專利名稱：一種人成骨肉瘤干細胞相關抗原標記物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及腫瘤生物學領域，更具體地講，涉及一種人成骨肉瘤干細胞相關抗原 標記物及其應用。
背景技術：
近年來，隨著對腫瘤干細胞理論認識的不斷深入，要求我們對腫瘤的起源和發生、 發展有更加清楚的認識。尤其是對白血病、乳腺癌、人神經膠質瘤和大腸癌等腫瘤干細胞 分離和鑒定工作的報道，不僅印證和鞏固了腫瘤干細胞理論，也使對其他腫瘤干細胞的鑒 定和內在分子機制特征的研究成為熱點。目前，國內外關于成骨肉瘤干細胞的報道極少， 2005年國外Gibbs等人采用體外培養方式，首次從細胞系中分離出含有干細胞樣骨肉瘤細 胞的肉瘤細胞球(sarcosphere)，表達多種間充質干細胞的表面標記物(如Stro-1、CD44 和0)10 以及胚胎干細胞特征基因(Nanog和Oct-4) ；2007年Colleen脅等發現體外培 養之成骨肉瘤細胞群體中存在SP細胞，但也未能分離鑒定具體的、特異性的成骨肉瘤干細 胞表面標記物。最為重要的是，這些工作均不是基于人原代腫瘤組織的研究工作，未進行嚴 格的細胞分離和體內接種試驗。2005年Gibbs等人首次分離出含有干細胞樣骨肉瘤細胞的肉瘤細胞球以及2007 年Colleen 等人從肉瘤病人標本中發現SP細胞。一方面，上述學者的工作主要局限 于體外細胞培養水平，未能在體內建立成骨肉瘤細胞異種移植模型以鑒定成骨肉瘤干細 胞的表型和功能(而這是腫瘤干細胞研究的金標準)；另一方面，SP細胞的分離方法存在 h0echst33342染料毒性、細胞活力低下、儀器配置較高等局限性。因而分離和鑒定特異性的 成骨肉瘤干細胞表面標記物是進行腫瘤干細胞針對性研究的技術基礎。SSEA-4 的現有研究和應用SSEA-4 即 stage specific embryonic antigen4，是屬 于階段特異性胚胎抗原的一種，作為一種早期胚胎的糖脂類抗原，常用作為胚胎干細胞和 間充質干細胞的表面標志物，但從未腫瘤干細胞的鑒定和篩選，本發明第一次將SSEA-4作 為表面標志物，作為成骨肉瘤干細胞的鑒定。
發明內容
本發明的目的是提供一種人成骨肉瘤干細胞相關抗原標記物。本發明的第二個目的是提供所述人成骨肉瘤干細胞相關抗原標記物SSEA-4在成 骨肉瘤靶向治療中的應用。本發明利用前期建立的19個人成骨肉瘤跨物種移植模型和無血清培養技術，從 體內和體外兩方面，分離和鑒定出具有間充質干細胞和胚胎干細胞雙重特征的成骨肉瘤表 面標記物SSEA-4與腫瘤干細胞群體共存。表面標記物SSEA-4易于抗體標記，標記不影響 細胞活力，適合分離后的功能實驗；同時SSEA-4不僅提示成骨肉瘤可能起源于間充質干細 胞階段，為后續機制研究提供具體分子對象和模型平臺。在臨床上，在一部分病人中的表達 程度，能夠提示其惡性程度、轉移及預后情況，是潛在的可作為靶向治療的分子靶點。
由于成骨肉瘤病人原代標本跨物種移植成功率較低，所以我們嘗試了大量的臨床 標本，最后得到3個動物模型。另外，我們檢測了多個具有間充質干細胞和胚胎干細胞表面 標記物，根據表達情況和文章報道的相關標記物，選擇具有間充質干細胞和胚胎干細胞雙 重特征的SSEA-4作為骨肉瘤表面標記物后，遂加以證實，最后我們結合細胞系和病人臨床 標本，對標記物的特異性進行了驗證。SSEA-4是一特異性的成骨肉瘤干細胞表面標記物，在各正常成體組織中幾乎不表 達。此表面標記物易于抗體標記，不影響細胞活力，適合分離后的功能實驗，為進一步研究 干細胞在成骨肉瘤的起源、發生和發展過程的作用提供了一可靠的分子示蹤物，為解釋臨 床成骨肉瘤耐藥、轉移和尋找靶向治療的細胞和分子靶點奠定了基礎。
下面結合說明書附圖，對本發明進一步詳細說明。圖1 成骨肉瘤細胞免疫表型的篩選。選擇間充質干細胞和胚胎干細胞常用的表 面標記物 CD105、CD166、CD117、CD90、CD44、STR0-1、SSEA-4、SSEA-3 等。圖2A 原代成骨肉瘤細胞表達SSEA-4和0ct_4 ；圖2B 建立的成骨肉瘤細胞系 5well 表達 SSEA-4 和 0ct_4。圖3 成骨肉瘤病理標本免疫組化顯示SSEA-4、nanog、oct_4表達。圖4 成骨肉瘤原代細胞在體外無血清培養條件下形成sphere。
具體實施例方式I、我們在前期研究中，采用初發成骨肉瘤病人的原代標本，消化成單細胞懸液后， 利用無血清培養技術和N0D/SCID小鼠成功建立了成骨肉瘤細胞球和跨物種移植模型。通 過流式細胞分析技術，對取自成瘤小鼠的成骨肉瘤細胞進行表型分析，發現這些細胞經常 表達SSEA-3、SSEA-4、CD184、CD105、CD166和CD49d等多個具有間充質干細胞和胚胎干細 胞表面標記物。II、對SSEA-4進行更加詳盡的驗證利用細胞系，采用免疫熒光和免疫組化得方 法，進行表型鑒定和驗證，在原代標本中測試表達情況等。III、通過對不同表面標記物之間更加細致的區分和比較，選取一小部分特異性最 強的標記物，進行免疫熒光抗體標記，利用流式分選技術將不同表達情況的成骨肉瘤細胞 分選出來，分別以梯度稀釋的方式移植入N0D/SCID小鼠，通過對成瘤情況的比較分析，選 定與成骨肉瘤致瘤能力最為相關的特異的表面標記物，即SSEA-4。IV、將得到的成骨肉瘤原代細胞在體外無血清培養條件下，加入FGF、N2B27等細 胞因子，能在體外形成成骨肉瘤細胞球(sphere)。
權利要求
1.一種人成骨肉瘤干細胞相關抗原標記物，其特征在于，所述標記物是SSEA-4。
2.權利要求1所述的人成骨肉瘤干細胞相關抗原標記物在成骨肉瘤靶向治療中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種人成骨肉瘤干細胞相關抗原標記物SSEA-4及其在成骨肉瘤靶向治療中的應用。SSEA-4是一特異性的成骨肉瘤干細胞表面標記物，在各正常成體組織中幾乎不表達。此表面標記物易于抗體標記，不影響細胞活力，適合分離后的功能實驗，為進一步研究干細胞在成骨肉瘤的起源、發生和發展過程的作用提供了一可靠的分子示蹤物，為解釋臨床成骨肉瘤耐藥、轉移和尋找靶向治療的細胞和分子靶點奠定了基礎。
文檔編號G01N33/533GK102053150SQ200910197959
公開日2011年5月11日 申請日期2009年10月30日 優先權日2009年10月30日
發明者張偉賓, 張武, 諸江 申請人:上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
