專利名稱：利用海洋微藻快速評價鉆井液急性毒性的方法
技術領域：
本發明涉及鉆井液的生物毒性評價，具體地說是利用海洋微藻快速評價鉆井液急 性毒性的方法。
背景技術：
鉆井液是一種由水以及各種化學處理劑組成的極其復雜的多相穩定膠態懸浮體， 其生物毒性主要來源于鉆井液各組分。對于鉆井液的生物毒性評價的研究始于20世紀60 年代，已發展了包括96h急性毒性和慢性毒性等多種評價方法，所采用的受試生物體多種 多樣，包括糠蝦、發光細菌、海洋微藻(如Skeletonema costatum,即本工作所選用的中肋 骨條藻)、橈腳類、蚤類和魚類以及雙貝類軟體動物、片腳類動物。美國等國家主要檢測鉆井 液的毒性，以歐洲經濟合作與發展組織(OECD)為代表的組織和國家則要求同時檢測鉆井 液及其組分的毒性。目前國內外對廢棄鉆井液的毒性檢測及分級評價方法尚無統一標準。
20世紀70年代中期美國環保局(EPA)和石油工業協會(API)共同制訂了巴西擬 糠蝦(Mysidopsis bahia)%h急性毒性實驗法，是美國環保局批準的鉆井液毒性評價的唯 一方法，也是美國試驗與材料學會(ASTM)和美國石油工業協會推薦的鉆井液毒性的評價 標準。由于美國EPA推薦使用的巴西擬糠蝦在我國無分布，我國學者致力于尋找新的可以 替代糠蝦的受試生物。
與美國EPA糠蝦法的96h急性毒性試驗時間相比，發光細菌法和發光海藻法測量 時間大大縮短。其中發光細菌法是根據發光細菌的發光度隨樣品毒性總體濃度的增高而呈 線性降低的特性，測定發光細菌在接觸樣品15min后的發光量，得出樣品的毒性水平。該檢 測方法具有簡易、快速、實時的特點，但由于多數鉆井液的黑褐色在發光細菌的發光波段有 吸收，需要校正才能應用。另外，該方法與糠蝦法的相關性較低，僅為0.3。而發光海藻法 采用專用的毒性檢測儀，如QwikLiteTM 200，利用夜光發光藻Pyrocystislunula作為測試 物種，當海藻接觸到污染物時，水中的毒性會殺死海藻，從死亡率預測污染物對人體和生態 環境危害的嚴重性，4 證時即可得出鉆井液的毒性結果。但是發光海藻在實驗室培養較 為困難，并且要求鉆井液儲備液的PH在7. 5-8. 0，通常鉆井液儲備液的pH值往往超出此范 圍。
在海洋環境中生物種類繁多，對鉆井液的耐受性差異也很大，鉆井液對海域污染 評價至少需要從海水和沉積物兩方面來衡量。因此，20世紀90年代一些歐洲北海沿岸國家 (North Sea countries 主要包括英國、挪威、荷蘭、丹麥)出臺了多種受試生物聯合毒性 評價指標，如挪威石油工業協會采用海洋微藻Skeletonema costatum、橈腳類動物Acartia tonsa和雙貝類軟體動物Abra alba、片腳類動物Corophium volutator等分別檢測合成基 鉆井液對海洋生物和底棲生物的毒性。西澳礦業與能源部(WADME)采用三種生物評價鉆井 液的毒性等邊金藻Isochysis sp.、對蝦Panaeus monodon以及橈腳類動物Gladioferens imparipes。
2001年我國頒布的國家標準《海洋石油勘探開發污染物生物毒性檢驗方法》GB/糠蝦法黑褐新 糠蝦法中華米 蝦法中華對 蝦法 幼鯉魚 法發光海 藻法發光細 菌法鹵蟲法美國EPA-60013-84-067美國試驗與材料學 會 ASTM (1988 年)96h LC50周名江等(2001年)96hLC 張保森等(1997年)96hLC5050王永艷等(1991年)96hLC50李長興等(1999年)96hLC50美國路易斯安納州 立大學(1991年)加拿大《Alberta Energy and Utilities Board Guide 50: Drilling Waste Management》指南 美國試驗與材料協 會 ASTM (1990 年) 我國現行行業標準 《海洋石油勘探開 發污染物生物毒性4~5h EC500.25hEC5096h LC50 或 NOEC昂貴，國內無受 試生物。可操作性差。生物個體差異 大，數據重現性差。同上同上快速，但實驗室 培養發光海藻有 難度，要求鉆井 液 pH 在 7.5-8.0。快速，但受鉆井 液的顏色干擾嚴 重，重現性不好， 與糠蝦法相關性差。鹵蟲幼體的養殖 技術、養殖條件 等方面都受到限否否否否 否是是否類型 方法提出者檢測指標 方法評價
CN 102031280 A說明書2/9 頁T18420. 2-2001(國家技術監督局，2002)規定采用對蝦的仔蝦、鹵蟲幼體或蒙古裸腹蚤三 者中至少一種進行毒性實驗(注尚未正式頒布的2006年該標準修訂版中仍采用上述 試驗動物)。鉆井液的急性毒性評價方法列于表1。
表1鉆井液的急性毒性評價方法一覽表
一物型 單生模可應 否場用 是現
權利要求
1.利用海洋微藻快速評價鉆井液急性毒性的方法，其特征在于1)按體積比取1份鉆井液加入9份海水，攪拌靜置后取上層混懸液做為貯備液；2)選擇對鉆井液敏感的海洋微藻進行培養至平穩期，得到進入平穩生長期后的海洋微 藻藻液；3)取錐形瓶10個或10個以上，將藻液與儲備液于錐形瓶中進行混合培養3 8小時； 以每個錐形瓶中液體體積為140mL計，藻液體積為IOOmL,所加入的儲備液體積從0至40mL 梯度變化，每個濃度設置2個平行樣；若混合容器中藻液與儲備液的體積不足的，以過濾滅 菌后的天然海水補充至140mL ；4)從錐形瓶中取樣，采用熒光分光光度計測定發射熒光光譜，得到678 685nm處的活 體藻葉綠素熒光強度；5)以未加儲備液的藻熒光強度作為對照，計算微藻的相對死亡率微藻的相對死亡率 =(未加鉆井液的藻熒光強度-加鉆井液的藻熒光強度)/未加鉆井液的藻熒光強度；6)半數有效濃度EC5tl的計算根據微藻的相對死亡率，利用Curveexpert或Microsoft Excel 2003軟件分別繪制 微藻死亡率與鉆井液濃度關系曲線，得出微藻致死率為50%所對應的鉆井液儲備液的體積 V(mL)，根據 EC5tl = 0. IVX 1.02X1070. 14.(單位=Hig*!/1)計算相應時間的 EC5tl 值，其中， 鉆井液儲備液的密度近似地取海水密度1. 02g · mL—1。7)根據EC5tl值按照國家標準確定鉆井液有無毒性。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于所述海洋微藻為中肋骨條藻 (Skeletonema costatum)、柔弱角毛藻(Chaetoceros debilis)、亞心型扁藻(Platymonas subcordiforus)或小球藻(Chlorella pynenoidosa)。
3.按照權利要求1所述的方法，其特征在于微藻的培養條件為(20士1)°C，4000 7000LUX，明暗周期12 12h，F/2培養基；接種后密度為1 4X104個/mL ；培養4 7d至 平穩期。
全文摘要
本發明涉及鉆井液的生物毒性評價，具體地說是利用海洋微藻快速評價鉆井液急性毒性的方法，將平穩生長期的海洋微藻液與鉆井液貯備液進行混合培養3～8小時；取樣，測定發射熒光光譜，得到678～685nm處的藻葉綠素熒光強度；以未加儲備液的微藻熒光強度作為對照，計算微藻的相對死亡率根據微藻的相對死亡率，利用Curveexpert或Microsoft Excel2003軟件繪制微藻死亡率與鉆井液濃度關系曲線，根據7～8h EC50值按照國家標準確定鉆井液有無毒性。本發明建立的微藻法對水基鉆井液的毒性評價結果與鹵蟲的96h LC50的一致，比常規96h生物毒性實驗時間縮短了88h，且能夠在現場使用。
文檔編號G01N21/64GK102031280SQ20091001952
公開日2011年4月27日 申請日期2009年9月30日 優先權日2009年9月30日
發明者劉麗萍, 張前前, 張妍, 李公讓, 梁生康, 薛玉志, 閆學平 申請人:中國海洋大學
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