專利名稱：Fret測量方法及fret測量裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及通過激光照射供體分子(第一分子)接收能量、能量從供體分子轉移到受體分子(第二分子)的 FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer:突光共振能量轉移)的測量方法及裝置。具體而言，對于感受體和向心配合體結合，且設置有供體分子和受體分子的測量樣品照射激光，由此求出解離常數的FRET測量裝置和測量方法。
背景技術：
目前，作為醫療、制新藥、食品產業中后基因的相關技術，蛋白質的功能分析變得越來越重要。特別是，為了分析細胞作用，需要研究活細胞中活體物質的蛋白質與其它蛋白質或低分子化合物之間的相互作用(結合、分離)。利用熒光共振能量轉移(FRET)現象對活細胞中活體物質的蛋白質和其它蛋白質 或低分子化合物之間的相互作用進行分析。對通過FRET現象產生的熒光進行測量，由此能夠對幾納米波段中的分子間的相互作用進行測量。例如，公開了一種利用FRET發生時的供體分子的熒光壽命和受體分子不存在時的供體分子的熒光壽命τ d，求出表示從供體分子向受體分子的能量轉移程度的FRET效率的技術(專利文獻I)。在上述專利文獻I中，FRET效率根據I- τ *d/ τ d求出。但是，所述FRET效率受供體分子或受體分子的濃度的影響，因此利用所述技術定量地求出包含在細胞等中的蛋白質的相互作用的強度變得困難。通常，作為表示分子相互作用時的結合強度的指標，利用解離常數Kd。但是，有時不容易精確測量解離常數Kd。下面，針對解離常數Kd進行說明。例如，下述式(a)所示的反應的情況，解離常數Kd被定義為如下述式(2)。其中，L表示向心配合體，R表示感受體，LR表示與向心配合體結合的感受體。另外，[L]表示不與感受體結合的向心配合體的濃度(下面，稱之為“向心配合體濃度”)，[R]表示不與向心配合體結合的感受體的濃度(下面，稱之為“感受體濃度”)，[LR]表示與向心配合體結合的感受體的濃度。[數I]L + RLR (I)[數2]
Γ η ν剛州Rd =(2)其中，如果將包含在樣品中的全體向心配合體濃度表示為[L。]，全體感受體濃度表不為[R。]，則[L0] > [R0]由下面的關系式表不。[數3][L0] = [L] + [LR](3)[R0] = [R] + [LR](4)
如果根據式(2)和式(4)消除[R]，則能夠得到下述式(5)。[數4]
Γ im m lr,--~ 5 I m Kd+m m式(5)的左邊表示全體感受體中與向心配合體結合的感受體所占的比率。如果將[LR]/[RJ針對[L]的對數軸進行繪圖，則呈S形(sigmoid)曲線。解離常數Kd大表示從式(I)的右邊向左邊的反應容易發生。因此，解離常數Kd大到某種程度時，[L] >> [LR]的關系成立。此時，根據式(3)和式(5)，[LR]/[RJ被近似為如下述式(6)。[數5]
r im ^ [i0] ^
m ι<4+[ ο] 1;根據式(6)，當全體向心配合體濃度[L。]與解離常數Kd相同時，包含在樣品中的全體感受體中與向心配合體結合的感受體所占的比率[LR]/[R。]為O. 5。因此，使全體向心配合體濃度[L。]變化的同時測量[LR]/[R。]，從[LR]/[R。]成為O. 5時的全體向心配合體濃度[LJ能夠求出解離常數Kd。即使處于平衡狀態的向心配合體濃度[L]的測量變得困難，但也能夠求出全體向心配合體濃度[L。]，因此，利用通過上述方法求出解離常數Kd的方法。專利文獻I :特開2007-240424號公報
發明內容
但是，當解離常數Kd小時，關系式[L] >> [LR]不成立，因此無法將式(5)近似化為如式(6)—樣。因此，當解離常數Kd小時，使全體向心配合體濃度[L。]變化的同時測量[LR]/[RJ，當[LR]/[R。]變為O. 5時的全體向心配合體濃度[L。]與解離常數Kd的值不同的值，因此通過現有技術無法正確地求出解離常數Kd。因此，本發明的目的在于提供一種FRET測量方法和FRET測量裝置，與解離常數Kd大小無關地能夠精確地測量解離常數Kd。本發明的FRET測量方法對于感受體和向心配合體結合、且設置有第一分子和第二分子的測量樣品照射激光，由此測量能量從第一分子轉移到第二分子的FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer :突光共振能量轉移),該方法包括下述步驟激光照射步驟，將對強度進行時間調制了的激光照射所述測量樣品上；測量步驟，測量被所述激光照射的所述測量樣品所發出的熒光；熒光壽命計算步驟，利用在所述測量步驟所測量的熒光信號計算出第一分子的熒光壽命；結合比率計算步驟，利用在所述熒光壽命計算步驟所計算出的所述熒光壽命，計算出作為包含在所述測量樣品中的所述感受體中發生FRET的感受體比率的結合比率；結合條件設定步驟，設定所述測量樣品的結合條件，使得所述結合比率不同；解離常數計算步驟，計算出表示所述感受體和所述向心配合體的結合程度的解離常數；其中，所述解離常數計算步驟利用最小二乘法將所述測量樣品中的所述感受體的全體濃度和所述解離常數作為變量的函數，通過向所述結合比率計算步驟中計算出的所述結合比率擬合，求出所述解離常數。另外，當將結合比率表示為K ■、包含在所述測量樣品中的所述感受體的全體濃度表示為[R。]、包含在所述測量樣品中的所述向心配合體的全體濃度表示為[L。]、所述解離常數表示為Kd時，優選的是，在所述解離常數計算步驟中，利用將[R。]和Kd作為變量的二變量最小二乘法，并通過將下述式向Kfket和[L。]擬合，由此求出所述解離常數Kd。[數6]
權利要求
1.一種FRET測量方法，對于感受體和向心配合體結合、且設置有第一分子和第二分子的測量樣品照射激光，由此測量能量從第一分子轉移到第二分子的FRET (FluorescenceResonance Energy Transfer :突光共振能量轉移),該方法包括下述步驟 激光照射步驟，將對強度進行時間調制了的激光照射所述測量樣品上； 測量步驟，測量被所述激光照射的所述測量樣品所發出的熒光； 熒光壽命計算步驟，利用在所述測量步驟所測量的熒光信號計算出第一分子的熒光壽命; 結合比率計算步驟，利用在所述熒光壽命計算步驟所計算出的所述熒光壽命，計算出作為包含在所述測量樣品中的所述感受體中發生FRET的感受體比率的結合比率； 結合條件設定步驟，設定所述測量樣品的結合條件，使得所述結合比率不同； 解離常數計算步驟，計算出表示所述感受體和所述向心配合體的結合程度的解離常數； 其中，所述解離常數計算步驟利用最小二乘法將所述測量樣品中的所述感受體的全體濃度和所述解離常數作為變量的函數通過向所述結合比率計算步驟中計算出的所述結合比率擬合來求出所述解離常數。
2.根據權利要求I所述FRET測量方法，其特征在于，當將所述結合比率表示為kfket、包含在所述測量樣品中的所述感受體的全體濃度表示為[R。]、包含在所述測量樣品中的所述向心配合體的全體濃度表示為[L。]、所述解離常數表示為Kd時， 在所述解離常數計算步驟中，利用將[R。]和Kd作為變量的二變量最小二乘法，并通過將下述式向1^—和[L0]擬合，由此求出所述解離常數Kd。
[數I][·￡·ο] ■+■ [ ο] + Rd ρ K' gj ψ —..................................................................
3.根據權利要求I或2所述的FRET測量方法，其特征在于，在所述熒光壽命計算步驟中，利用在所述測量步驟所測量的熒光信號和對所述激光進行調制的調制信號的相位差，計算出第一分子的熒光壽命。
4.根據權利要求I至3中任一項所述的FRET測量方法，其特征在于，在所述感受體中結合有第一分子和第二分子，在所述結合條件設定步驟中，通過向所述測量樣品添加所述向心配合體，設定所述樣品的結合條件，以使得所述結合比率不同。
5.根據權利要求I至3中任一項所述的FRET測量方法，其特征在于，在所述感受體中結合有第一分子，在所述向心配合體中結合有第二分子，在所述結合條件設定步驟中，通過向所述測量樣品添加所述向心配合體，設定所述樣品的結合條件，以使得所述結合比率不同。
6.一種FRET測量裝置，對于感受體和向心配合體結合、且設置有第一分子和第二分子的測量樣品照射激光，由此測量能量從第一分子轉移到第二分子的FRET (FluorescenceResonance Energy Transfer :突光共振能量轉移),該裝置包括 激光光源部，將對強度進行時間調制了的激光照射至所述測量樣品上； 測量部，測量被所述激光照射的所述測量樣品發出的熒光；熒光壽命計算部，利用在所述測量部所測量的熒光信號，計算出第一分子的熒光壽命; 結合比率計算部，利用在所述熒光壽命計算部所計算出的所述熒光壽命，計算出作為包含在所述測量樣品中的所述感受體中發生F RET的感受體比率的結合比率； 解離常數計算部，計算出表示所述感受體和所述向心配合體的結合程度的解離常數； 其中，所述解離常數計算部利用最小二乘法將所述樣品中的所述感受體的全體濃度和所述解離常數作為變量的函數通過向所述結合比率不同的多個結合條件中所述結合比率計算部中所計算出的所述結合比率擬合，求出所述解離常數。
7.根據權利要求6所述的FRET測量裝置，其特征在于，當將結合比率表示為Kfket、包含在所述測量樣品中的所述感受體的全體濃度表示為[R。]、包含在所述測量樣品中的所述向心配合體的全體濃度表示為[L。]、所述解離常數表示為Kd時，所述解離常數計算部利用將[R。]和Kd作為變量的二變量最小二乘法，并通過將下述式向^皿和[LJ擬合，由此求出所述解離常數Kd。
8.根據權利要求6或7所述的FRET測量裝置，其特征在于，所述熒光壽命計算部利用在所述測量部所測量的熒光信號和對所述激光進行調制的調制信號的相位差，計算出第一分子的突光壽命。
9.根據權利要求6至8中任一項所述的FRET測量裝置，其特征在于，在所述感受體中結合有第一分子和第二分子，所述解離常數計算部在通過向所述測量樣品上添加所述向心配合體來使得所述結合比率不同的多個結合條件中，通過將在所述結合比率計算部中所計算出的所述結合比率擬合化而求出所述解離常數。
10.根據權利要求6至8中任一項所述的FRET測量裝置，其特征在于，在所述感受體中結合有第一分子，在所述向心配合體中結合有第二分子，所述解離常數計算部在通過向所述測量樣品上添加所述向心配合體來使得所述結合比率不同的多個結合條件中，通過將在所述結合比率計算部中所計算出的所述結合比率擬合化而求出所述解離常數。
全文摘要
本發明提供一種FRET測量方法及FRET測量裝置，在FRET測量方法中，對于感受體和向心配合體結合、且設置有第一分子和第二分子的測量樣品照射激光，由此測量能量從第一分子轉移到第二分子的FRET，該方法包括將激光照射至樣品上的步驟；對測量樣品所發出的熒光進行測量的步驟；計算第一分子的熒光壽命的步驟；計算結合比率的步驟；設定測量樣品的結合條件的步驟；計算解離常數的步驟，其中，在解離常數計算步驟中利用最小二乘法將樣品中的感受體的全體濃度和解離常數作為變量的函數通過向結合比率計算步驟中計算出的結合比率擬合，由此求出解離常數。
文檔編號G01N33/542GK102792153SQ20118001307
公開日2012年11月21日 申請日期2011年5月6日 優先權日2010年5月12日
發明者中田成幸, 星島一輝 申請人:三井造船株式會社
專業數控銑床產品供應商
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