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專利名稱：氨基酸診斷/測定試劑盒及氨基酸濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種氨基酸診斷/測定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測定氨基酸濃度的
方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/工業(yè)/農(nóng)業(yè)/環(huán)境檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氨基酸含量的測定在醫(yī)學(xué)/食品/工業(yè)/農(nóng)業(yè)/環(huán)境中都是比較重要的測定項(xiàng)目。 現(xiàn)有的測定方法有色譜法、電化學(xué)法、儀器分析法(氨基酸分析儀)、分光光度計(jì)等方法，這 些方法或是操作方法較為繁雜、特異性差、或儀器設(shè)備成本較高等缺點(diǎn)。 氨基酸不是單純的一種物質(zhì)，用氨基酸分析儀可直接測定出17種氨基酸(儀器價(jià) 格昂貴，不能普遍使用)，對(duì)于醫(yī)學(xué)/食品/工業(yè)/農(nóng)業(yè)/環(huán)境中來說，多數(shù)情況下，都是很 多種氨基酸同時(shí)存在，所以需要測定總的氨基酸含量，它們不能以氨基酸百分率來表示，只 能以氨基酸中所含的氮(氨基酸氮)的百分率表示。 大量食肉或饑餓時(shí)尿中氨基酸氮增加，孕婦及新生兒尿液氨基酸氮也增加。氨基 酸代謝異常，造成某些氨基酸在體內(nèi)積累過多，使尿中氨基酸氮增高；急性肝萎縮、肝功能 衰竭、Reye綜合征、或某些因素造成蛋白質(zhì)分解加速的疾病，遺傳性疾病所導(dǎo)致的代謝異常 均可使尿中氨基酸氮增加。 酶法測定血、尿、體液、食品、土壤、工業(yè)產(chǎn)品中氨基酸氮含量具有特異性高、方法 簡便、成本低的特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶雙倍擴(kuò)增法(EnzymaticDoubling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction) 技術(shù)，監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定氨基 酸濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的氨基酸診斷/測定試劑盒，采用該 試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行氨基酸濃度測定，而 且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明氨基酸濃度測定方法如下 氨基酸+水+氧氨某酸氧化酶氧代酸+氨+過氧化氫
氨+2-酮戊二酸+還原型輔酶谷氨酸脫氡酶谷氨酸+水+
輔酶
過氧化氫+還原型輔酶NADH過氧化物酶輔酶+2水 這種方法應(yīng)用氨基酸氧化酶(amino acid oxidase ;EC 1. 4. 3. 2 ;EC 1. 4. 3. 3)酶 (偶)聯(lián)谷氨酸脫氫酶(Glutamate dehydrogenase ;EC 1. 4. 1. 2 ;EC 1. 4. 1. 3) 、 NADH過氧 化物酶(NADH peroxidase ;EC 1. 11. 1. 1 ;EC 1. 11. 1. 2)酶促反應(yīng)比色法。氨基酸氧化酶酶 解氨基酸反應(yīng)產(chǎn)生氨及過氧化氫，再通過(偶)聯(lián)合谷氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶的雙 重作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度，通過測量340nm處吸光度下 降的程度，可以測算氨基酸的濃度大小。 實(shí)驗(yàn)表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單 劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明氨基酸診斷/測定試劑盒較為理想 本發(fā)明的氨基酸診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氨基酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶、 2-酮戊二酸。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、2-酮戊二酸。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶。 還原型輔酶、氨基酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶、2-酮戊二酸在試劑
l或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以
配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑l 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、2-酮戊二酸。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶。 還原型輔酶、氨基酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶、2-酮戊二酸在試劑 1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定氨基酸濃度的方法，其還原型輔酶可以是 NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。





緩沖液 穩(wěn)定劑
還原型輔酶
氨基酸氧化酶
谷氨酸脫氫酶
NADH過氧化物酶 2-酮戊二酸
4
實(shí)施例一 本實(shí)施例的氨基酸診斷/測定試劑為單試劑，包括 [OO42]三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
還原型輔酶 0. 25mmol/L 氨基酸氧化酶 6000U/L
谷氨酸脫氫酶 8000U/L
NADH過氧化物酶 10000U/L
2-酮戊二酸 16mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈 水，復(fù)溶后使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7，
測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨基酸樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方
向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測
主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出氨基酸的濃度大小。 實(shí)施例二 本實(shí)施例的氨基酸診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L
穩(wěn)定劑 50mmol/L
還原型輔酶 0. 25mmol/L 2-酮戊二酸 16mmol/L
試劑2 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 氨基酸氧化酶 6000U/L 谷氨酸脫氫酶 8000U/L NADH過氧化物酶 10000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7，
測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨基酸樣品與試劑1、試劑2的體積比例為
2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約O分鐘左右，檢測時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測
主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出氨基酸的濃度大小。 實(shí)施例三 本實(shí)施例的氨基酸診斷/測定試劑為三試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L
穩(wěn)定劑 50mmol/L
還原型輔酶 0. 25mmol/L 2-酮戊二酸 16mmol/L
試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
谷氨酸脫氫酶 8000U/L
NADH過氧化物酶 10000U/L
試劑3三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 氨基酸氧化酶 6000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定氨基酸濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，起
始吸光度1. 8±0. 7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨基酸樣品與試劑1、試劑
2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左
右，檢測時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出氨基酸的濃度大小。 申請人:經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達(dá)到本發(fā)明 的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。 總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0012 ;吸光度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈下 降曲線直至終點(diǎn)；試劑可測有效(R > 0. 99)線形范圍可達(dá)40mmol/L ;試劑測試的不準(zhǔn)確 度，其相對(duì)偏差不超過±4% ;試劑測試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《3% ;試劑 的靈敏度可達(dá)O. 05±0. 03 AA/mmol/L ;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā) 明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
一種利用酶雙倍擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的氨基酸濃度測定方法，其方法如下氨基酸+水+氧氨基酸氧化酶氧代酸+氨+過氧化氫氨+2-酮戊二酸+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸+水+輔酶過氧化氫+還原型輔酶NADH過氧化物酶輔酶+2水將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，測算出氨基酸的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種氨基酸診斷緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶J定試劑盒，主要成分包括20-500,1/L1-4000mmol/L 0. 1-0. 35,1/L1000-80000U/L1000-80000U/L1000-80000U/L1--50mmol/LNADH過氧化物酶 2_酮戊二酸試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會(huì) 反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氨基酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶、2-酮 戊二酸組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氨基酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶、2-酮 戊二酸組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、2_酮戊二酸組成；試劑2，由 緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶組成。還原型輔酶、氨基酸 氧化酶、谷氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶、2-酮戊二酸在試劑1或試劑2中的位置可以不 限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氨基酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶、2-酮 戊二酸組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、2_酮戊二酸組成；試劑2，由 緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧 化酶組成。還原型輔酶、氨基酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶、2-酮戊二酸在試 劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 l-4000mmol/L或0. 1 % _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶雙倍擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的氨基酸診斷/測定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測定氨基酸濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/工業(yè)/農(nóng)業(yè)/環(huán)境檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、2-酮戊二酸、氨基酸氧化酶、谷氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度，從而測算出氨基酸的濃度大小。
文檔編號(hào)G01N21/31GK101762492SQ20081023567
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司