專利名稱：檢測人TBP-2基因表達的Taqman探針熒光定量PCR方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種檢測人TBP-2基因表達的Taqman探針 熒光定量PCR方法。
背景技術：
實時熒光定量PCR是美國PE (Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的 核酸定量技術，通過對PCR擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測從而實現對起 始模板定量及定性的分析。該技術的原理是PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個 特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個熒光報告基團和一個熒光淬 滅基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’ 端-3’端外切酶活性將探針切開，使報告熒光基團游離出來，發出熒光信號，從而可被熒光 監測系統檢測到，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與 PCR產物形成完全同步。與普通PCR相比，實時熒光定量PCR具有特異性強，靈敏度高，準確 性好等優點，目前已應用于分子生物學研究范疇。硫氧還蛋白結合蛋白-2(thioredoxin-binding protein-2，TBP-2)在酵母雙雜交 實驗中被鑒定與還原的硫氧還蛋白(thioredoxinjrx)結合，從而抑制Trx的活性。TBP-2 在生物體內具有多種生物學功能，如調節細胞內氧化還原反應、與細胞的增殖、分化、凋亡、 老化等有關。癌癥組織中TBP-2的表達量減少，TBP-2高表達可以抑制腫瘤組織的生長，故 可被看作是一個抑癌基因。TBP-2還與葡萄糖代謝、脂肪代謝密切相關。因此，對TBP-2的 研究，在對許多疾病的發病機理及防治上都具有非常重要的意義?，F有檢測技術中未涉及該專利所用的檢測人TBP-2基因表達的引物及Taqman探 針序列。
發明內容
本發明的目的在于提供一種檢測人TBP-2基因表達的Taqman探針熒光定量PCR 的方法，利用該方法，對組織和細胞中TBP-2的表達及變化情況進行檢測，可以準確、快速、 靈敏地檢測出人TBP-2的表達及變化情況，具有良好的重復性和穩定性，可以反應基因 mRNA水平。為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案一種檢測人TBP-2基因表達的Taqman探針熒光定量PCR方法，包括設計合成 TBP-2引物和Taqman探針，提取細胞總RNA，反轉錄得cDNA，建立確定最佳退火溫度Tm值、 最佳引物濃度、最佳探針濃度的Taqman PCR反反應體系，以cDNA為標準品建立標準曲線。其中，TBP-2的兩條引物F/R和Taqman探針分別為FGGATCCCAGCAGTGCAAACR:AAGCCGAACTTGTACTCATATTTGT Probe :AGTACCTGCGCTATGAAGACACGCTT
最佳退火溫度Tm值的確定是以cDNA為模板進行擴增，反應體系為=PremixTaq Buffer 12. 5 μ UH2O 10·5μ1、ΤΒΡ_2 F/R 各 0· 5 μ 1，cDNA 1 μ 1 ；反應條件為95°C 2min ； 95°C 30s，(55°C、57°C、59°C、61°C )30s，72°C lmin，40 個循環；72°C 5min ；4°C lmin，擴增 產物用1. 5%瓊脂糖電泳檢測，通過電泳檢測確定Tm為59°C。最佳引物濃度的確定是在擴增條件相同情況下，以能夠檢測到的最低濃度的cDNA 模板，擴增產物條帶清晰，無非特異性擴增為引物選擇標準；分別設50ηΜ、100ηΜ、200ηΜ、 400ηΜ四個不同梯度的ΤΒΡ-2引物濃度，用同一濃度cDNA為模板，同時進行PCR檢測；反應 體系為 25μ 1 :Premix Taq Buffer 12·5μ1、ΤΒΡ_2 F/R各0· 5 μ 1、Η20 10. 5 μ l.cDNA 1 μ 1 混合均勻進行普通PCR擴增；反應條件為95°C 2min ；95°C 30s, 59°C 30s, 72°C lmin, 40 個循環；72°C 5min ；4°C lmin ；擴增產物用1. 5 %瓊脂糖電泳檢測，確定最佳引物濃度為 200nM。最佳探針濃度的確定是以相同模板和引物濃度下循環域值(Ct)最小、熒光信號 比(Rn)活度最大為探針選擇標準；采用50nM、100nM、200nM 3個探針濃度，分別用于同一 濃度cDNA為模板，進行TaqMan PCR檢測；反應體系為25 μ L =RealtimePCR Master Mix 12. 5 μ L、ΤΒΡ-2 F/R 各 0. 5 μ L、Probe 0. 5 μ 1、H2O 10 μ L、cDNAl μ 1 混合均勻；反應條件 為95°C 2min ；95°C 30s，59°C 30s, 72°C lmin，40 個循環；72°C 5min ；4°C lmin ；結果確 定最佳探針濃度為ΙΟΟηΜ。標準曲線的建立是利用反轉錄的cDNA的一個樣品作為標準品，進行四倍濃度梯 度稀釋，得5個濃度的標準品1，1/4，1/16，1/64，1/256，根據反應結果中樣品濃度對數值及 其Ct值的對應關系得出定量標準曲線。本發明的方法主要包括下述步驟A利用Primer Express 5. 0軟件設計適當的TBP-2的引物和探針B提取細胞中總RNA，并反轉錄成cDNAC以cDNA為模板，設計實驗得出最佳退火溫度，引物濃度和探針濃度D以cDNA為標準品四倍濃度梯度稀釋，建立標準曲線E檢測此方法的重復性，準確性和穩定性，并可以根據標準曲線計算出待測樣品的 相對表達量。
圖1為同源比對后得到的TBP-2保守區序列；圖2為最佳退火溫度電泳圖；圖3為確定最佳引物濃度的電泳圖；圖4為確定最佳探針濃度的曲線圖；圖5為以Hela細胞cDNA為標準品建立Taqman熒光定量PCR標準曲線；圖6為以Jarkat細胞cDNA為標準品建立Taqman熒光定量PCR標準曲線；圖7為以SH-SY5Y細胞cDNA為標準品建立Taqman熒光定量PCR標準曲線；圖8為檢測TBP-2基因表達的Taqman熒光定量PCR的實際應用結果圖。
具體實施例方式下面用本發明的實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但并不以此來限定本 發明。實施例1.TBP-2引物和探針的設計從NCBI上檢索到30多種人的細胞的TBP-2序列，進行序列同源性分析，經比對后 得到TBP-2基因的保守區(見圖1)，并利用Primer Express5. 0軟件在該基因的保守區設 計出引物和探針，引物跨越內含子，目的片段長度135bp。所設計的引物和探針如下FGGATCCCAGCAGTGCAAACR:AAGCCGAACTTGTACTCATATTTGTProbe :AGTACCTGCGCTATGAAGACACGCTT將設計好的引物和探針通過DNAstar軟件進行評價，結果顯示引物和探針的序列 均符合Taqman探針熒光定量PCR的條件。引物和探針由TAKARA公司合成。實施例2 cDNA 的制備(1)本發明以Hela細胞為例，提取細胞總RNA在IO5 IO6 個 Hela 細胞中加入 Iml Trizol (invitrogen)，室溫放置 IOmin,加入 0. 2ml氯仿，振蕩搖勻，室溫放置IOmin, 12000rpm 4°C離心lOmin，取上清，加入0. 5ml異丙 醇，輕輕搖勻，室溫靜置10min，12000rpm4°C離心lOmin，棄上清，向沉淀中加入Iml 75%乙 醇，7500rpm 4°C離心5min，去乙醇，自然干燥，沉淀即為RNA，20y 1 DEPC水溶解，-80°C保 存，用于下一步的反轉錄。(2) cDNA 的制備反轉錄采用一步法反轉錄試劑盒(Τ0Υ0Β0)進行，反應體系為DEP(^K 10 μ 1， 5XRT Buffer 4 μ l,dNTP Mixture (IOmM)2 μ 1, Oligo(dT)20 1 μ 1，RNase Inhibitor(IOU/ μ 1)1 μ 1, Rever Tra Ace 1μ 1, TotalRNA 1 μ 1，反應條件為42°C 20min，99°C 5min，4°C 5min。將反轉錄得到的cDNA于_20°C保存，用于下一步的PCR和定量PCR。使用實施例1設計的弓I物和探針及實施例2合成DNA用于實施例3檢驗評價。實施例3.Taqman PCR檢測體系的建立及評價(1) Taqman熒光定量PCR反應條件根據引物和探針特點，設計退火溫度分別為55 °C、57 °C、59 °C、61 °C的普通PCR 實驗，確定其最佳退火溫度。以cDNA為模板進行擴增，反應體系為Premix TaqBuffer 12. 5 μ 1、H2O 10. 5 μ 1、TBP-2 F/R 各 0. 5 μ 1，cDNA Ιμ 。反應條件為95°C 2min ；95°C 30s，(55°C、57°C、59°C、61°C )30s，72°C lmin，40 個循環。72°C 5min ；4°C lmin。擴增產物 用1.5%瓊脂糖電泳檢測。通過電泳檢測結果可知59°C條件下電泳條帶清晰且產物最亮， 條帶位置正確，無非特異性擴增，因此本檢測體系確定Tm為59°C。(見圖2)(2) Taqman熒光定量PCR反應體系引物濃度的確定擴增條件相同情況下，以能夠檢測到的最低濃度的cDNA模板， 擴增產物條帶清晰，無非特異性擴增為引物選擇標準。分別設50nM、100nM、200nM、400nM四個不同梯度的TBP-2引物濃度，用同一濃度cDNA為模板，同時進行PCR檢測。反應體系為 25 μ 1 =Premix Taq Buffer 12. 5 μ 1、TBP-2 F/R 各 0· 5 μ 1、H2O 10. 5 μ 1, cDNA 1 μ 1 混合 均勻進行普通PCR擴增。反應條件為95°C 2min ；95°C 30s, 59°C 30s, 72°C lmin，40個循 環；72°C 5min ；4°C lmin。擴增產物用1. 5%瓊脂糖電泳檢測，結果如電泳圖所示，在引物 濃度為200nM時，擴增條帶正確清晰(見圖3)，因此最佳引物濃度為200nM。(3)探針濃度的確定以相同模板和引物濃度下循環域值(Ct)最小、熒光信號比(Rn)活度最大為探針 選擇標準。采用50ηΜ、100ηΜ、200ηΜ 3個探針濃度，分別用于同一濃度cDNA為模板，進行 TaqMan PCR 檢測。反應體系為 25 μ L :Realtime PCR Master Mix 12. 5μ L, TBP-2 F/R 各 0. 5 μ L、Probe 0. 5 μ 1、H2O 10 μ L、cDNA 1 μ 1 混合均勻。反應條件為95°C 2min ；95°C 30s, 59°C 30s, 72°C lmin，40個循環；72°C 5min ；4°C lmin。結果顯示，該檢測體系在探針 濃度為IOOnM時，Ct = 16. 68值最小(見圖4)，擴增曲線良好，因此最佳探針濃度為ΙΟΟηΜ。通過使用實施例1設計的探針和實施例2合成的cDNA，進行反應體系和引物和探 針濃度的確立，得出了實施例3所獲得的結果。(4) Taqman熒光定量PCR標準曲線的建立將第二步驟獲得的cDNA的一個樣品作為標準品，濃度定為1，進行四倍濃度 梯度稀釋，得到5個濃度的標準品，分別為1、1/4、1/16、1/64、1/256。根據反應結果中 樣品濃度對數值及其Ct值的對應關系得出定量標準曲線。由圖可知本檢測體系標準 曲線線性關系良好，其斜率-3. 7732，截距17. 339，R2 = 0. 9967?？傻镁€形方程為Ct =-3. 77321og (Qty)+17. 339 (見圖 5)(4) TaqMan熒光定量PCR檢測體系的評價為了進一步驗證該檢測體系的重復性和穩定性，本發明從Jarkat和SH-SY5Y細胞 中提取了總RNA，并反轉錄成cDNA，進一步以此為模板，檢測該檢測體系在其它人的細胞中 的重復性和穩定性。結果發現，以Jarkat和SH-SY5Y細胞中提取的RNA反轉錄出來的cDNA 作為標準品制備的標準曲線線性關系良好，擴增曲線準確，證明此TaqMan熒光定量PCR檢 測體系具有良好的重復性和穩定性。(如圖6、7)(5)檢測人TBP-2基因表達的Taqman熒光定量PCR的實際應用提取藥物刺激后的Hela細胞的總RNA，按照以上方法反轉錄成cDNA，以其中任意 一個樣品的cDNA為標準品，作標準曲線，與未知樣品同時進行Taqman實時熒光定量PCR檢 測，結果可以通過該標準曲線得出藥物刺激后Hela細胞的TBP-2的相對含量，從而可以間 接反應TBP-2的mRNA水平的變化(圖8)。
權利要求
一種檢測人TBP 2基因表達的Taqman探針熒光定量PCR方法，其特征在于包括設計合成TBP 2引物和Taqman探針，提取細胞總RNA，反轉錄得cDNA，確定最佳退火溫度Tm值、最佳引物濃度、最佳探針濃度的TaqmanPCR反應體系，以cDNA為標準品建立標準曲線。
2.根據權利要求書1所述的方法，其特征在于TBP-2的兩條引物F/R和Taqman探針分 別為F :GGATCCCAGCAGTGCAAACR :AAGCCGAACTTGTACTCATATTTGTProbe :AGTACCTGCGCTATGAAGACACGCTT
3.根據權利要求書1所述的方法，其特征在于最佳退火溫度Tm值的確定是以cDNA 為模板進行擴增，反應體系為Premix Taq Buffer 12. 5 μ 1、H2O 10. 5 μ 1、TBP-2F/R 各 0· 5μ 1，cDNA 1 μ 1 ；反應條件為95 "C 2min ；95 "C 30s, (55 "C>57 "C>59 "C>61 "C )30s, 72°C lmin，40個循環；72°C 5min ；4°C lmin，擴增產物用1. 5%瓊脂糖電泳檢測，通過電泳檢 測確定Tm為59 °C。
4.根據權利要求書1所述的方法，其特征在于最佳引物濃度的確定是在擴增條件相 同情況下，以能夠檢測到的最低濃度的cDNA模板，擴增產物條帶清晰，無非特異性擴增為 引物選擇標準；分別設50nM、100nM、200nM、400nM四個不同梯度的TBP-2引物濃度，用同一 濃度cDNA為模板，同時進行PCR檢測；反應體系為25 μ 1 =Premix Taq Buffer 12. 5 μ 1、 TBP-2F/R各0. 5μ 1、H2O 10. 5 μ 1, cDNA 1 μ 1混合均勻進行普通PCR擴增；反應條件為 95 0C 2min ；95 °C 30s, 59 °C 30s, 72 °C lmin, 40 個循環；72°C 5min ；4 °C lmin ；擴增產物用 1. 5%瓊脂糖電泳檢測，確定最佳引物濃度為200nM。
5.根據權利要求書1所述的方法，其特征在于最佳探針濃度的確定是以相同模板和 引物濃度下循環域值(Ct)最小、熒光信號比(Rn)活度最大為探針選擇標準；采用50nM、 100nM、200nM 3個探針濃度，分別用于同一濃度cDNA為模板，進行TaqMan PCR檢測；反應體 系為 25 μ L =Realtime PCR Master Mix 12. 5μ L> TBP—2F/R 各 0· 5 μ L、Probe 0. 5 μ 1、H2O 10 μ L、cDNA 1 μ 1 混合均勻；反應條件為95°C 2min ；95°C 30s, 59°C 30s, 72°C lmin, 40 個 循環；72°C 5min ；4°C lmin ；結果確定最佳探針濃度為ΙΟΟηΜ。
6.根據權利要求書1所述的方法，其特征在于標準曲線的建立是利用反轉錄的cDNA 的一個樣品作為標準品，進行四倍濃度梯度稀釋，得5個濃度的標準品1，1/4，1/16，1/64， 1/256，根據反應結果中樣品濃度對數值及其Ct值的對應關系得出定量標準曲線。
全文摘要
本發明公開了一種檢測人硫氧還蛋白結合蛋白2(thioredoxin-binding protein-2，TBP-2)的Taqman探針熒光定量PCR方法，該方法包括設計合成TBP-2的引物和Taqman探針，細胞總RNA的提取，RNA反轉錄成cDNA，建立Taqman PCR反應體系，將反轉錄得到的cDNA以四倍濃度梯度稀釋建立標準曲線。利用該方法，對組織和細胞中TBP-2的表達及變化情況進行檢測，可以準確、快速、靈敏地檢測出人TBP-2的表達及變化情況，具有良好的重復性和穩定性，可以從mRNA水平反應TBP-2的表達及改變情況。
文檔編號G01N21/64GK101985649SQ20091009417
公開日2011年3月16日 申請日期2009年3月9日 優先權日2009年3月9日
發明者馮月梅, 白潔 申請人:昆明理工大學
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
