結(jié)果；其中CD10(+)、或CD10(-)/Bcl-6(+)/MUMl(-)則表明宜對所述彌漫大B細(xì)胞淋 巴瘤患者采用CHOP方案治療；CD10(-)/Bcl-6(-)、或CD10(-)/Bcl-6(+)/MUMl(+)則表明宜對所述彌漫大B細(xì)胞 淋巴瘤患者采用R-CHOP方案治療。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤進(jìn)行預(yù)后比較和/或治療方案的選擇的試劑盒及其用途，其特征在于，所述試劑盒包括i)檢測生物樣品中CD10蛋白表達(dá)的一種或多種試劑；ii)檢測生物樣品中Bcl-6蛋白表達(dá)的一種或多種試劑；以及iii)檢測生物樣品中MUM1蛋白表達(dá)的一種或多種試劑。采用本發(fā)明的試劑盒及方法可對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者采取有針對性的治療方案，從而提高治療方案的預(yù)后效果并節(jié)省醫(yī)療費(fèi)用。
文檔編號G01N33/68GK101470119SQ200710173600
公開日2009年7月1日 申請日期2007年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月28日
發(fā)明者夏祖光, 凱 宋, 張慶華, 李軍民, 沈志祥, 趙維蒞 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院;上海生物芯片有限公司