專利名稱：：用于癌癥、炎性病癥和自身免疫性病癥的治療和診斷的制作方法
技術領域：
：本發明涉及腫瘤生長領域。本發明涉及腫瘤相關巨噬細胞的活性和特征，及其用于癌癥和腫瘤生長的診斷和治療的用途。本發明還涉及免疫學領域及腫瘤相關巨噬細胞和脂肪組織巨噬細胞活性和特征用于治療自身免疫性和炎性病癥的用途。
背景技術：
：在美國，惡性腫瘤(癌癥)是位居心臟病之后的一種主要死亡原因。癌癥的特征為自正常組織衍生的異?；蛸樕约毎臄的吭黾?，所述細胞增殖形成腫瘤塊；這些贅生性腫瘤細胞侵入鄰近組織；及產生惡性細胞，所述惡性細胞最終經血液或淋巴系統擴散至局部淋巴結并經稱為轉移的過程擴散至遠處。在癌性狀態，細胞在正常細胞不會生長的條件下增殖。癌癥自身表現為極其多種形式，特征為不同程度的侵襲力和進攻性。人類腫瘤由惡性和非惡性這兩種細胞構成。后一類包括基質成纖維細胞、內皮細胞和白細胞。腫瘤相關巨噬細胞(“ΤΑΜ”)是大多數實體瘤中白細胞浸潤物的主要組分。在有些情況中，TAM能占到總腫瘤塊的50%(Kelly等1988;0，SullivanandLewis1994；Leek等1994；Bingle等2002)。已經將乳腺癌和其它人類腫瘤中高水平的巨噬細胞浸潤物與差的預后聯系起來。對乳腺癌鼠模型的分析支持TAM促進腫瘤生長和轉移的觀點。例如，在乳腺癌遺傳模型中抑制TAM分化降低腫瘤進展的速率且顯著減輕肺中的轉移形成(Lin等2001)。TAM可促成人乳腺癌生長的一種建議機制是通過對血管發生性因子(諸如血管內皮生長因子)的誘導；已經將高水平的TAM與乳腺瘤內升高的血管密度聯系起來(Leek等1996;Lin等2006)。已經顯示了髓樣譜系造血細胞(包括ΤΑΜ)刺激血管發生，或是直接通過分泌血管發生性因子或是間接通過生成胞外基質降解性蛋白酶，其繼而釋放被隔絕的血管發生性因子(綜述見Lewis，C.Ε.&Pollard，Τ·W.Distinctroleofmacrophagesindifferenttumormicroenvironments.CancerResearch66:605-612(2006)；及Naldini，A.&Carraro，F.RoleofinflammatorymediatorsinanRioRenesis.CurrDrugTargetsInflammAllergy4:3-8(2005))。在髓樣細胞譜系中，自荷瘤小鼠的脾分離的⑶Ilb+Grl+祖細胞在與腫瘤細胞共注射時促進血管發生(參見例如Yang，L.等ExpansionofmyeloidimmunesuppressorGr土CD1IbiCellsintumor-bearinRhostdirectlypromotestumorangiogenesis.CancerCell6409-21(2004)),而且腫瘤浸潤巨噬細胞數目與一些人腫瘤中差的預后有關(綜述見Balkwill等inBalkwill,F.，Charles,K.Α.&Mantovani，A.SmolderinRandpolarizedinflammationintheinitiationandpromotionofmaliRnantdisease.CancerCell7:211_7(2005))。然而，在另一項研究中，巨噬細胞抑制小鼠中實驗型腫瘤的生長，提示它們作為抗癌療法的潛力(參加例如Kohchi，C.等UtilizationofmacrophaResinanticancertherapy:themacrophaRenetworktheory.AnticancerRes24:3311-20(2004))。已經提示，在促進血管發生之外，TAM可能還通過促進炎癥、基質重塑、腫瘤細胞侵入、內侵和遠處播種而促成腫瘤生長(Lewis等2000;LewisandPoloard2006；Pollard2004；Hiratsuka等2002；Lin等2001；Sica等2006)。TAM是自循環中的單核細胞衍生的，后者被腫瘤衍生的趨化因子募集至惡性組織。單核細胞因其通用性和可塑性而與眾不同，而且取決于它們的特定微環境，能分化成具有各種活化階段的巨噬細胞。這些活化范圍在操作上是在兩個獨特的極化狀態(即Ml和M2)間定義的。雖然已經在體外定義了這些狀態，但是認為組織巨噬細胞沿Ml和M2的連續譜存在。在促炎性刺激和I型細胞因子占優勢的環境中，單核細胞分化成Ml巨噬細胞，其表達高水平促炎性細胞因子、促進Thl免疫應答和介導針對胞內寄生物的抗性。相反，II型細胞因子(即IL-4和IL-13)占優勢的環境促進M2或“營養性”巨噬細胞的生成。M2巨噬細胞是免疫調控性的，而且促進組織修復和重塑。已經提出TAM作為“營養性”M2巨噬細胞在腫瘤中通過分泌被認為是抑制樹突細胞(“DC”)成熟的某些細胞因子(諸如IL-6、CSF-1、IL-10和TGFi^)而在誘導耐受中具有間接作用(Mantovani等2002;PolIard2004)。DC是專門的抗原呈遞細胞，有能力誘導和調節免疫應答，而且經常在組織中捕捉抗原之后經歷成熟。它們上調MHCI表達和共刺激分子，而且遷移至引流淋巴結，在那里它們能誘導有力的T細胞應答。在非炎性條件下(即在腫瘤組織中)捕捉抗原的DC可能沒有完全成熟，且如此在抗原呈遞方面受損。這些不成熟的或半成熟的DC表達低水平的共刺激性蛋白質，而且潛在生成強化致耐受性應答的調節性T淋巴細胞(Steinman等2003)?；谄鹪床课?、表型標志物表達和抑制機制，已經定義了數個調節性T細胞子集。一個得到特別好地表征的子集是天然發生的胸腺衍生⑶4+CD25+T調節性細胞。此類細胞表達高水平的FoxP3和GITR，而且經由細胞接觸依賴性機制介導免疫抑制。第二個⑶4+子集(Trl細胞)是在外周組織中誘導的，而且經由IL-10和/或TGFii的分泌以不依賴接觸的方式介導免疫抑制。越來越多的證據支持調節性T細胞在抑制針對腫瘤的免疫應答中的重要性。數份報告記錄了實體瘤中數目升高的調節性FoxP3+⑶4+T細胞(Leong等2006;Liyanage等2002)和IL_10+CD4+Trl細胞(Marshall等2004；Seo等2001)的存在。此外，人類乳腺癌樣品中水平升高的FoxP3+CD4+T細胞與降低的總體存活率有關(Curiel等2004；Bates等2006)。不管TAM在腫瘤浸潤物中的存在及它們生成血管發生性因子的潛力，它們在腫瘤生長和形成中的作用仍然未明。需要發現和了解TAM的生物學功能及它們生成的因子。本發明解決了這些需要和其它需要，在閱讀以下公開內容后，這會是顯而易見的。發明概述在一個實施方案中，本發明提供了一種鑒定樣品內的炎癥相關組織巨噬細胞(IRTM)的方法，包括使所述樣品接觸IRTM結合劑，并測定一種或多種與所述IRTM結合劑結合的細胞的存在。在一個方面，所述樣品是組織樣品。在另一個方面，所述樣品是人的。在另一個方面，所述IRTM結合劑是抗體或其抗原結合片段。在另一個方面，所述IRTM是腫瘤相關巨噬細胞(ΤΑΜ)。在另一個方面，所述IRTM是脂肪組織巨噬細胞(ATM)。在另一個實施方案中，本發明提供了一種鑒定樣品內的炎癥相關組織巨噬細胞(IRTM)的方法，包括使所述樣品接觸至少一種特異性識別巨噬細胞特異性細胞表面標志物的第一試劑和至少一種特異性識別樹突細胞特異性細胞表面標志物的第二試劑，并測定受到所述至少一種第一試劑和所述至少一種第二試劑二者識別的細胞的存在。在一個方面，所述至少一種第一試劑和/或所述至少一種第二試劑特異性結合所述巨噬細胞特異性細胞表面標志物或所述樹突細胞特異性細胞表面標志物。在另一個這樣的方面，所述至少一種第一試劑和/或所述至少一種第二試劑是抗體或其抗原結合片段。在另一個方面，所述至少一種第一試劑和所述至少一種第二試劑是同一分子。在另一個這樣的方面，所述分子選自下組雙特異性抗體、三特異性抗體、具有超過三種特異性的抗體和任何所述抗體的抗原結合片段。在另一個方面，所述巨噬細胞特異性細胞表面標志物是F4/80。在另一個方面，所述樹突細胞特異性細胞表面標志物是CDllc。在另一個方面，測定受到所述至少一種第一試劑和所述至少一種第二試劑二者識別的細胞的存在包括至少一種選自下組的方法免疫組織化學、熒光激活細胞分選、磁細胞分選、親和層析、熒光原位雜交和免疫顯微術。在另一個方面，所述細胞樣品是腫瘤樣品。在另一個方面，所述IRTM是ΤΑΜ。在另一個方面，所述IRTM是ATM。在另一個實施方案中，本發明提供了一種自細胞混合物分離TAM的方法，包括(a)使細胞樣品接觸至少一種特異性識別巨噬細胞特異性細胞表面標志物的第一試劑和至少一種特異性識別樹突細胞特異性細胞表面標志物的第二試劑，并(b)分離受到所述至少一種第一試劑和所述至少一種第二試劑二者識別的細胞。在一個方面，所述至少一種第一試劑和/或所述至少一種第二試劑特異性結合所述巨噬細胞特異性細胞表面標志物或所述樹突細胞特異性細胞表面標志物。在另一個方面，所述至少一種第一試劑和/或所述至少一種第二試劑是抗體或其抗原結合片段。在另一個方面，所述至少一種第一試劑和所述至少一種第二試劑是同一分子。在另一個這樣的方面，所述分子選自下組雙特異性抗體、三特異性抗體、具有超過三種特異性的抗體和任何所述抗體的抗原結合片段。在另一個方面，所述巨噬細胞特異性細胞表面標志物是F4/80。在另一個方面，所述樹突細胞特異性細胞表面標志物是CDllc。在另一個方面，所述分離步驟包括熒光激活細胞分選、親和層析和磁細胞分選中至少一項。在另一個實施方案中，本發明提供了一種診斷受試者中的增殖性病癥的方法，包括測定所述受試者中TAM的存在和/或活性。在一個方面，所述測定步驟包括使來自所述受試者的細胞樣品接觸至少一種特異性識別巨噬細胞特異性細胞表面標志物的第一試劑和至少一種特異性識別樹突細胞特異性細胞表面標志物的第二試劑，并鑒定受到所述至少一種第一試劑和所述至少一種第二試劑二者識別的細胞。在另一個方面，所述增殖性病癥是乳腺癌。在另一個方面，所述至少一種第一試劑和/或所述至少一種第二試劑特異性結合所述巨噬細胞特異性細胞表面標志物或所述樹突細胞特異性細胞表面標志物。在一個這樣的方面，所述至少一種第一試劑和/或所述至少一種第二試劑是抗體或其抗原結合片段。在另一個這樣的方面，所述至少一種第一試劑和所述至少一種第二試劑是同一分子。在另一個這樣的方面，所述分子選自下組雙特異性抗體、三特異性抗體、具有超過三種特異性的抗體和任何所述抗體的抗原結合片段。在另一個這樣的方面，所述巨噬細胞特異性細胞表面標志物是F4/80。在另一個這樣的方面，所述樹突細胞特異性細胞表面標志物是⑶11c。在另一個這樣的方面，所述鑒定步驟包括至少一種選自下組的方法免疫組織化學、熒光激活細胞分選、磁細胞分選、親和層析、熒光原位雜交和免疫顯微術。在另一個實施方案中，本發明提供了一種對受試者中的腫瘤分期的方法，包括測定所述受試者中TAM的存在和/或活性。在一個方面，所述測定步驟包括使來自所述受試者的細胞樣品接觸至少一種特異性識別巨噬細胞特異性細胞表面標志物的第一試劑和至少一種特異性識別樹突細胞特異性細胞表面標志物的第二試劑，并鑒定受到所述至少一種第一試劑和所述至少一種第二試劑二者識別的細胞。在另一個方面，所述腫瘤是乳腺癌腫瘤。在另一個方面，所述至少一種第一試劑和/或所述至少一種第二試劑特異性結合所述巨噬細胞特異性細胞表面標志物或所述樹突細胞特異性細胞表面標志物。在另一個這樣的方面，所述至少一種第一試劑和/或所述至少一種第二試劑是抗體或其抗原結合片段。在另一個這樣的方面，所述至少一種第一試劑和所述至少一種第二試劑是同一分子。在另一個這樣的方面，所述分子選自下組雙特異性抗體、三特異性抗體、具有超過三種特異性的抗體和任何所述抗體的抗原結合片段。在另一個這樣的方面，所述巨噬細胞特異性細胞表面標志物是F4/80。在另一個這樣的方面，所述樹突細胞特異性細胞表面標志物是CDllc。在另一個方面，所述鑒定步驟包括至少一種選自下組的方法免疫組織化學、熒光激活細胞分選、磁細胞分選、親和層析、熒光原位雜交和免疫顯微術。在另一個實施方案中，本發明提供了一種治療受試者的腫瘤的方法，包括調控TAM生存力或活性。在一個方面，調控TAM生存力或活性包括自腫瘤細胞群體或腫瘤樣品選擇性消除ΤΑΜ。在一個這樣的方面，所述選擇性消除TAM包括(a)使所述群體或樣品接觸TAM結合劑，并(b)自所述群體或樣品選擇性消除那些特異性結合所述TAM結合劑的細胞。在另一個這樣的方面，所述TAM結合劑包括至少一種抗體且所述選擇性消除步驟選自抗體介導的清除、蛋白A層析、親和層析、熒光激活細胞分選和磁細胞分選。在另一個方面，調控TAM生存力或活性包括選擇性殺死腫瘤細胞群體或腫瘤樣品內的ΤΑΜ。在一個這樣的方面，選擇性殺死TAM包括(a)使所述群體或樣品接觸TAM結合劑，并(b)自所述群體或樣品選擇性殺死那些特異性結合所述TAM結合劑的細胞。在另一個這樣的方面，所述TAM結合劑包括至少一種抗體且所述選擇性殺死步驟是補體介導的細胞毒性。在另一個這樣的方面，所述TAM結合劑包括至少一種抗體且所述選擇性殺死步驟是由偶聯至所述抗體的細胞毒性分子介導的。在另一個方面，調控TAM生存力或活性包括抑制腫瘤細胞群體或腫瘤樣品內的TAM活性。在一個這樣的方面，抑制TAM活性包括抑制所述群體或樣品中一種或多種TAM分泌細胞因子或TAM分泌趨化因子的分泌或活性。在另一個這樣的方面，所述TAM分泌細胞因子是TGFβ。在另一個這樣的方面，抑制一種或多種TAM分泌細胞因子或TAM分泌趨化因子的分泌或活性包括施用TAM分泌細胞因子/趨化因子結合劑。在另一個這樣的方面，所述TAM分泌細胞因子/趨化因子結合劑選自對所述細胞因子或趨化因子特異性的抗體或抗原結合片段、對所述細胞因子或趨化因子特異性的受體或抑制所述細胞因子/趨化因子活性的小分子。在另一個方面，抑制一種或多種TAM分泌細胞因子或TAM分泌趨化因子的分泌或活性包括施用TAM分泌細胞因子/趨化因子的拮抗劑。在另一個方面，所述受試者是人類受試者。在另一個方面，所述方法進一步包括共施用或序貫施用一種或多種選自下組的別的治療劑化療劑、細胞因子、趨化因子、抗血管發生劑、免疫抑制劑、細胞毒劑、抗炎劑和生長抑制劑。在另一個實施方案中，本發明提供了一種治療受試者中的自身免疫性病癥的方法，包括調控TAM生存力或活性。在一個方面，調控TAM生存力或活性包括刺激TAM活性。在一個這樣的方面，刺激TAM活性包括施用一種或多種選自下組的化合物TAM激動劑和TAM分泌細胞因子/趨化因子的激動劑。在另一個這樣的方面，刺激TAM活性導致對FoxP3+⑶4+T調節性細胞、IL-10+CD4+T調節性細胞和炎癥TH17細胞中至少一項的誘導。在另一個方面，所述受試者是人類受試者。在另一個方面，所述方法進一步包括共施用或序貫施用一種或多種選自下組的別的治療劑細胞因子、趨化因子、細胞毒劑和免疫抑制劑。在另一個實施方案中，本發明提供了一種抑制受試者中的耐受性形成的方法，包括調控TAM生存力或活性。在一個方面，調控TAM生存力或活性包括選擇性消除ΤΑΜ。在一個這樣的方面，所述選擇性消除TAM包括(a)施用TAM結合劑，并(b)選擇性消除那些特異性結合所述TAM結合劑的細胞。在另一個這樣的方面，所述TAM結合劑包括至少一種抗體且所述選擇性消除步驟是抗體介導的清除。在另一個方面，調控TAM生存力或活性包括選擇性殺死ΤΑΜ。在一個這樣的方面，選擇性殺死TAM包括(a)施用TAM結合劑，并(b)選擇性殺死那些特異性結合所述TAM結合劑的細胞。在另一個這樣的方面，所述TAM結合劑包括至少一種抗體且所述殺死步驟是補體介導的細胞毒性。在另一個這樣的方面，所述TAM結合劑包括至少一種抗體或抗原結合片段且所述選擇性殺死步驟是由偶聯至所述抗體或抗原結合片段的細胞毒性分子介導的。在另一個方面，調控TAM生存力或活性包括抑制TAM活性。在一個這樣的方面，抑制TAM活性包括抑制一種或多種TAM分泌細胞因子或TAM分泌趨化因子的分泌或活性。在一個這樣的方面，所述TAM分泌細胞因子是TGFβ。在另一個這樣的方面，抑制一種或多種TAM分泌細胞因子或TAM分泌趨化因子的分泌或活性包括施用TAM分泌細胞因子/趨化因子結合劑。在一個這樣的方面，所述TAM分泌細胞因子/趨化因子結合劑選自對所述細胞因子或趨化因子特異性的抗體或抗原結合片段、受體或抑制所述細胞因子/趨化因子活性的小分子。在另一個方面，抑制一種或多種TAM分泌細胞因子或TAM分泌趨化因子的分泌或活性包括施用TAM分泌細胞因子/趨化因子的拮抗劑。在另一個方面，所述受試者是人類受試者。在另一個方面，所述方法進一步包括共施用或序貫施用一種或多種選自下組的別的治療劑細胞因子、趨化因子、細胞毒劑、抗炎劑和免疫抑制劑。在另一個實施方案中，本發明提供了一種用于選擇性誘導FoxP3+⑶4+Τ調節性細胞、IL-IO+⑶4+Trl細胞或炎癥TH17細胞生長和/或增殖的方法，包括在適于正常細胞生長的條件下給幼稚T細胞施用IRTM或使幼稚T細胞暴露于IRTM。在一個方面，所述IRTM是ΤΑΜ。在另一個方面，所述IRTM是ATM。在一個方面，所述方法進一步包括施用一種或多種選自下組的化合物TAM和/或ATM激動劑和TAM和/或ATM分泌細胞因子/趨化因子的激動劑。在另一個方面，所述方法進一步包括分離所述經過誘導的FoxP3+CD4+T調節性細胞、IL-10+CD4+Trl細胞或炎癥TH17細胞。在另一個實施方案中，本發明提供了一種治療受試者中的炎性病癥的方法，包括調控IRTM生存力或活性。在一個方面，調控IRTM生存力或活性包括刺激IRTM活性。在另一個方面，刺激IRTM活性包括施用一種或多種選自下組的化合物IRTM激動劑和IRTM分泌細胞因子/趨化因子的激動劑。在另一個方面，刺激IRTM活性導致對FoxP3+CD4+T調節性細胞、IL-10+CD4+Trl細胞或炎癥TH17細胞中至少一項的誘導。在另一個方面，所述受試者是人類受試者。在另一個方面，所述方法進一步包括共施用或序貫施用一種或多種選自下組的別的治療劑細胞因子、趨化因子、細胞毒劑、抗炎劑和免疫抑制劑。在另一個方面，調控IRTM生存力或活性包括選擇性消除IRTM。在另一個方面，所述選擇性消除IRTM包括(a)施用IRTM結合劑，并(b)選擇性消除那些特異性結合所述IRTM結合劑的細胞。在另一個方面，所述IRTM結合劑包括至少一種抗體且所述選擇性消除步驟是抗體介導的清除。在另一個方面，調控IRTM生存力或活性包括選擇性殺死IRTM。在另一個方面，選擇性殺死IRTM包括(a)施用IRTM結合劑，并(b)選擇性殺死那些特異性結合所述IRTM結合劑的細胞。在另一個方面，所述IRTM結合劑包括至少一種抗體且所述選擇性殺死步驟是補體介導的細胞毒性。在另一個方面，所述IRTM結合劑包括至少一種抗體或抗原結合片段且所述選擇性殺死步驟是由偶聯至所述抗體或抗原結合片段的細胞毒性分子介導的。在另一個方面，調控IRTM生存力或活性包括抑制IRTM活性。在另一個方面，抑制IRTM活性包括抑制一種或多種IRTM分泌細胞因子或IRTM分泌趨化因子的分泌或活性。在另一個方面，所述IRTM分泌細胞因子是TGFβ。在另一個方面，抑制一種或多種IRTM分泌細胞因子或IRTM分泌趨化因子的分泌或活性包括施用IRTM分泌細胞因子/趨化因子結合劑。在另一個方面，所述IRTM分泌細胞因子/趨化因子結合劑選自對所述細胞因子或趨化因子特異性的抗體或抗原結合片段、對所述細胞因子或趨化因子特異性的受體或抑制所述細胞因子/趨化因子活性的小分子。在另一個方面，抑制一種或多種IRTM分泌細胞因子或IRTM分泌趨化因子的分泌或活性包括施用IRTM分泌細胞因子/趨化因子的拮抗劑。在另一個方面，所述IRTM選自TAM和ATM。在另一個方面，所述受試者是人類受試者。在另一個方面，所述方法進一步包括共施用或序貫施用一種或多種選自下組的別的治療劑細胞因子、趨化因子、細胞毒劑、抗炎劑和免疫抑制劑。在另一個實施方案中，本發明提供了一種用于選擇性誘導FoxP3+⑶4+T調節性細胞、IL-IO+⑶4+Trl細胞和/或炎癥TH17細胞生長和/或增殖的方法，包括在適于正常細胞生長的條件下使幼稚T細胞暴露于TAM和/或ATM。在一個方面，所述方法進一步包括施用一種或多種選自下組的化合物TAM激動劑、ATM激動劑、TAM分泌細胞因子/趨化因子的激動劑和ATM分泌細胞因子/趨化因子的激動劑。在另一個方面，所述方法進一步包括分離所述經過誘導的FoxP3+⑶4+T調節性細胞、IL-IO+⑶4+Trl細胞或炎癥TH17細胞。附圖簡述圖1A-1H描繪了對腫瘤樣品的免疫組織化學分析的結果，如實施例1所述。圖IA描繪了腫瘤組織的抗CD45抗體染色，顯示顯著的白細胞浸潤物。圖IB描繪了腫瘤組織的抗F4/80抗體染色，用以鑒定巨噬細胞。圖IC描繪了腫瘤組織的抗CD3抗體染色，用以鑒定T細胞。圖ID的圖顯示了CD45+淋巴樣腫瘤浸潤物中免疫細胞的相對比例。圖IE的圖顯示了NKl.l_DX5_CDllb+腫瘤髓樣浸潤物中免疫細胞的相對比例。圖IF描繪了用抗F4/80和抗CD31這兩種抗體染色的腫瘤樣品，用以顯示腫瘤組織中TAM相對于內皮細胞的定位。圖IG描繪了用抗Ly-6G和抗⑶31這兩種抗體染色的腫瘤樣品，用以顯示腫瘤組織中嗜中性粒細胞相對于內皮細胞的定位。圖IH描繪了用抗Ly-6C和抗CD31這兩種抗體染色的腫瘤樣品，用以顯示腫瘤組織中炎癥單核細胞(Moif)相對于內皮細胞的定位。圖1F-1H中的數據代表2-3次重復和6-7份腫瘤個體。圖2A-2C圖解描繪了評估MMTV-PyMT腫瘤的白細胞組成的FACS分析的結果。在所有三幅圖中，FVB對照樣品以白色顯示，而PyMTtg樣品以條文顯示。圖2A顯示了PyMT誘發的腫瘤中外周血單個核細胞(PBMC)總數與無瘤對照FVB小鼠樣品相比的2.3倍增加。圖2B顯示了荷瘤小鼠中⑶Ilb+髓樣PBMC(Nkl.1_DX5_)細胞與無瘤對照FVB小鼠相比的增力口。圖2C顯示了PyMT腫瘤小鼠中嗜中性粒細胞單核細胞比與對照小鼠相比的增加。符號“*”指示數據是顯著的，ρ彡0.05；符號“**”指示數據是顯著的，ρ彡0.01。圖3A-3E描繪了實施例2A所述實驗的結果，顯示了TAM具有巨噬細胞和樹突細胞二者的特征。圖3A描繪了基因表達分析的結果，顯示了bmDC(白色柱)、腹膜巨噬細胞(黑色柱)和PyMTtg衍生TAM(條紋柱)的⑶1IcmRNA表達水平(最左邊的小圖)。圖3A還描繪了FACS分析的結果，顯示了TAM表達高水平的⑶11c和F4/80，而bmDC或腹膜巨噬細胞表達⑶Ilc或F4/80(最右邊的三幅小圖)。圖3B-3C描繪了免疫組織化學分析的結果，顯示了PyMTtg衍生腫瘤的冷凍切片(圖3B)或在體外培養了60個小時的分離的F4/80+TAM(圖3C)表達樹突細胞標志物CDllc。圖3D描繪了bmDC(白色柱)、腹膜巨噬細胞(條紋柱)和PyMTtg衍生TAM(斑點柱)的⑶207mRNA表達水平的基因表達水平(最左邊的小圖)。圖3D還描繪了FACS分析的結果，顯示了CDllb+F4/80+CDllc+TAM表達langerin(CD207)。圖3D中的數據代表四次實驗。圖3E描繪了實時PCR實驗的結果，顯示了bmDC(白色柱)、腹膜巨噬細胞(條紋柱)和PyMTtg衍生TAM(斑點柱)中的TGF3RI、Runx3和IRF-8表達水平。圖4A-4C描繪了實施例2A所述實驗的結果，顯示了與無瘤FVB小鼠相比PyMTtg小鼠腫瘤引流腋窩和臂淋巴結的免疫細胞組成。圖4A圖解顯示了在來自含瘤小鼠的淋巴結中鑒定到升高數目的⑶Ilb+細胞。圖4B顯示了FACS結果，指示了在來自荷瘤小鼠的淋巴結中鑒定到升高數目的、共表達⑶Ilc和F4/80的⑶Ilb+細胞。圖4C描繪了顯微照相，顯示了TAM的形態學更接近bmDC而非巨噬細胞。圖5A-5C描繪了ΤΑΜ、腹膜巨噬細胞和bmDC中表達的基因的微陣列分析的結果，如實施例2A所述。圖5A顯示了那三種細胞群體中表達的基因的熱像(heatmapimage),其中白色著色指示最小限度水平的相對表達，而黑色著色指示最大限度水平的相對表達，灰色指示相對表達為1。圖5B顯示了ΤΑΜ、腹膜巨噬細胞和bmDC的基因表達譜型分析的統計PC分析，顯示了TAM與腹膜巨噬細胞之間的密切關系(左邊的小圖)和所分析的個別主要組分的重要性程度的圖形顯現(右邊的小圖)。圖5C描繪了PyMTtg衍生TAM和Her2tgS生TAM的基因表達譜型分析的統計PC分析的結果，證明了與其它組織巨噬細胞(腹膜巨噬細胞和脾巨噬細胞及Kupffer細胞)相比TAM的獨特基因譜型(左邊的小圖)和所分析的個別主要組分的重要性程度的圖形顯現(右邊的小圖)。圖5B和5C中的數據是來自個別分離的群體的3-5份mRNA制備物的平均值。圖6A-6C顯示了數項FACS分析，評估MHCII和共刺激分子⑶80、⑶83和⑶86的TAM表面表達，如實施例2B所述。圖6A描繪了MHCII、⑶80、⑶83和⑶86的TAM表達的FACS結果。圖6B描繪了MHCII、⑶80、⑶83和⑶86的腹膜巨噬細胞表達的FACS結果。圖6C描繪了MHCII、CD80、CD83和CD86的bmDC表達的FACS結果。圖7A-7B描繪了TAM對腹膜巨噬細胞中的趨化因子和細胞因子表達的微陣列分析的結果，如實施例3所述。圖7A顯示了兩個細胞群體中趨化因子CCL2、CXCLlO、CCL3、CCL5和KC的表達水平。圖7B顯示了兩個細胞群體中細胞因子IL-Iα、IL-Iβ、TNFα、IL_10和IL-6的表達水平。圖7C描繪了實時RT-PCR實驗的結果，顯示了bmDC(白色柱)、腹膜巨噬細胞(斑點柱)、PyMTtg衍生TAM(疏條紋柱)和腫瘤細胞(密條紋柱)中的TGF^表達水平。所示數據是3-5次獨立實驗的平均值。圖8A-8C描繪了FACS分析的結果，評估TAM對幼稚T細胞(nai'veTcell)的影響，如實施例4所述。圖8A圖解顯示了由受ΤΑΜ、腹膜巨噬細胞或bmDC刺激的幼稚T細胞培養物生成的細胞因子IL-10、IL-4、IL-2和IL-17的相對量。圖8B描繪了FACS結果，顯示了TAM活化的T細胞生成IL-10和IL-17。圖8C圖解描繪了免疫染色實驗的結果，顯示了來自TAM刺激的⑶4+T細胞的細胞因子分泌依賴于TAM的TGFβ分泌。圖9A-9D描繪了實施例4所述FACS分析的結果，用以調查TAM對FoxP3+調節性T細胞的誘導。圖9A描繪了FACS分析，顯示用TAM或bmDC處理的培養物中FoxP3+T細胞誘導的差異。圖9B描繪了FACS分析的結果，顯示包括TGFi3RII對TAM誘導FoxP3+T細胞的影響。圖9C描繪了FACS分析的結果，評估TAM誘導的FoxP3+T細胞上GITR的存在，作為調節性T細胞的標志物。圖9D描繪了FACS分析的結果，評估TAM誘導的FoxP3+T細胞上的CD103表達，作為外周誘導的調節性T細胞的標志物。圖10A-10D描繪了實驗的結果，用以確認TAM誘導FoxP3+T細胞，而非刺激現有FoxP3+T細胞克隆擴增，如實施例4所述。圖IOA描繪了FACS分析的結果，評估本文中所使用的幼稚⑶4+T細胞制備物中FoxP3+T細胞的量。圖IOB顯示了實驗的結果，分析bmDC、TAM和腹膜巨噬細胞對CFSE標記的幼稚⑶4+T細胞的刺激能力。圖IOC描繪了FACS分析的結果，評估全脾細胞中的FoxP3+T細胞集合(圖10C)。圖IOD描繪了FACS分析的結果，評估自純化的CD103+CD25+CD69+T細胞分離(圖10D)并用TAM再處理后的FoxP3+T細胞集合。圖11A-11C描繪了實驗的結果，評估PyMT小鼠(圖11A)對對照小鼠(圖11B)中IL-IO+和FoxP3+調節性T細胞的體內發生率，如實施例5所述。圖IlC圖解顯示了在來自PyMT小鼠(條紋柱和黑色圓)對對照小鼠(白色柱和圓)的腫瘤引流淋巴結(最左邊的兩幅小圖)、脾(中間的和中間靠右的小圖)和腫瘤(最右邊的小圖)中找到的F0XP3+CD4+T細胞的相對量和/或絕對數。圖12A-G描繪了在脂肪組織巨噬細胞(ATM)上實施的實驗的結果，如實施例6所述。圖12A描繪了FACS分析的結果，顯示了⑶Ilb+細胞含量。數據代表20份獨立的脂肪組織分離物。圖12B描繪了FACS分析的結果，顯示了F4/80+ATM中的⑶llc、MHCII和⑶86的表達。數據代表來自數個不同實驗的14份(⑶lie)或5份(MHCII或⑶86)脂肪組織分離物。圖12C描繪了FACS分析的結果，顯示了自在HFD下飼養的雄性C57BI/6小鼠的附睪脂肪衍生的單細胞ATM懸浮液中⑶14、ICOSL和TIM3表達。數據代表來自數個不同實驗的5份獨立脂肪組織分離物。圖12D描繪了FACS分析的結果，顯示了TAM中的⑶14、ICOSL和TIM3表達的表達。數據代表來自數個不同實驗的5份獨立脂肪組織分離物。圖12E描繪了自附睪脂肪組織(條紋柱)、C57BI/6野生型腹膜巨噬細胞(白色柱)或瘦脂肪巨噬細胞(leanfatmacrophage)(斑點柱)衍生的ATM的細胞因子譜型。數據代表來自兩個實驗的6只小鼠。圖12F描繪了TAM(白色柱)和ATM(條紋柱)中TGFβi和TGFβRI表達水平的實時RT-PCR分析的結果。數據代表來自1-3個實驗或4份各自分離的巨噬細胞集合的8種TAM和3種ATMRNA探針。圖12G顯示了用H&E染色的新鮮分離的ATM、TAM和腹膜巨噬細胞的形態。圖13A-J顯示了實驗的結果，測試脂肪組織、淋巴結組織和純化的ATM誘導FoxP3+調節性T細胞的能力，如實施例7所述。圖13A描繪了被ATM(左邊的小圖)、瘦脂肪巨噬細胞(LTM)(中央的小圖)或腹膜巨噬細胞(右邊的小圖)活化的CD4+T細胞中FoxP3表達的FACS分析的結果。所示數據代表單一實驗中的兩只獨立小鼠。圖13B描繪了TGF-β對補充有重組TGFi3RII-Fc的T細胞培養物中TAM對FoxP3誘導的影響的FACS分析的結果。所示數據代表單一實驗中的兩只獨立小鼠。圖13C和13D顯示了FACS分析的結果，評估來自雄性Db/Db小鼠和年齡匹配的C57BI/6小鼠的CD4+T細胞中附睪脂肪(圖13C)或脾組織(圖13D)中FoxP3+T調節性細胞的相對量。所示數據代表單一實驗中的四只獨立小鼠。圖13E描繪了實驗的結果，評估ATM活化的T細胞的細胞因子生成。白色柱對應于用腹膜巨噬細胞處理的T細胞，而黑色柱對應于用ATM處理的T細胞。所示數據代表兩次實驗，每次使用兩只小鼠。圖13F描繪了FACS分析的結果，評估被TAM活化的T細胞群體中Trl和TH17細胞的存在。所示數據代表兩次實驗，每次使用兩只小鼠。圖13G-H描繪了實驗的結果，評估來自用高脂肪食譜喂養的C57BI/6小鼠(圖13G)或野生型C57BI/6小鼠(圖13H)(都用PMA/伊屋諾霉素(ionomycin)再刺激)中的腫瘤引流淋巴結的CD4+T細胞群體，顯示了肥胖小鼠中明顯IL-IO+Trl和TH17T細胞群體的存在。圖131和13J顯示的柱形圖描繪了實驗的結果，評估年齡匹配的對照FVB小鼠(白色圓)或雄性HFD肥胖C57BI/6小鼠(黑色圓)的脂肪組織(圖131)或引流淋巴結組織(圖13J)中FoxP3+CD4+T細胞的百分比。#指示實驗具有ρ<0.01。圖14A-F描繪了選定的免疫細胞和腫瘤細胞群體中的基因表達譜型。圖14A-C和E描繪了腫瘤細胞、PyMTtg衍生ΤΑΜ、來自野生型FVB小鼠的腹膜巨噬細胞和bmDC中細胞因子(圖14A)、細胞因子受體(圖14B)、趨化因子(圖14C)和趨化因子受體(圖14E)的差異表達的熱圖譜型。圖14D顯示了實驗的結果，用以確認腹膜巨噬細胞(白色柱)或PyMTtg衍生TAM(條紋柱)中的CCL2、CCL3、CCL5和CXCLlO的差異表達。**指示ρ<0.01。圖14F描繪了bmDC(白色柱)、腹膜巨噬細胞(條紋柱)和PyMTtg衍生TAM(斑點柱)中CCR6基因表達的實時RT-PCR分析的結果。在每幅圖中，數據顯示了來自3-5份獨立樣品的基因譜型分析或3-5次獨立實驗的平均值。在圖14A-C和E中，最低表達水平以深灰色顯示，而最高表達水平以淺灰色指示；白色正方形指示該特定分析的數據不可得。圖15A-B描繪了來自腫瘤細胞、PyMTtg衍生ΤΑΜ、來自野生型FVB小鼠的腹膜巨噬細胞和bmDC的Ml(圖15A)和M2(圖15B)標志物基因mRNA的差異表達的熱圖譜型。數據顯示了來自3-5份獨立樣品的基因譜型分析結果。最低表達水平以深灰色顯示，而最高表達水平以淺灰色指示；白色正方形指示該特定分析的數據不可得。圖16A-B描繪了實驗的結果，顯示了被某些免疫細胞群體活化的幼稚T細胞的細胞因子和趨化因子譜型。圖16A顯示了受bmDC(白色柱)、來自FVB小鼠的腹膜巨噬細胞(條紋柱)或TAM(斑點柱)刺激的幼稚T細胞中的TNFα、IL_5、IL-13和CCL3表達。圖16B顯示了受來自C57BI/6小鼠的腹膜巨噬細胞(白色柱)或ATM(條紋柱)刺激的幼稚T細胞中的TNFa、IL-5和IL-13表達。圖17描繪了某些免疫細胞群體的基因表達譜型分析的統計PC分析的結果。左邊的小圖顯示的圖證明了ATM、⑶11c_ATM和⑶11C+ATM具有相似的基因表達譜型，但是擁有與PyMTtgTAM、Her2tgTAM和腹膜巨噬細胞(“PF”)不同的基因表達譜型。圖18描繪了⑶llc_ATM(白色柱)或⑶llc+ΑΤΜ(條紋柱)的細胞因子/趨化因子譜型，如實施例8所述。*指示實驗具有ρ<0.05；**指示實驗具有ρ<0.01。圖19A和19B描繪了被⑶llc_ATM(白色柱)或⑶llc+ATM(條紋柱)活化的T細胞的細胞因子/趨化因子譜型，如實施例8所述。圖20A顯示的圖證明了與⑶Ilc+ATM(條紋柱)相比，⑶llc_ATM具有顯著更高的編碼⑶209a、⑶209b和⑶209c的mRNA水平(白色柱)，如實施例9所述。圖20B描繪了自不肥胖雄性C57BL/6小鼠(8周齡)或肥胖雄性C57BL/6小鼠(24周齡，在HFD上20周)附睪脂肪組織衍生的ATM上的⑶209b/SIGN-Rl和⑶Ilc的FACS分析，如實施例9所述。數據代表來自4-6份獨立ATM分離物的各個分離群體的三個陣列的平均值。*指示ρ彡0.05；**指示P^0.Olo發明詳述定義在詳細描述本發明之前，應當理解，本發明不限于具體的組合物或生物學系統，其當然可以有所變化。還應當理解，本文中所使用的術語僅僅是出于描述具體實施方案的目的，并非意圖限制。在用于本說明書和所附權利要求書時，單數形式“一個”、“一種”和“所述”包括復數稱謂，除非另有明確說明。如此，例如，“一個/一種分子”任選包括兩個或多個/兩種或多種所述分子的組合，諸如此類。術語“炎癥相關組織巨噬細胞”或“IRTM”在用于本文時指自單核細胞衍生的、與炎癥和一種或多種疾病狀態有關的一類免疫細胞。IRTM的例子包括但不限于腫瘤相關巨噬細胞和脂肪組織巨噬細胞。在某些實施方案中，IRTM還可包括但不限于肺泡巨噬細胞和在實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)中的中樞神經系統中找到的巨噬細胞。術語“IRTM結合蛋白”在用于本文時指特異性結合IRTM的分子。IRTM結合蛋白包括但不限于結合IRTM的抗體或其抗原結合片段、蛋白質、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、生物有機分子、肽模擬物、藥物學試劑及其代謝物、融合蛋白和受體分子。此類結合可以是例如針對IRTM細胞表面的蛋白質的或針對一些其它IRTM細胞表面分子的。術語“腫瘤相關巨噬細胞”或“ΤΑΜ”在用于本文時指自單核細胞衍生的、能在與腫瘤有關的免疫浸潤物中找到的細胞。如本文中所示，TAM表達某些巨噬細胞細胞表面標志物和某些樹突細胞表面標志物二者。術語“ΤΑΜ結合蛋白”在用于本文時指特異性結合TAM的分子。TAM結合蛋白包括但不限于結合TAM的抗體或其抗原結合片段、蛋白質、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、生物有機分子、肽模擬物、藥物學試劑及其代謝物、融合蛋白和受體分子。此類結合可以是例如針對TAM細胞表面處的蛋白質的或針對一些其它TAM細胞表面分子的。術語“脂肪組織巨噬細胞”或“ATM”在用于本文時指自單核細胞衍生的、能在肥胖受試者中與脂肪組織有關的免疫浸潤物中找到的細胞。如本文中所示，ATM表達某些巨噬細胞細胞表面標志物和某些樹突細胞表面標志物二者。術語“ATM結合蛋白”在用于本文時指特異性結合ATM的分子。ATM結合蛋白包括但不限于結合ATM的抗體或其抗原結合片段、蛋白質、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、生物有機分子、肽模擬物、藥物學試劑及其代謝物、融合蛋白和受體分子。此類結合可以是例如針對ATM細胞表面的蛋白質的或針對一些其它ATM細胞表面分子的?？s寫“Mf”和“ΜΦ”在用于本文時指巨噬細胞?？s寫“pMf”和“ρΜΦ”指腹膜巨噬細胞。術語“拮抗劑”在用于本文時指能夠中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾本發明蛋白質的活性(包括其與一種或多種受體的結合(在配體的情況中)或與一種或多種配體的結合(在受體的情況中)的分子。拮抗劑包括抗體及其抗原結合片段、蛋白質、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有機分子、肽模擬物、藥物學試劑及其代謝物、轉錄和翻譯控制序列、諸如此類。拮抗劑還包括本發明蛋白質的小分子抑制劑和融合蛋白、能特異性結合蛋白質由此使其隔絕與其靶物結合的受體分子及衍生物、蛋白質的拮抗性變體、針對本發明蛋白質的反義分子、RNA適體和針對本發明蛋白質的核酶?！白钄嘈浴笨贵w或“拮抗性”抗體指抑制或降低其所結合的抗原的生物學活性的抗體。某些阻斷性抗體或拮抗性抗體實質上或完全抑制抗原的生物學活性。術語“IRTM拮抗劑”在用于本文時指能結合IRTM并抑制或實質性降低IRTM生物學活性的分子。IRTM拮抗劑的非限制性例子包括抗體、蛋白質、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有機分子、肽模擬物、小分子、藥物學試劑及其代謝物、轉錄和翻譯控制序列、諸如此類。在本發明的一個實施方案中，IRTM拮抗劑是抗體，尤其是能結合人IRTM的抗IRTM細胞表面標志物抗體。術語“ΤΑΜ拮抗劑”在用于本文時指能結合TAM并抑制或實質性降低TAM生物學活性的分子。TAM拮抗劑的非限制性例子包括抗體、蛋白質、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有機分子、肽模擬物、小分子、藥物學試劑及其代謝物、轉錄和翻譯控制序列、諸如此類。在本發明的一個實施方案中，TAM拮抗劑是抗體，尤其是能結合人TAM的抗TAM細胞表面標志物抗體。術語“ATM拮抗劑”在用于本文時指能結合ATM并抑制或實質性降低ATM生物學活性的分子。ATM拮抗劑的非限制性例子包括抗體、蛋白質、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有機分子、肽模擬物、小分子、藥物學試劑及其代謝物、轉錄和翻譯控制序列、諸如此類。在本發明的一個實施方案中，ATM拮抗劑是抗體，尤其是能結合人ATM的抗ATM細胞表面標志物抗體。術語“F4/80拮抗劑”在用于本文時指能結合F4/80并抑制或實質性降低F4/80生物學活性的分子。F4/80拮抗劑的非限制性例子包括抗體、蛋白質、肽、糖蛋白、糖肽、糖月旨、多糖、寡糖、核酸、生物有機分子、肽模擬物、小分子、藥物學試劑及其代謝物、轉錄和翻譯控制序列、諸如此類。在本發明的一個實施方案中，F4/80拮抗劑是抗體，尤其是能結合人F4/80的抗F4/80抗體。術語“⑶IlC拮抗劑”在用于本文時指能結合⑶IlC并抑制或實質性降低⑶IlC生物學活性的分子。CDllC拮抗劑的非限制性例子包括抗體、蛋白質、肽、糖蛋白、糖肽、糖月旨、多糖、寡糖、核酸、生物有機分子、肽模擬物、小分子、藥物學試劑及其代謝物、轉錄和翻譯控制序列、諸如此類。在本發明的一個實施方案中，CDllC拮抗劑是抗體，尤其是能結合人CDllC的抗CDllC抗體。術語“Iangerin拮抗劑”在用于本文時指能結合Iangerin(優選人langerin)并抑制或實質性降低Iangerin生物學活性的分子。langerin拮抗劑的非限制性例子包括抗體、蛋白質、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有機分子、肽模擬物、小分子、藥物學試劑及其代謝物、轉錄和翻譯控制序列、諸如此類。在本發明的一個實施方案中，Iangerin拮抗劑是抗體，尤其是能在胞內結合人Iangerin的抗Iangerin抗體。在本發明的另一個實施方案中，Iangerin拮抗劑是能結合人Iangerin的小分子。術語“激動劑”指能夠刺激、活化或以其它方式增強本發明蛋白質的活性(包括其與一種或多種受體的結合(在配體的情況中)或與一種或多種配體的結合(在受體的情況中)的分子。激動劑包括抗體及其抗原結合片段、蛋白質、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有機分子、肽模擬物、藥物學試劑及其代謝物、轉錄和翻譯控制序列、諸如此類。激動劑還包括本發明蛋白質的小分子活化劑和融合蛋白、能特異性結合蛋白質由此增強蛋白質的活性(例如與其靶物的結合)的受體分子及衍生物、蛋白質的激動性變體、針對本發明蛋白質的抑制劑的反義分子、對本發明蛋白質的抑制劑特異性的RNA適體和針對本發明蛋白質的抑制劑的核酶。術語“IRTM激動劑”指能夠刺激、活化或以其它方式增強IRTM活性(例如通過與一種或多種IRTM受體結合并刺激IRTM活性或通過與一種或多種IRTM抑制劑結合并防止該抑制劑與IRTM相互作用)的分子。激動劑包括但不限于抗體及其抗原結合片段、蛋白質、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有機分子、肽模擬物、藥物學試劑及其代謝物、小分子、融合蛋白、受體分子及其延伸物、以及針對IRTM抑制劑的反義分子、RNA適體和核酶。術語“ATM激動劑”指能夠刺激、活化或以其它方式增強ATM活性(例如通過與一種或多種ATM受體結合并刺激ATM活性或通過與一種或多種ATM抑制劑結合并防止該抑制劑與ATM相互作用)的分子。激動劑包括但不限于抗體及其抗原結合片段、蛋白質、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有機分子、肽模擬物、藥物學試劑及其代謝物、小分子、融合蛋白、受體分子及其延伸物、以及針對ATM抑制劑的反義分子、RNA適體和核酶。“天然序列”多肽包括與衍生自自然界的多肽具有相同氨基酸序列的多肽。如此，天然序列多肽可以具有來自任何哺乳動物的天然存在多肽的氨基酸序列。此類天然序列多肽可以從自然界分離，或者可以通過重組或合成手段來生產。術語“天然序列”多肽明確涵蓋該多肽的天然存在的截短或分泌形式(例如胞外結構域序列)、天然存在的變體形式(例如可變剪接形式)、及天然存在的等位變體?！岸嚯逆湣敝钙渲衅涿總€結構域通過肽鍵(不同于非共價相互作用或二硫鍵)與其它結構域相連的多肽。多肽“變體”指與相應的天然序列多肽具有至少約80%氨基酸序列同一性的生物學活性多肽。此類變體包括例如其中在多肽的N和/或C末端添加或刪除一個或多個氨基酸(天然存在氨基酸和/或非天然存在氨基酸)殘基的多肽。通常，變體將會與天然序列多肽具有至少約80%氨基酸序列同一性，或至少約90%氨基酸序列同一性，或至少約95%或更多氨基酸序列同一性。變體還包括天然序列的多肽片段(例如亞序列、截短物等)，它們通常是有生物學活性的。本文中的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定義為對比序列并在必要時引入缺口以獲取最大百分比序列同一性后，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時，候選序列中與選定序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測定百分比氨基酸序列同一性目的的對比可以以本領域技術范圍內的多種方式進行，例如使用公眾可得到的計算機軟件,諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)軟件。本領域技術人員可決定用于測量對比的適宜參數，包括對所比較序列全長獲得最大對比所需的任何算法。然而，為了本發明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比較計算機程序ALIGN-2如下所述獲得的。ALIGN-2序列比較計算機程序由Genentech公司編寫，而且已經連同用戶文檔一起提交給美國版權局(USCopyrightOffice,WashingtonD.C.，20559)，并以美國版權注冊號TXU510087注冊，公眾可通過Genentech公司(SouthSanFrancisco,California)獲取。ALIGN2程序應當編譯成在UNIX操作系統(優選數碼UNIXV4.OD)上使用。所有序列比較參數由ALIGN-2程序設定且不變。為了本發明的目的，給定氨基酸序列A相對于(to)、與(with)或針對(against)給定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對于、與或針對給定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A)如下計算分數X/Y乘100其中X是由序列對比程序ALIGN-2在該程序的A和B對比中評分為相同匹配的氨基酸殘基數，且其中Y是B中的氨基酸殘基總數。可以領會，若氨基酸序列A的長度與氨基酸序列B的長度不相等，則A相對于B的％氨基酸序列同一性將不等于B相對于A的％氨基酸序列同一性。術語“蛋白質變體”在用于本文時指上文所述變體和/或在天然蛋白質序列中包含一處或多處氨基酸突變的蛋白質。任選的是，所述一處或多處氨基酸突變包括氨基酸替代。用于本發明的蛋白質及其變體可通過本領域眾所周知的多種方法來制備。蛋白質的氨基酸序列變體可通過蛋白質DNA中的突變來制備。此類變體包括例如蛋白質氨基酸序列內的殘基刪除、插入或替代?？梢赃M行刪除、插入和替代的任何組合以獲得具有期望活性的最終構建物。將在編碼變體的DNA中進行的突變絕不能將序列置于讀碼框之外，而且優選不會產生能產生二級mRNA結構的互補區。蛋白質變體的制備任選通過編碼天然蛋白質的DNA中的核苷酸定點誘變或噬菌體展示技術，由此產生編碼變體的DNA，然后在重組細胞培養物中表達該DNA。盡管用于引入氨基酸序列變異的位點是預先決定的，然而突變本身不必預先決定。例如，為了優化給定位點處突變的后果，可以在目標密碼子或區域進行隨機誘變，并對所表達的蛋白質變體篩選期望活性的最佳組合。用于在具有已知序列的DNA中預先決定的位點進行替代突變的技術是眾所周知的，諸如例如位點特異性誘變。本文所述蛋白質變體的制備可通過噬菌體展示技術來實現，諸如那些如PCT出版物WO00/63380所記載的。在選出這樣的克隆后，可以取出突變后的蛋白質區并置入適用于蛋白質生產的載體，一般是可用于轉化適宜宿主的那種類型的表達載體。氨基酸序列刪除的范圍一般是約1-30個殘基，任選1-10個殘基，任選1-5個殘基或更少，而且通常是連續的。氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，從一個殘基至長度本質上不受限制的多肽，以及單個或多個氨基酸殘基的序列內插入。序列內插入(即天然蛋白質序列內的插入)的范圍一般可以是約1-10個殘基，任選1-5個，或任選1-3個。末端插入的例子包括在N-末端融合信號序列(無論對宿主細胞是異源的或同源的)以便于由重組宿主分泌。別的蛋白質變體有那些其中天然蛋白質的至少一個氨基酸殘基已經消除并在它的位置插入了不同殘基的。此類替代可依照表1所示進行。蛋白質變體還可包含本文所述的非天然氨基酸。氨基酸可以根據其側鏈特性的相似性如下分組(A.L.Lehninger,Biochemistry,第2版，pp.73-75，WorthPublishers,NewYork,(1975))非極性的=Ala(A),Val(V)、Leu(L)、lie(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)不帶電荷的、極性的:Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)酸性的Asp(D)、Glu(E)堿性的Lys(K)、Arg(R)、His(H)或者，天然存在殘基可以基于共同的側鏈特性如下分組疏水性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie；中性的、親水性的Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；酸性的Asp、Glu;堿性的His、Lys、Arg；影響鏈取向的殘基Gly、Pro；芳香族的Trp、Tyr、Phe。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>“天然存在的氨基酸殘基”(即由遺傳密碼編碼的氨基酸殘基)可以選自丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gin)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；組氨酸(His)；異亮氨酸(lie)；亮氨酸(Leu)；賴氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；絲氨酸(Ser)；蘇氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和纈氨酸(Val)?！胺翘烊淮嬖诘陌被釟埢敝干衔乃刑烊淮嬖诎被釟埢酝獾模軌蛟诙嚯逆溨信c鄰近氨基酸殘基共價結合的殘基。非天然存在氨基酸殘基的例子包括例如正亮氨酸、鳥氨酸、正纈氨酸、高絲氨酸和其它氨基酸殘基類似物，諸如那些Ellmanetal.,Meth.Enzym.202=301-336(1991)及美國專利申請出版物20030108885和20030082575中所記載的。簡言之，這些規程牽涉用非天然存在氨基酸殘基活化阻抑型tRNA，接著在體外或在體內轉錄并翻譯RNA。參見例如美國專利申請出版物20030108885和20030082575；Norenetal.，Science244:182(1989)；及Ellmanetal.，見上文?！胺蛛x的”多肽指已經鑒定且與/由其天然環境的成分分開和/或回收的多肽。多肽的天然環境的污染性成分指將會干擾其診斷或治療用途的物質，可包括酶、激素和其它蛋白質性質或非蛋白質性質的溶質。在某些實施方案中，將多肽純化至(1)根據Lowry法的測定，多肽重量超過95%或重量超過99%，(2)足以通過使用轉杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端或內部氨基酸序列的程度，或(3)根據使用考馬斯藍或銀染色的還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE，達到同質。既然多肽的天然環境的至少一種成分不會存在，那么分離的多肽包括重組細胞內的原位多肽。然而，分離的多肽通常通過至少一個純化步驟來制備。術語“抗體”以最廣義使用，明確涵蓋單克隆抗體(包括全長的或完整的單克隆抗體)、多克隆抗體、多價抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段(見下文)，只要它們展現出期望的生物學活性。除非另有說明，表述“多價抗體”貫穿本說明書用于指包含三個或更多抗原結合位點的抗體。多價抗體通常改造成具有三個或更多抗原結合位點，而且一般不是天然序列IgM或IgA抗體?！翱贵w片段”只包含完整抗體的一部分，一般包括完整抗體的抗原結合位點，如此保留了與抗原結合的能力。此定義所涵蓋的抗體片段的例子包括(i)Fab片段，其具有VL、CL、VH和CH1結構域；(ii)Fab‘片段，其是在CH1結構域的C-末端具有一個或多個半胱氨酸殘基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CH1結構域；(iv)Fd'片段，其具有VH和CH1結構域及CH1結構域C-末端的一個或多個半胱氨酸殘基；(v)Fv片段，其具有抗體單臂的VL和VH結構域；(vi)dAb片段(Wardetal.，Nature341:544_546(1989))，其由VH結構域組成；(vii)分離的⑶R區；(viii)F(ab')2片段，即包含通過鉸鏈區的二硫橋相連的兩個Fab'片段的二價片段；(ix)單鏈抗體分子(例如單鏈FV;SCFV)(Birdetal.，Science242:423_426(1988)和Hustonetal.，PNAS(USA)85:5879_5883(1988))；(x)“雙抗體”，其具有兩個抗原結合位點，包含在同一條多肽鏈中相連的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)(參見例如EP404,097;W093/11161；和Hollingeretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90=6444-6448(1993))；(xi)“線性抗體”，其包含一對串聯的Fd區段(VH-CH1-VH-CH1)，與互補的輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區(Zapataetal.，ProteinEng.8(10)1057-1062(1995)和美國專利5，641，870)。術語“單克隆抗體”在用于本文時指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即構成群體的各個抗體是相同的，除了可以以極小量存在的可能突變(例如天然存在突變)夕卜。如此，修飾語“單克隆”表明抗體不是不同抗體混合物的特征。單克隆抗體是針對單一抗原高度特異性的。在某些實施方案中，單克隆抗體典型地包括包含能結合靶物的多肽序列的抗體，其中靶物結合多肽序列是通過包括從眾多多肽序列中選擇單一靶物結合多肽序列在內的過程得到的。例如，選擇過程可以是從眾多克隆(諸如雜交瘤克隆、噬菌體克隆或重組DNA克隆的集合)中選擇獨特克隆。應當理解，所選擇的靶物結合序列可進一步改變，例如為了提高對靶物的親和力、將靶物結合序列人源化、提高其在細胞培養物中的產量、降低其在體內的免疫原性、創建多特異性抗體等，而且包含改變后的靶物結合序列的抗體也是本發明的單克隆抗體。與典型的包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。在它們的特異性之外，單克隆抗體制備物的優點還在于它們通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語“單克隆”表明抗體從基本上同質的抗體群獲得的特征，不應解釋為要求通過任何特定方法來生產抗體。例如，將依照本發明使用的單克隆抗體可通過多種技術來生成，包括例如雜交瘤法(例如KohlerandMilstein,Nature256:495—97(1975)；Hongoetal.,Hybridoma,14(3):253_260(1995)；Harlowetal.,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2nded.1988；Hammerlingetal.,于MonoclonalAntibodiesandT—CellHybridomas,563—681,Elsevier,N.Y.,1981)、重組DNA法(參見例如美國專利No.4，816，567)、噬菌體展示技術(參見例如Clacksonetal.,Nature352:624-628(1991)；Marksetal.,J.Mol.Biol.222581-597(1991)；Sidhuetal.,J.Mol.Biol.338(2):299_310(2004)；Leeetal.,J.Mol.Biol.340(5)1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Nat.Acad.Sci.USA101(34)12467-12472(2004)；及Leeetal.,J.Immunol.Methods284(1-2)119-132(2004))、及用于在具有部分或整個人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因的動物中生成人或人樣抗體的技術(參見例如WO1998/24893；WO1996/34096；WO1996/33735；W01991/10741；Jakobovitsetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2551(1993)；Jakobovitsetal.,Nature362:255-258(1993)；Bruggemannetal.,Yearinlmmuno.7:33(1993)；美國專利No.5，545，807；5，545，806；5，569，825；5，625，126；5，633，425；5，661，016；Marksetal.，Bio/Technology10:779_783(1992)；Lonbergetal.，Nature368:856_859(1994)；Morrison,Nature368812-813(1994)；Fishwildetal.,NatureBiotechnol.14845-851(1996)；Neuberger,NatureBiotechnol.14:826(1996)；及LonbergandHuszar,Intern.Rev.Immunol.13:65_93(1995))。單克隆抗體在本文中明確包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或屬于特定抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或屬于另一抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現出期望的生物學活性(美國專利No.4，816，567和Morrisonetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851_6855(1984))。非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)(諸如小鼠、大鼠、家兔或非人靈長類動物)的高變區殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(FR)殘基用相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體中或在供體抗體中沒有找到的殘基。進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個、通常兩個基本上整個如下的可變域，其中所有或基本上所有高變環對應于非人免疫球蛋白的高變環，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR0人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定區。更多細節參見Jonesetal.，Nature321:522_525(1986)；Riechmannetal.，Nature332:323_329(1988)；及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2:593_596(1992)。還可參見例如VaswaniandHamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions231035-1038(1995)；HurleandGross,Curr.Op.Biotech.5:428_433(1994)；及美國專利No.6，982，321和7，087，409。還可參見vanDijkandvandeWinkel，Curr.Opin.Pharmacol.，5:368_74(2001)。人抗體可以如下制備，即將抗原施用于轉基因動物，其經修飾而應答抗原挑戰生成此類抗體，但是其內源基因座已經失去能力，例如經免疫的異種移植小鼠(xenomice)(參見例如美國專利No.6，075，181和6，150，584，關于XEN0M0USE技術)。還可參見例如Lietal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103=3557-3562(2006)，關于經人B細胞雜交瘤技術生成的人抗體?！叭丝贵w”指擁有與由人生成的抗體的氨基酸序列對應的氨基酸序列和/或使用本文所公開的用于生成人抗體的任何技術生成的抗體。人抗體的這種定義明確排除包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。人抗體可使用本領域已知的多種技術來生成。在一個實施方案中，人抗體是從噬菌體文庫選擇的，該噬菌體文庫表達人抗體(Vaughanetal.，NatureBiotechnology14:309-314(1996)；Sheetsetal.，PNAS(USA)95:6157_6162(1998);Hoogenboomandffinter,J.Mol.Biol.227381(1991)；Marksetal.,J.Mol.Biol.222581(1991))。人抗體還可通過將人免疫球蛋白基因座導入內源免疫球蛋白基因已經部分或完全滅活的轉基因動物(例如小鼠)來生成。在受到攻擊時，觀察到人抗體生成，它在所有方面與在人體中看到的極其相似，包括基因重排、裝配和抗體全集。這種方法記載于例如美國專利No.5，545,807；5，545,806；5，569,825；5,625,126；5，633，425；5，661，016，及以下科學出版物Marksetal.,Bio/Technology10:779-783(1992)；Lonbergetal.,Nature368856-859(1994)；Morrison,Nature368812-13(1994)；Fishwildetal.，NatureBiotechnologyl4845-51(1996)；Neuberger,NatureBiotechnology14:826(1996)；LonbergandHuszar,Intern.Rev.Immunol.13:65_93(1995)?；蛘?，人抗體可通過生成針對靶抗原的抗體的人B淋巴細胞的永生化來制備(此類B淋巴細胞可從個體回收，或者可在體夕卜免疫)。參見例如Coleetal.,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss，p.77(1985)；Boerneretal.,J.Immunol.147(1):86_95(1991)；及美國專利No.5，750，373。術語“可變的”指可變域中的某些部分在抗體間序列差異廣泛且用于每種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性的實情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個可變域。它集中于輕鏈和重鏈可變域中稱作高變區的三個區段。可變域中較高度保守的部分稱作框架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個FR，它們大多采取折疊片構象，通過形成環狀連接且在有些情況中形成折疊片結構一部分的三個高變區連接。每條鏈中的高變區通過FR非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的高變區一起促成抗體的抗原結合位點的形成(參見Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，PublicHealthService,NationalInstituteofHealth,Bethesda,MD.(1991))。恒定域不直接參與抗體與抗原的結合，但展現出多種效應器功能，諸如抗體在抗體依賴性細胞的細胞毒性中的參與。術語“高變區”、“HVR”或“HV”在用于本文時指抗體中負責抗原結合的氨基酸殘基。例如，術語高變區指抗體可變域中序列上高度可變和/或形成結構上定義的環的區域。通常，抗體包含六個HVR:三個在VH中011、112、113)，三個在乂1^中(L1、L2、L3)。在天然抗體中，H3和L3展示這六個HVR的最大多樣性，而且認為特別是H3在賦予抗體以精密特異性中發揮獨特作用。參見例如Xuetal.Immunity13:37-45(2000)JohnsonandWu于MethodsinMolecularBiology248:l-25(Lo,ed.,HumanPress，Totowa，NJ，2003)。實上，僅由重鏈組成的天然存在camelid抗體在缺乏輕鏈時是有功能的且穩定的。參見例如Hamers-Castermanetal.Nature363446-448(1993)；Sheriffetal.NatureStruct.Biol.3733-736(1996)。本文中使用且涵蓋許多HVR的敘述。Kabat互補決定區(⑶R)是以序列變異性為基石出的，而且是最常用的(Kabatetal.，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD.(1991))。Chothia改為指結構環的位置(ChothiaandLeskJ.Mol.Biol.196901-917(1987))。AbMHVR代表KabatHVR與Chothia結構環之間的折衷，而且得到OxfordMolecular的AbM抗體建模軟件的使用。“接觸”HVR是以對可獲得的復合物晶體結構的分析為基礎的。下文記錄了這些HVR中每一個的殘基。環KabatAbMChothia接觸LIL24-L34L24-L34L26-L32L30-L36L2L50-L56L50-L56L50-L52L46-L55L3L89-L97L89-L97L91-L96L89-L96HIH31-H35BiH26-H35BH26-H32H30-H35B(Kabat編號方式)HIH31-H35H26-H35H26-H32H30-H35(Chothia編號方式)H2H50-H65H50-H58H53-H55H47-H58H3H95-H102H95-H102H96-H101H93-H101HVR可包括如下“延伸的HVR”:VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-■97或89-96(L3)及VH中的26-35(HI),50-65或49-65(H2)和93-102,94-102或95-102(H3)。對于這些定義中的每一個，可變域殘基是依照Kabat等，見上文編號的?！翱蚣軈^”或“FR”殘基指可變域中除本文中所定義的高變區殘基之外的那些殘基。術語“依照Kabat的可變域殘基編號方式”或“依照Kabat的氨基酸位置編號方式”及其變化形式指Kabatetal.，見上文中的用于抗體重鏈可變域或輕鏈可變域編輯的編號系統。使用此編號系統，實際的線性氨基酸序列可包含較少或另外的氨基酸，對應于可變域FR或HVR的縮短或插入。例如，重鏈可變域可包含H2殘基52后的單一氨基酸插入(依照Kabat為殘基52a)及重鏈FR殘基82后的插入殘基(例如依照Kabat為殘基82a、82b和82c等)。給定抗體的Kabat殘基編號方式可通過將抗體序列與“標準”Kabat編號序列對比同源區來確定。貫穿本說明書和權利要求書，Kabat編號系統一般在提及可變域中的殘基(大約是輕鏈殘基1-107和重鏈殘基1-113)時使用(例如Kabatetal.，SequencesofImmunologicalInterest.5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991))?！癊U編號系統”或“EU索引”一般在提及免疫球蛋白重鏈恒定區中的殘基時使用(例如Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)中報道的EU索引，明確收入本文作為參考)。除非本文中另有說明，提及抗體可變域中的殘基編號指根據Kabat編號系統的殘基編號方式。除非本文中另有說明，提及抗體恒定域中的殘基編號指根據EU編號系統的殘基編號方式(例如參見美國臨時申請No.60/640，323，EU編號方式的圖)。根據其重鏈恒定域的氨基酸序列，抗體(免疫球蛋白)可歸入不同的類。免疫球蛋白有五大類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進一步分為亞類(同種型)，例如IgGj包括非A和A同種異型)、IgG2、IgG3、IgG4、她和IgA2。將與不同類的免疫球蛋白對應的重鏈恒定域分別稱作a、S、￡、Y和y。不同類別免疫球蛋白的亞基結構和三維構造是眾所周知的，一般性記載于例如Abbasetal.,CellularandMol.Immunology,4thed.(ff.B.Saunders,Co.，2000)?？贵w可以是抗體與一種或多種其它蛋白質或肽共價或非共價結合而形成的更大融合分子的一部分。根據其恒定域的氨基酸序列，來自任何脊椎動物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可歸入兩種截然不同的型中的一種，稱作卡帕(K)和拉姆達(入)。術語“Fc區”用于定義免疫球蛋白重鏈的C端區，其可以是通過木瓜蛋白酶消化完整抗體生成的。Fc區可以是天然序列Fc區或變異Fc區。雖然免疫球蛋白重鏈Fc區的邊界可以變化，但是人IgG重鏈Fc區通常定義為Fc區自大約Cys226位置或大約Pro230位置的氨基酸殘基至羧基末端的區段。Fc區的C-末端賴氨酸(殘基447，依照EU編號系統)可以消除，例如在生產或純化抗體的過程中，或者通過對編碼抗體重鏈的核酸進行重組工程改造。因而，完整抗體的組合物可包括所有K447殘基都被消除的抗體群、無一K447殘基被消除的抗體群或者混合了有和無K447殘基的抗體的抗體群。免疫球蛋白的Fc區一般包含兩個恒定域，即CH2結構域和CH3結構域，任選包含CH4結構域。除非本文另有說明，免疫球蛋白重鏈的殘基編號方式是如Kabatetal.，見上文中的EU索引的編號方式。“如Kabat中的EU索引”指人IgGlEU抗體的殘基編號方式。"Fc區鏈”在本文中指Fc區兩條多肽鏈之一。人IgGFc區的“CH2結構域”(也稱為“Cg2”結構域)通常自約第231位氨基酸殘基延伸至約第340位氨基酸殘基。CH2結構域的獨特之處在于它沒有與另一結構域緊密配對。而是，有兩個N-連接的分支的碳水化合物鏈介于完整天然IgG分子的兩個CH2結構域之間。推測碳水化合物可能提供結構域_結構域配對的替代且有助于穩定CH2結構域。Burton,Molec.Immunol.22161-206(1985)。CH2結構域在本文中可以是天然序列CH2結構域或變異CH2結構域。"CH3結構域”包含Fc區中CH2結構域C端的一段殘基(即自IgG的約第341位氨基酸殘基至約第447位氨基酸殘基)。CH3區在本文中可以是天然序列CH3結構域或變異CH3結構域(例如在其一條鏈中具有引入的“隆起”(protroberance)而在其另一條鏈中具有相應引入的“空腔”(cavity)的CH3結構域；參見美國專利No.5，821，333，明確收入本文作為參考)。此類變異CH3結構域可用于生成本文所述多特異性(例如雙特異性)抗體?！般q鏈區”通常定義為自人IgGl的約Glu216或約Cys226至約Pro230的區段(Burton,Molec.Immunol.22161-206(1985))。其它IgG同種型的鉸鏈區可以通過將第一個和最后一個形成重鏈間S-S鍵的半胱氨酸殘基置于相同位置而與IgGl序列對比。鉸鏈區在本文中可以是天然序列鉸鏈區或變異鉸鏈區。變異鉸鏈區的兩條多肽鏈通常每條多肽鏈保留至少一個半胱氨酸殘基，使得變異鉸鏈區的兩條多肽鏈可在兩條鏈之間形成二硫鍵。本文中優選的鉸鏈區是天然序列人鉸鏈區，例如天然序列人IgGl鉸鏈區。“功能性Fc區”擁有天然序列Fc區的至少一項“效應器功能”。例示性的“效應器功能”包括Clq結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、吞噬作用、細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)下調等。此類效應器功能一般要求Fc區與結合域(例如抗體可變域)結合，而且可使用本領域已知的用于評估此類抗體效應器功能的多種測定法來評估?！疤烊恍蛄蠪c區”包含與自然界中找到的Fc區的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc區包括天然序列人IgGlFc區(非A和A同種異型)、天然序列人IgG2Fc區、天然序列人IgG3Fc區、及天然序列人IgG4Fc區，及其天然存在變體?！白儺怓c區”包含由于至少一處氨基酸修飾而與天然序列Fc區有所不同的氨基酸序列。在某些實施方案中，變異Fc區具有與天然序列Fc區或與親本多肽的Fc區相比至少一處氨基酸替代，例如在天然序列Fc區中或在親本多肽的Fc區中具有約1處至約10處氨基酸替代，優選約1處至約5處氨基酸替代，例如在天然序列Fc區中或在親本多肽的Fc區中具有約1處至約10處氨基酸替代，優選約1處至約5處氨基酸替代。典型的是，變異Fc區在本文中將與天然序列Fc區和/或親本多肽的Fc區擁有至少約80%序列同一性，或至少約90%序列同一性，或至少約95%或更多序列同一性?？贵w“效應器功能”指那些可歸于抗體Fc區(天然序列Fc區或氨基酸序列變體Fc區)且隨抗體同種型而變化的生物學活性。抗體效應器功能的例子包括Clq結合和補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)下調；和B細胞活化?！翱贵w依賴性細胞介導的細胞毒性”或“ADCC”指其中結合到某些細胞毒性細胞(例如天然殺傷(NK)細胞、嗜中性細胞和巨噬細胞)上存在的Fc受體(FcR)上的分泌型Ig使得這些細胞毒性效應細胞能夠特異性結合攜帶抗原的靶細胞，隨后用細胞毒素殺死靶細胞的細胞毒性形式。介導ADCC的主要細胞即NK細胞只表達FcyRIII，而單核細胞表達FcγRI、FcYRII禾口FcYRIII0RavetchandKinet,Annu.Rev.Immunol.9457-92(1991)第464頁表3總結了造血細胞上的FcR表達。為了評估感興趣分子的ADCC活性，可進行體外ADCC測定法，諸如美國專利No.5，500,362或5，821，337中所記載的。可用于此類測定法的效應細胞包括外周血單個核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞。或者/另外，可在體內評估感興趣分子的ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynesetal.，PNAS(USA)95652-656(1998)中所披露的。“人效應細胞”指表達一種或多種FcR并行使效應器功能的白細胞。在某些實施方案中，該細胞至少表達FcYRIII并行使ADCC效應器功能。介導ADCC的人白細胞的例子包括外周血單個核細胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞和嗜中性細胞，一般優選PBMC和NK細胞。效應細胞可以從其天然來源(例如從血液或PBMC)分離，如本文所述?！癋e受體”或“FcR”描述結合抗體Fc區的受體。在有些實施方案中，FcR是天然人FcR。在有些實施方案中，FcR是結合IgG抗體的FcR(γ受體)，包括屬于FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類的受體，包括那些受體的等位變體和可變剪接形式。FcyRII受體包括FcyRIIA(“活化受體”)和FCYRIIB(“抑制受體”)，它們具有相似的氨基酸序列，區別主要在于其胞質結構域?；罨荏wFcyRIIA在其胞質結構域中包含免疫受體基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其胞質結構域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見例如DaSron,Annu.Rev.Immunol.15:203_234(1997))。FcR的綜述參見例如RavetchandKinet,Annu.Rev.Immunol.9457-492(1991)；Capeletal.，Immunomethods4:25-34(1994)；及deHaasetal.，J.Lab.Clin.Med.126:330_41(1995)。術語“FcR”在本文中涵蓋其它FcR，包括那些未來將會鑒定的。術語“Fe受體”或“FcR”還包括新生兒受體，FcRn，它負責將母體IgG轉移給胎兒(Guyeretal.，J.Immunol.117587(1976)和Kimetal.，J.Immunol.24249(1994))并調節免疫球蛋白的體內穩態。測量對FcRn的結合的方法是已知的(參見例如Ghetie1997，Hinton2004)。測量對FeRn的結合的方法是已知的(參見例如GhetieandWard·,Immunol.Today18(12):592_598(1997)；Ghetieetal.,NatureBiotechnology,15(7)637-640(1997)；Hintonetal.,J.Biol.Chem.279(8)6213-6216(2004)；WO2004/92219(Hintonetal·))?？蓽y定人FcRn高親和力結合多肽與人FcRn的體內結合和血清半衰期，例如在表達人FcRn的轉基因小鼠或經轉染人細胞系中，或者在施用了具有變異Fc區的多肽的靈長類動物中。WO00/42072(Presta)記載了對FcR的結合提高或降低的抗體變體。還可參見例如Shieldsetal.,J.Biol.Chem.9(2):6591_6604(2001)。“補體依賴性細胞毒性”或“CDC”指存在補體時對靶細胞的溶解。經典補體途徑的激活是由補體系統第一組分(Clq)結合抗體(適宜亞類的)起始的，該抗體已結合至其關聯抗原。為了評估補體激活，可進行CDC測定法，例如如Gazzano-Santoroetal.,J.Immunol.Methods202:163(1996)中所記載的。具有更改的Fc區氨基酸序列(具有變異Fc區的多肽)及提高或降低的Clq結合能力的多肽變體記載于例如美國專利No.6，194，551B1和W01999/51642。還可參見例如Idusogieetal.,J.Immunol.1644178-4184(2000)?！坝H和力成熟的”抗體指在抗體的一個或多個CDR中具有一處或多處改變、導致該抗體對抗原的親和力與沒有這些改變的親本抗體相比有所改進的抗體。在一個實施方案，親和力成熟的抗體具有納摩爾或甚至皮摩爾量級的對靶抗原的親和力。親和力成熟的抗體可通過本領域已知規程來生成。Marksetal.,Bio/Technology10:779_783(1992)記載了通過VH和VL結構域改組進行的親和力成熟。以下文獻記載了CDR和/或框架殘基的隨機誘^=Barbasetal.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA913809-3813(1994)；Schieretal.，Gene169147-155(1995)；Yeltonetal.，J.Immunol.1551994-2004(1995)Jacksonetal.，J.Immunol.154(7):3310_9(1995)；及Hawkinsetal.，J.Mol.Biol.226:889_896(1992)?！叭嵝越宇^”在本文中指包含兩個或更多通過肽鍵相連的氨基酸殘基且為由其連接的兩段多肽(諸如兩個Fd區)提供更多旋轉自由的肽。所述旋轉自由容許由柔性接頭連接的兩個或更多抗原結合位點各自更高效的接近靶抗原。合適的柔性接頭肽序列的例子包括gly_ser、gly-ser—gly—ser、ala-ser禾口gly-gly-gly—ser?！岸刍Y構域”是由至少兩個氨基酸殘基(一般是半胱氨酸殘基)或者至少兩個肽或多肽(其可以具有相同或不同的氨基酸序列)結合形成的。所述肽或多肽可以經由共價和/或非共價結合而彼此相互作用。本文中的二聚化結構域的例子包括Fc區；鉸鏈區；CH3結構域；CH4結構域；CHl-CL對；具有“結節”(knob)和/或“突起”(protruberance)的“界面”，如美國專利No.5，821，333中所記載的，明確收入本文作為參考；亮氨酸拉鏈(例如jun/fos亮氨酸拉鏈，參見Kostelneyetal.，J.Immunol.,1481547-1553(1992)；或酵母GCN4亮氨酸拉鏈)；異亮氨酸拉鏈；受體二聚體對(例如白介素_8受體(IL-8R)；和整聯蛋白異二聚體，諸如LFA-I和GPIIIb/IIIa)或其二聚化區；二聚體配體多肽(例如神經生長因子(NGF)、神經營養因子-3(NT-3)、白介素-8(IL-8)、血管內皮生長因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D、PDGF成員和腦衍生神經營養性因子(BDNF)；參見Arakawaetal.J.Biol.Chem.269(45):27833_27839(1994)及Radziejewskietal.Biochem.32(48)1350(1993))或其二聚化區；一對能夠形成二硫鍵的半胱氨酸殘基；一對肽或多肽，各自包含至少一個半胱氨酸殘基(例如約1個、2個或3個到約10個半胱氨酸殘基)使得可以在所述肽或多肽之間形成二硫鍵(下文的“合成鉸鏈”)；及抗體可變域。在一個實施方案中，本文中的二聚化結構域是Fc區或鉸鏈區?？贵w的“功能性抗原結合位點”指能夠結合靶抗原的位點。抗原結合位點的抗原結合親和力不必像衍生該抗原結合位點的親本抗體那樣強，但是結合抗原的能力必須是使用已知用于評估抗體對抗原結合的多種方法之任一可測量到的。此外，本文中多價抗體的每個抗原結合位點的抗原結合親和力不必定量相同。對于本文中的多聚體抗體，功能性抗原結合位點的數目可以使用超速離心分析來評估。依照這種分析方法，將靶抗原與多聚體抗體以不同比例混合，并計算復合物的平均分子量，其中假設不同數目的功能性結合位點。將這些理論值與得到的實際實驗值進行比較以評估功能性結合位點的數目。具有指定抗體的“生物學特征”的抗體指擁有該指定抗體區別于其它結合相同抗原的抗體的一項或多項生物學特征的抗體。為了篩選能結合抗原上感興趣抗體所結合的表位的抗體，可以實施常規交叉阻斷測定法，諸如Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlowandDavidLane(1988)中所記載的。與一種或多種其它治療劑“組合”施用包括同時(共同)施用和/或任何次序的序貫施用。為了治療目的，“哺乳動物”指歸入哺乳類的任何動物，包括人，家畜和牲畜，及動物園、運動或寵物動物，諸如犬、馬、貓、牛、綿羊、豬等。典型的是，哺乳動物指人?！安“Y”指任何會受益于使用本發明分子的治療的疾患。這包括慢性和急性病癥或疾病，包括那些使哺乳動物傾向于所討論病癥的病理狀況。病癥包括細胞增殖性病癥、血管發生性病癥、及炎性、血管發生性和免疫學病癥(包括但不限于自身免疫性病癥)。術語“細胞增殖性病癥”和“增殖性病癥”指與一定程度的異常細胞增殖和/或肥大有關的病癥。在一個實施方案中，細胞增殖性病癥是癌癥。術語“炎性病癥”和“免疫性病癥”指向或描述由異常免疫學機制和/或異常細胞因子信號傳導(例如異常干擾素信號傳導)引起的病癥。炎性和免疫性病癥的例子包括但不限于自身免疫性疾病、免疫學缺陷綜合征和超敏反應。術語“炎性病癥”指以炎性狀況為基礎的或與炎性狀況有關的疾病或病癥。炎性病癥包括但不限于自身免疫性病癥、高血糖性病癥和與胰島素耐受性有關的病癥。術語“自身免疫性病癥”指源于且針對個體自身組織的非惡性疾病或病癥。自身免疫性病癥典型的是特征為自身反應性免疫細胞不能被免疫系統破壞；自身反應性淋巴細胞已經鑒定為過表達或以其它方式提高促存活凋亡因子的活性，或者降低促凋亡因子的表達或活性。自身免疫性病癥在本文中明確排除惡性或癌性疾病或疾患，尤其排除B細胞淋巴瘤、急性成淋巴細胞白血病(ALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、毛細胞白血病和慢性成髓細胞白血病。自身免疫性疾病或病癥的例子包括但不限于炎性應答，諸如炎性皮膚病，包括銀屑病和皮炎(例如特應性皮炎)；系統性硬皮病和硬化；與炎性腸病有關的應答(諸如克羅恩氏(Crohn)病和潰瘍性結腸炎)；呼吸窘迫綜合征(包括成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS))；皮炎；腦膜炎；腦炎；葡萄膜炎；結腸炎；腎小球腎炎；過敏狀況，諸如濕疹和哮喘及牽涉T細胞浸潤和慢性炎性應答的其它狀況；動脈粥樣硬化；白細胞粘著缺陷；類風濕性關節炎；系統性紅斑狼瘡(SLE)(包括但不限于狼瘡腎炎、皮膚狼瘡)；糖尿病(例如I型糖尿病或胰島素依賴性糖尿病)；多發性硬化；雷諾氏(Reynaud)綜合征；自身免疫性甲狀腺炎；橋本氏(Hashimoto)甲狀腺炎；變應性腦脊髓炎；斯耶格倫氏(Sjogren)綜合征；幼發型糖尿病；通常在結核病、結節病、多肌炎、肉芽腫病和血管炎中發現的與細胞因子和T-淋巴細胞介導的急性和遲發性超敏感性有關的免疫應答；惡性貧血(阿狄森氏(Addison)病)；牽涉白細胞滲出的疾??；中樞神經系統(CNS)炎性病癥；多器官損傷綜合征；溶血性貧血(包括但不限于冷球蛋白血癥或庫姆斯氏(Coombs)陽性貧血)；重癥肌無力；抗原-抗體復合物介導的疾??；抗腎小球基膜病；抗磷脂綜合癥；過敏性神經炎；格雷夫斯氏(Graves)病；朗-伊二氏(Lambert-Eaton)肌無力綜合癥；大皰性類天皰瘡；天皰瘡；自身免疫性多種內分泌腺病；萊特氏(Reiter)?。唤┤司C合癥；貝切特氏(Behcet)??；巨細胞動脈炎；免疫復合物腎炎；IgA腎??；IgM多神經?。幻庖咝匝“鍦p少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板減少癥等。術語“高血糖性病癥”包括但不限于糖尿病及相關疾病/病癥，包括但不限于高脂血癥和由高血糖性病癥弓I起的肥胖癥。術語“與胰島素耐受性有關的病癥”包括但不限于胰島素耐受性、多囊性卵巢綜合征、冠心病和外周血管病。術語“有效量”或“治療有效量”指在哺乳動物中有效治療疾病或病癥的藥物量。在癌癥的情況中，有效量的藥物可減少癌細胞的數目；縮小腫瘤的大?。灰种?即一定程度的減緩，典型的是阻止)癌細胞浸潤入周圍器官；抑制(即一定程度的減緩，典型的是阻止)腫瘤轉移；一定程度的抑制腫瘤生長；容許治療腫瘤；和/或一定程度的減輕一種或多種與病癥有關的癥狀。根據藥物可阻止現有癌細胞生長和/或殺死現有癌細胞的程度，它可以是細胞抑制性的和/或細胞毒性的。對于癌癥療法，體內功效可以通過例如評估存活持續時間、距疾病進展的時間(TTP)、響應率(RR)、響應持續時間和/或生活質量來測量。“處理”和“治療”(treatment)指治療性處理和預防性或防范性措施二者。需要治療的受試者包括那些早就患有病癥的以及要預防病癥的。在本發明的某些實施方案中，治療可以指抑制腫瘤生長，或者抑制自身免疫性病癥。術語“生物學活性”和“有生物學活性的”就本發明的多肽而言指分子特異性結合靶物并調節細胞應答(例如增殖、遷移等)的能力。細胞應答還包括那些經由受體介導的，包括但不限于遷移和/或增殖。在此語境中，術語“調控”包括促進和抑制二者。術語“癌癥”和“癌性”指或描述哺乳動物中特征通常為細胞生長不受調節的生理疾患。癌癥的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴樣惡性腫瘤。此類癌癥的更具體例子包括腎癌(kidneyorrenalcancer)、乳腺癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺的腺癌和肺的鱗癌)、鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)、宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌(livercancer)、膀胱癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(gastricorstomachcancer)(包括胃腸癌、胃腸基質腫瘤(GIST))、胰腺癌、頭頸癌、成膠質細胞瘤、成視網膜細胞瘤、星形細胞瘤、泡膜細胞瘤、男性細胞瘤、肝肉瘤(h印atoma)、血液學惡性腫瘤(包括非何杰金(Hodgkin)氏淋巴瘤(NHL)、多發性骨髓瘤和急性血液學惡性腫瘤)、子宮內膜癌或子宮癌、子宮內膜異位癥、纖維肉瘤、絨毛膜癌、唾液腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、食管癌、肝癌(h印aticcarcinoma)、肛門癌、陰莖癌、鼻咽癌、喉癌、卡波西(Kaposi)氏肉瘤、黑素瘤、皮膚癌、許旺氏細胞瘤、少突神經膠質瘤、成神經細胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨源性肉瘤、平滑肌肉瘤、尿道癌、甲狀腺癌、維爾姆斯(Wilm)氏腫瘤、以及B細胞淋巴瘤(包括低級/濾泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴細胞性(SL)NHL、中級/濾泡性NHL、中級彌漫性NHL、高級成免疫細胞性NHL、高級成淋巴細胞性NHL、高級小無核裂細胞性NHL、貯積病(bulkydisease)NHL、套細胞淋巴瘤、AIDS相關淋巴瘤和瓦爾登斯特倫氏(Waldenstrom)巨球蛋白血癥)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、毛細胞性白血病、慢性成髓細胞性白血病和移植后淋巴增殖性病癥(PTLD)、以及與瘢痣病(Phakomatoses)JKW(諸如與腦瘤有關的水腫)和梅格斯氏(Meigs)綜合征有關的異常血管增殖?！澳[瘤”在用于本文時指所有贅生性細胞生長和增殖，無論是惡性的或者是良性的，及所有癌前的和癌性的細胞和組織。術語“細胞毒劑”在用于本文時指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞的物質。該術語意圖包括放射性同位素(例如211At、131I、125I、9°Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P和Lu的放射性同位素)、化療劑和毒素(諸如小分子毒素或者細菌、真菌、植物或動物起源的酶活毒素，包括其片段和/或變體)。“生長抑制劑”在用于本文時指在體外和/或在體內抑制細胞生長的化合物或組合物。如此，生長抑制劑可以是顯著降低處于S期的細胞百分比的藥劑。生長抑制劑的例子包括阻斷細胞周期行進(處于S期以外的位置)的藥劑，諸如誘導Gl停滯和M期停滯的藥劑。經典的M期阻斷劑包括長春藥類(vincas)(長春新堿(vincristine)和長春堿(vinblastine))、TAXOL和拓撲異構酶II抑制劑，諸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(印irubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博來霉素(bleomycin)。那些阻滯Gl的藥劑也溢出進入S期停滯，例如DNA烷化劑類，諸如他莫昔芬(tamoxifen)、潑尼松(prednisone)、達卡巴嗪(dacarbazine)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、順鉬(cisplatin)、甲氨喋呤(methotrexate)、5_氟尿嘧唆(5-fluorouracil)禾口ara_C。更多信息可參見TheMolecularBasisofCancer,MendelsohnandIsrael編，第1章，題^J"Cellcycleregulation,oncogenes,andantineoplasticdrugs",Murakamietal.，WBSaunders,Philadelphia(1995),jtMMM13頁?！盎焺敝缚捎糜谥委煱┌Y的化學化合物?；焺┑睦影ㄍ榛瘎╊?alkylatingagents)，諸如塞替派(thiot印a)和CYTOXAN環磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯類(alkylsulfonates)，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類(aziridines)，諸如苯佐替派(benzod印a)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturecbpa)和烏瑞替派(ured印a)；乙撐亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撐硫代憐酉先胺(triethylenethiophosphoramide)和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝內酯類(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氫大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)，MARINOL)；β-拉帕醌(Iapachone)；拉帕醇(Iapachol)；秋水仙素類(colchicines)；白樺脂酸(betulinicacid)；喜樹堿(camptothecin)(包括合成類似物托泊替康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR)、乙酰喜樹堿、東莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜樹堿)；苔蘚抑素(bryostatin)；callystatin;CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；替尼泊苷(teniposide)；隱藻素類(cryptophycins)(特別是隱藻素1和隱藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成類似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞T^M(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；'M^^iJ]M(spongistatin)；氣芥類(nitrogenmustards)，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)>美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿啼唆氮芥(uracilmustard)；亞硝脲類(nitrosoureas),諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(Iomustine)、尼莫司汀(nimustine)禾口雷莫司汀(ranimustine)；抗生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(例如加利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素YII和加利車霉素ωIl(參見例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33183-186(1994))；蒽環類抗生素(dynemicin),包括dynemicinA；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)發色團和相關色蛋白烯二炔類抗生素發色團)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)>carabicin>ψ(carminomycin)^^^ΜΜ(carzinophilin)>色霉素(chromomycin)、方文線菌素D(dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6_二氮_5_氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括ADRIAMYCIN、嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、鹽酸多柔比星脂質體注射劑(DOXIL)和脫氧多柔比星)、表柔比星(印irubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、諾拉霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培洛霉素(ρ印lomycin)、potfiromycin、口票呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(str印tonigrin)、鏈佐星(Sti^ptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物類，諸如甲氨喋呤(methotrexate)、吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR)、替加氟(tegafur)(UFTORAL)、卡培他濱(capecitabine)(XELODA)、埃坡霉素(印othilone)和5_氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲氨喋呤(methotrexate)、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6_巰基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6_氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、表硫雄醇(印itiostanol)、美雄烷(m印itiostane)、睪內酯(testolactone)；抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸(folinicacid)；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酉先丙酸(aminolevulinicacid)；恩尿啼唆(eniluracil)；安口丫唆(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地磷酉先月安(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地口丫酉昆(diaziquone)；elfornithine；Hc利醋銨(elliptiniumacetate)；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥脲(hydroxyurea)；香菇多糖(Ientinan)；氯尼達明(Ionidamine)；美登木素生物堿類(maytansinoids),諸如美登素(maytansine)禾口安絲菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽酉昆(Iosoxantrone)；2-乙■酉先月井(ethylhydrazide)；丙卡EL月井(procarbazine)；PSK多糖復合物(JHSNaturalProducts,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2‘，2〃-三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、桿孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)(ELDISINE,FILDESIN)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二漠衛矛酉享(mitolactol)；喊泊漠燒(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C")；塞替派(thiotepa)；類紫杉醇類(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)(TAXOL)、帕利他塞的清蛋白改造的納米顆粒劑型(ABRAXANE)和多西他塞(doxetaxel)(TAXOTERE))；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；6-硫鳥嘌呤(thioguanine)；巰基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨喋呤(methotrexate)；鉬類似物，諸如順鉬(cisplatin)和卡鉬(carboplatin)；長春堿(vinblastine)(VELBAN)；鉬(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；異環磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新堿(vincristine)(ONCOVIN)；奧沙利鉬(oxaliplatin)；亞葉酸(Ieucovorin)；長春瑞濱(vinorelbine)(NAVELBINE);能滅瘤(novantrone)；依達曲沙(edatrexate)；道諾霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸鹽(ibandronate)；拓撲異構酶抑制劑RFS2000;二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；類視黃酸類(retinoids)，諸如視黃酸(retinoicacid)；任何上述物質的藥學可接受鹽、酸或衍生物；以及兩種或更多上述物質的組合，諸如CHOP(環磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松龍組合療法的縮寫)和FOLFOX(奧沙利鉬(EL0XATIN)組合5-FU和亞葉酸的治療方案的縮寫)。該定義還包括作用為調節、降低、阻斷或抑制可促進癌生長的激素效果的抗激素劑，且常常是系統或全身治療的形式。它們自身可以是激素。例子包括抗雌激素類和選擇性雌激素受體調控物類(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX·他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)(EVISTA)、屈洛昔芬(droloxifene)、4_羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(FARESTON);抗孕酮類；雌激素受體下調劑類(ERD)；功能為抑制或關閉卵巢的藥劑，例如促黃體生成激素釋放激素(LHRH)激動劑，諸如醋酸亮丙瑞林(leuprolideacetate)(LUPRON和ELIGARD)、醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、醋酸布舍瑞林(buserelinacetate)和曲普瑞林(triptorelin)；其它抗雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及抑制在腎上腺中調節雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)(MEGASE)、依西美坦(exemestane)(AROMASIN)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏氯唑(vorozole)(RIVISOR)、來曲唑(Ietrozole)(FEMARA)和阿那曲唑(anastrozole)(ARIMIDEX)。另外，化療劑的這種定義包括二膦酸鹽類(bisphosphonates)，諸如氯膦酸鹽(clodronate)(例如BONEFOS或OSTAC)、依替膦酸鈉(etidronate)(DIDROCAL)、NE-58095、唑來膦酸/唑來膦酸鹽(zoledronicacid/zoledronate)(ZOMETA)、阿倫膦酸鹽(alendronate)(FOSAMAX)、帕米膦酸鹽(pamidronate)(AREDIA)、替魯膦酸鹽(tiludronate)(SKELID)或利塞膦酸鹽(risedronate)(ACTONEL);以及曲沙他濱(tr0XaCitabine)(l，3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是那些抑制牽涉異常(abherant)細胞增殖的信號傳導途經中的基因表達的反義寡核苷酸，諸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生長因子受體(EGF-R)；疫苗，諸如THERATOPE疫苗和基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗和VAXID.疫苗；拓撲異構酶1抑制劑(例如LURTOTECAN)；rmRH(例如ABARELIX)；lapatinibditosylate(ErbB-2和EGFR雙重酪氨酸激酶小分子抑制劑，也稱為GW572016)；C0X-2抑制劑，諸如塞來考昔(CELEBREX;4-(5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-IH-吡唑-1-基)苯磺酰胺；及任何上述物質的藥學可接受鹽、酸或衍生物。術語“細胞因子”是由一種細胞群釋放，作為細胞間介質作用于另一細胞的蛋白質的通稱。此類細胞因子的例子有淋巴因子、單核因子和傳統的多肽激素。細胞因子中包括生長激素，諸如人生長激素、N-甲硫氨酰人生長激素和牛生長激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松馳素；松馳素原；糖蛋白激素類，諸如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和促黃體激素(LH)；肝生長因子；成纖維細胞生長因子；促乳素；胎盤催乳激素；腫瘤壞死因子-α和-β；穆勒氏(Mullerian)抑制性物質；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；激活素；血管內皮生長因子(例如VEGF、VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,VEGF-E)；胎盤衍生生長因子(PlGF)；血小板衍生生長因子(PDGF)(例如PDGFA、PDGFB,PDGFC,PDGFD)；整聯蛋白；血小板生成素(TPO)；神經生長因子，諸如NGF-α；血小板生長因子；轉化生長因子(TGF)，諸如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長因子-I和-II；紅細胞生成素(EPO)；骨誘導因子(osteoinductivefactor)；干擾素，諸如干擾素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，諸如巨噬細胞CSF(M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞CSF(GM-CSF)和粒細胞CSF(G-CSF)；白介素(IL)，諸如IL-UIL-Iα、IL-Iβ、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IUIL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20-IL-30；分泌珠蛋白(secretoglobin)/子宮珠蛋白；制瘤素M(OSM)；腫瘤壞死因子，諸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。在用于本文時，術語細胞因子包括來自天然來源或來自重組細胞培養物的蛋白質及天然序列細胞因子的生物學活性等效物。術語“前體藥物”在用于本申請時指與母藥(parentdrug)相比對腫瘤細胞的細胞毒性較小并能夠酶促活化或轉變為更具活性母藥形式的前體或衍生物形式藥用活性物質。參見例如Wilman,"ProdrugsinCancerChemotherapy",BiochemicalSocietyTransactions,14,pp.375-382,615thMeetingBelfast(1986)禾口Stellaetal.,"Prodrugs:AChemicalApproachtoTargetedDrugDelivery",DirectedDrugDelivery,Borchardtetal.,ed.,pp.247-267,HumanaPress(1985)本發明的前體藥物包括但不限于含磷酸鹽/酯前體藥物、含硫代磷酸鹽/酯前體藥物、含硫酸鹽/酯前體藥物、含肽前體藥物、D-氨基酸修飾前體藥物、糖基化前體藥物、含內酰胺前體藥物、含任選取代苯氧基乙酰胺的前體藥物或含任選取代苯乙酰胺的前體藥物、可轉變為更具活性而無細胞毒性的藥物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前體藥物?？裳苌鸀楸景l明使用的前體藥物形式的細胞毒性藥物的例子包括但不限于上文描述的那些化療劑?！把馨l生因子”或“血管發生劑”指刺激血管發育，例如促進血管發生(angiogenesis)、內皮細胞生長、血管穩定性和/或血管生成(vasculogenesis)等的生長因子。例如，血管發生因子包括但不限于例如VEGF和VEGF家族的成員、P1GF、PDGF家族、成纖維細胞生長因子家族(FGF)、TIE配體(血管生成素)、肝配蛋白、ANGPTL3、ANGPTL4等。它還包括加速傷口愈合的因子，諸如生長激素、胰島素樣生長因子-I(IGF-I)、VIGF、表皮生長因子(EGF)、CTGF及其家族成員、及TGF-α和TGF-β。參見例如KlagsbrunandD'Amore,Annu.Rev.Physiol.53:217_39(1991)；StreitandDetmar,0ncogene223172-3179(2003)；Ferrara&Alitalo,NatureMedicine5(12)1359-1364(1999)；Toninietal.,Oncogene22:6549_6556(2003)(例如列舉血管發生因子的表1)；和Sato，Int.J.Clin.Oncol.8200-206(2003)?！翱寡馨l生劑”或“血管發生抑制劑”指或是直接或是間接抑制血管發生(angiogenesis)、血管生成(vasculogenesis)或不想要的血管通透性的小分子量物質、多核苷酸、多肽、分離的蛋白質、重組蛋白、抗體或其偶聯物或融合蛋白。例如，抗血管發生劑是上文定義的血管發生劑的抗體或其它拮抗劑，例如VEGF的抗體、VEGF受體的抗體、阻斷VEGF受體信號傳導的小分子(例如PTK787/ZK2284、SU6668、SUTENT/SU11248(sunitinibmalate)、AMG706)?？寡馨l生劑還包括天然血管發生抑制劑，例如血管他丁(angiostatin)、內皮他丁(endostatin)等。參見例如KlagsbrunandD'AmoreAnnu.Rev.Physiol.53217-39(1991)；StreitandDetmarOncogene22:3172_3179(2003)(例如列舉惡性黑素瘤中抗血管發生療法的表3)；Ferrara&AlitaloNatureMedicine5(12)1359-1364(1999)；Tonini等Oncogene226549-6556(2003)(例如列舉抗血管發生因子的表2)；及Sato,Int.J.Clin.Oncol.8=200-206(2003)(例如列舉臨床試驗中所使用的抗血管發生劑的表1)。術語“免疫抑制劑”在用于本文時指作用于抑制或掩蓋本文所治療哺乳動物的免疫系統(包括調控炎癥)的物質。這包括但不限于抑制細胞因子生成、下調或抑制自身抗原表達或掩蓋MHC抗原的物質。此類藥劑的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(見美國專利No.4，665，077)；非類固醇抗炎藥(NSAID)；更昔洛韋(ganciclovir)、他克莫司(tacrolimus)、糖皮質激素諸如皮質醇(Cortisol)或醛甾酮(aldosterone)、抗炎藥諸如環加氧酶抑制劑、5-脂加氧酶抑制劑或白三烯受體拮抗劑；嘌呤拮抗劑，諸如硫唑嘌呤(azathioprine)或麥考酚酸嗎乙酯(mycophenolatemofetil,MMF)；烷化劑，諸如環磷酰胺；溴隱亭(bromocryptine)；達扎唑(danazol)；氨苯砜(dapsone)；戊二醛(其掩蓋MHC抗原，如美國專利No.4，120,649中所記載的)；針對MHC抗原和MHC片段的抗獨特型抗體；環孢菌素A；類固醇，諸如皮質類固醇或糖皮質類固醇或糖皮質激素類似物，例如潑尼松(prednisone)、甲基潑尼松龍(methylprednisolone)和地塞米松(dexamethasone)；二氫葉酸還原酶抑制劑，諸如甲氨蝶呤(methotrexate)(口服或皮下)；羥氯喹(hydroxycloroquine)；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；來氟米特(Ieflunomide)；細胞因子或細胞因子受體抗體，包括抗干擾素-α、-β或-γ抗體、抗腫瘤壞死因子-α抗體(infliximab或adalimumab)、抗TNFα免疫粘附素(依那西普(etanerc印t))、抗腫瘤壞死因子-β抗體、抗白介素_2抗體和抗IL-2受體抗體；抗LFA-I抗體，包括抗⑶Ila和抗CD18抗體；抗L3T4抗體；異源抗淋巴細胞球蛋白；泛T抗體(pan-Tantibody)，優選抗⑶3或抗⑶4/⑶4a抗體；含有LFA-3結合域的可溶性肽(1990年7月26日公布的WO1990/08187)；鏈激酶；TGF-β；鏈道酶；來自宿主的RNA或DNA;Π(506;RS_61443；脫氧精胍菌素(deoxyspergualin)；雷帕霉素(rapamycin)；T細胞受體(Cohenetal.，美國專利No.5，114，721)；T細胞受體片段(Offneretal.，Science251:430-432(1991);WO1990/11294；Ianeway,Nature341482(1989)；及WO1991/01133)；及T細胞受體抗體(EP340,109)，諸如T10B9?！胺穷惞檀伎寡姿帯被颉癗SAID”的例子有乙酰水楊酸(acetylsalicylicacid)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、吲哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、托美丁(tolmetin)，包括其鹽和衍生物，等。術語“標記物”在用于本文時指與多肽直接或間接偶聯的可檢測化合物或組合物。標記物自身可以是可檢測的(例如放射性同位素標記物或熒光標記物)，或者在酶標記物的情況中，可催化可檢測的底物化合物或組合物的化學改變。“分離的”核酸分子指已經鑒定且與多肽核酸的天然來源中通常與之關聯的至少一種污染性核酸分子分開的核酸分子。分離的核酸分子不同于在自然界中發現它時的形式或背景。分離的核酸分子因此與存在于天然細胞中時的核酸分子有區別。然而，分離的核酸分子包括通常表達該多肽的細胞中所包含的核酸分子，例如當所述核酸分子在所述細胞中的染色體定位不同于它在天然細胞中的染色體定位時。本發明的方法本發明鑒定了出于治療目的使用本發明方法時可利用的IRTM(特別是TAM和ATM)的某些新特性和活性。慢性炎癥是具有獨特病因起源的許多疾病(諸如癌癥、II型糖尿病和動脈粥樣硬化)的共同特征。最近，巨噬細胞直接參與這些病癥的發病機制(Mantovani等，Immunol.Today13:265_70，1992；Pollard,Nat.Rev.Cancer4:71_8，2004；Arkan等，Nat.Med.11:191_8，2005；Lumeng等，J.ClinInvest.117175-84,2007；Liang等，Circ.Res.1001546-55,2007；Choudhury,NatClinPractCardiovascMed2(6)309-15,2005)。為了了解它們在腫瘤中的功能，在重演人類乳腺浸潤性導管癌的許多方面的PyMTtg模型中實施實驗來表征TAM(Lin等，AmJ.Pathol163:2113_26，2003)。為了了解它們在其它炎性病癥(包括但不限于II型糖尿病和胰島素耐受性)中的功能，實施實驗來表征來自用長期高脂肪食譜喂養的小鼠的ATM。如本文所示和如本領域所知，TAM常見于腫瘤免疫細胞浸潤物中。已經將高水平的TAM與人類腫瘤中差的預后關聯起來，而且在乳腺癌的遺傳模型中抑制TAM分化顯示出降低腫瘤進展和轉移的速率(Lin等，2001)。有人提出，TAM通過生成血管發生性因子(諸如VEGF)，如此提高腫瘤的血管形成來促成腫瘤生長(Leek等1996；Lin等2006)。其他人提出，通過分泌抑制腫瘤中專職抗原呈遞細胞(例如樹突細胞)成熟的某些細胞因子，由此削弱此類細胞將異常腫瘤細胞呈遞給免疫系統的能力，使得不發生針對腫瘤的有效免疫應答，TAM可在誘導耐受中具有間接作用(Mantovanti等2002；Pollard等，2003)。在此，顯示出在上述活性之外，TAM還誘導兩種特定⑶4+T調節性細胞子集FoxP3+T調節性細胞和IL-IO+Trl細胞。將TAM與幼稚T細胞一起溫育則誘導IL-IO+Trl和FoxP3+T調節性細胞二者增殖及預期自那些細胞類型生成的細胞因子(IL-10和IL-17，以及極少至沒有的IL-2或IL-4)生成，而將bmDC與幼稚T細胞一起溫育則不具有相同效果。在培養物至包括TGFβRII則抑制TAM的這種誘導作用，提示TGFβ對于TAM誘導的對那些細胞類型的誘導是重要的。先前已經將升高水平的這些調節性T細胞子集與實體瘤和降低的整體乳腺癌存活率關聯起來(Leong等，2006；Liyanage等，2002；Marshall等，2004；Seo等，2001；Curiel等，2004；及Bates等，2006)。TAM還顯示出在體外誘導炎癥TH17細胞，與PyMTtg荷瘤小鼠的引流淋巴結中觀察到的TH17細胞數目升高有關聯。雖然TAM與bmDC或腹膜巨噬細胞在它們誘導IL-17+T細胞的能力方面相似，但是那些其它類型的巨噬細胞無一能夠誘導調節性和促炎性T細胞子集二者。TAM在體外誘導的T細胞譜型與乳腺荷瘤動物中增多的T細胞類型相同。本發明提供了在體外和在體內調控TAM介導的對IL-IO+Trl和FoxP3+T調節性細胞和炎癥TH17細胞的誘導的方法，用于調控腫瘤生長和活性的啟動、進展或嚴重程度。本發明還提供了通過檢測TAM的存在、量和/或活性來檢測腫瘤形成、進展和/或對腫瘤分期的方法。在人類及嚙齒類中，肥胖與升高的脂肪組織巨噬細胞(ATM)浸潤有關聯。已經將肥胖與心血管疾病、糖尿病、腎病和一些類型的癌癥關聯起來(Flegal等，JAMA298(17)2028-37,2007)。肥胖還與使受試者偏向于胰島素耐受性和發生II型糖尿病的慢性炎癥有關聯。數項最近的研究證明了ATM生成炎性細胞因子，它們能阻斷脂肪細胞中的胰島素作用且有助于系統性胰島素耐受性(Weisberg等，J.Clin.Invest.1121796-808，2003；Arkan等，Nat.Med.11:191_8，2005；Neels和Olefsky,J.Clin·Invest.116:33_5，2006；Lumeng等，J.Clin.Invest.117175-84，2007)。在此，顯示出ATM(像TAM—樣)誘導兩種特定⑶4+T調節性細胞子集F0XP3+T調節性細胞和IL-IO+Trl細胞，而且誘導炎癥TH17細胞。在正常系統中，通過抑制常規T細胞和下調其活性，T調節性細胞在誘導耐受性形成中發揮關鍵作用。T調節性細胞已經顯示出在多種實驗性自身免疫性病癥狀況中是治療性的(參見Suri-Payer和Fritzsching，SpringerSemin.Immun.(2006)28:3_16)。在此類細胞有治療價值的某些疾病狀態(諸如免疫性病癥，特別是炎性和自身免疫性病癥)中選擇性誘導T調節性細胞的能力顯然是有治療價值的。本發明還提供了通過調控TAM或ATM存在或活性來啟動和/或刺激IL-IO+Trl和FoxP3+T調節性細胞誘導的方法，該方法可用于調控炎性和自身免疫性病癥的啟動、進展或嚴重程度。TH17細胞在來自腫瘤和脂肪組織的引流淋巴結中也以升高的水平存在。TH17細胞在癌癥或II型糖尿病的病理學中的作用尚不清楚。通過誘導其它促炎介導物(諸如TNFa、IL-Iβ和IL-6)的表達，IL-17可間接促進腫瘤生長。IL-17(像TNFα那樣活化NF-κB)也可作為腫瘤的促存活和血管發生性因子直接起作用(Lin，和Karin，JClinInvest117(5)1175-83，2007;Takahashi，等，ImmunolLett98(2)189-93，2005;Numasaki等，JImmunol175(9)=6177-89,2005)有趣的是，ATM和TAM(對照巨噬細胞不行)在體外誘導T調節性細胞和TH17細胞二者，而且這兩種群體在荷瘤和肥胖小鼠中都升高。這些數據再次強調促炎性和抗炎性機制共存，如此導致慢性炎癥的狀態。此類慢性炎癥可以通過調控TAM或ATM存在或活性來調控。本文所述工作提供了對TAM和ATM的進一步表征。例如，TAM顯示出具有腹膜巨噬細胞和bmDC在細胞因子/趨化因子生成和細胞表面標志物方面的某些特性。如本文所示，TAM表達巨噬細胞標志物F4/80和樹突細胞標志物Iangerin和⑶Ilc二者。ATM表達巨噬細胞標志物F4/80和樹突細胞標志物⑶Ilc二者。此外，TAM和ATM均表達趨化因子、細胞因子、趨化因子受體和細胞因子受體的不同子集(見圖14A-C和E)，它們可獨立地或集體地用作TAM或ATM存在和/或活性的標志物。本發明提供了自細胞群體或含有細胞的樣品鑒定/檢測和分離TAM和/或ATM的方法，其通過使所述群體或樣品接觸一種或多種試劑以檢測TAM和/或ATM標志物，并任選將TAM和/或ATM與所述群體或樣品的其余部分分開。本發明還提供了調控TAM和/或ATM的方法。例如，通過選擇性消除或殺死TAM和/或ATM，可以阻斷TAM和/或ATM活性或功能。一種用于實現此目的的方法是用TAM和/或ATM結合劑特異性靶向TAM和/或ATM(即通過只靶向同時攜帶巨噬細胞特異性和DC特異性兩者細胞表面標志物的細胞)，并自群體中選擇性消除所述被特異性靶向的細胞。例如，可以使用特異性識別F4/80和CDllc二者的雙特異性抗體或其片段來特異性結合TAM和/或ATM，然而通過例如蛋白A層析或本領域公知的抗體捕捉和分離的任何其它方法，包括但不限于FACS、親和層析和磁細胞分選，將TAM和/或ATM與剩余細胞群體/樣品分開。在另一種方法中，可以特異性靶向TAM和/或ATM(即通過只靶向同時攜帶巨噬細胞特異性和DC特異性兩者細胞表面標志物的細胞)，并自群體中選擇性殺死所述被特異性靶向的細胞。例如，可以采用上文所述同一雙特異性抗體(或其片段)方案，但是該抗體可另外偶聯有細胞毒性分子，或者該抗體自身的效應器功能可足以觸發對結合至該抗體的TAM和/或ATM的清除和破壞。使用雙特異性或其它多特異性抗體不是必須的；本領域普通技術人員會認識到，用兩種或更多種分開的抗體或其片段或其它結合分子來提供自細胞混合物中選擇性拉出同時仍然保持結合TAM和/或ATM的一些手段，可以實現同一目的。對此類選擇適宜的TAM和/或ATM細胞表面標志物可見于例如圖14B和14E，而且包括但不限于I型IL-1R、IL4Ra、IL-13Ra；IL_17Ra；TGFβRII；CCR6；和CX3CRl,每一種都在TAM對ATM上展示差異表達。本發明還提供了通過特異性抑制TAM和/或ATM功能來調控TAM和/或ATM的方法。例如，TAM和/或ATM可經由一種或多種細胞信使(諸如細胞因子或趨化因子，即TAM介導的對需要TGFii活性的某些T調節性細胞或炎癥T細胞的誘導，如本文所示)的分泌來介導其某些效應和活性。特異性抑制或阻斷一種或多種此類通常由TAM和/或ATM分泌的細胞信使的分泌和/或自環境中消除一種或多種此類通常由TAM和/或ATM分泌的細胞信使可具有阻斷TAM和/或ATM效應和活性的效果。此類抑制可以通過例如施用TAM和/或ATM細胞因子/趨化因子結合劑(包括但不限于抗細胞信使抗體或其片段(諸如抗TGFβ抗體)和小分子)來實現。由TAM或ATM表達的趨化因子和細胞因子包括但不限于圖14A和14C所示細胞因子和趨化因子。本發明還提供了用于選擇性生成和/或分離某些免疫細胞的方法。如本文所示，TAM和ATM都是具有巨噬細胞和樹突細胞二者某些特性的專門化免疫細胞。TAM代表腫瘤中免疫浸潤物的一小部分，而且難以獲得。本發明基于其某些樹突細胞和某些巨噬細胞二者細胞表面標志物的表達分離TAM的方法提供了自混合細胞群體獲得TAM供研究或治療用的一種有效方式。類似地，本發明基于其某些樹突細胞和某些巨噬細胞二者細胞表面標志物的表達分離ATM的方法提供了自混合細胞群體獲得ATM供研究或治療用的一種有效方式。本領域普通技術人員會領會，通過使分離或純化以在各細胞類型間不同的細胞表面標志物組合為基礎，可以分開分離或純化TAM和ATM。作為一個非限制性例子，TAM表達IL-4Rα，而ATM不然。其它例子包括但不限于那些在TAM和ATM中差異表達的細胞因子受體和趨化因子受體(見圖14B和14E)。本發明還提供了通過用TAM或ATM刺激培養物自幼稚T細胞培養物選擇性誘導IL-10+CD4+Trl細胞、FoxP3+⑶4+T調節性細胞和/或TH17細胞的方法。能夠可再現地大量生成這三種T細胞類型對于治療和研究是有用的。提供了包含一種或多種上文所述藥劑(即IRTM靶向劑(即TAM靶向劑或ATM靶向齊IJ)和/或IRTM細胞信使靶向劑(即TAM細胞信使靶向劑或ATM細胞信使靶向劑))的組合物。本發明還提供了組合治療方法和組合物，其中不僅摻有一種或多種特異性靶向IRTM的藥劑(即TAM或ATM靶向劑和/或由TAM或ATM分泌的細胞信使)，而且摻有一種或多種化療劑、細胞因子、趨化因子、抗血管發生劑、免疫抑制劑、細胞毒劑或生長抑制劑。這些組合治療能抑制腫瘤血管發生和生長和/或治療炎性或自身免疫性病癥。可以同時或序貫施用組合治療。另外，提供了試劑盒。此類試劑盒可包括本文所述一種或多種組合物或組合治療，而且可另外包括用于對需要此類治療的受試者測量和/或施用適宜劑量的手段，而且任選進一步包括使用說明書。診斷本發明還提供了用于診斷細胞增殖性病癥、血管發生性病癥、及炎性、血管發生性和免疫學病癥(包括但不限于自身免疫性病癥)的方法和組合物。在本發明的某些實施方案中，本發明的方法比較測試和參考細胞群體中存在的TAM或ATM的水平。本文公開的、關于自巨噬細胞和樹突細胞二者區分TAM和/或ATM的TAM和ATM細胞表面標志物的信息，與本領域已知的蛋白質和核酸檢測系統一起，容許檢測不同細胞群體/樣品中的存在和比較不同細胞群體/樣品中存在的相對量。測試細胞群體可以是任何數目的細胞，即一個或多個細胞，而且可以是體外、體內或離體提供的。在某些實施方案中，參考細胞群體中的細胞衍生自與測試樣品(例如腫瘤細胞群體)盡可能相似的組織類型。在一些實施方案中，參考細胞群體衍生自與測試細胞群體相同的受試者，例如衍生自測試細胞群體的來源區域鄰近的區域。在一些實施方案中，參考細胞群體衍生自與測試細胞群體相同的組織類型，但是是在不同時間(例如早于測試細胞群體的時間)自受試者收集的。在一些實施方案中，以規則的時間間隔(例如每天一次、每周一次、每月一次或每年一次)自受試者收集一系列參考細胞群體樣品。在本發明的一個實施方案中，參考細胞群體衍生自多種細胞。例如，參考細胞群體可以是來自早先測試的細胞的TAM和/或ATM表達樣式的數據庫。蛋白質和核酸檢測方法檢測本發明蛋白質的存在、活性或量可容易地使用本領域已知方法來實施?？梢栽诘鞍踪|水平測量表達，即通過測量多肽的水平。此類方法是本領域公知的，而且包括例如基于針對蛋白質的抗體的免疫測定法?？梢员容^測試細胞群體中一種或多種蛋白質序列的表達水平與來自參考細胞群體的一種或多種細胞中該序列的表達水平?？梢允褂帽绢I域公認的、用于比較核酸序列表達的任何方法來比較測試與對照細胞群體中序列的表達。例如，可以使用GENECALLING方法來比較表達，如美國專利No.5，871，697及Shimkets等，Nat.Biotechnol.17798-803中所記載的。在本發明的某些實施方案中，測量一種、兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種、七種或更多種、八種或更多種、九種或更多種、十種或更多種、十一種或更多種、十二種或更多種、十三種或更多種、十四種或更多種、十五種或更多種、20種或更多種、25種或更多種蛋白質序列的表達。也可采用本領域已知的多種測定法技術，諸如競爭性結合測定法、直接或間接三明治式/夾心式測定法和免疫沉淀測定法(以異相或均相進行)(Zola，MonoclonalAntibodies:AManualofTechniques,CRCPress,Inc.(1987)pp.147-158)。測定法中使用的抗體或其抗原結合片段可以用可檢測模塊標記。可檢測模塊應當能夠直接或間接生成可檢測信號。例如，可檢測模塊可以是放射性同位素，諸如3H、14C、32P、35S或125I；熒光或化學發光化合物，諸如熒光素異硫氰酸、羅丹明或螢光素；或酶，諸如堿性磷酸酶、半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶?？梢圆捎帽绢I域已知的、用于偶聯抗體至可檢測模塊的任何方法，包括Hunter等，Nature，144945(1962)；David等，Biochemistry，131014(1974)；Pain等，J.Immunol.Meth.,40219(1981)；及Nygren,J.Histochem.禾口Cytochem.,30407(1982)記載的那些方法。核酸檢測技術也是本領域公知的，而且在一個實施方案中可以用來評估一種或多種TAM和/或ATM細胞表面標志物或其它TAM和/或ATM特異性分子的mRNA的存在，并如此測定吸取細胞樣品的細胞群體中TAM和/或ATM的存在或量。在某些實施方案中，評估編碼至少兩種不同TAM和/或ATM細胞表面標志物的mRNA的存在或量。重組DNA
技術領域：
中普遍知道的、可用于評估核酸的存在、量或活性的方法記載于例如Ausubel等eds.(1993)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NY及Kriegler(1990)GeneTransfer和Expression,ALaboratoryManual,StocktonPress,NY。任選的是，測試細胞群體與參考細胞群體之間差異表達序列的比較可以相對于對照核酸來進行，所述對照核酸的表達不依賴所測量的參數或條件?？梢允褂脺y試和參考核酸中對照核酸的表達水平來標準化所比較群體中的信號水平。本領域普通技術人員能容易地確定合適的對照核酸。診斷或標志物集合本發明還提供了標志物集合(markerset)來鑒定TAM和/或ATM。在某些實施方案中，這些標志物集合在試劑盒中提供，用于評估TAM和/或ATM的存在。例如，標志物集合可以包括兩種或更多、三種或更多、四種或更多、五種或更多、六種或更多、七種或更多、八種或更多、九種或更多、十種或更多、十一種或更多、十二種或更多、十三種或更多、十四種或更多、十五或更多、二十種或更多或整個集合的分子。所述分子是編碼TAM和/或ATM的胞內蛋白質、分泌蛋白質或細胞表面標志物(包括但不限于F4/80、⑶Ilc和langerin)的核酸。在本發明的一個實施方案中，提供了檢測一種或多種此類蛋白質的抗體。如本文所示，TAM和ATM表達巨噬細胞和樹突細胞二者的細胞表面標志物，而且如此用于檢測TAM和/或ATM的標志物集合可包含巨噬細胞標志物和樹突細胞標志物二者。應當認識到，一般可以單獨使用樹突細胞標志物來檢測ΤΑΜ、ATM和樹突細胞，而且一般可以單獨使用巨噬細胞標志物來檢測ΤΑΜ、ATM和巨噬細胞。治療用途根據本發明期待的是，單獨的或彼此組合的或與其它治療劑(包括但不限于化療齊U、細胞因子、趨化因子和抗血管發生劑、免疫抑制劑、細胞毒劑和生長抑制劑)組合的調控物組合(包括TAM和/或ATM激動劑、TAM和/或ATM拮抗劑、TAM結合劑、ATM結合劑、TAM分泌細胞因子/趨化因子的激動劑、ATM分泌細胞因子/趨化因子的激動劑、TAM分泌細胞因子/趨化因子的拮抗劑、ATM分泌細胞因子/趨化因子的拮抗劑、TAM分泌細胞因子/趨化因子結合劑和ATM分泌細胞因子/趨化因子結合劑)可以用于治療多種疾患，諸如細胞增殖性病癥、血管發生性病癥、及炎性、血管發生性和免疫學病癥(包括但不限于自身免疫性病癥)。在一個實施方案中，TAM生存力、存在或活性的調控物用于抑制癌細胞或腫瘤生長。在本發明的某些實施方案中，TAM結合劑、TAM拮抗劑、TAM分泌細胞因子/趨化因子的拮抗劑和/或TAM分泌細胞因子/趨化因子結合劑用于治療例如增殖性病癥、抑制癌細胞或腫瘤生長或抑制腫瘤轉移。還參見本文中標題為組合療法的小節。待治療的贅生性病癥的例子包括但不限于本文中術語“癌癥”和“癌性”下所記載的那些。在另一個實施方案中，TAM生存力、存在或活性的調控物用于治療免疫性病癥，包括但不限于自身免疫性病癥。在本發明的某些實施方案中，TAM激動劑、TAM結合劑、TAM分泌細胞因子/趨化因子的激動劑和/或TAM分泌細胞因子/趨化因子結合劑用于刺激TAM存在、生長和/或活性，用于治療自身免疫性病癥，例如通過刺激TAM誘導的來自幼稚T細胞群體的IL-10+CD4+Trl細胞和FoxP3+CD4+T調節性細胞生長和分化。要治療的自身免疫性病癥的例子包括但不限于本文中術語“自身免疫性病癥”下所記載的那些。在另一個實施方案中，ATM生存力、存在或活性的調控物用于抑制炎性病癥，包括但不限于高血糖性病癥和胰島素耐受性病癥。在本發明的某些實施方案中，ATM結合劑、ATM拮抗劑、ATM分泌細胞因子/趨化因子的拮抗劑和/或ATM分泌細胞因子/趨化因子結合劑用于抑制炎性病癥，包括但不限于高血糖性病癥和胰島素耐受性病癥。組合療法如上所述，本發明提供了組合療法，其中TAM結合劑、ATM結合劑、TAM激動劑、ATM激動劑、TAM拮抗劑、ATM拮抗劑、TAM分泌細胞因子/趨化因子結合劑、ATM分泌細胞因子/趨化因子結合劑、TAM分泌細胞因子/趨化因子的激動劑、ATM分泌細胞因子/趨化因子的激動劑、TAM分泌細胞因子/趨化因子的拮抗劑或ATM分泌細胞因子/趨化因子的拮抗劑與另外的療法組合施用。例如，TAM結合劑可以與本發明的不同藥劑、激動劑或拮抗劑組合施用來治療例如增殖性病癥或自身免疫性病癥。又例如，ATM結合劑可以與本發明的不同藥劑、激動劑或拮抗劑組合施用來治療例如炎性病癥，包括但不限于高血糖性病癥或胰島素耐受性病癥。在某些實施方案中，可以采用別的藥劑，例如化療劑、細胞因子、趨化因子、抗血管發生劑、免疫抑制劑、細胞毒劑、抗炎劑和生長抑制劑。本發明的藥劑、激動劑和拮抗劑可以與對那些目的有效的另一種藥劑連續地或組合地施用，或是在同一組合物中或是作為分開的組合物。或者/另外，可以施用本發明的多種拮抗劑、藥劑和/或激動劑。本發明的激動劑、拮抗劑和/或藥劑的施用可以同時進行，例如作為單一組合物或作為使用相同或不同施用路徑的兩種或多種不同組合物。或者/另外，施用可以連續地、按任何次序進行。在某些實施方案中，范圍從數分鐘到數天、到數周、到數月的間隔可以存在于兩個或多個組合物的施用之間。然而，還涵蓋同時施用或先施用本發明的不同的激動齊U、拮抗劑或藥劑。與本發明的激動劑、拮抗劑或藥劑組合施用的治療劑的有效量將處于醫師或獸醫的判斷之內。進行劑量施用和調整來實現待治療疾患的最大管理。劑量將另外取決于這些因素，諸如待使用的治療劑的類型和所治療的特定的患者。在某些實施方案中，數種相似分子(例如數種拮抗劑)的組合強化了單一分子的效力。術語“強化”是指在其常用的或批準的劑量下治療劑的效力方面的改善。還參見本文中標題為藥物組合物的小節。在本發明的某些方面，可用于使用本發明TAM和/或ATM結合劑、TAM和/或ATM拮抗劑、TAM和/或ATM分泌細胞因子/趨化因子的激動劑和TAM和/或ATM分泌細胞因子/趨化因子結合劑的組合腫瘤治療的其它治療劑包括其它癌癥療法(例如手術、放射治療(例如照射或施用放射性物質)、化學療法、使用本文所列的和本領域已知的抗癌劑的治療或其組合)。或者/另外，結合本文公開的相同的或兩種或更多不同的抗原的兩種或更多抗體可以共施用給患者。有時，可能有益的是還向患者施用一種或多種細胞因子。化療劑在某些方面，本發明提供了阻斷或降低腫瘤生長或癌細胞生長的方法，其通過向易患癌癥或診斷有癌癥的患者施用有效量的本發明的TAM拮抗劑、TAM結合劑、TAM分泌細胞因子/趨化因子的拮抗劑和/或TAM分泌細胞因子/趨化因子結合劑以及一種或多種化療劑。多種化療劑可以在本發明的組合治療方法中使用。所涵蓋的化療劑的例示性的和非限制性的列表在本文術語“化療劑”下提供。本領域普通技術人員將理解的是，適合劑量的化療劑一般將接近臨床療法中所早就采用的那些，在所述臨床療法中化療劑被單獨地或與其它化療劑組合地施用。劑量的變異將有可能存在，這取決于所治療的疾患。施行治療的醫師將能夠確定各個受試者的適合劑量?？贵w本發明的抗體包括特異性結合本發明蛋白質的抗體和此類抗體的抗體片段。本發明的多肽或蛋白質包括但不限于TAM細胞表面標志物(包括但不限于F4/80、⑶Ilc和例如圖14B和14E所列的、由TAM表達的細胞因子和趨化因子受體)和TAM細胞因子或趨化因子(包括但不限于TGFii和例如圖14A和14C所列的、由TAM表達的細胞因子和趨化因子)。在某些方面，本發明的多肽或蛋白質是特異性結合TAM細胞表面標志物(包括但不限于F4/80、CDllc和例如圖14Β和14Ε所列的、由TAM表達的細胞因子和趨化因子受體)和TAM細胞因子或趨化因子(包括但不限于TGFii和例如圖14Α和14C所列的、由TAM表達的細胞因子和趨化因子)的抗體。本發明的抗體進一步包括作為抗血管發生劑或血管發生抑制劑的抗體，作為髓樣細胞減少劑的抗體，作為抗癌劑的抗體，或本文所述其它抗體。例示性的抗體包括例如多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、抗體片段、雙特異性抗體、多特異性抗體、異源偶聯抗體、多價抗體、含效應器功能的抗體等。多克降抗體本發明的抗體可以包括多克隆抗體。制備多克隆抗體的方法是熟練技術人員知道的。例如，本發明的多克隆抗體通過在動物中一次或多次皮下(SC)或腹膜內(ip)注射相關抗原和佐劑來生成。使用雙功能或衍生化藥劑(例如馬來酰亞胺苯甲酰磺基琥珀酰亞胺酯(通過半胱氨酸殘基偶聯)、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N=C=NR(其中R和R1是不同的烴基))將相關抗原與在待免疫物種中有免疫原性的蛋白質(例如匙孔i威血藍蛋白、血清清蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制齊U)偶聯可能是有用的。在一個實施方案中，通過將例如IOOyg或5yg蛋白質或偶聯物(分別用于家兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混和并將該溶液皮內注射于多個部位，將動物針對本發明的分子、免疫原性偶聯物或衍生物進行免疫。一個月后，通過多個部位的皮下注射，用弗氏完全佐劑中初始量1/5-1/10的肽或偶聯物對動物進行加強免疫。7-14天后，采集動物的血液，并測定血清的抗體滴度。對動物進行加強免疫，直到滴度達到平臺(plateau)。典型的是，將動物用相同抗原但與不同蛋白質和/或通過不同交聯劑偶聯得到的偶聯物進行加強免疫。偶聯物還可在重組細胞培養中作為蛋白質融合物來制備。同樣，適當使用凝聚劑(諸如明礬)來增強免疫應答。單克降抗體針對本文所述抗原的單克隆抗體可以使用最初由Kohler等，Nature256495(1975)記載的雜交瘤方法來制備，或者可以通過重組DNA方法(參加例如美國專利No.4,816,567)來制備。在雜交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它適宜的宿主動物(諸如倉鼠或短尾猴(macaquemonkey))以引發生成或能夠生成如下抗體的淋巴細胞，所述抗體將特異性結合用于免疫的蛋白質。或者，可以在體外免疫淋巴細胞。然后，使用合適的融合劑(諸如聚乙二醇)將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成雜交瘤細胞(Goding，MonoclonalAntibodiesPrinciplesandPractice,pp.59-103,AcademicPress,1986)。將如此制備的雜交瘤細胞在合適的培養基中接種和培養，所述培養基典型的含有一種或多種抑制未融合的親本骨髓瘤細胞生長或存活的物質。例如，若親本骨髓瘤細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養基典型的將含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培養基)，這些物質阻止HGPRT缺陷細胞生長。典型的骨髓瘤細胞是那些高效融合、支持所選抗體生成細胞穩定的高水平生成抗體、并對諸如HAT培養基的培養基敏感的。在這些骨髓瘤細胞中，優選的骨髓瘤細胞系是鼠骨髓瘤系，諸如那些可從索爾克研究所細胞分配中心(SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,California,USA)獲得的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤及可從美國典型培養物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Rockville,Maryland,USA)獲得的SP-2或X63-Ag8-653細胞所衍生的。人骨髓瘤和小鼠_人異源骨髓瘤細胞系也已記載用于生成人單克隆抗體(Kozbor，J.Immunol.1333001(1984)；Brodeur等，MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,pp.51-63,MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987)。對雜交瘤細胞正在其中生長的培養液測定針對感興趣靶物的單克隆抗體的生成。可通過免疫沉淀或通過體外結合測定法(諸如放射免疫測定法(RIA)或酶聯免疫吸附測定法(ELISA))測定由雜交瘤細胞生成的單克隆抗體的結合特異性。此類技術和測定法是本領域知道的。單克隆抗體的結合親和力可通過例如MunsonandPollard,Anal.Biochem.107220(1980)的Scatchard分析來測定。在鑒定到生成具有期望特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后，該克隆可通過有限稀釋規程進行亞克隆并通過標準方法進行培養(Goding，MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,pp.59-103,AcademicPress,1986)。適于這一目的的培養基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養基。另外，雜交瘤細胞可在動物中作為腹水瘤進行體內培養。通過常規免疫球蛋白純化規程(諸如例如蛋白A-S印harose、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析)將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養基、腹水或血清適當分開。單克隆抗體還可以通過重組DNA方法來制備，諸如美國專利No.4，816，567中所記載的。編碼單克隆抗體的DNA易于使用常規規程分離和測序(例如通過使用能夠特異性結合編碼單克隆抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。雜交瘤細胞可充當此類DNA的來源。一旦分離，可將DNA置入表達載體，然后將該表達載體轉染入原本不生成免疫球蛋白蛋白質的宿主細胞(諸如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)以在重組宿主細胞中獲得單克隆抗體的合成。抗體的重組生產在下文中有更詳細的描述。在另一個實施方案中，可以從使用McCafferty等，Nature348:552-554(1990)所記載的技術構建的噬菌體抗體庫分離抗體或抗體片段。Clackson等，Nature352624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.222:581_597(1991)分別記載了使用噬菌體文庫分離鼠和人抗體。后續出版物記載了通過鏈改組(Marks等，Bio/Technology10:779-783(1992))，以及組合感染和體內重組作為構建非常大的噬菌體文庫的策略(Waterhouse等，Nuc.AcidsRes.21:2265_2266(1993))，生成高親和力(nM范圍)的人抗體。如此，這些技術是用于分離單克隆抗體的傳統單克隆抗體雜交瘤技術的可行替代方法。還可以修飾DNA，例如通過替代即用人重鏈和輕鏈恒定域的編碼序列替換同源鼠序列(美國專利No.4，816，567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA816851(1984)),或通過將非免疫球蛋白多肽的整個或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價連接。典型的是，用此類非免疫球蛋白多肽替代抗體的恒定域，或者用它們替代抗體的一個抗原結合位點的可變域，以產生嵌合二價抗體，其包含對一種抗原具有特異性的一個抗原結合位點和對不同抗原具有特異性的另一個抗原結合位點。人源化抗體和人抗體本發明的抗體可以包括人源化抗體或人抗體。人源化抗體具有一個或多個從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱作“輸入”殘基，它們典型的取自“輸入”可變域。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法進行(Jones等，Nature321522-525(1986)；Riechmann等，Nature332:323_327(1988)；Verhoeyen等，Science2391534-1536(1988))，通過用嚙齒類⑶R序列替代人抗體的相應序列。因而，此類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利No.4，816，567)，其中基本上少于整個人可變域用來自非人物種的相應序列替代。在實踐中，人源化抗體典型的是其中一些CDR殘基和可能的一些FR殘基用來自嚙齒類抗體中類似位點的殘基替代的人抗體。用于構建人源化抗體的人可變域(包括輕鏈和重鏈二者)的選擇對于降低抗原性非常重要。依照所謂的“最適”(best-fit)方法，用嚙齒類抗體的可變域序列對已知的人可變域序列的整個文庫進行篩選。然后接受與嚙齒類最接近的人序列作為人源化抗體的人框架(FR)(Sims等，J.Immunol.1512296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.196901(1987))。另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架。同一框架可用于數種不同的人源化抗體(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89=4285(1992)；Presta等，J.Immunol.1512623(1993))。更為重要的是，抗體在人源化后保持對抗原的高親和力及其它有利的生物學特性。為了實現這一目標，依照一種典型的方法，通過使用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產物的方法來制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型是公眾可獲得的，且為本領域技術人員所熟悉?？色@得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構象結構的計算機程序。檢查這些顯示圖像容許分析殘基在候選免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原的能力的殘基。這樣，可從受體和輸入序列中選出FR殘基并進行組合，從而獲得期望抗體特征，諸如對靶抗原的親和力提高。一般而言，CDR殘基直接且最實質性地涉及對抗原結合的影響?；蛘撸F在有可能生成在缺乏內源免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫后生成人抗體完整全集的轉基因動物(例如小鼠)。例如，已經記載了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(Jh)基因的純合刪除導致內源抗體生成的完全抑制。在此類種系突變小鼠中轉移大量人種系免疫球蛋白基因將導致在抗原攻擊后生成人抗體。參見例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA902551(1993)Jakobovits等，Nature362:255-258(1993)；Bruggermann等，YearinImmuno.733(1993)；及Duchosal等Nature355:258(1992)。人抗體也可以衍生自噬菌體展示庫(Hoogenboom等，J.Mol.Biol.，227=381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222:581-597(1991)；Vaughan等NatureBiotech14:309(1996))。人抗體還可以使用本領域已知的多種技術來生產，包括噬菌體展示庫(HoogenboomandWinter,J.Mol.Biol.227381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.222581(1991))。依照這種技術，將抗體V結構域基因以符合讀碼框的方式克隆入絲狀噬菌體(諸如M13或fd)的主要或次要外殼蛋白基因，并在噬菌體顆粒表面上展示為功能性抗體片段。因為絲狀噬菌體顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，以抗體的功能特性為基礎進行的選擇也導致編碼展示那些特性的抗體的基因的選擇。如此，噬菌體模擬B細胞的一些特性。噬菌體展示可以以多種格式進行，綜述參見例如Johnson，KS.andChiswell,DJ.，CurOpininStructBiol3:564-571(1993)。V基因區段的數種來源可用于噬菌體展示。例如，Clackson等，Nature352:624-628(1991)從衍生自經免疫小鼠脾的小型V基因隨機組合文庫分離得到大量不同的抗噁唑酮抗體。例如通過基本上遵循Marks等，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffith等，EMBOJ.12:725_734(1993)記載的技術，可以自未免疫人供體構建V基因全集和分離針對大量不同抗原(包括自身抗原)的抗體。還可參見美國專利No.5，565，332和5，573，905。Cole等人和Boerner等人的技術也可用于制備人單克隆抗體(Cole等，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,p.77(1985)及Boerner等，J.Immunol.147(1):86_95(1991))。還可以由體外激活的B細胞來生成人抗體(參見美國專利No.5，567，610和5，229，275)。抗體片段本發明還包括抗體片段。已經開發了用于生成抗體片段的多種技術。傳統上，通過蛋白水解消化完整抗體來衍生這些片段(參見例如Morimoto等，JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107—117(1992)；Brennan等，Science229:81(1985))。然而，現在可直接由重組宿主細胞生成這些片段。例如，可從上文討論的噬菌體抗體庫中分離抗體片段?；蛘?，可直接從大腸桿菌回收Fab'-SH片段并化學偶聯以形成F(ab')2片段(Carter等，Bio/TechnologylO:163_167(1992))。依照另一種方法，可直接從重組宿主細胞培養物分離F(ab')2片段。用于生成抗體片段的其它技術對于本領域普通技術人員將是顯而易見的。在其它實施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見W093/16185；美國專禾IjNo.5，571，894；及美國專利No.5，587，458。Fv和sFv是具有完整結合位點、缺少恒定區的唯一類型；如此，它們適于在體內使用時降低非特異性結合?？蓸嫿╯Fv融合蛋白以生成效應器蛋白質在sFv的氨基或羧基末端的融合。參見AntibodyEngineering,Borrebaeck編，見上文?？贵w片段還可以是“線性抗體”，例如如美國專利No.5，641，870中所記載的。此類線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。多特異性抗體(例如雙特異性的)本發明的抗體還包括例如多特異性抗體，其具有對至少兩種不同抗原的結合特異性。盡管此類分子通常只會結合兩種抗原(即雙特異性抗體，BsAb)，但是此表述在用于本文時涵蓋具有額外特異性的抗體(諸如三特異性抗體或其它特異性(即一種分子中涵蓋四種或更多種特異性)抗體)。本領域已知的BsAb的例子包括一個臂針對腫瘤細胞抗原而另一個臂針對細胞毒性觸發分子的BsAb，諸如抗FcyRI/抗⑶15、抗pl85HEK2/FCyRIII(⑶16)、抗CD3/抗惡性B細胞(IDlO)、抗CD3/抗ρ185·2、抗CD3/抗ρ97、抗CD3/抗腎細胞癌、抗CD3/抗0VCAR-3、抗CD3/L-D1(抗結腸癌)、抗CD3/抗黑色素細胞刺激激素類似物、抗EGF受體/抗⑶3、抗⑶3/抗CAMAl、抗⑶3/抗⑶19、抗⑶3/MoV18、抗神經細胞粘附分子(NCAM)/抗CD3、抗葉酸結合蛋白(FBP)/抗CD3、抗泛癌相關抗原(AM0C-31)/抗CD3；一個臂特異性結合腫瘤抗原而一個臂結合毒素的BsAb，諸如抗皂草素/抗Id-Ι、抗⑶22/抗皂草素、抗⑶7/抗皂草素、抗⑶38/抗皂草素、抗CEA/抗蓖麻毒蛋白A鏈、抗干擾素-a(IFN-α)/抗雜交瘤獨特型、抗CEA/抗長春花生物堿類；用于轉變酶活化的前體藥物的BsAb，諸如抗CD30/抗堿性磷酸酶(其催化磷酸絲裂霉素前體藥物轉變成絲裂霉素醇)；可用作纖溶劑的BsAb，諸如抗血纖維蛋白/抗組織型纖溶酶原激活物(tPA)、抗血纖維蛋白/抗尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)；用于將免疫復合物靶向細胞表面受體的BsAb，諸如抗低密度脂蛋白(LDL)/抗Fc受體(例如FcγRI、FcγRII或FcyRIII)；用于傳染病治療的BsAb，諸如抗⑶3/抗單純皰疹病毒(HSV)、抗T細胞受體⑶3復合物/抗流感、抗FcγR/抗HIV；用于體外或體內腫瘤檢測的BsAb，諸如抗CEA/抗EOTUBE、抗CEA/抗DPTA、抗ρ185ΗΕΚ2/抗半抗原；作為疫苗佐劑的BsAb；及作為診斷工具的BsAb，諸如抗家兔IgG/抗鐵蛋白、抗辣根過氧化物酶(HRP)/抗激素、抗促生長素抑制素/抗物質P、抗HRP/抗FITC、抗CEA/抗β-半乳糖苷酶。三特異性抗體的例子包括抗⑶3/抗⑶4/抗⑶37、抗⑶3/抗⑶5/抗⑶37和抗⑶3/抗⑶8/抗⑶37。在本發明的某些方面，雙特異性抗體中的一抗體可偶聯至巨噬細胞特異性細胞標志物，而另一抗體可偶聯至樹突細胞特異性細胞標志物。在某些實施方案中，這樣的抗體會更緊密地結合攜帶給定的巨噬細胞特異性細胞標志物和給定的樹突細胞特異性細胞標志物二者的細胞，超過只攜帶一種或另一種標志物的細胞。雙特異性抗體可以制備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab’)2雙特異性抗體)。用于生成雙特異性抗體的方法是本領域已知的。全長雙特異性抗體的傳統生產基于兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達，其中兩種鏈具有不同的特異性(Millstein等，Nature305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結構。通常通過親和層析進行的正確分子的純化相當麻煩且產物產量低。類似的規程披露于W093/08829及Traunecker等，EMBOJ.10:3655_3659(1991)。依照一種不同的方法，將具有期望結合特異性(抗體_抗原結合位點)的抗體可變域與免疫球蛋白恒定域序列融合。優選的是，與包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區的免疫球蛋白重鏈恒定域進行融合。優選在至少一種融合物中存在包含輕鏈結合所必需的位點的第一重鏈恒定區(CHl)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和需要時的免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達載體，并共轉染入合適的宿主生物體。在用于構建的三種多肽鏈比例不等時提供最佳產量的實施方案中，這為調整三種多肽片段的相互比例提供了很大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比例表達導致高產量時或在該比例沒有特別意義時，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入一個表達載體。在該方法的一個實施方案中，雙特異性抗體由一個臂上具有第一結合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)構成。由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個雙特異性分子中的存在提供了便利的分離途徑，因此發現這種不對稱結構便于將想要的雙特異性復合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開。該方法披露于W094/04690。關于生成雙特異性抗體的進一步詳情參見例如Suresh等，MethodsinEnzymology121:210(1986)。依照例如WOgeATOii中記載的另一種方法，可改造一對抗體分子間的界面，以將從重組細胞培養物回收的異二聚體的百分比最大化。優選的界面包含抗體恒定域的至少部結構域。在該方法中，將第一抗體分子界面的一個或多個小氨基酸側鏈用較大側鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換。通過將大氨基酸側鏈用較小氨基酸側鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換，在第二抗體分子的界面上產生與大側鏈大小相同或相似的補償性“空腔”。這提供了較之其它不想要的終產物(諸如同二聚體)提高異二聚體產量的機制。本領域還知道自抗體片段生成雙特異性抗體的技術。例如，可使用化學連接來制備雙特異性抗體。Brerman等，Science229:81(1985)記載了通過蛋白水解切割完整抗體以生成F(ab')2片段的規程。將這些片段在存在二硫醇絡合劑亞砷酸鈉時還原，以穩定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫鍵的形成。然后將產生的Fab’片段轉變為硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后將Fab'-TNB衍生物之一通過巰基乙胺的還原重新恢復成Fab'-硫醇，并與等摩爾量的另一種Fab'-TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。產生的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。最新的進展便于從大腸桿菌直接回收Fab'_SH片段，這些片段可化學偶聯以形成雙特異性抗體。Shalaby等，J.Exp.Med.175:217_225(1992)記載了完全人源化的雙特異性抗體F(ab')2分子的生成。由大腸桿菌分開分泌每種Fab'片段，并在體外進行定向化學偶聯以形成雙特異性抗體。如此形成的雙特異性抗體能夠結合過表達VEGF受體的細胞和正常人T細胞，以及觸發人細胞毒性淋巴細胞針對人乳腺腫瘤靶物的溶解活性。還記載了從重組細胞培養物直接生成和分離雙特異性抗體片段的多種技術。例如，已使用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體。Kostelny等，J.Immunol.148(5)1547-1553(1992)。將來自Fos和Jim蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗體的Fab'部分連接?？贵w同二聚體在鉸鏈區還原以形成單體，然后重新氧化以形成抗體異二聚體。這種方法也可用于生成抗體同二聚體。Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)記載的“雙抗體”技術提供了生成雙特異性抗體片段的替代機制。該片段包含通過接頭相連的重鏈可變域(Vh)和輕鏈可變域(\)，所述接頭太短使得同一條鏈上的兩個結構域之間不能配對。因而，迫使一個片段上的Vh和\結構域與另一個片段上的互補八和Vh結構域配對，由此形成兩個抗原結合位點。還報道了通過使用單鏈Fv(sFv)二聚體生成雙特異性抗體片段的另一種策略。參見Gruber等，J.Immunol.152=5368(1994)。還涵蓋具有超過兩個效價的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt等，J.Immunol.14760(1991)。異源偶聯抗體雙特異性抗體包括交聯或“異源偶聯”抗體，它們是本發明的抗體。例如，此類雙特異性抗體已經建議用于將免疫系統細胞靶向不想要的細胞(美國專利No.4，676，980)，及用于治療HIV感染(W091/00360,WO92/200373和EP03089)。可使用任何便利的交聯方法來生成異源偶聯抗體。合適的交聯劑是本領域眾所周知的，連同許多交聯技術一起披露于例如美國專利No.4，676，980。多價抗體本發明的抗體包括多價抗體。多價抗體可以比二價抗體更快的受到表達該抗體所結合抗原的細胞的內在化(和/或異化)。本發明的抗體可以是可容易的通過重組表達編碼抗體多肽鏈的核酸而生成的、具有三個或更多抗原結合位點(例如四價抗體)的多價抗體(IgM類別以外的)。多價抗體可包含二聚化結構域和三個或更多抗原結合位點。優選的二聚化結構域包含(或由其組成)Fc區或鉸鏈區。在這種情況中，抗體將包含Fc區及Fc區氨基末端的三個或更多抗原結合位點。本文中優選的多價抗體包含(或由其組成)三個至約八個但優選四個抗原結合位點。多價抗體包含至少一條多肽鏈(優選兩條多肽鏈)，其中所述多肽鏈包含兩個或更多可變域。例如，多肽鏈可包含VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VDl是第一可變域，VD2是第二可變域，Fc是Fc區的一條多肽鏈，Xl和X2代表氨基酸或多肽，而η是O或1。例如，多肽鏈可包含VH-CH1-柔性接頭-VH-CHl-Fc區鏈；或VH-CHl-VH-CHI-Fc區鏈。本文中的多價抗體優選進一步包含至少兩條(優選四條)輕鏈可變域多肽。本文中的多價抗體可包含例如約兩條至約八條輕鏈可變域多肽。本文涵蓋的輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變域，且任選進一步包含CL結構域。多價抗體可具有針對同一抗原的多個結合位點，或針對兩種或更多種不同抗原的結合位點。效應器功能工稈改造可能希望在效應器功能方面修飾本發明的抗體，從而增強抗體在治療特定病癥或疾病中的效力。例如，可向Fc區中引入半胱氨酸殘基，從而使得在該區中形成鏈間二硫鍵。如此生成的同二聚體抗體可具有改善的內在化能力和/或提高的補體介導的細胞殺傷和抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)。參見Caron等，J.Exp.Med.176:1191_1195(1992)和Shopes,B.，J.Immunol.148=2918-2922(1992)。具有增強的抗腫瘤活性的同二聚體抗體還可使用如Wolff等，CancerResearch53=2560-2565(1993)中記載的異雙功能交聯劑來制備?；蛘?，抗體可改造成具有雙重Fc區，由此可具有增強的補體溶解和ADCC能力。參見Stevenson等，Anti-CancerDrugDesign3:219_230(1989)。為了延長抗體的血清半衰期，可如例如美國專利No.5，739，277中記載的將補救受體結合表位摻入抗體(尤其是抗體片段)。在用于本文時，術語“補救受體結合表位”指IgG分子(例如IgG1JgG2JgG3或IgG4)的Fc區中負責延長IgG分子體內血清半衰期的表位。免疫偶聯物本發明還涵蓋包含本文所述抗體且其偶聯至細胞毒劑的免疫偶聯物，所述細胞毒劑諸如化療劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶聯物)。多種放射性核素可用于生成放射偶聯抗體。例子包括但不限于例如212Bi、131I、mIn、9°Y和186Re?？捎糜谏纱祟惷庖吲悸撐锏幕焺┥衔囊延忻枋?。例如，BCNU、鏈佐星(streptozoicin)、長春新堿、5-氟尿嘧啶、統稱為LL-E33288復合物的藥劑家族(美國專利5，053，394，5，770，710)、埃斯波霉素類(美國專利5，877，296)等(還可見本文中化療劑的定義)可以偶聯至本發明的抗體或其片段。為了選擇性破壞腫瘤，抗體可包含高度放射性原子。多種放射性同位素可用于生成放射偶聯的抗體或其片段。例子包括但不限于例如211At、131I、125I、9°Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212Pb、mIn、Lu的放射性同位素等。在將偶聯物用于診斷時，它可包含放射性原子以用于閃爍照相研究，例如"mtc或1231，或自旋標記物以用于核磁共振(NMR)成像(也稱為磁共振成像(MRI))，諸如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。可以以已知方式將放射性標記物或其它標記物摻入偶聯物。例如，肽可以生物合成，或者可以通過化學氨基酸合成法合成，其中使用牽涉例如以氟-19代替氫的合適氨基酸前體?？梢越涬闹械陌腚装彼釟埢鶃砀街鴺擞浳铮T如"mtc或123I、186Re、188Re和mIn。可以經賴氨酸殘基來附著釔-90。I0D0GEN法(Fraker等，Biochem.Biophys.Res.Commun.8049-57(1978))可用于摻入碘-123。參見例如Chatal,MonoclonalAntibodiesinImmunoscintigraphy,CRCPress，1989，其詳細記載了其它方法。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結合性活性片段、炭疽毒素保護性抗原、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A鏈、相思豆毒蛋白(abrin)A鏈、蒴蓮根毒蛋白(modeccin)A鏈、α-帚^MM(sarcin)(Aleutitesfordii)(dianthinprotein)>美洲商陸(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制物、白樹毒蛋白(gelonin)、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酷霉素(phenomycin)、新霉素(neomycin)、依諾霉素(enomycin)禾口單端孢菌素(trichothecenes)。參見例如1993年10月28日公布的WO93/21232?？墒褂枚喾N雙功能蛋白質偶聯劑來制備抗體和細胞毒劑的偶聯物，諸如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來酰亞氨基甲基)環己烷-1-羧酸酯，亞氨基硫烷(IT)，亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二甲酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對疊氮苯甲酰基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲?；?_乙二胺)、二異硫氰酸酯(諸如甲苯2，6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(諸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可以如Vitetta等，Science238=1098(1987)中所記載的制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸與抗體偶聯的例示性螯合劑。參見W094/11026。接頭可以是便于在細胞中釋放細胞毒性藥物的“可切割接頭”。例如，可使用酸不穩定接頭、肽酶敏感接頭、光不穩定接頭、二甲基接頭或含二硫化物接頭(Chari等，CancerResearch52127-131(1992)；美國專利No.5，208，020)?；蛘?，可通過例如重組技術或肽合成來生成包含抗VEGF和/或抗本發明蛋白質抗體和細胞毒劑的融合蛋白。DNA的長度可以包含各自編碼偶聯物兩部分的區域，或是彼此毗鄰或是由編碼接頭肽的區域分開，所述接頭肽不破壞偶聯物的期望特性。在某些實施方案中，將抗體與“受體”(諸如鏈霉親合素)偶聯以用于腫瘤預先靶向，其中對患者施用抗體-受體偶聯物，接著使用清除劑由循環中清除未結合的偶聯物，然后施用與細胞毒劑(例如放射性核苷酸)偶聯的“配體”(例如親合素)。在某些實施方案中，在抗體與具有核酸降解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA內切核酸酶諸如脫氧核糖核酸酶；DNA酶)之間形成免疫偶聯物。m^mm^^.mm本發明進一步提供了偶聯至一個或多個美登木素生物堿類分子的本發明抗體。美登木素生物堿類是通過抑制微管蛋白聚合來起作用的有絲分裂抑制劑。美登素最初從東非灌木齒葉美登木(Maytenusserrata)分離到(美國專利No.3，896，111)。隨后發現某些微生物也生成美登木素生物堿類，諸如美登醇和C-3美登醇酯(美國專利No.4，151，042)。合成的美登醇及其衍生物和類似物披露于例如美國專利No.4，137，230；4,248，870；4，256，746；4，260，608；4，265，814；4，294，757；4，307，016；4，308，268；4，308，269；4，309，428；4，313，946；4，315，929；4，317，821；4，322，348；4，331，598；4，361，650；4，364，866；4，424，219；4，450，254；4，362，663；及4，371，533。本發明的抗體可以偶聯至美登木素生物堿類分子且不顯著削弱抗體或美登木素生物堿類分子的生物學活性。每個抗體分子偶聯平均3-4個美登木素生物堿類分子在增強針對靶細胞的細胞毒性中顯示出功效，且對抗體的功能或溶解度沒有負面影響，盡管預計甚至一個分子的毒素/抗體也將較之裸抗體的使用增強細胞毒性。美登木素生物堿類在本領域是眾所周知的，而且可通過已知技術合成或從天然來源分離。例如美國專利No.5，208，020及上文提及的其它專利和非專利出版物中披露了合適的美登木素生物堿類。在一個實施方案中，美登木素生物堿類是美登醇和美登醇分子的芳香環或其它位置經過修飾的美登醇類似物，諸如各種美登醇酯。本領域知道許多連接基團可用于生成抗體_美登木素生物堿類偶聯物，包括例如美國專利No.5，208，020或歐洲專利0425235Bl及Chari等，CancerResearch52:127-131(1992)中所披露的。連接基團包括二硫化物基團、硫醚基團、酸不穩定基團、光不穩定基團、肽酶不穩定基團或酯酶不穩定基團，正如上述專利中所披露的，優選二硫化物和硫醚基團?？墒褂枚喾N雙功能蛋白質偶聯劑來制備抗體與美登木素生物堿類的偶聯物，諸如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來酰亞氨基甲基)環己烷-1-羧酸酯，亞氨基硫烷(IT)，亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二甲酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對疊氮苯甲?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲酰基)乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2，6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(諸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的雙功能衍生物。典型的偶聯劑包括N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，Biochem.J.173:723_737(1978))和N-琥珀酰亞氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，以提供二硫化物連接。根據連接的類型，可將接頭附著于美登木素生物堿類分子的多個位置。例如，可使用常規偶聯技術通過與羥基的反應來形成酯連接。反應可發生在具有羥基的C-3位置、用羥甲基修飾的C-14位置、用羥基修飾的C-15位置和具有羥基的C-20位置。在美登醇或美登醇類似物的C-3位置形成連接。加利車霉素另一種感興趣的免疫偶聯物包含與一個或多個加利車霉素分子偶聯的本發明抗體。加利車霉素抗生素家族能夠在亞皮摩爾濃度產生雙鏈DNA斷裂。關于加利車霉素家族偶聯物的制備參見美國專利No.5,712,374；5,714,586；5,739，116；5,767，285；5，770，701；5,770，710；5,773，001；5，877，296(都屬于美國Cyanamid公司)。可使用的加利車霉素結構類似物包括但不限于ΥΛα2\α/、N-乙?；?γΛPSAG和θ1JHinman等，CancerResearch53:3336-3342(1993)；Lode等，CancerResearch58:2925-2928(1998)；及上述授予美國Cyanamid公司的美國專利)?？梢耘c抗體偶聯的另一種抗腫瘤藥物是QFA，它是一種抗葉酸藥物。加利車霉素和QFA都具有胞內作用位點，且不易穿過質膜。因此，這些藥劑經由抗體介導的內在化的細胞攝取大大增強了它們的細胞毒性效果。其它抗體修飾本文還涵蓋本發明抗體的其它修飾。例如，可將抗體與多種非蛋白質性質聚合物之一連接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物。還可將抗體包載入例如通過凝聚技術或通過界面聚合制備的微膠囊(例如分別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)、膠狀藥物投遞系統(例如脂質體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)或粗滴乳狀液。此類技術披露于Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版，Osol,Α.編，1980。脂質體和納米顆粒本發明的多肽可以配制成脂質體。例如，本發明的抗體可以配制成免疫脂質體。含有抗體的脂質體通過本領域已知方法來制備，諸如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA823688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA774030(1980)；及美國專利No.4，485，045和4，544，545中所記載的。循環時間延長的脂質體披露于美國專利No.5，013，556。一般而言，脂質體的配制和使用是本領域技術人員所知道的?？梢杂冒字Ｄ憠A、膽固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質組合物通過反相蒸發法生成特別有用的脂質體。將脂質體擠過具有限定孔徑的濾器，以產生具有期望直徑的脂質體?？梢匀鏜artin等，J.Biol.Chem.257:286_288(1982)中所述，將本發明抗體的Fab’片段經二硫化物交換反應與脂質體偶聯。任選在脂質體中包含化療劑(諸如多柔比星)。參見Gabizon等，J.NationalCancerInst.81(19)1484(1989)。對本發明多肽的共價修飾本發明多肽(例如本發明的蛋白質、本發明蛋白質的抗體、多肽拮抗劑或激動劑片段、融合分子(例如免疫融合分子)等)的共價修飾包括在本發明的范圍內。如果適用，它們可通過化學合成或者通過酶促或化學切割所述多肽來生成。多肽的其它類型共價修飾如下引入分子，即通過將多肽的目標氨基酸殘基與能夠與選定側鏈或N-或C-末端殘基反應的有機衍生化試劑起反應，或者通過將經修飾的氨基酸或非天然的氨基酸摻入正在增長的多肽鏈，例如Ellman等，Meth.Enzym.202:301-336(1991)；Noren等，Science244182(1989)；及美國專利申請出版物20030108885和20030082575。半胱氨酰殘基最常見的是與α-鹵代乙酸(鹽/酯)(和相應的胺)起反應，諸如氯乙酸或氯乙酰胺，以得到羧甲基或羧酰氨甲基(carboxyamidomethyl)衍生物。半胱氨酰殘基還可以通過與溴代三氟丙酮、α-溴代-i3-(5-imidOZOyl)丙酸、氯乙?；姿?鹽/酯)、N_烷基馬來酰亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對氯汞苯甲酸(鹽/酯)、2_氯汞基-4-硝基酚或(4_)氯-7-硝基苯并-2-氧-1，3-二唑起反應而衍生化。組氨酰殘基通過與二乙基焦碳酸(鹽/酯)在pH5.5-7.0起反應而衍生化，因為此試劑相對特異于組氨酰側鏈。對溴苯甲酰甲基溴也是有用的；此反應通常在PH6.0的0.IM二甲胂酸鈉中進行。賴氨酰和氨基末端殘基與琥珀酸酐或其它羧酸酐起反應。用這些試劑的衍生化具有逆轉賴氨酰殘基電荷的效果。適于衍生化含α-氨基的殘基的其它試劑包括亞氨基酯，諸如皮考啉亞氨酸甲酯(methylpicolinimidate)、磷酸吡哆醛酯、吡哆醛、氯硼氫化物、三硝基苯磺酸、鄰甲基異脲、2，4_戊二酮和轉氨酶催化的與乙醛酸(glyoxylate)的反應。精氨酰殘基通過與一種或數種常規試劑起反應來修飾，其中有苯甲酰甲醛(phenylglyOXal)、2，3-丁二酮、1，2_環己二酮和茚三酮。精氨酸殘基的衍生化由于胍官能基的高PKa所以需要在堿性條件下進行反應。此外，這些試劑可以與賴氨酸的基團以及精氨酸ε-氨基起反應。酪氨酰殘基可以進行特異性修飾，對在酪氨酰殘基中引入光譜標記物特別感興趣，其通過與芳香族重氮化合物或四硝基甲烷起反應。最常見的是，使用N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分別形成鄰乙酰基酪氨酰種類和3-硝基衍生物。用125I或131I碘化酪氨酰殘基以制備帶標記物的蛋白質以用于放射免疫測定法。羧基側基團(天冬氨?；蚬劝滨?通過與碳二亞胺(R-N=C=N-R')起反應而進行選擇性修飾，碳二亞胺中的R和R’是不同的烴基，諸如1-環己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3_(4-氮陽離子-4，4-二甲基戊基)碳二亞胺。此外，通過與銨離子起反應將天冬氨酰和谷氨酰殘基轉變成天冬酰胺酰和谷酰胺酰殘基。谷酰胺酰和天冬酰胺酰殘基常常脫酰胺，分別成為相應的谷氨酰和天冬氨酰殘基。這些殘基在中性或堿性條件下脫酰胺。這些殘基的脫酰胺形式落入本發明的范圍。其它修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨?；蛱K氨酰殘基羥基的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側鏈α-氨基的甲基化(Τ.Ε.Creighton，ProteinsStructureandMolecularProperties,W.H.Freeman&Co.,SanFrancisco,pp.79-86(1983)),N-末端胺的乙?；?，及任何C-末端羧基的酰胺化。另一類共價修飾牽涉向本發明的多肽化學或酶促偶聯糖苷。這些規程的優點在于它們不需要在具有N-或0-連接糖基化的糖基化能力的宿主細胞中生成多肽根據所使用的偶聯模式，可以將糖附著于(a)精氨酸和組氨酸，(b)游離羧基，(c)游離巰基，諸如半胱氨酸的游離巰基，(d)游離羥基，諸如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的游離羥基，(e)芳香族殘基，諸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。這些方法記載于1987年9月11日公布的WO87/05330和Aplinandffriston,CRCCrit.Rev.Biochem.pp.259-306(1981)。本發明多肽上存在的任何碳水化合物模塊的消除可通過化學或酶促方法實現?；瘜W的脫糖基化作用需要將多肽暴露于化合物三氟甲磺酸或等效化合物。此處理導致除連接糖(linkingsugar)(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大部分或全部糖得到切除，而多肽保持完整?；瘜W的脫糖基化作用記載于Hakimuddin等，Arch.Biochem.Biophys.25952(1987)和Edge等，Anal.Biochem.118131(1981)。碳水化合物模塊(例如抗體上的)的酶促切割可通過使用多種內切和外切糖苷酶來實現，記載于Thotakura等，Meth.Enzymol.138350(1987)。本發明多肽的另一類共價修飾包括將多肽連接至多種非蛋白質性質聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，以美國專利No.4，640,835；4,496，689；4,301，144；4，670，417；4，791，192或4，179，337所列方式。載體、宿主細胞和重組方法本發明的多肽可以使用易于獲得的技術和材料而重組生產。為了重組生產本發明的多肽，例如本發明的蛋白質，例如本發明的抗體，分離編碼它的核酸，并插入可復制載體，用于進一步克隆(DNA擴增)或表達。編碼本發明多肽的DNA易于使用常規規程分離和測序。例如，對編碼單克隆抗體的DNA分離和測序，例如通過使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針?？梢垣@得許多載體。載體構件通常包括但不限于下列一種或多種信號序列、復制起點、一種或多種標志基因、增強子元件、啟動子和轉錄終止序列。信號序列構件本發明的多肽不僅可以直接重組生產，而且可以作為與異源多肽的融合多肽，所述異源多肽典型的是成熟蛋白質或多肽的N-末端處的信號序列或具有特異性切割位點的其它多肽。所選擇的異源信號序列典型的是受到宿主細胞識別并加工(即受到信號肽酶切割)的。對于不識別和加工天然多肽信號序列的原核宿主細胞，所述信號序列用例如選自下組的原核信號序列替代堿性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或熱穩定腸毒素II前導序列。為了酵母分泌，天然信號序列可以用例如酵母轉化酶前導序列、α因子前導序列(包括糖酵母屬和克魯維氏酵母屬α因子前導序列)、酸性磷酸酶前導序列、白色假絲酵母葡萄糖淀粉酶前導序列或WO90/13646中記載的信號替代。在哺乳動物細胞表達中，可以利用哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導序列，例如單純皰疹gD信號。將此類前體區(precursorregion)的DNA以符合讀碼框的方式與編碼本發明多肽的DNA連接。復制起點構件表達和克隆載體都包含能夠使載體在一種或多種所選擇的宿主細胞中復制的核酸序列。通常，在克隆載體中，這種序列是能夠使載體不依賴于宿主染色體DNA而復制的序列，包括復制起點或自主復制序列。眾所周知多種細菌、酵母和病毒的此類序列。來自質粒PBR322的復制起點適合于大多數革蘭氏陰性細菌，2μ質粒起點適合于酵母，而各種病毒起點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳動物細胞中的克隆載體。一般而言，哺乳動物表達載體不需要復制起點構件(SV40起點的使用通常可能只是因為它包含早期啟動子)。詵擇基因構件表達和克隆載體可包含選擇基因，也稱為選擇標志。典型的選擇基因編碼如下蛋白質(a)賦予對抗生素或其它毒素的抗性，例如氨芐青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四環素；(b)補足營養缺陷型的缺陷；或(c)提供不能由復合培養基獲得的必需營養物，例如用于芽孢桿菌的編碼D-丙氨酸消旋酶的基因。選擇方案的一個例子利用藥物來阻滯宿主細胞的生長。用異源基因成功轉化的那些細胞生成賦予藥物抗性的蛋白質，因而幸免于選擇方案。此類顯性選擇的例子使用藥物新霉素、霉酚酸和潮霉素。適于哺乳動物細胞的選擇標志的另一個例子是那些能夠鑒定有能力攝取抗體核酸的細胞的選擇標志，諸如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I和-II(典型的是靈長類金屬硫蛋白基因)、腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等。例如，首先通過將所有轉化子在含有甲氨蝶呤(Mtx)(DHFR的一種競爭性拮抗劑)的培養基中進行培養來鑒定經DHFR選擇基因轉化的細胞。在采用野生型DHFR時，適宜的宿主細胞是DHFR活性缺陷的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系?；蛘?，可以通過細胞在含有針對選擇標志的選擇劑(諸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418)的培養基中的生長來選擇經編碼本發明多肽、野生型DHFR蛋白質和另一種選擇標志(諸如氨基糖苷3‘-磷酸轉移酶(APH))的DNA序列轉化或共轉化的宿主細胞(特別是包含內源DHFR的野生型宿主)。參閱美國專利No.4，965，199。適用于酵母的選擇基因是存在于酵母質粒Yrp7中的trpl基因(Stinchcomb等，Nature282:39(1979))。trpl基因為缺乏在色氨酸中生長能力的酵母突變株(例如ATCCNo.44076或PEP4-1)提供了選擇標志。Jones,Genetics85:12(1977)。酵母宿主細胞基因組中存在trpl損傷隨之提供了用于通過在缺乏色氨酸時的生長來檢測轉化的有效環境。類似的，用攜帶Leu2基因的已知質粒補足Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC20，622或38，626)。此外，衍生自1.6μπι環狀質粒pKDl的載體可用于轉化克魯維氏酵母屬酵母?；蛘?，報導了用于在乳酸克魯維氏酵母中大規模生產重組小牛凝乳酶的表達系統。VandenBerg,Bio/Technology8:135(1990)。還披露了用于由克魯維氏酵母屬的工業用菌株分泌成熟重組人血清清蛋白的穩定多拷貝表達載體。Fleer等，Bio/Technology9968-975(1991)。啟動子構件表達和克隆載體通常包含受到宿主生物體識別的啟動子，而且它與編碼本發明多肽的核酸可操作連接。適用于原核宿主的啟動子包括PhoA啟動子、β-內酰胺酶和乳糖啟動子系統、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統和雜合啟動子(諸如tac啟動子)。然而，其它已知的細菌啟動子也是合適的。用于細菌系統的啟動子還將包含與編碼本發明多肽的DNA可操作連接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。已知真核細胞的啟動子序列。事實上，所有真核基因都具有富含AT區，它位于起始轉錄的位點上游大約25至30個堿基處。在許多基因的轉錄起點上游70至80個堿基處找到的另一種序列是CNCAAT區，其中N可以是任何核苷酸。在大多數真核基因的3'端是AATAAA序列，它可能是向編碼序列的3'端添加polyA尾的信號。所有這些序列合適的插入真核表達載體。適用于酵母宿主的啟動序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動子，諸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡萄糖異構酶和葡糖激酶。作為具有通過生長條件控制轉錄的額外優點的誘導型啟動子的其它酵母啟動子是醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝有關的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、及負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子區。適用于酵母表達的載體和啟動子進一步記載于EP73，657。酵母增強子也可以有利的與酵母啟動子一起使用。在哺乳動物宿主細胞中由載體轉錄本發明多肽受到例如從病毒(諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、乙肝病毒和典型的猿猴病毒40(SV40))基因組、異源哺乳動物啟動子(例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子)、及熱休克啟動子獲得的啟動子的控制，倘若此類啟動子與宿主細胞系統相容的話。方便的以SV40限制性片段的形式獲得SV40病毒的早期和晚期啟動子，該片段還包含SV40病毒復制起點。方便的以HindIIIE限制性片段的形式獲得人巨細胞病毒的立即早期啟動子。美國專利No.4，419，446中披露了使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿主中表達DNA的系統。美國專利No.4，601，978中記載了該系統的一種改良。關于在小鼠細胞中在來自單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子的控制下表達人β“干擾素cDNA還可參見Reyes等，Nature297:598_601(1982)?；蛘?，可以使用勞氏肉瘤病毒長末端重復序列作為啟動子。增強子元件構件常常通過將增強子序列插入載體來提高高等真核細胞對編碼本發明多肽的DNA的轉錄?，F在知道來自哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰島素)的許多增強子序列。典型的是，使用來自真核細胞病毒的增強子。例子包括SV40復制起點晚期一側的增強子(bp100-270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、多瘤病毒復制起點晚期一側的增強子和腺病毒增強子。關于激活真核啟動子的增強元件還可參見Yaniv，Nature297:17-18(1982)?？梢詫⒃鰪娮蛹艚尤胼d體，位于多肽編碼序列的5'或3'位置，但是典型的位于啟動子的5'位點。轉錄終Ih構件用于真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其它多細胞生物體的有核細胞)的表達載體還將包含終止轉錄和穩定mRNA所必需的序列。此類序列通常可以從真核或病毒DNA或cDNA非翻譯區的5'端和偶爾的3'端獲得。這些區域包含在編碼本發明多肽的mRNA的非翻譯部分中轉錄成聚腺苷酸化片段的核苷酸區段。一種有用的轉錄終止構件是牛生長激素聚腺苷酸化區。參見WO94/11026及其中披露的表達載體。宿主細胞的詵擇和轉化適于克隆或表達本文載體中的編碼本發明多肽的DNA的宿主細胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核細胞。適于此目的的原核生物包括真細菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科，諸如埃希氏菌屬(Escherichia)例如大腸埃希氏菌或大腸桿菌(E.coli)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形菌屬(Proteus)、沙門氏菌屬(Salmonella)例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、沙雷氏菌屬(Serratia)例如粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescans)、志賀氏菌屬(Shigella)、以及芽孢桿菌屬(Bacilli)諸如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.Iicheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD266，710中披露的地衣芽孢桿菌41P)、假單胞菌屬(Pseudomonas)諸如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)和鏈霉菌屬(Str印tomyces)。典型的是，大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294仏了031，446)，盡管其它菌株諸如大腸桿菌8、大腸桿菌乂1776仏1031,537)和大腸桿菌W3110(ATCC27，325)也是合適的。這些例子是例示性的，而不是限制性的。在原核生物以外，真核微生物(諸如絲狀真菌或酵母)也是編碼本發明多肽的載體的合適克隆或表達宿主。釀酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)或常用的面包酵母在最常用的低等真核宿主微生物之中。然而，通常可獲得許多其它屬、種和菌株且可用于本發明，諸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主，諸如例如乳酸克魯維酵母(K.Iactis)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC12，424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC16，045)、威克克魯維酵母(K.wickeramii)(ATCC24，178)、K.waltii(ATCC56，500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)(ATCC36，906)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)和馬克思克魯維酵母(K.marxianus)；亞羅酵母屬(Yarrowia)(EP402,226)；巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)(EP183，070)；假絲酵母屬(Candida)；瑞氏木霉(Trichodermareesia)(EP244,234)；粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)；許旺酵母屬(Schwanniomyces)，諸如Schwanniomycesoccidentalis；禾口絲狀真菌，i者如例如脈抱菌屬(Neurospora)>(Penicillium)、彎頸霉屬(Tolypocladium)和曲霉屬(Aspergillus)宿主諸如構巢曲霉(A.nidulans)禾口黑曲霄(A.niger)。適于表達糖基化本發明多肽的宿主細胞衍生自多細胞生物體。無脊椎動物細胞的例子包括植物和昆蟲細胞。已經鑒定了許多桿狀病毒株和變體及相應的允許昆蟲宿主細胞，它們來自諸如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(毛蟲)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)(蚊子)、白紋伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)(果蠅)和家蠶(Bombyxmori)等宿主。公眾可獲得多種病毒株用于轉染，例如苜蓿尺蠖AutographacalifornicaNPV的L-1變體禾口家香BombyxmoriNPV的Bm_5株，而且此類病毒可依照本發明用作本文中的病毒，特別是用于轉染草地夜蛾細胞。還可利用棉、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄和煙草的植物細胞培養物作為宿主。然而，脊椎動物細胞得到最多關注，而且培養(組織培養)中脊椎動物細胞的繁殖已經成為常規流程。有用哺乳動物宿主細胞系的例子是用SV40轉化的猴腎CVl系(COS-7，ATCCCRL1651)；人胚腎系(293或為了在懸浮培養中生長而亞克隆的293細胞，Graham等，J.GenVirol.36:59(1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCCCCL10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA774216(1980))；小鼠塞托利(sertoli)細胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243_251(1980))；猴腎細胞(CVLATCCCCL70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76,ATCCCRL-1587)；人宮頸癌細胞(HELA，ATCCCCL2)；犬腎細胞(MDCK,ATCCCCL34)；牛鼠(buffalorat)肝細胞(BRL3A,ATCCCRL1442)；人肺細胞(Wl38,ATCCCCL75)；人肝細胞(HepG2，HB8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT060562，ATCCCCL51)；TRI細胞(Mather等，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44_68(1982)；MRC5細胞；FS4細胞；和人肝肉瘤系(HepG2)。用上文所述用于生產本發明多肽的表達或克隆載體轉化宿主細胞，并在為了誘導啟動子、選擇轉化子或擴增編碼期望序列的基因而適當更改的常規營養培養基中進行培養。培養宿主細胞可以在多種培養基中培養用于生產本發明多肽的宿主細胞。商品化培養基諸如Ham氏FlO(Sigma)、極限必需培養基(MEM,Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco氏改良的Eagle氏培養基(DMEM，Sigma)適于培養宿主細胞。另外，可以使用下列文獻中記載的任何培養基作為宿主細胞的培養基Ham等，Meth.Enz.5844(1979)；Barnes等，Anal.Biochem.102255(1980)；美國專利No.4，767，704；4，657，866；4，927，762；4，560，655；或5，122，469；W090/03430；WO87/00195；或美國專利Re.30,985。任何這些培養基可以根據需要補充激素和/或其它生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷和胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCIN藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍的終濃度存在的無機化合物)和葡萄糖或等效能源。還可以以適宜濃度包含本領域技術人員知道的任何其它必需補充物。培養條件(諸如溫度、PH等)就是先前為表達而選擇用于宿主細胞的，這對于普通技術人員而言是顯而易見的。多肽純化本發明的多肽或蛋白質可以是純化的。在使用重組技術時，可以在細胞內、在周質空間中生成本發明的多肽，或者直接分泌入培養基。可以從培養物的培養液或者從宿主細胞溶胞液回收本發明的多肽。如果是膜結合的，那么可以用合適的去污劑溶液(例如Triton-X100)或通過酶促切割從膜上釋放它。本發明多肽的表達中所采用的細胞可通過各種物理或化學手段破碎，諸如凍融循環、超聲處理、機械破碎或細胞裂解劑。以下規程是合適的蛋白質純化規程的例子通過離子交換柱上的分級；乙醇沉淀；反相HPLC；硅土上的層析，肝素SEPHAR0SE上的層析，陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬氨酸柱、DEAE等)上的層析；層析聚焦；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀；利用例如S印hadexG-75的凝膠過濾；用蛋白ASiipharose柱去除雜質諸如IgG；及用金屬螯合柱結合帶表位標簽形式的本發明多肽?？梢圆捎枚喾N蛋白質純化方法，此類方法是本領域已知的，而且記載于例如Deutscher,MethodsinEnzymology,182(1990)；Scopes,ProteinPurificationPrinciplesandPractice,Springer-Verlag,NewYork(1982)。所選擇的純化步驟取決于例如所用純化方法的本質和所生成的具體本發明多肽。例如，可以使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析來純化由細胞制備的抗體組合物，典型的純化技術是親和層析。蛋白A作為親和配體的適宜性取決于抗體中存在的任何免疫球蛋白Fc區的種類和同種型。蛋白A可用于純化基于人Yl、Y2或重鏈的抗體(Lindmark等，J.Immunol.Meth.621-13(1983))。蛋白G推薦用于所有小鼠同種型和人Y3(Guss等，EMBOJ.51567-1575(1986))。親和配體所附著的基質最常用的是瓊脂糖，但是可以使用其它基質。物理穩定的基質(諸如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯)容許獲得比瓊脂糖更快的流速和更短的加工時間。若抗體包含Ch3結構域，則可使用BakerbondABX樹脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)進行純化。根據待回收的抗體，也可使用其它蛋白質純化技術，例如上文所述的。還可參見Carter等，Bio/Technology10:163-167(1992)，其記載了用于分離分泌到大腸桿菌周質空間的抗體的規程。藥用配制劑通過將具有期望純度的分子(例如多肽)與任選的藥學可接受載體、賦形劑或穩定劑(《Remington'sPharmaceuticalSciences》，第I6版，0sol，A.編，I98O)混合來制備本文所述和依照本發明使用的本發明藥劑(例如TAM和/或ATM結合劑或TAM和/或ATM分泌細胞信使結合劑)及其組合的治療用配制劑，以凍干劑型或水溶液的形式貯存。可接受的載體、賦形劑或穩定劑在所采用的劑量和濃度對接受者是無毒的，而且包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基芐基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨、苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相反離子，諸如鈉；金屬復合物(例如Zn-蛋白質復合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEEN、PLUR0NICS或聚乙二醇(PEG)?；钚猿煞诌€可包載入例如通過凝聚技術或通過界面聚合制備的微膠囊(例如分別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)、膠狀藥物投遞系統(例如脂質體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)或粗滴乳狀液。此類技術披露于例如《Remington'sPharmaceuticalSciences》，第16版，Osol,A.編，1980。用于體內施用的配制劑必須是無菌的。這可容易的通過例如使用無菌濾膜過濾來實現?？芍苽涑掷m釋放制劑。持續釋放制劑的合適例子包括含有本發明多肽的固體疏水性聚合物半透性基質，該基質以定型產品的形式存在，例如薄膜或微膠囊。持續釋放基質的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基_甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利No.3，773，919)、L_谷氨酸和Y-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRONDEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構成的可注射微球體)及聚-D-(_)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能夠釋放分子100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白質的時間較短。當膠囊化抗體在體內長時間維持時，它們可能由于暴露于37°C的潮濕環境而變性或聚集，導致生物學活性損失和免疫原性可能改變。可根據相關機制來設計合理的穩定化策略。例如，如果發現聚集機制是經由硫醇_二硫化物互換而形成分子間S-S鍵，那么可通過修飾巰基、由酸性溶液凍干、控制濕度、采用適宜添加劑和開發特定的聚合物基質組合物來實現穩定化。還可參見例如美國專利No.6，699，501，其記載了具有聚電解質覆蓋物的膠囊。還涵蓋可以通過基因療法將本發明的藥劑(例如TAM激動劑、TAM拮抗劑或TAM細胞因子/趨化因子分泌的激動劑或拮抗劑)導入受試者?；虔煼ㄖ竿ㄟ^給受試者施用核酸進行的療法。在基因療法的應用中，為了實現治療上有效的基因產物的體內合成，例如為了替換缺陷基因，將基因引入細胞。“基因療法”包括通過單次處理實現持久效果的傳統基因療法及牽涉一次或重復施用治療上有效的DNA或mRNA的基因治療劑施用二者。反義RNA和DNA可作為治療劑用于阻斷某些基因的體內表達。早已顯示可以將短反義寡核苷酸輸入細胞，在那里它們起抑制劑的作用，盡管由于細胞膜對它們的攝取受限制因而它們的胞內濃度低(Zamecnik等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:4143_4146(1986))。可以修飾寡核苷酸以增強它們的攝取，例如通過用不帶電荷的基團取代它們帶負電荷的磷酸二酯基團。關于基因療法的方法的一般性綜述參閱例如Goldspiel等，ClinicalPharmacy12:488-505(1993)；Wuandffu,Biotherapy3:87-95(1991)；Tolstoshev,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596(1993)；Mulligan,Science260:926-932(1993)；MorganandAnderson,Ann.Rev.Biochem.62191-217(1993)；及May，TIBTECH11:155-215(1993)。重組DNA
技術領域：
普遍知道的、可以使用的方法記載于Ausubel等人編(1993)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NY禾口Kriegler(1990)GeneTransferandExpression,ALaboratoryManual,StocktonPress，NY。有多種技術可用于將核酸引入活細胞。所述技術可根據核酸是在體外轉移入培養的細胞還是在體內轉移入預期宿主的細胞而變化。適于在體外將核酸轉移入哺乳動物細胞的技術包括使用脂質體、電穿孔、顯微注射、細胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸鈣沉淀法等。當前優選的體內基因轉移技術包括用病毒(典型的是逆轉錄病毒)載體進行的轉染和病毒外殼蛋白-脂質體介導的轉染(Dzau等，TrendsinBiotechnologyll:205_210(1993))。例如，體內核酸轉移技術包括用病毒載體(諸如腺病毒、I型單純皰疹病毒、慢病毒、逆轉錄病毒或腺伴隨病毒)和基于脂質的系統(可用于脂質介導的基因轉移的脂類有例如DOTMA,DOPE和DC-Chol)進行的轉染。在基因療法中使用病毒載體的例子可參閱Clowes等，J.Clin.Invest.93644-651(1994)；Kiem等，Blood831467-1473(1994)；SalmonsandGunzberg,HumanGeneTherapy4129-141(1993)；GrossmanandWilson,Curr.Opin.inGeneticsandDevel.3110-114(1993)；BoutHumanGeneTherapy5:3—10(1994)；Rosenfeld等，Science252:431-434(1991)；Rosenfeld等，Cell68143-155(1992)；Mastrangeli等，J.Clin.Invest.91:225_234(1993)；及Walsh等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204:289_300(1993)。在有些情況中希望與靶向靶細胞的藥劑(諸如對細胞表面膜蛋白或靶細胞特異性的抗體、針對靶細胞上受體的配體等)一起提供核酸來源。若采用脂質體，則可以使用與胞吞作用有關的細胞表面膜蛋白結合的蛋白質靶向和/或促進攝取，例如對特定細胞類型有向性的衣殼蛋白或其片段、針對在循環中經歷內在化的蛋白質的抗體、靶向胞內定位并延長胞內半衰期的蛋白質。受體介導的胞吞作用的技術記載于例如Wu等，J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987)禾ΠWagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:3410-3414(1990)。關于基因標記和基因療法方案的綜述參閱Anderson等，Science256808-813(1992)。劑量和施用依照已知方法將本發明的藥劑(ΤΑΜ和/或ATM結合劑、TAM和/或ATM激動劑、TAM和/或ATM拮抗劑、TAM和/或ATM分泌細胞因子/趨化因子結合劑、TAM和/或ATM分泌細胞因子/趨化因子的激動劑和/或TAM和/或ATM分泌細胞因子/趨化因子的拮抗齊U)施用于哺乳動物患者(即人類患者)，諸如靜脈內施用(像推注或持續一段時間的連續輸注)、肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、口服、表面或吸入路徑，和/或皮下施用。在某些實施方案中，本發明的治療牽涉組合施用本發明的組合物和一種或多種別的治療劑(例如化療劑、細胞因子、趨化因子、抗血管發生劑、免疫抑制劑、細胞毒性劑和生長抑制劑)。本發明還涵蓋施用針對同一抗原的多種抗體或針對本發明不同蛋白質的多種抗體。在一個實施方案中，與本發明的組合物一起施用不同化療劑的混合物。組合施用包括使用分開的配制劑或單一藥物配制劑的共施用，和/或任一次序的順次施用。在一個實施方案中，有一段時間所有(兩種或更多)活性劑同時發揮其生物學活性。對于疾病的預防或治療，本發明藥劑的適宜劑量取決于上文定義的待治療疾病的類型、疾病的嚴重程度和病程、施用抑制劑是用于預防還是治療目的、先前的療法、患者的臨床史和對抑制劑的響應、及主治醫師的判斷。將抑制劑一次性或者在一系列治療中適當的施用于患者。在組合治療方案中，本發明的組合物以治療有效量或治療協同量施用。在用于本文時，治療有效量指導致所針對疾病或疾患得到減輕或抑制的本發明組合物的施用量和/或本發明組合物和一種或多種其它治療劑的共施用量。藥劑組合的施用效果可以是疊加的。在一個實施方案中，施用的效果是協同效應。治療協同量指協同的或顯著的減輕或消除與特定疾病有關的狀況或癥狀所必需的本發明組合物和一種或多種其它治療劑(例如化療劑或抗癌劑)的量。根據疾病的類型和嚴重程度，大約1μg/kg到50mg/kg(例如0.l_20mg/kg)本發明藥劑、激動劑或拮抗劑是施用于患者的初始候選劑量，無論是例如通過一次或多次分開施用，或者是通過連續輸注。典型每日劑量的范圍可以為大約lyg/kg到大約100mg/kg或者更多，取決于上述因素。對于持續數天或更長時間的重復給藥，根據疾患，治療維持到直至發生期望的疾病癥狀抑制。然而，其它劑量方案可能也是有用的。典型的是，臨床醫師將會施用本發明的分子，直至劑量達到提供所需生物學效應?？梢酝ㄟ^常規技術和測定法來容易的監測本發明療法的進展。例如，血管發生抑制劑(例如抗VEGF抗體，諸如AVASTIN(Genentech))的制備和劑量給藥方案可以依照制造商的說明書使用，或者由熟練從業人員憑經驗確定。在另一個例子中，此類化療劑的制備和劑量給藥方案可以依照制造商的說明書使用，或者由熟練從業人員憑經驗確定。化療的準備和劑量給藥方案還記載于ChemotherapyServiceEd.，Μ.C.Perry,Williams&ffilkins,Baltimore,MD(1992)。治療功效在一些實施方案中，本發明治療的功效可以通過本領域已知的各種終點來測量。在一個實施方案周，基于TAM的治療的功效可以通過評估贅生性或非贅生性病癥中常用的多種終點(endpoint)來測量。例如，癌癥治療可以通過例如但不限于腫瘤消退、腫瘤重量或大小收縮、距進展的時間、存活持續時間、無進展存活、整體響應率、響應持續時間、生活質量、蛋白質表達和/或活性來評估。因為本文所述藥劑靶向并滲透腫瘤血管結構而不必是贅生性細胞本身，所以它們代表了一類不同的抗癌藥，并因此可以要求與標準抗贅生性細胞療法不同的對藥物的臨床應答的測量和定義。例如，二維分析中大于50%的腫瘤收縮是宣告響應的標準截留。然而，本發明的抑制劑可以引起對轉移性擴散的抑制而沒有原發瘤的收縮，或者可以僅僅發揮抑制腫瘤效果。因而，可采用測定治療功效的方法，包括例如測量血管發生的血漿或尿液標志物和通過放射學成像測量響應。在一個實施方案中，本發明治療的功效可以通過評估自身免疫性病癥中常用的多種終點來測量。例如，自身免疫性病癥治療可以通過以下方法來評估，包括但不限于疾病原發性或繼發性特征的減輕或停止、距進展的時間、存活持續時間、無進展存活、整體響應率、響應持續時間、生活質量、蛋白質表達和/或活性。相同的邏輯可應用于使用本領域普通技術人員常用來評估本發明治療要解決的特定病癥的終點測量本發明治療的功效。制品在本發明的另一個實施方案中，提供了包含可用于治療或診斷上文所述病癥的物質的制品。所述制品包括容器、標簽和包裝插頁。合適的容器包括例如藥瓶、藥管、注射器等。所述容器可以用多種材料制成，諸如玻璃或塑料。在一個實施方案中，所述容器裝有有效治療所述疾患的組合物，可以具有無菌存取口(例如所述容器可以是帶有皮下注射針可刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或藥瓶)。在一個實施方案中，所述組合物中的至少一種活性藥劑是TAM和/或ATM結合劑或TAM和/或ATM分泌細胞因子/趨化因子結合劑。在另一個實施方案中，所述組合物中的至少一種活性藥劑是TAM和/或ATM激動劑或至少一種TAM和/或ATM分泌細胞因子/趨化因子的激動劑。在另一個實施方案中，所述組合物中的至少一種活性藥劑是TAM和/或ATM拮抗劑或至少一種TAM和/或ATM分泌細胞因子/趨化因子的拮抗劑。在某些實施方案中，所述組合物進一步包括至少一種第二活性分子，包括但不限于化療劑、細胞因子、趨化因子、抗血管發生劑、免疫抑制劑、細胞毒劑和生長抑制劑。容器上或與容器相連的標簽指明該組合物用于治療所選擇的疾患。所述制品可進一步包括第二容器，其中裝有藥學可接受的緩沖液，諸如磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。本發明的制品可進一步包括從商業和用戶立場出發需要的其它物質，包括別的活性劑、其它緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。應當理解，在此描述的實施例和實施方案僅用于例示目的，根據這些將為本領域技術人員提供各種修改或變化，它們包括在本申請的精神和范圍、以及所附權利要求的范圍內。認為本說明書足以使本領域技術人員能實施本發明。通過述及，將本文中所引用的所有出版物、專利和專利申請完整收入本文用于艘游目的。實施例實施例1髓樣浸潤物的組成和定位通過免疫組織化學評估了MMTV-PyMT誘導的乳腺腫瘤中的免疫浸潤物的組成和定位。購買對Friend白血病病毒B株(“FVB”)敏感的野生型小鼠(CharlesRiver)，并且在無病原體的設施中飼養在FVB背景中包含MMTV.PyMTtg或匪17.Her2tg腫瘤的小鼠。將來自MMTV.PyMTtg小鼠的腫瘤在OCT溶液中包埋和冷凍。使用標準規程，將冷凍切片切成5微米薄切片，于室溫干燥，并用冰冷的丙酮固定。將內源過氧化物酶用葡萄糖氧化酶于37°C淬滅60分鐘。用PBS漂洗切片，并用親合素生物素封閉試劑盒(Vector)依照制造商的指令封閉內源親合素和生物素。將切片用含10%家兔血清的3%BSA/PBS于室溫封閉30分鐘，然后與在封閉血清中稀釋的適宜抗體一起于室溫溫育60分鐘，以大鼠IgG2b作為陰性對照。將切片用TBST漂洗，并與適宜的生物素化二抗一起于室溫溫育30分鐘。依照標準規程對切片顯色。大鼠抗⑶45(LCA)抗體得自Pharmingen，家兔抗⑶3抗體得自DAK0，生物素化山羊抗家兔IgG和生物素化家兔抗大鼠IgG得自Vector，大鼠抗F4/80抗體得自Serotec。將腫瘤樣品首先用抗CD45抗體處理以檢測白細胞。如圖IA所示，在腫瘤和基質中鑒定出顯著的白細胞浸潤物。為了進一步闡明浸潤物的組成，用抗F4/80抗體或抗CD3抗體(分別作為巨噬細胞和T細胞的標志物)處理樣品。在抗F4/80抗體處理后觀察到的染色樣式與用抗CD45抗體處理后觀察到的相似，指示大部分CD45+白細胞是巨噬細胞(比較圖IB與圖1A)。雖然在腫瘤浸潤物內觀察到CD3+細胞，但是它們不如F4/80巨噬細胞普遍(比較圖IC與圖1B)。通過流式細胞術證實和擴充了結果。簡言之，將腫瘤切成碎塊，并用膠原酶II、IV和DNA酶(Gibco和Sigma)于37°C消化15分鐘。將準備好的腫瘤細胞樣品用熒光標記的、對不同髓樣子集特異性的抗體處理，包括抗⑶lib、抗GR-1、抗Nkl.1、抗DX5、抗MHCII、抗CDllc、抗F4/80和抗PD-Ll(Pharmingen、Serotec和eBioscience)。將所有細胞在染色之前用適宜的血清或純化的IgG封閉，并且還使用標準規程用碘化丙啶對細胞染色以排除死細胞。使用FACSCalibur或LSRII(都是BectonDickinson)實施分析。淋巴樣腫瘤浸潤物中的主要細胞類型是⑶Ilb+細胞(見圖1D)。觀察到8.4士1.8%的NKl.l_DX5TDllb+髓樣浸潤物。大多數那些髓樣細胞是Gr_rF4/80s巨噬細胞(77.9士11.3%)。在剩余的CDllb+細胞中，11.5士4.3%是Gr_rF4/80低定居組織單核細胞(Mokt)，1.1士0.5%是Gr-Γ炎癥單核細胞(Moif)，而9.5士4.3%是Gr-Γ嗜中性粒細胞(見圖1E)。已經報告了荷瘤宿主通常展現白細胞增多(Serafini等，2004)。因而，還通過FACS分析評估了MMTV-PyMT小鼠外周的白細胞組成，如上所述。與無瘤對照FVB小鼠(4.2士1.IxlO6)相比，在攜帶MMTV-PyMT誘導的腫瘤的小鼠中觀察到外周血單個核細胞(“PBMC”)總數2.3倍的增加(9.7士3.2xl06)(圖2A)。在荷瘤小鼠中觀察到的這種總白細胞增加伴隨有CDllb+髓樣細胞頻率的升高(70.1士15.)，與它們在無瘤對照小鼠中的發生率(19.1士5.5%)相比(圖2B)。總之，總PBMC的增加加上⑶Ilb+細胞頻率的升高導致荷瘤小鼠中外周髓樣細胞8.5倍的增加。這種增加主要是由于嗜中性粒細胞12.5倍的擴增(6.0士1.5x106/mL比對照小鼠中的0.5士0.2xl06/mL)，而Moif和Moet分別只增加了5倍(0.5士0.2xl06/mL比0.1士0.04xl06/mL)和2.5倍(0.5士0.2xl06/mL比0.2士0.IxlO6/mL)。與在對照動物中觀察到的相比，血液中嗜中性粒細胞對單核細胞的比例也略有升高(圖2C)。在正在生長的腫瘤內，血管形成程度是異質的，而且低氧張力的區域是常見的，且常常與壞死有關。為了進一步了解髓樣細胞在腫瘤中的作用，使用免疫熒光染色來關于PyMTtg腫瘤的血管系統定位Moif、嗜中性粒細胞和腫瘤相關巨噬細胞(“ΤΑΜ”)。將來自10-14周齡MMTV.PyMTtg小鼠的腫瘤包埋在OCT溶液中并驟凍。使用標準規程將OCT冷凍腫瘤組織用分別對F4/80(Serotec)、Ly_6C(Pharmingen)或Ly_6G(Pharmingen)(分別用于鑒定1々1^0"或嗜中性粒細胞)，以及內皮標志物⑶31(Pharmingen)(用于顯現組織中的任何血管)特異性的抗體染色(見例如實施例1)。結果顯示于圖1F-H。圖像圖示了F4/80+TAM的定位非常接近內皮細胞和腫瘤的壞死區域(見圖1F)。類似的，檢測到嗜中性粒細胞接近內皮細胞，而且也在腫瘤的壞死區域中(見圖1G)。相反，Moif的定位幾乎完全在腫瘤的壞死區域內或附近(見圖1H)。先前提出單核細胞遷移至腫瘤的低氧區域并分化成巨噬細胞(Yamashire等，1994；Murdoch等，2004)。已知，應答低氧，TAM上調低氧誘導的因子HIF-Ia和HIF_2a的表達，它們繼而改變TAM血管發生、代謝和吞噬活性(Mantovani等，2006；Lewis和Murdoch，2005)。值得注意的是，在體外在低氧條件下培養的Moif和MOif衍生巨噬細胞分泌水平比Moet和Mokt衍生巨噬細胞高得多的VEGF-A(數據未顯示)。實施例2=TAM的表征A.TAM表達⑶Ilc和Langerin且展示專職抗原呈遞細胞的特征巨噬細胞和樹突細胞(“DC”)都有能力捕獲抗原并將它們呈遞給T細胞。為了更好地了解TAM在T細胞應答調控中的作用，評估腫瘤內常常與抗原呈遞有關的基因的表達。依照實施例1中描述的方法對TAM實施針對通常在髓樣或DC細胞上表達的標志物的免疫組織化學分析。大鼠抗？4/80抗體得自561~(^6(3，大鼠抗0)1113抗體得自68108(^61^，而大鼠抗CDllc抗體得自Pharmingen。一般如實施例1中所述實施針對抗人langerin(CD207)的免疫組織化學，但是將組織切片脫蠟并使用LabVision的PT模塊在靶物恢復緩沖液(pH6.0，DakoCytomation)中于99°C進行抗原恢復20分鐘，隨后冷卻20分鐘。山羊抗langerin得自R&DSystems,而生物素化家兔抗山羊IgG得自VectorLabs。有少數例外，大多數組織定居巨噬細胞(例如腹膜巨噬細胞)是⑶llb+F4/80+⑶llc_細胞，而髓樣DC(例如骨髓衍生DC)是⑶llb+CDlIc+細胞且缺乏F4/80表達。令人驚訝的是，觀察到來自PyMT衍生腫瘤的⑶llb+ΤΑΜ不僅在細胞表面處表達F4/80,而且還表達高水平的⑶Ilc(圖3A)。在自匪TV_HER2tg小鼠分離的TAM中觀察到相似的結果(數據未顯示)。來自PyMTtg小鼠的OCT冷凍腫瘤的組織學顯示TAM共表達F4/80和CDllc(圖3B)，這得到了對在體外培養60小時的分離的TAM的免疫熒光研究的進一步證實(圖3C)。同樣令人驚訝的是，來自PyMTtg小鼠的TAM還表達C型凝集素langerin，一種迄今已知主要由LangerhansDC(LhDC)表達的蛋白質(Kissenpfennig和Milissen，TrendsImmunol27132-9，2006；Kaplan等，Immunity23:611-20，2005)(圖3D)。由于鼠和人LangerhansDC(LhDC)的發育依賴TGFβ1信號傳導(Borkowski等，JExpMed184:2417-22，1996Jaksits等，JImmunol163:4869-77,1999)，因此在TAM中調查此細胞因子的表達。事實上，與在bmDC(AAct=1.0士0.06)和腹膜巨噬細胞(ΔAct=39.9士1.6)中觀察到的量相比，TAM表達更高水平的編碼TGFβRl的mRNA(ΔAct=707.3士47.3)。進一步觀察到TAM表達相對較高水平的編碼Runx3(ΤΑΜΔAct=9.8士1.1；bmDCΔAct=1.0士0.06；腹膜巨噬細胞ΔAct=1.02士0.05)和IRF_8(TAMΔAct=7.9士0.6；bmDCΔAct=1.0士0.06；腹膜巨噬細胞ΔΔct=0.98士0.05)的mRNA(圖3E)，這是涉及LhDC發育和TGFi^信號傳導級聯的兩種轉錄因子(Woolf等，DevBiol303:703_14，2007;Schiavoni等，Blood103:2221-8,2004)。Runx3已經顯示出調控⑶lie的表達，而且Runx3.K0和IRF-8.KO這兩種小鼠都是在LhDC生成方面缺陷的(Borkowski等，JExpMed184:2417-22,1996)?？傊?，這些數據提示TGFβ是對所觀察到的TAM生物學重要的一種因子。已知專職抗原呈遞細胞遷移至引流淋巴結以啟動免疫反應。因而，如實施例1所述使用FACS分析與來自無瘤FVB小鼠比較地評估PyMTtg小鼠的腫瘤引流腋窩和臂淋巴結的免疫細胞組成。在來自含瘤小鼠的淋巴結中鑒定出升高數目的CDllb+細胞(圖4Α)以及升高數目的表達F4/80和⑶Ilc的⑶Ilb+細胞(圖4Β)。對此數據的一種非限制性解釋是TAM可能遷移至引流淋巴結以將腫瘤抗原呈遞給其它免疫細胞。實施了比較全基因組微陣列分析來進一步調查TAM和腹膜巨噬細胞與來自FVB對照小鼠的骨髓衍生樹突細胞(“bmDC”)之間的差異。簡言之，使用低RNA輸入熒光線性擴增試劑盒(Agilent)將1微克總RNA轉變成雙鏈cDNA。使用T7RNA聚合酶自cDNA合成cRNA，同時摻入花青3或花青5標記的CTP。將經過標記的cRNA在親和樹脂柱(RNeasyMiniKit，Qiagen)上純化，并通過測量260nm吸光度來定量。通過使用NanoDropND-1000分光光度計(NanoDropTechnologies)測量花青3和花青5標記的CTP的吸光度來測定染料的摻入。通過在斷裂緩沖液(InsituHybridizationKit-Plus；Agilent)中于60°C溫育30分鐘，使750ng花青3標記的cRNA和750ng花青5標記的cRNA斷裂。通過添加含有LiCl和十二烷基硫酸鋰的雜交緩沖液來終止斷裂。將樣品與微陣列于60°C雜交17小時。將陣列用SSC緩沖液清洗并用乙腈干燥。使用微陣列掃描儀(Agilent)掃描陣列。自經紅血球消減的骨髓細胞生成未成熟bmDC，在補充有150ng/mL鼠IL-4和20ng/mL鼠GM-CSF(R&DBiosystems)的RPMI1640培養基(Sigma-Aldrich)中以5xl05細胞/mL于37°C和5%CO2培養6天。隔天取出一半培養基并用新鮮的補充有GM-CSF和IL-4的RPMI1640更換。在第6天，通過FACS分選來分離⑶llb+CDlIc+細胞。自獲自腹膜PBS/EDTA灌洗的單細胞溶液FACS分選F4/80腹膜巨噬細胞。將來自10-14周齡MMTV.PyMTtg小鼠的腫瘤用膠原酶II、IV和DNA酶(Gibco和Sigma)于37°C處理15分鐘。使用抗F4/80PE和抗PEMicroBeads(MiltenyiBiotech)通過磁細胞分選來富集腫瘤相關F4/80^巨噬細胞(ΤΑΜ)。通過流式細胞術驗證了所分選細胞的純度，而且根據磁細胞分選，細胞純度的范圍為大于95%，而根據流式細胞術，細胞純度的范圍為大于98%。在染色之前，將所有細胞用10-20%的適宜血清或純化的IgG封閉。在Vantage或Aria分選儀(BectonDickinson)上用PI排除來進行FACS分選。通過使用Partek基因組套組軟件第6.3版(PartekInc.，St.Louis,MO)在Agilent完整小鼠基因組(WMG)或M1A(巨噬細胞子集的比較)寡聚物微陣列log2比數據(AgilentTechnologiesInc.，SantaClara,CA)上，實施分級聚族(hierarchicalclustering)禾口分分t/(principalcomponentanalysis,PCA)。使用Euclidean距離來測量行或列之間的相異性、使用平均連鎖法(averagelinkagemethod)來計算各簇間的距離，而在分級聚簇中使用“2-Pass”聚簇法。在PCA中，分散矩陣是協方差，而本征矢量是標準化的。使用PartekBatchRemover來消除小鼠株系差異對PCA中數據顯現的影響。在強度圖上，Agilentlog2比的表達值被換算成ζ得分。在那三種細胞類型中表達的基因的熱像顯示了TAM不同于腹膜巨噬細胞和bmDC(圖5A)。還通過三維主成分分析(“PCA”)在統計學上檢查數據以評估三種不同基因表達序型之間的相關性。群體的聚簇顯示了TAM不同于那兩種對照群體，盡管TAM似乎與腹膜巨噬細胞更加相關，勝過與bmDC(圖5B)。圖5C顯示了TAM能與其它巨噬細胞區分開，諸如腹膜巨噬細胞、脾巨噬細胞和KupfTer細胞。還將TAM的形態學與腹膜巨噬細胞和bmDC的比較(圖4C)。TAM和bmDC是具有小細胞核和大細胞質(其中散布有許多液泡)的大細胞。相反，腹膜巨噬細胞在大小方面小得多，而且具有大細胞核和缺乏液泡的均質細胞質。如此，TAM看上去顯著不同于腹膜巨噬細胞，但是類似bmDC。B=TAM展示致耐受性抗原呈遞細胞的特征鑒于上文所述自PyMTtg小鼠分離的TAM與bmDC的形態學相似性及與腹膜巨噬細胞的相異性，實施了這些細胞類型間分子相似性和差異的進一步分析，特別是評估自PyMT腫瘤分離的TAM是否可能充當抗原呈遞細胞。如上所述通過FACS分析測量ΤΑΜ、bmDC和腹膜巨噬細胞中MHCII、共刺激分子⑶80和⑶86、及⑶83(成熟DC的一種標志物)的表達。值得注意的是，TAM以高水平表達MHCII，與在半成熟bmDC上觀察到的相似，而腹膜巨噬細胞只表達中等水平的MHCIK比較圖6A-C中最左邊的小圖)。TAM表達少許至不表達⑶80或⑶83，及中等量的⑶86。靜止的腹膜巨噬細胞表達低水平的⑶80和⑶83，但高水平的⑶86，而bmDC(未成熟與半成熟DC的異質群體)表達低至中等水平的⑶80、⑶83和CD86(圖6A-C)。實施例3=TAM趨化因子和細胞因子譜型為了進一步了解TAM如何影響腫瘤生長和進展以及抗腫瘤免疫應答，評估TAM的細胞因子和趨化因子譜型。如實施例2所述對選定的基因集合實施微陣列分析趨化因子CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL17、CXCLl、CXCL9、CXCL10,CXCL16和KC及細胞因子IL-Iα、IL-Iβ、IL1RA、TNFα、TGFβ和LTβ。腹膜巨噬細胞和TAM展示不同的趨化因子和細胞因子譜型(見表2和圖7Α)。與bmDC相比，TAM生成更大量的編碼某些趨化因子的mRNA，例如CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL17、CXCL1、CXCL9、CXCL10、CXCL16禾口KC(見表2和圖7A)。此類趨化因子表達應當吸引多種淋巴細胞，包括那些通常在腫瘤中找到的，諸如單核細胞、未成熟DC、NK細胞和T細胞。與bmDC相比，在TAM中檢測到水平增強的編碼IL-Iα、IL-Iβ、IL-1RA、TNFα和LTβ的mRNA(數據未顯示)。表2與bmDC相比，TAM中的趨化因子mRNA表達趨化因子表達靶細胞CCL2/MCP-112.4單核細胞，記憶T細胞(CD8)，未成熟DCCCL3/MIP-la37.9單核細胞，NK細胞，記憶T細胞(THl)，未成熟DCCCL4/MIP-lb183.3THlCCL5/RANTES5.0THl，NK細胞，未成熟DCCCL7/MCP-315.2單核細胞CCL8/MCP-25.1單核細胞CCL17/TARC4.0TH2，調節性T細胞CXCL1/MIP-2*5.5單核細胞，NK細胞CXCL9/MIG5.6THlCXCL10/IP-10103.0THl，單核細胞，活化的T細胞(THl，TH2)KC6.2嗜中性粒細胞CXCL16*13.3T細胞*跨膜蛋白；脫落形式起清除受體的作用還實施了與腫瘤細胞、腹膜巨噬細胞和bmDC相比，TAM中基因表達的熱圖分析。使用RNeasy微型試劑盒(Qiagen)依照制造商的指令純化總RNA。使用總RNAPico測定法在Agilent2100Bioanalyzer上評估RNA質量，并使用低RNA輸入熒光線性擴增試劑盒來制備熒光cRNA探針(Agilent)。使用Agilent小鼠MlA微陣列來評估基因表達。用Cy5標記每種細胞類型的6份重復樣品，并用Cy3標記通用小鼠參照(Stratagene)。將750ng經過標記的Cy5和Cy3探針斷裂30分鐘，并將這兩種探針都加載到每個芯片上。于60°C實施過夜雜交，隨后在6xSSC和0.IxSSC中清洗載玻片，接著是乙腈干燥步驟。用設成100的掃描儀靈敏度掃描微陣列。結果顯示了TAM表達水平升高的編碼許多炎性細胞因子(IL-1α、IL-Iβ、TNFα和LTβ)以及抗炎細胞因子(IL-1RA、IL-10和TGFβ1)的mRNA，但低水平的編碼IL-6、TGFii2或TGFii3的mRNA(圖14A)。這些分析還發現TAM展現獨特的細胞因子受體表達樣式，其中IL-4Ra、IL-IORa、IL-IOR^、IL-13Ra、IL-17Ra、TGFβRl禾PTGFβR2/K平升高(圖14B)。TAM還表達水平升高的編碼許多炎癥趨化因子(CCL2、CCL12、CCL3、CCL4、CCL7、CCLl2、CXCLl、CXCL2、CXCL9、CXCLlO、CXCLl1、CXCL14和CXCL16)的mRNA(圖14C)。純化的TAM分泌高水平的CCL3(1.1士0.3ng/ml比腹膜巨噬細胞中檢測不到的量)、CCL5(1.8士0.6ng/ml比腹膜巨噬細胞中檢測不到的量)和CXCLlO(5.5士1.3ng/ml比腹膜巨噬細胞中的1.3士0.3ng/ml)，而CCL2的表達與腹膜巨噬細胞的相似(2.7士1.Ong/ml比3.9士0.9ng/ml)(圖14D)。這種獨特的趨化因子譜型提示TAM活躍地募集淋巴細胞至腫瘤。TAM還表達水平升高的編碼CCR6、CXCR4和CX3CR1(已知由TGFβ1誘導的趨化因子受體)的mRNA(Chen、S.等，Immunology114:565_74，2005;Yang，D.，等，JImmunol1631737-41，1999；Chen,S.，JNeuroimmunol133:46_55，2002)，以及水平升高的CCR2、CCR12和CCR5(圖14E)。實時RT-PCR證實了TAM中存在升高的CCR6mRNA水平(ΤΑΜΔΔct=467.8士332.0；bmDCΔAct=1.0士0·6；腹膜巨噬細胞ΔΔct=6.4士6·1)(圖14F)。為了測試在TAM中觀察到的這種獨特的趨化因子和細胞因子mRNA譜型是否也存在于表達的蛋白質水平，如上所述自PyMTtg小鼠純化TAM，并在培養21小時后評估某些細胞因子和趨化因子蛋白質的生成，與腹膜巨噬細胞中的蛋白質表達比較。如實施例1所述實施FACS分析。將TAM和腹膜巨噬細胞在纖連蛋白包被的圓底96孔板中以2xl06/mL的濃度在RPMI1640培養基中于37°C和5%CO2培養21小時。通過Luminex分析來檢測上清液中分泌的細胞因子。還實施實時RT-PCR分析。用RNeasy試劑盒(Qiagen)分離所分選的免疫細胞的RNA，并用DNA酶I(Sigma)消化。將總細胞RNA逆轉錄并用7700序列檢測系統(AppliedBiosystems)依照制造商的指令通過實時TaqManPCR—式三份地分析。給出所表達基因的任意表達單位，即相對于持家基因GAPDH的表達倍數。針對各種基因的引物是依照標準方案在外顯子/內含子邊界上設計的且自AppliedBiosystems獲得的。結果顯示于圖7B。雖然TAM和腹膜巨噬細胞都分泌中等水平的IL_10(TAM中的0.81士0.13ng/mL比腹膜巨噬細胞中的0.69士0.19ng/mL)，但是TAM生成相對較高水平的TNFa(ΤΑΜ中的0.57士0.12ng/mL比腹膜巨噬細胞中的0.08士0.01)和很低水平的IL-6(TAM中的3.5士0.5ng/mL比腹膜巨噬細胞中的48.5士12.7ng/mL)。另外，TAM分泌低水平的IL-Iα(ΤΑΜ中的0.05士0.01ng/mL比腹膜巨噬細胞中的0.05士0.02ng/mL)，及略微但水平顯著升高的IL-Iβ(0.12士0.04ng/mL比0.05士0.02ng/mL)。趨化因子分析在極大程度上證實了通過上述微陣列分析獲得的獨特的TAM譜型。TAM表達高水平的CCL3(TAM中1.1士0.3ng/mL，腹膜巨噬細胞中檢測不到)；CCL5(TAM中1.8士0.6ng/mL，腹膜巨噬細胞中檢測不到)；和CXCLlO(ΤΑΜ中的5.5士1.3ng/mL比腹膜巨噬細胞中的1.3士0.3ng/mL)的mRNA(圖7B)。TAM中的CCL2mRNA表達與腹膜巨噬細胞的相似(ΤΑΜ中的2.7士1.Ong/mL比腹膜巨噬細胞中的3.7士1.Ong/mL)，而KCmRNA表達是降低的(ΤΑΜ中的6.4士0.7ng/mL比腹膜巨噬細胞中的18.6士6.9ng/mL)(圖7B)。PyMTtg衍生ΤΑΜ、腹膜巨噬細胞、bmDC和腫瘤細胞中TGFi31表達實時PCR分析顯示了TAM具有該細胞因子的最高表達(圖7C)。TGF^、IL-10和TNFa中等表達與非常低水平IL-6的組合提示TAM可能具有免疫抑制特性。此外，觀察到的TAM趨化因子譜型提示TAM可能能夠通過分泌極其多種趨化因子來調控在腫瘤中觀察到的白細胞浸潤物。文獻中認可的M1/M2范例(見Mantovani等，TrendsImmunol25(12):677_86，2004；Gordon,NatRevImmunol3(1):23_35，2003)提示經典炎癥條件下(IFNγ/LPS)或可變(alternatively)活化條件(IL-4/IL-13)下的巨噬細胞分化成具有獨特功能特性的專門化子集(subset)(Ml或M2)。已經提出經典Ml巨噬細胞支持炎癥反應，而M2巨噬細胞刺激富含抑制性IL-10和TGFii的微環境的形成。文獻中將TAM分類成“可變活化的(alternativelyactivated)"M2giliffllfi(MantovaniTrendsImmunol23:549-55,2002;Sica等，EurJCancer42:717_27，2006)。對與Ml或M2表型有關的分子的mRNA表達譜型的熱圖分析發現TAM表達與中性腹膜巨噬細胞相比mRNA水平升高的某些M2相關分子(ScaRB、MRl、CD14、CD163、Fizzl、IL-IRII和IL-1RA)，但缺乏其它M2相關分子的表達(Mgl1、Mgl2、ScaRA、MR2、FceRII、Argl、Yml、CCL17、CCL22和CCL24)，而且還表達mRNA水平升高的Ml相關分子(IL-Ιβ、FcRIa、FcRIIb、FcRIIIa、CCL2、CCL3、CXCL9、CXCL10、CXCLll和CXCL16)(圖15A-B)。這些觀察到的細胞因子和趨化因子譜型證明了TAM(雖然分泌抑制性細胞因子)不同于M2巨噬細胞。TAM顯示許多炎癥Ml特征，諸如TNFa和IL-Iβ的生成及FcRl、FCRIIb和FcRIIIa的表達。TAM分泌許多對例如NK細胞有趨化性的炎癥“Ml”CC和CXC趨化因子，但是沒有吸引TH2或T調節性細胞的經典M2趨化因子CCL17、CCL22和CCL24。實施例4=TAM在體外對T細胞的影響為了調查上文所述TAM特性是否反映TAM與T細胞的相互作用，評估了TAM誘導幼稚T細胞增殖和細胞因子分泌的能力，與腹膜巨噬細胞和bmDC的T細胞誘導活性比較。雖然PyMTtg腫瘤模型模擬人轉移性乳腺癌形成的許多方面，但是它也需要FVB背景，使之難以實施抗原特異性T細胞研究。事實上，采用了與選定免疫細胞和CFSE標記的CD4+T細胞的體外共培養。自FVB小鼠的脾和外周淋巴結制備幼稚CD4+T細胞。將單細胞懸浮液MACS消減CD25+、CD69+和CD103+細胞(eBioscience和MiltenyiBiotech)。用CD4-MicroBeads(MiltenyiBiotech)富集陰性級分中的CD4+T細胞，并通過FACS分選來分離CD62L+CD45RbhighCD25XD69XD103"幼稚CD4+T細胞(所有抗體均來自eBioscience或Pharmingen)。如下研究由ΤΑΜ、腹膜巨噬細胞或bmDC誘導的T細胞增殖，即與IxlO5個幼稚T細胞和0.5μg/mL抗⑶3抗體一起培養2xl04個ΤΑΜ、腹膜巨噬細胞或bmDC。在纖連蛋白包被的圓底96孔板中于37°C5%CO2培養細胞。培養5天后，將細胞上清液冷凍于_80°C，供使用標準規程通過ELISA測定法進行的細胞因子分析用。用Lincoplex試劑盒(Linco)遵循制造商的指令在培養物上清液中檢測到GM-CSF、G-CSF、MIP-Iα、MCP-I、RANTES、ΙΡ-10、KC、IL-Iα、IL-Iβ、IL—2、IL—4、IL—5、IL—6、IL—10、IL—13、IL—17、IFNy禾口TNFα。通過FACS檢查到T細胞增殖。CSFE稀釋度的測量顯示TAM以與專職抗原呈遞細胞腹膜巨噬細胞和bmDC所誘導的相當的水平誘導T細胞增殖(數據未顯示)。與bmDC相反，TAM引發的T細胞分泌高水平的IL-IO(ΤΑΜ引發的細胞中的2.5士0.4ng/mL比bmDC引發的細胞中檢測不到)和IFNy(ΤΑΜ引發的細胞中的5.6士1.2ng/mL比bmDC引發的細胞中的0.2士0.Ing/mL),以及很低水平的IL-2(TAM引發的細胞中的0.3士0.Ing/mL比bmDC引發的細胞中的5.4士0.6ng/mL)，且不表達IL_4(ΤΑΜ引發的細胞中檢測不到比bmDC引發的細胞中的0.2士0.Ing/mL)(圖8A)。與bmDC的非常高的IL-4誘導(2.7士0.2ng/mL)相比，TAM不能在幼稚⑶4+T細胞中誘導IL-4，該無能在11的比例時更加顯著，顯示由TAM引發引起的IL-4誘導的幾乎完全缺失(0.2士0.02ng/mL)(圖8A)。用TAM或bmDC刺激的T細胞表達可比水平的IL-5、IL-13和TNFα(數據未顯示)。這種來自被TAM活化的⑶4+Τ細胞的細胞因子分泌樣式提示TAM誘導IL-IO+TrlT細胞。TAM還誘導高水平的IL_17(TAM引發的T細胞中的1.6士0.6ng/mL比bmDC引發的T細胞中的0.7士0.Ing/mL)(圖8A，右邊的小圖)。為了證實那些T細胞細胞因子是由T細胞分泌的，將TAM和其它免疫細胞活化的CD4+T細胞培養物(如上所述)固定并針對每種主要細胞因子胞內染色。簡言之，將與ΤΑΜ、腹膜巨噬細胞或bmDC—起培養5天的T細胞用50ng/mLPMA和750ng/mL伊屋諾霉素再刺激6小時，最后4小時添加5μg/mL布雷菲德菌素A(BrefeldinΑ)，然后用封閉劑處理并針對⑶4表面染色。然后將細胞固定并使用FastlmmuneCD4胞內細胞因子檢測試劑盒(BD)依照制造商的指令針對IL-4、IL-10和IL-17的胞內表達染色。如實施例1所述實施FACS分析。如圖8B所示，TAM引發的⑶4+T細胞分泌高水平的IL-10和IL-17及水平降低的IL-2，而且這種分泌依賴于TAM的TGFii分泌。通過重組TGFi3RII來中和TGF^導致IL-10(27.4士22.)和IL-17(79.4士9.9%)表達的降低及IL-2分泌的升高(259.9士68.0%)(圖8C)。此數據與上述發現一起證實了TAM有可能在那些培養物中誘導IL-IO+Trl和IL-17+CD4+T細胞。顯示了TAM有可能誘導至少一種某些調節性T細胞子集后，實施實驗來確定TAM是否能夠誘導FoxP3+調節性T細胞。為了評估FoxP3誘導，在纖連蛋白包被的圓底96孔板中于37°C和5%CO2與IxlO5個幼稚CDSE+T細胞(CD25XD69TD103XD45Rb高CD62L高和FoxP3幾乎陰性(0.3%FoxP3+))和0.002yg/mL抗CD3抗體一起培養2xl04個TAM或bmDC。5天后，使用對小鼠和大鼠FoxP3特異性的偶聯抗體(eBioscience)遵循制造商的指令分析⑶4+T細胞的胞內FoxP3表達。結果顯示于圖9。與bmDC活化的⑶4+T細胞相反，TAM活化有利于調節性T細胞的誘導，正如TAM處理的培養物中3.3士0.9%FoxP3+T細胞的存在所證明的，而bmDC處理的培養物只顯示0.8士0.5%的FoxP3+T細胞(見圖9A)。用TAM活化的T細胞中的FoxP3誘導也依賴于TAM的TGFβ生成，因為用重組TGFβRII中和TGFβ將TAM處理的T細胞中的FoxP3表達降低幾乎80%，至FoxP3+T細胞的0.7士0.2%(圖9B)。為了證實TAM誘導的FoxP3+T細胞具有調控能力，將細胞針對已知在天然存在的FoxP3+調節性T細胞上表達的蛋白質染色。已知與其它⑶4+T細胞相比，GITR在FoxP3+調節性T細胞以更高水平表達(McHugh等，Immunity16=311-23,2002)TAM誘導的T細胞還具有高水平的GITR表達(圖9C)，提示那些細胞是具有調控能力的FoxP3+T細胞。而且，有些TAM誘導的FoxP3+T細胞(大約6.3%，見圖9D)表達低水平的⑶103(—種已知在體內在外周誘導的調節性T細胞上表達的標志物)，進一步提示TAM誘導的FoxP3+T細胞是具有調控特性的調節性T細胞。為了闡明TAM不僅在分離后刺激幼稚T細胞集合中剩余的少數FoxP3+T細胞(0.3%，見圖10Α)擴增，而且還誘導FoxP3+T細胞，在相同條件下刺激脾細胞，其含有⑶4+Τ細胞集合中8.7士0.2%FoxP3+細胞。如圖IOC所示，FoxP3+T細胞集合為2.2士1.5%，提示TAM能夠直接誘導FoxP3+調節性CD4+T細胞。使用T調節性細胞代替脾細胞來重復實驗，而且結果是相同的(比較圖IOD和10C)。還評估了不同抗原呈遞細胞對幼稚⑶4+T細胞的刺激能力。如圖IOB所示，bmDC、TAM和腹膜巨噬細胞中每一項都能夠以相似程度刺激CFSE標記的幼稚⑶4+T細胞。如此，TAM對FoxP3+T細胞的誘導不是由于TAM相對于其它抗原呈遞細胞在T細胞誘導方面的一般性升高。實施例5=TAM在體內對T細胞的影響組合來自前述實施例的數據提示TAM在體外誘導IL-IO+和FoxP3+調節性T細胞以及IL-17+THiw7⑶4+T細胞。為了評估誘導此類細胞群體的體內關聯性，測定了那些細胞子集在體內的存在和定位。使用標準技術自PyMTtg小鼠制備腋窩和臂淋巴結的單細胞懸浮液。如先前所述，將細胞懸浮液再刺激6小時，然后用對⑶4、IL-4、IL-10和IL-17特異性的抗體染色。與體外數據很好的一致，在體內檢測到IL-4-和IL-10+CD4+Trl細胞以及IL-17+CD4+T細胞(圖11A)。在來自年齡匹配的對照FVB小鼠衍生的腋窩和臂淋巴結的CD4+T細胞中沒有檢測到這些細胞因子的顯著表達(圖11B)。有趣的是，所有生成細胞因子的⑶4+T細胞只表達一種所調查的細胞因子(即或是IL-10或是IL-17，而非兩者)。還調查了腫瘤模型小鼠對FVB小鼠中調節性FoxP3+⑶4+T細胞的體內發生頻率。與FVB對照相比，在PyMTtg小鼠的腫瘤引流腋窩和臂淋巴結中觀察到FoxP3+CD4+T細胞的顯著增加(8.6士0.9%比6.3士1.2%，p=0.033)(圖11C)。與FVB對照相比，在PyMTtg小鼠的脾中觀察到FoxP3+CD4+T細胞的顯著增加(12.3士5.4%比7.6士0.5%，ρ=0.027)(圖lie)。在PyMTtg小鼠的腫瘤中觀察到很高頻率的FoxP3+⑶4+Treg細胞(19.O士7.8%)(圖11C)。實施例6=TAM展示與脂肪組織巨噬細胞的類似性最近報告了F4/80+脂肪組織巨噬細胞(ATM)能在有些情況中獲得⑶lie表達(Lumeng等，JClinInvest117:175_84，2007)，非常像上文證明TAM如此的研究。由于某些疾病(諸如糖尿病)與輕度但慢性炎癥有關(Neels和01efsky，JClinInvest11633-5，2006)，進行TAM與ATM細胞群體的比較以更好地了解ATM是否促成此慢性炎癥，非常像上文提示TAM促成腫瘤生物學的結果。通過自6周齡開始用由60kcal%脂肪組成的高脂肪食譜(HFD)喂養20周，使得飲食誘發的肥胖C57BI/6雄性小鼠(JacksonLaboratory)對胰島素耐受。還獲得了Db/db小鼠以及年輕的或年齡匹配的對照小鼠(喂養由IOkcal%脂肪組成的標準食譜)。使用來自腋窩和臂腫瘤引流和腹股溝脂肪引流淋巴結的RBC溶解的單細胞懸浮液進行FACS分析。簡言之，自來自FVB或C57BI/6對照小鼠脾、外周和腸系膜淋巴結的RBC溶解的單細胞懸浮液制備幼稚⑶4+T細胞。將細胞首先MACS消減⑶25+、⑶69+和⑶103+細胞，然后用CDOicrobeads(MiltenyiBiotech)富集。最后，通過FACS分選來分離CD62L+CD45Rbhigh⑶25XD69TD103-幼稚⑶4+T細胞。如前述實施例所述實施FACS和RT-PCR實驗。對通過離心自組織樣品收集的新鮮分離的ATM、TAM和腹膜巨噬細胞實施顯微術研究，并使用標準技術用蘇木精和曙紅染色劑染色。結果顯示于圖12。喂養高脂肪食譜5個月的雄性C57BI/6小鼠在它們的附睪脂肪組織中展示高比例的髓樣細胞，正如年齡匹配的對照小鼠(HFD:35.9±6.7%(圖12A)；年齡匹配的對照小鼠32.9士7.(數據未顯示))。然而，2月齡雄性C57BI/6小鼠在它們的附睪脂肪組織中展示顯著更低比例的⑶Ilb+細胞(15.5士11.0%，η=4(數據未顯示))。驗證較早的發現(Lumeng等，JClinInvest117:175_84，2007)，發現脂肪組織中32.9士6.7%的F4/80+ATM還共表達⑶1Ic(圖12Β)，而自喂養正常食譜的年齡匹配的或2月齡的小鼠的附睪脂肪組織分離的巨噬細胞顯示很少的CDllc表達(數據未顯示)。另外，發現ATM還表達高水平的MHCII和低水平的⑶86，與上文對TAM的發現相似(圖12B)。也在ATM群體中檢查在上述研究中鑒定的別的TAM表面標志物。發現ATM和TAM具有相似的⑶14表達水平，但是ATM缺少ICOSL和TIM3表達，二者都在TAM上顯示中等至強的表達(比較圖12C和12D)。值得注意的是，自喂養高脂肪食譜20周的雄性C57BI/6小鼠純化的ATM的細胞因子和趨化因子譜型與TAM的相似。這些特定ATM表達高水平的IL-IO(0.84士0.01ng/ml比腹膜巨噬細胞中觀察到的0.47士0.18ng/ml)、中等水平的IL_6(10.9士7.9ng/ml比腹膜巨噬細胞中觀察到的38.1士30.6ng/ml)和低水平的TNFa(0.13士0.04ng/ml比腹膜巨噬細胞中的0.13士0.06ng/ml)(圖12E)。還發現ATM分泌高水平的CCL2(5.9士1.8ng/ml比腹膜巨噬細胞中觀察到的4.3士2.7ng/ml)和CXCL10(23.5士8.lng/ml比腹膜巨噬細胞中觀察到的28.7士16.5ng/ml)、但低水平的CCL3(0.97士0.57ng/ml比腹膜巨噬細胞中檢測不到的量)和CCL5(0.2士0.2ng/ml比腹膜巨噬細胞中檢測不到的量)(見圖12E)。此外，ATM表達相似水平的TGFβ！和略微更低水平的TGFβRl(比TAM低3.6倍，但比腹膜巨噬細胞高4.9倍(圖12F)。然而，與TAM形成鮮明對比，ATM不表達Runx3或IRF-8(數據未顯示)，這與ATM中Iangerin表達的缺失相關。顯微術研究進一步提示ATM和TAM的形態學彼此相似，但是不同于腹膜巨噬細胞形態學(圖12G)。TAM和ATM的大小都是大的，具有小的細胞核和大的具液泡的細胞質(見圖12G)。結果指明了F4/80+CDllc+巨噬細胞不是限于特殊微環境的獨特免疫細胞子集，而是表征了炎癥組織中存在的巨噬細胞新子群。另外，此巨噬細胞子群自身由至少兩種具有不同細胞因子表達和細胞表面標志物表達的亞型組成。實施例7=ATM對CD4+T細胞的影響上述實施例證明了TAM能夠誘導FoxP3+調節性T細胞(見圖10A)。進行相似的實驗來測定肥胖高脂肪食譜(HFD)喂養的小鼠中FOXP3+CD4+T細胞的呈現是否升高及ATM是否類似地能夠誘導FoxP3+調節性T細胞。用相應的組織和抗⑶3活化幼稚FoxP3TD4+T細胞。將IxlO4個來自肥胖小鼠的脂肪組織巨噬細胞(ATM)與0.002μg/mL抗CD3(BDBioscience)和5xl04個幼稚CD4+T細胞一起分配入圓底96孔板并以200μL終體積(完全RPMI1640，于37°C，5%CO2)培養。5天后，收獲⑶4+T細胞并分析FoxP3表達。為了確定ATM是否誘導FoxP3+調節性T細胞，將2xl04個CDllc+ATM、腹膜巨噬細胞或瘦脂肪組織巨噬細胞(leanfattissuemacrophage,LTM)與IxlO5個幼稚FoxP3+CD4+T細胞和0.002μg/ml抗⑶3—起培養5天。隨后將細胞固定并對FoxP3染色，或者收獲培養物上清液并測試IL-2、IL-4、IL-10和IL-17的存在。如實施例3所述實施熱圖分析。為了證實CCL2、CCL3、CCL5和CXCLlO的差異表達，在沒有進一步刺激的情況中以2xl06/ml濃度培養來自野生型FVB小鼠的腹膜巨噬細胞或PyMTtg衍生ΤΑΜ。21小時后分析分泌入上清液中的趨化因子。如實施例3所述實施實時RT-PCR。如實施例4所述實施白介素測量。與腫瘤中的免疫浸潤物相似，與年齡匹配的對照相比，來自肥胖HFD小鼠的附睪脂肪組織含有顯著更高百分比的FoxP3+⑶4+Τ細胞(18.5士6.2%比對照中的7.9士3.7%；見圖131)。此外，與年齡匹配的對照相比，來自肥胖HFD小鼠的脂肪引流淋巴結也含有顯著更高水平的FoxP3+CD4+T細胞(17.2士3.3%比對照中的13.4士0.6%；見圖13J)。如圖13A所示，⑶Ilc+ATM能夠誘導FoxP3+調節性T細胞，但腹膜巨噬細胞或瘦脂肪組織巨噬細胞不行(8.3士1.7%的活化的幼稚T細胞；比較左邊的小圖與中央的和右邊的小圖)。此體外數據得到了體內數據的進一步支持。如在荷瘤小鼠中觀察到的，在肥胖Db/Db小鼠的脾(23.6士1.6%比對照中的14.4士1.6%)以及附睪脂肪組織(24.9士6.2%比對照中的8.5士1.3%)(已知ATM普遍升高的組織)⑶4+T細胞中檢測到水平升高的FoxP3+T調節性細胞(圖13C和13D)。由于已知ATM表達TGFi3i(—種先前已經顯示對于調節性T細胞分化重要的細胞因子)，因此評估了此細胞因子對FoxP3+細胞的ATM誘導的影響。通過將TGFβRII-Fc摻入測定法中來阻斷TGFβ幾乎完全抑制⑶llc+ΑΤΜ對FoxP3+T細胞的誘導(2.2士0.的活化的幼稚T細胞)(圖13B)。還評估了⑶Ilc+ATM誘導其它類型T細胞的能力。如圖13E所示，⑶llc+ΑΤΜ活化幼稚T細胞，不僅包括FoxP3+調節性T細胞群體，而且它們還展示Trl和TH17細胞因子譜型。具體而言，⑶Ilc+ATM活化幼稚T細胞，分泌高水平的IL-10(0.5士0.lng/ml比用腹膜巨噬細胞活化的T細胞中的0.6士0.15ng/ml)及很低水平的IL-2(0.02士0.0lng/ml比用腹膜巨噬細胞活化的T細胞中的0.1士0.04ng/ml)和IL_4(0.1士0.03ng/ml比用腹膜巨噬細胞活化的T細胞中的0.1士0.03ng/ml)。另外，ATM誘導T細胞中表達的高水平的IL-17(1.6士0.6ng/ml比用腹膜巨噬細胞活化的T細胞中的3.4士0.2ng/ml)。對ATM誘導的T細胞培養物樣品的FACS分析證實了ATM刺激自幼稚T細胞培養物誘導Trl和TH17T細胞(圖13F)。另外，用⑶Ilc+ATM刺激的幼稚T細胞分泌顯著量的TNFα、IL-5和IL-13(圖16Β)。與上文在PyMTtg小鼠上進行的實驗的結果類似，與對照小鼠相比，在喂養高脂肪食譜的肥胖小鼠的脂肪引流淋巴結中檢測到升高水平的生成IL-10(1.0士0.2%比對照中的0.3士0.1%)和IL-17(0.6士0.2%比對照中的0.3士0.1%)的細胞(圖13G和13H)。雖然CDllc+ATM和CDllc+TAM在炎癥條件下的表現似乎相似，但是PCA分析揭示了ATM和TAM是組織巨噬細胞中不同的細胞群體(圖17)。上述實施例中顯示了TAM不適合規范的Ml或M2巨噬細胞范疇，盡管文獻中有相反的報告(見實施例3)。文獻中提示ATM展示Ml表型(Lumeng等，JClinInvest117175-84,2007)。事實上，本文所示結果提示ATM分泌IL-10、TGFβ和IL-1RA，而且表達Mgll、Mgl2、⑶14和⑶163(M2表型的典型特征)。這些結果還清楚地顯示ATM誘導抑制性調節性T細胞以及炎癥TH17細胞的生成，如此，ATM跨越Ml和M2兩類巨噬細胞的特性，與TAM非常相似。實施例8CD11c+ATM與CDlIcTATM之間的功能差異如實施例3所示，TAM展示特征性細胞因子表達譜型。檢查了⑶llc_和⑶Ilc+ATM的細胞因子表達譜型。如上所述，自飲食誘發的肥胖C57BI/6雄性小鼠純化⑶Ilc+和CDllc_ATM，并在培養21小時后評估每種細胞群體中某些細胞因子和趨化因子蛋白質的生成。如實施例1所述實施FACS分析。將ATM在纖連蛋白包被的圓底96孔板中以2xl06/mL濃度在RPMI1640培養基中于37°C和5%CO2培養21小時。通過Luminex分析來檢測上清液中分泌的細胞因子。結果顯示于圖18。與⑶Ilc+ATM相比，⑶llc_ATM顯示更高的CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、IL-6、IL-10、TNFα和G-CSF表達水平。然而，CD11c+ATM顯示比CD11(ΓΑΤΜ更高的VEGF表達水平。M-CSF、IL-Ib、MIG/CXCL9、MIP-2/CXCL2、RANTES和KC/CXCL1水平在CDIIcTATM與CDllc+ATM之間是相似的，而且CDlIcTATM和CDllc+ATM都不表達IL-Ia或eotaxin(數據未顯示)。此數據進一步指明了基于它們不同的細胞因子表達譜型，⑶1ΓΑΤΜ和CDll+ATM是不同的細胞群體，有可能具有不同的生理學功能。如實施例4所述，TAM自幼稚T細胞群體誘導FoxP3+T細胞。為了調查CDllc—ATM和CDllc+ATM的T細胞引發潛力，在圓底96孔板中以0.5μg/mL抗CD3和5x104個幼稚CD4+T細胞培養IxlO4個⑶llc_或CDllc+ATM，終體積200μL。為了促進ATM和幼稚T細胞的存活，可以事先用重組鼠纖連蛋白包被96孔板，或者向培養物添加重組人IL-2。5天后，收獲上清液并在分析前保存于-80°C。稍后通過細胞因子ELISA(Lincoplexkits(Linco)，依照制造商的指令)在融化的上清液中檢測到上清液中的細胞因子和趨化因子。為了評估CD4+T細胞中的細胞因子生成，將引流淋巴結或培養細胞的單細胞懸浮液用PMA/伊屋諾霉素再刺激6小時，最后4小時添加布雷菲德菌素A。在對細胞染色之前，用適宜的血清或純化的IgG封閉細胞。獲取包括PI排除(表面染色)且是在FACSCalibur或LSRII(BectonDickinson)上實施的，并用JoFlo軟件(TreeStar)分析。結果描繪于圖19A和19B。⑶llc—ATM誘導T細胞，相對于未刺激的T細胞，IL-4、TNFa、CCL5、IFNy和IL-17表達略微升高，而IL-13、IL-10和IL-5表達升高大得多(IL-6表達升高超過25倍)。CDllc+ATM誘導T細胞，相對于未刺激的T細胞，IL-4、IL-13、IL10、TNFα、CCL5和IFNγ表達有輕微至中等升高，而IL-17和IL-6表達升高大得多(IL-6表達升高超過30倍)。⑶llc_ATM誘導的T細胞與⑶Ilc+ATM誘導的T細胞之間細胞因子/趨化因子表達水平樣式的比較證明了，與⑶Ilc+ATM誘導的細胞相比，⑶llc_ATM誘導的細胞展示實質性更高的IL-10和IL-13表達，相似的IL-4、TNFα、CCL5和IFNγ表達，及實質性降低的IL-17和IL-6表達(見圖19Α禾口19Β)。此結果進一步證明了⑶llc_ATM和CDllc+ATM是兩種不同的細胞群體，具有不同的生理學功能。實施例9=ATM對Thl比Th2細胞的誘導樹突細胞活化⑶4+T細胞以分化成Thl或Th2細胞的一種方法是通過它們表面上C型凝集素分子與幼稚CD4+T細胞的相互作用。某些C型凝集素可偏向于誘導Th2細胞，例如SIGN-Rl和DC-SIGN(Wieland等，MicrobesInfect.(2007)9134-41；Soilleux等，J.Pathol.(2006)209182-9；Bergman等，J.Exp.Med.(2004)200979~90；Ryan等，J.Immunol.(2002)1695638-48；及Hart禾口vanKooyk,TrendsImmunol.(2004)7353-359)。因為ATM具有巨噬細胞和樹突細胞二者的特征，所以調查了ATM中這些C型凝集素中某些的表達。簡言之，如實施例2所述使用微陣列分析實施⑶Ilc+ATM和⑶llc_ATM細胞群體中DC-SIGN(CD209a)、SIGN-Rl(CD209b)和SIGN-R2(CD209c)mRNA表達的微陣列分析。依照實施例1所列方案實施ATM細胞混合群體中SIGN-Rl蛋白質表達的FACS分析。⑶11(ΓΑΤΜ和⑶11C+ATM中各種C型凝集素的mRNA表達的微陣列分析揭示了CDllc_ATM表達顯著比CDlIc+ATM更大量的、DC-SIGN，SIGN-Rl和SIGN-R2每一種的mRNA(見圖20A)。所表達蛋白質的FACS研究顯示了取自用正常食譜喂養的正常8周齡BI6小鼠(即非肥胖小鼠)淋巴結的免疫細胞含有顯著數目的表達SIGN-Rl的⑶11_細胞(圖20B，左小圖)。然而，來自用高脂肪食譜喂養24周的BI6小鼠(即肥胖小鼠)的樣品含有顯著更大數目的⑶Ilc+細胞，其中少于10%表達SIGN-Rl(圖20B，右小圖)?？傊?，此數據提示用HFD喂養的小鼠中炎性ATM(CDlIc+DC-SIGN-)細胞群體增加，而抗炎ATM(CDllc_DC_SIGN+)細胞群體減少。實施例10不同ATM群體對T細胞的引發如下調查了⑶llc_和⑶Ilc+ATM的T細胞引發潛力，即在圓底96孔板中以mL抗⑶3和5x104個幼稚⑶4+T細胞培養IxlO4個⑶IlcT和⑶llc+ATM，終體積200μL。為了促進ATM和幼稚T細胞的存活，可以用重組鼠纖連蛋白包被96孔板，或者可以向培養物添加重組人IL-2。通過添加10μg/mL抗SIGN-Rl或10μg/mL重組人ICAM-3來阻斷SIGN-Rl信號傳導。生長5天后，收獲培養物上清液并在分析前保存于-80°C。在融化的上清液中通過前述實施例所述細胞因子ELISA(即使用Lincoplex試劑盒依照制造商的指令)能檢測到上清液中的細胞因子和趨化因子?？傊@些實驗顯示了TAM展示專職致耐受性APC的表型且能誘導IL_10+Trl、FoxP3+T調節性細胞和TH17T細胞。TAM與ATM共享某些表型和功能類似，提示組織巨噬細胞在各式各樣的炎癥條件下獲得一些與TAM相似的特征(且仍保留一些區別特征)。ATM與TAM之間的共性可能有助于解釋在小鼠和人中觀察到的肥胖與致癌作用之間相關性(Yakar等，Endocrinologyl47(12):5826_34，2006；Calle等，NEnglJMed348(17)1625-38,2003)，及2型糖尿病與升高10-20%的乳腺癌風險的相關性(Wolf等，LancetOncol.6(2)103-11，2005)。在這兩種疾病中，輕度但慢性的炎癥伴隨有患病組織中巨噬細胞的顯著積累(Balkwill和Mantovani，Lancet,357(9255):539_45，2001；Neels禾口Olefsky,JClinInvest116:33_5，2006)，而且研究已經將數目增加的組織巨噬細胞和慢性炎癥與腫瘤進展(Mantovani等，ImmunolToday13265-70,1992；Pollard,NatRevCancer471-8,2004)或胰島素耐受性(Kamei等，JBiolChem281:26602_14，2006；Weisberg等，JClinInvest116(1):115_24，2006；；Arkan等，NatMed11:191_8，2005)聯系起來。類似的，在實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)(另一種慢性炎癥模型)中已經記載了CDllc+F4/80+髓樣DC的存在(Ponomarev等，JNeurosciRes81:374_89，2005；Fischer和Reichmann,JImmunol166:2717_26，2001；Miller等，AnnNYAcadSci1103179-91,2007)。雖然作者陳述了所指明的免疫細胞是樹突細胞，鑒于來自上述實施例的結果，它們可能是活化的巨噬細胞。另外，發現肺泡巨噬細胞(在患有輕度但持久炎癥的肺組織中找到的一個定居組織巨噬細胞子集)也表達⑶lie(Padilla等，JImmunol174(12)8097-105，2005;Fulton等，InfectImmun72(4):2101_10，2004)。雖然尚未證明那些肺泡巨噬細胞上的F4/80表達，但是肺泡微環境富含促炎和抗炎細胞因子，鑒于前述實驗的結果，它們可能誘導此專門的組織定居巨噬細胞子集的分化。部分參考文獻列表Arkan,M.C.,Hevener,A.L.,Greten,F.R.,Maeda,S.,Li,Z.W.,Long,J.Μ.,Wynshaw-Boris,Α.,Poli,G.,Olefsky,J.,andKarin,Μ.:IKK_betaIinksinflammationtoobesity-inducedinsulinresistance.NatMed11191-8,2005Bailey,S.L.，Schreiner,B.，McMahon,Ε.J.，andMiller,S.D.:CNSmyeloidDCspresentingendogenousmyelinpeptides'preferentially'polarizeCD4+T(H)-17cellsinrelapsingEAE.NatImmunol8:172_80，2007Balkwill,F.,Mantovani,A.:Inflammationandcancer:backtoVirchow？,Lancet2001,357(9255):539_45Bates,G.J.,Fox,S.B.,Han,C.,Leek,R.D.,Garcia,J.F.,Harris,A.L.,andBanham,A.H.:QuantifixationofregulatoryTcellsenablestheidentificationofhigh-riskbreastcancerpatientsandthoseatriskoflaterelapse.JClinOncol245373-80,2006Bettelli,Ε.,Carrier,Y.,Gao,W.,Korn,Τ.,Strom,Τ.B.,Oukka,Μ.,Weiner,H.L.,andKuchroo,V.K.:ReciprocaldevelopmentalpathwaysforthegenerationofpathogeniceffectorTH17andregulatoryTcells.Nature441:235_8,2006Beyer,M.andSchultze,J.L.:RegulatoryTcellsincancer.Blood108804-11，2006Bingle,L.,Brown,N.J.,andLewis,C.E.Theroleoftumour—associatedmacrophagesintumourprogressionimplicationsfornewanticancertherapies.JPathol196:254-65,2002Borkowski,Τ.A.,Letterio,J.J.,Farr,A.G.,andUdey,M.C.:Aroleforendogenoustransforminggrowthfactorbeta1inLangerhanscellbiologytheskinoftransforminggrowthfactorbeta1nullmiceisdevoidofepidermalLangerhanscells.JExpMed184:2417_22，1996Calle，Ε.Ε.，Rodriguez,C.，Walker-Thurmond，K.，Thun,Μ.J.Overweight,obesity,andmortalityfromcancerinaprospectivelystudiedcohortofU.S.adults，NEnglJMed2003,348(17)1625-38Chen，S.，Luo,D.，Streit，W.J.，andHarrison，J.K.:TGF_betalupregulatesCX3CRlexpressionandinhibitsfractalkine—stimulatedsignalinginratmicroglia.JNeuroimmunol13346-55,2002Chen,S.，Tuttle，D.L.，Oshier,J.T.，Knot,H.J.，Streit,W.J.，Goodenow,Μ.M.，andHarrison,J.K.-Transforminggrowthfactor—betalincreasesCXCR4expression，stromal一derivedfactor-1alpha-stimulatedsignallingandhumanimmunodeficiencyvirus-1entryinhumanmonocyte-derivedmacrophages.Immunology114:565_74，2005Chen，X.，Baumel,Μ.，Mannel,D.N.，Howard,0.Μ.，andOppenheim，J.J.InteractionofTNFwithTNFreceptortype2promotesexpansionandfunctionofmouseCD4+CD25+Tregulatorycells.JImmunol179:154_61，2007Cho,H.J.，Shashkin，P.，Gleissner,C.Α.，Dunson，D.，Jain,N.，Lee,J.K.，Miller，Y.，andLey,K.Inductionofdendriticcell-likephenotypeinmacrophagesduringfoamcellformation.PhysiolGenomics29:149—60，2007Choudhury,R.P.，Lee,J.M.，Greaves,D.R.:Mechanismsofdiseasemacrophage-derivedfoamcellsemergingastherapeutictargetsinatherosclerosis.NatClinPractCardiovascMed2005，2(6):309_15Cua，D.J.andKastelein，R.A.:TGF_beta，a'doubleagent'intheimmunepathologywar.NatImmunol7:557_9，2006Curiel，T.J.，Coukos，G.，Zou，L.，Alvarez,X.，Cheng，P.，Mottram，P.，Evdemon-Hogan,Μ.，Conejo—Garcia，J.R.，Zhang，L，Burow,Μ.，Zhu,Y.，Wei，S.，Kryczek,I.，Daniel，B.，Gordon，Α.，Myers,L，Lackner,Α.，Disis，Μ.L，Knutson，K.L，Chen，L，andZou,W.:SpecificrecruitmentofregulatoryTcellsinovariancarcinomafostersimmuneprivilegeandpredictsreducedsurvival.NatMed10:942_9，2004Denning，T.L，Wang,Y.C.，Patel,S.R.，Williams,I.R.，andPulendran,B.Laminapropriamacrophagesanddendriticcellsdifferentiallyinduceregulatoryandinterleukin17-producingTcellresponses.NatImmunol8:1086_94，2007Fain，J.N.，Tichansky,D.S.，andMadan,A.K.-Transforminggrowthfactorbetalreleasebyhumanadiposetissueisenhancedinobesity.Metabolism54:1546-51，2005Fainaru,0.，Woolf,Ε.，Lotem，J.，Yarmus，Μ.，Brenner，0.，Goldenberg，D.，Negreanu,V.，Bernstein，Y.，Levanon,D.，Jung，S.，andGroner,Y.:Runx3regulatesmouseTGF-beta—mediateddendriticcellfunctionanditsabsenceresultsinairwayinflammation.EmboJ23:969_79，2004Fischer，H.G.andReichmann，G.:Braindendriticcellsandmacrophages/microgliaincentralnervoussysteminflammation.JImmunoll66:2717_26，2001Flegal，K.Μ.，Graubard，B.I.，Williamson,D.F.，Gail，Μ.H.Cause-specificexcessdeathsassociatedwithunderweight,overweight,andobesity,Jama2007，298(17):2028_37Fulton,S.A.，Reba,S.Μ.，Pai,R.K.，Pennini,Μ.，，Torres,Μ.Harding,C.V.，Boom，W.H.InhibitionofmajorhistocompatibilitycomplexIIexpressionandantigenprocessinginmurinealveolarmacrophagesbyMycobacteriumbovisBCGandthe19-kilodaltonmycobacteriallipoprotein，InfectImmun2004，72(4):2101_10Gordon,S.!Alternativeactivationofmacrophages,NatRevImmunol2003，3(1)23-35Hardy,C.LandBalducci，L!Hemopoieticalterationsofcancer.AmJMedSci290:196-205，1985Huehn,J.，Siegmund，K.，Lehmann,J.C.，Siewert，C.，Haubold，U.，Feuerer,Μ.，Debes，G.F.，Lauber,J.，Frey,0.，Przybylski，G.K.，Niesner,U.，delaRosa，Μ.，Schmidt，C.Α.，Brauer,R.，Buer,J.，Scheffold，Α.，andHamann,Α.-Developmentalstage，phenotype,andmigrationdistinguishnaive-andeffector/memory-1ikeCD4+regulatoryTcells.JExpMed199:303_13，2004Hiratsuka，S.，Nakamura,K.，Iwai，S.，Murakami，Μ.，Itoh，Τ.，Kijima，H.，Shipley,J.Μ.,Senior,R.Μ.,andShibuya,M.:ΜΜΡ9inductionbyvascularendothelialgrowthfactorreceptor-1isinvolvedinlung-specificmetastasis.CancerCell2:289-300，2002Jaksits，S.，Kriehuber，E.，Charbonnier,A.S.，Rappersberger,K.，Stingl，G.,andMaurer,D.:CD34+cell_derivedCD14+precursorcellsdevelopintoLangerhanscellsinaTGF—beta1—dependentmanner.JImmunol163:4869_77，1999Kamei，N.，Tobe，K.，Suzuki,R.，Ohsugi，Μ.，Watanabe,Τ.，Kubota，N.，Ohtsuka-Kowatari,N.，Kumagai，K.，Sakamoto，K.，Kobayashi，M.，Yamauchi，T.，Ueki，K.，Oishi，Y.，Nishimura,S.，Manabe,I.，Hashimoto，H.，Ohnishi，Y.，Ogata，H.，Tokuyama,K.，Tsunoda,M.，Ide,T.，Murakami，K.，Nagai，R.，andKadowaki，T.Overexpressionofmonocytechemoattractantprotein—linadiposetissuescausesmacrophagerecruitmentandinsulinresistance.JBiolChem281:26602_14，2006Kaplan，D.H.，Jenison,M.C.，Sae1and,S.，Shlomchik，W.D.，andShlomchik，M.J.:Epidermallangerhanscell-deficientmicedevelopenhancedcontacthypersensitivity.Immunity23:611_20，2005Karin，M.NucIearfactor—kappaBincancerdevelopmentandprogression.Nature441:431_6，2006Kelly,P.M.，Davison,R.S.，Bliss，E.，andMcGee，J.0.!Macrophagesinhumanbreastdisease:aquantitativeimmunohistochemicalstudy.BrJCancer57174-7，1988Kissenpfennig，A.andMalissen，B.Langerhanscells—revisitingtheparadigmusinggeneticallyengineeredmice.TrendsImmunol27:132_9，2006Lee,J.H.，Yu，H.H.，Wang,L.C.，Yang,Y.H.，Lin,Y.Τ.，andChiang,B.L.ThelevelsofCD4+CD25+regulatoryTcellsinpaediatricpatientswithallergicrhinitisandbronchialasthma.ClinExpImmunol148:53_63，2007Leek,R.D.，Harris，A.L.，andLewis,C.E.:Cytokinenetworksinsolidhumantumors:regulationofangiogenesis.JLeukocBiol56:423_35，1994Lehmann,J.，Huehn,J.，delaRosa，M.，Maszyna,F.，Kretschmer,U.，Krenn,V.，Brunner，M.，Scheffold，A.，andHamann,A.-ExpressionoftheintegrinalphaEbeta7identifiesuniquesubsetsofCD25+aswellasCD25-regulatoryTcells.ProcNatlAcadSciUSA99:13031_6，2002Leong，P.P.，Mohammad,R.，Ibrahim，N.，Ithnin，H.，Abdullah，M.，Davis,W.C.，andSeow,H.F.:Phenotypingoflymphocytesexpressingregulatoryandeffectormarkersininfiltratingductalcarcinomaofthebreast.ImmunolLettl02:229_36，2006Lewis,C.E.andPollard，J.W.:Distinctroleofmacrophagesindifferenttumormicroenvironments.CancerRes66:605_12，2006Lewis,J.S.，Landers，R.J.，Underwood,J.C.，Harris，A.L，andLewis,C.E.Expressionofvascularendothelialgrowthfactorbymacrophagesisup—regulatedinpoorlyvascularizedareasofbreastcarcinomas.JPathol192:150—8，2000Lewis，C.andMurdoch，C.:Macrophageresponsestohypoxiaamplicationsfortumorprogressionandanti-cancertherapies.AmJPathol167:627_35，2005Liang，C.P.，Han,S.，Senokuchi,Τ.，andTall，A.R.:Themacrophageatthecrossroadsofinsulinresistanceandatherosclerosis.CircRes100:1546—55，2007Lin,E.Y.，Jones,J.G.，Li,P.，Zhu,L.，Whitney,K.D.，Muller,W.J.，andPollard,J.W.!ProgressiontomalignancyinthepolyomamiddleToncoproteinmousebreastcancermodelprovidesareliablemodelforhumandiseases.AmJPathol163:2113-26，2003Lin，E.Y.，Nguyen,A.V.，Russell，R.G.，andPollard，J.W.:Colony-stimulatingfactor1promotesprogressionofmammarytumorstomalignancy.JExpMed193:727_40，2001Lin,E.Y.andPollard，J.W.:Roleofinfiltratedleucocytesintumourgrowthandspread.BrJCancer90:2053_8，2004Lin,E.Y.，Li，J.F.，Gnatovskiy，L，Deng，Y.，Zhu,L，Grzesik，D.Α.，Qian，H.，Xue,Χ.N.，andPollard,J.W.-Macrophagesregulatetheangiogenicswitchinamousemodelofbreastcancer.CancerRes66:11238_46，2006Lin,W.W.andKarin,M.:Acytokine-mediatedlinkbetweeninnateimmunity,inflammation,andcancer.JClinInvest117:1175_83，2007Liyanage,U.K.，Moore,Τ.T.，Joo,H.G.，Tanaka,Y.，Herrmann，V.，Doherty,G.，Drebin，J.Α.，Strasberg，S.Μ.，Eberlein，Τ.J.，Goedegebuure，P.S.，andLinehan，D.C.PrevalenceofregulatoryTcellsisincreasedinperipheralbIoodandtumormicroenvironmentofpatientswithpancreasorbreastadenocarcinoma.JImmunol169:2756-61，2002Luhn,K.，Simmons,C.P.，Moran,Ε.，Dung，N.Τ.，Chau,Τ.N.，Quyen,N.Τ.，Thaole，Τ.Τ.，VanNgoc,Τ.，Dung，N.Μ.，Wills,B.，Farrar,J.，McMichael,A.J.，Dong，Τ.，andRowland-Jones,S.-IncreasedfrequenciesofCD4+CD25(high)regulatoryTcellsinacutedengueinfection.JExpMed204:979_85，2007Lumeng，C.N.，Bodzin，J.L.，andSaltiel,A.R.:0besityinducesaphenotypicswitchinadiposetissuemacrophagepolarization.JClinInvest117175-84,2007Mahnke,K.，Schmitt，E.，Bonifaz，L，Enk,A.H.，andJonuleit，H.Immature,butnotinactivethetolerogenicfunctionofimmaturedendriticcells.ImmunolCellBiol80:477_83，2002Mantovani，A.Tumor-associatedmacrophagesinneoplasticprogressionaparadigmfortheinvivofunctionofchemokines.LabInvest71:5_16，1994Mantovani，A.，Bottazzi，B.，Colotta，F.，Sozzani，S.，andRuco，L:Theoriginandfunctionoftumor-associatedmacrophages.ImmunolToday13:265_70，1992Mantovani,A.，Sozzani,S.，Locati,Μ.，Allavena，P.，andSica，A.Macrophagepolarization:tumor—associatedmacrophagesasaparadigmforpolarizedM2mononuclearphagocytes.TrendsImmunol23:549_55，2002Mantovani,A.，Sica,Α.，Sozzani,S.，Allavena,P.，Vecchi,Α.，Locati,Μ.Thechemokinesystemindiverseformsofmacrophageactivationandpolarization,TrendsImmunol2004，25(12):677_86Mantovani,A.，Schioppa，T.，Porta，C.，Allavena，P.，Sica,A.Roleoftumor-associatedmacrophagesintumorprogressionandinvasion.CancerMetastasisRev23:315_22，2006Marshall，N.A.，Christie，L.E.，Munro,L.R.，Culligan,D.J.，Johnston,P.W.，Barker,R.N.,andVickers,Μ.Α.:ImmunosuppressiveregulatoryTcellsareabundantinthereactivelymphocytesofHodgkinlymphoma.Blood103:1755_62，2004McHugh,R.S.，Whitters,M.J.，Piccirillo,C.Α.，Young,D.A.，Shevach,Ε.M.，Collins，M.，Byrne,M.C.:CD4(+)CD25(+)immunoregulatoryTcells:geneexpressionanalysisrevealsafunctionalrolefortheglucocorticoid-inducedTNFreceptor.Immunity16:311_23，2002Miller,S.D.，McMahon,Ε.J.，Schreiner,B.，andBailey,S.L.AntigenpresentationintheCNSbymyeloiddendriticcellsdrivesprogressionofrelapsingexperimentalautoimmuneencephalomyelitis.AnnNYAcadScill03179-91,2007Murdoch，C.，Giannoudis,Α.，Lewis，C.E.:Mechanismsregulatingtherecruitmentofmacrophagesintohypoxicareasoftumorsandotherischemictissues.Blood104(8):2224_34，2001Murdoch，C.，Giannondis，Α.，andLewis,C.Ε.:Mechanismsregulatingtherecruitmentofmacrophagesintohypoxicareasoftumorsandotherischemictissues.Blood104:2224_34，2004Neels,J.G.andOlefsky,J.M.Inflamedfat:whatstartsthefire？JClinInvestll6:33_5，2006Numasaki，M.，Watanabe,M.，Suzuki,T.，Takahashi，H.，Nakamura，Α.，McAllister，F.，Hishinuma，T.，Goto，J.，Lotze，Μ.T.，Kolls，J.K.，andSasaki，H.IL_17enhancesthenetangiogenicactivityandinvivogrowthofhumannon—smallcelllungcancerinSCIDmicethroughpromotingCXCR-2-dependentangiogenesis.JImmunol175:6177_89，20050'Sullivan,C.andLewis，C·E·Tumour-associatedleucocytes:friendsorfoesinbreastcarcinoma.JPathol172:229_35，1994Padilla，J.，Daley,E.，Chow,A.，Robinson，K.，Parthasarathi，K.，McKenzie,Α.N.，Tschernig，Τ.，Kurup,V.P.，Donaldson，D.D.，Grunig，G.:IL_13regulatestheimmuneresponsetoinhaledantigens,JImmunol2005,174(12)8097-105Pollard，J.W.Tumour-educatedmacrophagespromotetumourprogressionandmetastasis.NatRevCancer4:71—8，2004Ponomarev,E.D.，Shriver,L.P.，Maresz,K.，andDittel，B.N.-MicroglialcellactivationandproliferationprecedestheonsetofCNSautoimmunity.JNeurosciRes81:374_89，2005Rad,R.，Brenner，L，Bauer，S.，Schwendy,S.，Layland,L，daCosta,C.P.，Reindl，W.，Dossumbekova，A.，Friedrich，M.，Saur,D.，Wagner,H.，Schmid，R.Μ.，andPrinz，C.:CD25+/Foxp3+TcellsregulategastricinflammationandHelicobacterpyloricolonizationinvivo.Gastroenterology131:525_37，2006Raes,G.，Brys，L，Dahal，B·K·，Brandt，J·,Grooten,J.，Brombacher，F·,Vanham,G.，Noel，W.，Bogaert，P.，Boonefaes，Τ.，Kindt，Α.，VandenBergh,R.，Leenen，P.J.，DeBaetselier,P.，andGhassabeh，G.H.:Macrophagegalactose_typeC—typelectinsasnovelmarkersforalternativelyactivatedmacrophageselicitedbyparasiticinfectionsandallergicairwayinflammation.JLeukocBiol77:321_7，2005Raes,G.，DeBaetselier,P.，Noel，W.，Beschin，Α.，Brombacher,F.，andHassanzadehGh,G.!DifferentialexpressionofFIZZlandYmlinalternativelyversusclassicallyactivatedmacrophages.JLeukocBiol71597-602,2002Roncarolo,M.G.，Gregori,S.，Battaglia,Μ.，Bacchetta，R.，Fleischhauer,K.，andLevings，Μ.K.InterIeukiη-10-secretingtypelregulatoryTcellsinrodentsandhumans.ImmunolRev212:28_50，2006Sadhu,C.，Ting，H.J.，Lipsky,B.，Hensley,K.，Garcia-Martinez，LF.，Simon，S.I.，andStaunton,D.Ε.:CD1lc/CD18:novelligandsandaroleindelayed-typehypersensitivity.JLeukocBiol811395-403,2007Serafini，P.，DeSanto,C.，Marigo，I.，Cingarlini，S.，Dolcetti，L，Gallina，G.，Zanovello，P.，andBronte，V.:Derangementofimmuneresponsesbymyeloidsuppressorcells.CancerImmunolImmunother53:64_72，2004Schiavoni,G.，Mattel,F.，Borghi,P.，Sestili,P.，Venditti,Μ.，Morse,H.C.，3rd，Belardelli，F.，andGabriele，L:ICSBPiscriticallyinvolvedinthenormaldevelopmentandtraffickingofLangerhanscellsanddermaldendriticcells.Blood103:2221_8，2004Seo，N.，Hayakawa，S.，Takigawa，M.，andTokura,Y.:Interleukin_10expressedatearlytumoursitesinducessubsequentgenerationofCD4(+)T-regulatorycellsandsystemiccollapseofantitumourimmunity.Immunology103:449_57，2001Serafini，P.，DeSanto,C.，Marigo，I.，Cingarlini，S.，Dolcetti，L，Gallina,G.，Zanovello,P.，andBronte，V.:Derangementofimmuneresponsesbymyeloidsuppressorcells.CancerImmunolImmunother53:64_72，2004Sica，A.，Schioppa，T.，Mantovani，A.，andAllavena，P.Tumour-associatedmacrophagesareadistinctM2polarisedpopulationpromotingtumourprogression-potentialtargetsofanti-cancertherapy.EurJCancer42717-27，2006Steinman,R.M.，Hawiger,D.，andNussenzweig,M.C.!Tolerogenicdendriticcells.AnnuRevImmunol21:685_711，2003Takahashi，H.，Numasaki，Μ.，Lotze，Μ.T.，andSasaki，H.Interleukin-17enhancesbFGF-，HGF-andVEGF-inducedgrowthofvascularendothelialcells.ImmunolLett98:189-93，2005Tsunemi，S.，Iwasaki，Τ.，Imado,Τ.，Higasa，S.，Kakishita，Ε.，Shirasaka，Τ.，andSano，H.-RelationshipofCD4+CD25+regulatoryTcellstoimmunestatusinHIV-infectedpatients.Aids19:879_86，2005Valladeau,J.，Ravel,0.，Dezutter-Dambuyant,C.，Moore,K.，Kleijmeer，Μ.，Liu,Y.，Duvert-Frances,V.，Vincent,C.，Schmitt，D.，Davoust,J.，Caux,C.，Lebecque，S.,andSaeland,S.:Langerin,anovelC-typelectinspecifictoLangerhanscells,isanendocyticreceptorthatinducestheformationofBirbeckgranules.Immunity12:71-81，2000Wan,Y.Y.andFlavell，R.A.:TherolesforcytokinesinthegenerationandmaintenanceofregulatoryTcells.ImmunolRev212:114_30，2006Weaver,C.T.，Harrington，LE.，Mangan,P.R.，Gavrieli，Μ·，andMurphyK.Μ.Th17:aneffectorCD4TcelllineagewithregulatoryTcellties.Immunity24677-88,2006Weisberg,S.P.，McCann，D.，Desai,Μ.，Rosenbaum，Μ.，Leibel,R.L.，andFerrante，Α.W.，Jr.:0besityisassociatedwithmacrophageaccumulationinadiposetissue.JClinInvest1121796-808,2003Weisberg,S.P.，Hunter，D.，Huber,R.，Lemieux，J.，Slaymaker，S.，Vaddi,K.，Charo,I.，Leibel，R.L，Ferrante,Α.W.，Jr.，CCR2modulatesinflammatoryandmetaboliceffectsofhigh-fatfeeding，JClinInvest2006，116(1)115-24Wolf,I.，Sadetzki,S.，Catane，R.，Karasik，Α.，Kaufman，B.:Diabetesmellitusandbreastcancer2005,6(2):103_11Woolf,E.，Brenner，0.，Goldenberg，D.，Levanon，D.，andGroner,Y.Runx3regulatesdendriticepidermalTcelldevelopment.DevBiol303:703_14，2007Wyckoff,J.B.，Wang,Y.，Lin,E.Y.，Li，J.E.，Goswami，S.，Stanley,Ε.R.，Segal1，J.Ε.,Pollard,J.W.,andCondeelis,J.:Directvisualizationofmacrophage-assistedtumorcellintravasationinmammarytumors.CancerRes67:2649_56，2007Xu,D.，Fu,J.，Jin,L.，Zhang，H.，Zhou，C.，Zou,Ζ.，Zhao，J.Μ.，Zhang，B.，Shi,Μ.，Ding，X.，Tang,Ζ.，Fu,Y.X.，andWang,F.S.-CirculatingandliverresidentCD4+CD25+regulatoryTcellsactivelyinfluencetheantiviralimmuneresponseanddiseaseprogressioninpatientswithhepatitisB.JImmunol177:739_47，2006Yakar，S.，Nunez,N.P.，Pennisi，P.，Brodt，P.，Sun，H.，Fallavollita,L，Zhao，H.，Scavo,L，Novosyadlyy,R.，Kurshan,N.，Stannard，B.，East-Palmer,J.，Smith，N.C.，Perkins，S.N.，Fuchs—Young，R.，Barrett，J.C.，Hursting，S.D.，LeRoith，D.Increasedtumorgrowthinmicewithdiet-inducedobesityimpactofovarianhormones，Endocrinology2006，147(12):5826_34Yamashiro,S.，Takeya，M.，Nishi，T.，Kuratsu，J.，Yoshimura，T.，Ushio，Y.，Takahashi,K.:Tumor_derivedmonocytechemoattractantprotein—1inducesintratumoralinfiltrationofmonocyte-derivedmacrophagesubpopulationintransplantedrattumors.AmJPathol145:856_67，1994Yang，D.，Howard,0.M.，Chen，Q.，andOppenheim，J.J.!CuttingedgeimmaturedendriticcellsgeneratedfrommonocytesinthepresenceofTGF—betalexpressfunctionalC-Cchemokinereceptor6.JImmunol163:1737_41，1999權利要求一種鑒定細胞樣品內的炎癥相關組織巨噬細胞(IRTM)的方法，包括使所述細胞樣品接觸至少一種特異性識別巨噬細胞特異性細胞表面標志物的第一試劑和至少一種特異性識別樹突細胞特異性細胞表面標志物的第二試劑，并測定受到所述至少一種第一試劑和至少一種第二試劑二者識別的細胞的存在。2.權利要求1的方法，其中所述至少一種第一試劑和/或所述至少一種第二試劑特異性結合所述巨噬細胞特異性細胞表面標志物或所述樹突細胞特異性細胞表面標志物。3.權利要求2的方法，其中所述至少一種第一試劑和/或所述至少一種第二試劑是抗體或其抗原結合片段。4.權利要求1的方法，其中所述至少一種第一試劑和所述至少一種第二試劑是同一分子。5.權利要求4的方法，其中所述分子選自下組雙特異性抗體、三特異性抗體、具有超過三種特異性的抗體和任何所述抗體的抗原結合片段。6.權利要求1的方法，其中所述巨噬細胞特異性細胞表面標志物是F4/80。7.權利要求1的方法，其中所述樹突細胞特異性細胞表面標志物是CDllc。8.權利要求1的方法，其中所述IRTM是腫瘤相關巨噬細胞(TAM)。9.權利要求1的方法，其中所述IRTM是脂肪組織巨噬細胞(ATM)。10.權利要求1的方法，其中測定受到所述至少一種第一試劑和所述至少一種第二試劑二者識別的細胞的存在包括至少一種選自下組的方法免疫組織化學、熒光激活細胞分選、磁細胞分選、親和層析、FISH和免疫顯微術。11.權利要求1的方法，其中所述細胞樣品是腫瘤樣品。12.—種自細胞混合物分離TAM或ATM的方法，包括(a)使細胞樣品接觸至少一種特異性識別巨噬細胞特異性細胞表面標志物的第一試劑和至少一種特異性識別樹突細胞特異性細胞表面標志物的第二試劑，并(b)分離受到所述至少一種第一試劑和所述至少一種第二試劑二者識別的細胞。13.權利要求12的方法，其中所述至少一種第一試劑和/或所述至少一種第二試劑特異性結合所述巨噬細胞特異性細胞表面標志物或所述樹突細胞特異性細胞表面標志物。14.權利要求12的方法，其中所述至少一種第一試劑和/或所述至少一種第二試劑是抗體或其抗原結合片段。15.權利要求12的方法，其中所述至少一種第一試劑和所述至少一種第二試劑是同一分子。16.權利要求15的方法，其中所述分子選自下組雙特異性抗體、三特異性抗體、具有超過三種特異性的抗體和任何所述抗體的抗原結合片段。17.權利要求12的方法，其中所述巨噬細胞特異性細胞表面標志物是F4/80。18.權利要求12的方法，其中所述樹突細胞特異性細胞表面標志物是CDllc。19.權利要求12的方法，其中所述分離步驟包括FACS、親和層析和磁細胞分選中至少一項。20.一種診斷受試者中的增殖性病癥的方法，包括測定所述受試者中TAM的存在和/或活性。21.權利要求20的方法，其中所述測定步驟包括使來自所述受試者的細胞樣品接觸至少一種特異性識別巨噬細胞特異性細胞表面標志物的第一試劑和至少一種特異性識別樹突細胞特異性細胞表面標志物的第二試劑，并鑒定受到所述至少一種第一試劑和所述至少一種第二試劑二者識別的細胞。22.權利要求20的方法，其中所述增殖性病癥是乳腺癌。23.權利要求21的方法，其中所述至少一種第一試劑和/或所述至少一種第二試劑特異性結合所述巨噬細胞特異性細胞表面標志物或所述樹突細胞特異性細胞表面標志物。24.權利要求21的方法，其中所述至少一種第一試劑和/或所述至少一種第二試劑是抗體或其抗原結合片段。25.權利要求24的方法，其中所述至少一種第一試劑和所述至少一種第二試劑是同一分子。26.權利要求25的方法，其中所述分子選自下組雙特異性抗體、三特異性抗體、具有超過三種特異性的抗體和任何所述抗體的抗原結合片段。27.權利要求21的方法，其中所述巨噬細胞特異性細胞表面標志物是F4/80。28.權利要求21的方法，其中所述樹突細胞特異性細胞表面標志物是CDllc。29.權利要求21的方法，其中所述鑒定步驟包括至少一種選自下組的方法免疫組織化學、熒光激活細胞分選、磁細胞分選、親和層析、FISH和免疫顯微術。30.一種對受試者中的腫瘤分期的方法，包括測定所述受試者中TAM的存在和/或活性。31.權利要求30的方法，其中所述測定步驟包括使來自所述受試者的細胞樣品接觸至少一種特異性識別巨噬細胞特異性細胞表面標志物的第一試劑和至少一種特異性識別樹突細胞特異性細胞表面標志物的第二試劑，并鑒定受到所述至少一種第一試劑和所述至少一種第二試劑二者識別的細胞。32.權利要求30的方法，其中所述腫瘤是乳腺癌。33.權利要求30的方法，其中所述至少一種第一試劑和/或所述至少一種第二試劑特異性結合所述巨噬細胞特異性細胞表面標志物或所述樹突細胞特異性細胞表面標志物。34.權利要求30的方法，其中所述至少一種第一試劑和/或所述至少一種第二試劑是抗體或其抗原結合片段。35.權利要求34的方法，其中所述至少一種第一試劑和所述至少一種第二試劑是同一分子。36.權利要求35的方法，其中t所述分子選自下組雙特異性抗體、三特異性抗體、具有超過三種特異性的抗體和任何所述抗體的抗原結合片段。37.權利要求31的方法，其中所述巨噬細胞特異性細胞表面標志物是F4/80。38.權利要求31的方法，其中所述樹突細胞特異性細胞表面標志物是CDllc。39.權利要求31的方法，其中所述鑒定步驟包括至少一種選自下組的方法免疫組織化學、熒光激活細胞分選、磁細胞分選、親和層析、FISH和免疫顯微術。40.權利要求30的方法，其中所述測定步驟包括使來自所述受試者的細胞樣品接觸一種或多種集體地特異性識別兩種或更多種在TAM上表達的細胞表面受體的試劑，并鑒定受到所述一種或多種試劑識別的細胞。41.一種治療受試者的腫瘤的方法，包括調控TAM生存力或活性。42.權利要求41的方法，其中調控TAM生存力或活性包括自腫瘤細胞群體或腫瘤樣品選擇性消除ΤΑΜ。43.權利要求42的方法，其中所述選擇性消除TAM包括(a)使所述群體或樣品接觸TAM結合劑，并(b)自所述群體或樣品選擇性消除那些特異性結合所述TAM結合劑的細胞。44.權利要求43的方法，其中所述TAM結合劑包括至少一種抗體且所述選擇性消除步驟選自抗體介導的清除、蛋白A層析、親和層析、FACS和磁細胞分選。45.權利要求41的方法，其中調控TAM生存力或活性包括選擇性殺死腫瘤細胞群體或腫瘤樣品內的ΤΑΜ。46.權利要求45的方法，其中選擇性殺死TAM包括(a)使所述群體或樣品接觸TAM結合劑，并(b)自所述群體或樣品選擇性殺死那些特異性結合所述TAM結合劑的細胞。47.權利要求46的方法，其中所述TAM結合劑包括至少一種抗體且所述選擇性殺死步驟是補體介導的細胞毒性。48.權利要求46的方法，其中所述TAM結合劑包括至少一種抗體且所述選擇性殺死步驟是由偶聯至所述抗體的細胞毒性分子介導的。49.權利要求41的方法，其中調控TAM生存力或活性包括抑制腫瘤細胞群體或腫瘤樣品內的TAM活性。50.權利要求49的方法，其中抑制TAM活性包括抑制所述群體或樣品中一種或多種TAM分泌細胞因子或TAM分泌趨化因子的分泌或活性。51.權利要求50的方法，其中所述TAM分泌細胞因子是TGFβ。52.權利要求50的方法，其中抑制一種或多種TAM分泌細胞因子或TAM分泌趨化因子的分泌或活性包括施用TAM分泌細胞因子/趨化因子結合劑。53.權利要求52的方法，其中所述TAM分泌細胞因子/趨化因子結合劑選自對所述細胞因子或趨化因子特異性的抗體或抗原結合片段、對所述細胞因子或趨化因子特異性的受體或抑制所述細胞因子/趨化因子活性的小分子。54.權利要求50的方法，其中抑制一種或多種TAM分泌細胞因子或TAM分泌趨化因子的分泌或活性包括施用TAM分泌細胞因子/趨化因子的拮抗劑。55.權利要求41-54任一項的方法，其中所述受試者是人類受試者。56.權利要求43、44和46-55任一項的方法，進一步包括共施用或序貫施用一種或多種選自下組的別的治療劑化療劑、細胞因子、趨化因子、抗血管發生劑、免疫抑制劑、細胞毒齊U、抗炎劑和生長抑制劑。57.一種治療受試者中的自身免疫性病癥的方法，包括調控TAM生存力或活性。58.權利要求57的方法，其中調控TAM生存力或活性包括刺激TAM活性。59.權利要求58的方法，其中刺激TAM活性包括施用一種或多種選自下組的化合物TAM激動劑和TAM分泌細胞因子/趨化因子的激動劑。60.權利要求59的方法，其中刺激TAM活性導致對FoxP3+⑶4+Τ調節性細胞、IL-10+CD4+T調節性細胞和炎癥TH17細胞中至少一項的誘導。61.權利要求任一項57-60的方法，其中所述受試者是人類受試者。62.權利要求任一項59-61的方法，進一步包括共施用或序貫施用一種或多種選自下組的別的治療劑細胞因子、趨化因子、細胞毒劑、抗炎劑和免疫抑制劑。63.一種抑制受試者中的耐受性形成的方法，包括調控TAM生存力或活性。64.權利要求63的方法，其中調控TAM生存力或活性包括選擇性消除ΤΑΜ。65.權利要求64的方法，其中所述選擇性消除TAM包括(a)施用TAM結合劑，并(b)選擇性消除那些特異性結合所述TAM結合劑的細胞。66.權利要求65的方法，其中所述TAM結合劑包括至少一種抗體且所述選擇性消除步驟是抗體介導的清除。67.權利要求63的方法，其中調控TAM生存力或活性包括選擇性殺死ΤΑΜ。68.權利要求67的方法，其中選擇性殺死TAM包括(a)施用TAM結合劑，并(b)選擇性殺死那些特異性結合所述TAM結合劑的細胞。69.權利要求68的方法，其中所述TAM結合劑包括至少一種抗體且所述殺死步驟是補體介導的細胞毒性。70.權利要求68的方法，其中所述TAM結合劑包括至少一種抗體或抗原結合片段且所述選擇性殺死步驟是由偶聯至所述抗體或抗原結合片段的細胞毒性分子介導的。71.權利要求63的方法，其中調控TAM生存力或活性包括抑制TAM活性。72.權利要求71的方法，其中抑制TAM活性包括抑制一種或多種TAM分泌細胞因子或TAM分泌趨化因子的分泌或活性。73.權利要求72的方法，其中所述TAM分泌細胞因子是TGFβ。74.權利要求72的方法，其中抑制一種或多種TAM分泌細胞因子或TAM分泌趨化因子的分泌或活性包括施用TAM分泌細胞因子/趨化因子結合劑。75.權利要求74的方法，其中所述TAM分泌細胞因子/趨化因子結合劑選自對所述細胞因子或趨化因子特異性的抗體或抗原結合片段、對所述細胞因子或趨化因子特異性的受體或抑制所述細胞因子/趨化因子活性的小分子。76.權利要求72的方法，其中抑制一種或多種TAM分泌細胞因子或TAM分泌趨化因子的分泌或活性包括施用TAM分泌細胞因子/趨化因子的拮抗劑。77.權利要求63-76任一項的方法，其中所述受試者是人類受試者。78.權利要求63-77任一項的方法，進一步包括共施用或序貫施用一種或多種選自下組的別的治療劑細胞因子、趨化因子、細胞毒劑、抗炎劑和免疫抑制劑。79.一種用于選擇性誘導FoxP3+⑶4+Τ調節性細胞、IL-IO+⑶4+Trl細胞和炎癥TH17細胞中至少一項生長和/或增殖的方法，包括在適于正常細胞生長的條件下給幼稚T細胞施用TAM或使幼稚T細胞暴露于ΤΑΜ。80.權利要求79的方法，進一步包括施用一種或多種選自下組的化合物ΤΑΜ激動劑和TAM分泌細胞因子/趨化因子的激動劑。81.權利要求79的方法，進一步包括分離所述經過誘導的FOXP3+CD4+T調節性細胞、IL-10+CD4+Trl細胞和/或炎癥TH17細胞。82.—種治療受試者中的炎性病癥的方法，包括調控IRTM生存力或活性。83.權利要求82的方法，其中調控IRTM生存力或活性包括刺激IRTM活性。84.權利要求83的方法，其中刺激IRTM活性包括施用一種或多種選自下組的化合物IRTM激動劑和IRTM分泌細胞因子/趨化因子的激動劑。85.權利要求83的方法，其中刺激IRTM活性導致對FoxP3+⑶4+T調節性細胞、IL-10+CD4+T調節性細胞和炎癥TH17細胞中至少一項的誘導。86.權利要求82-85任一項的方法，其中所述受試者是人類受試者。87.權利要求83-85任一項的方法，進一步包括共施用或序貫施用一種或多種選自下組的別的治療劑細胞因子、趨化因子、細胞毒劑、抗炎劑和免疫抑制劑。88.權利要求82的方法，其中調控IRTM生存力或活性包括選擇性消除IRTM。89.權利要求88的方法，其中所述選擇性消除IRTM包括(a)施用IRTM結合劑，并(b)選擇性消除那些特異性結合所述IRTM結合劑的細胞。90.權利要求89的方法，其中所述IRTM結合劑包括至少一種抗體且所述選擇性消除步驟是抗體介導的清除。91.權利要求82的方法，其中調控IRTM生存力或活性包括選擇性殺死IRTM。92.權利要求91的方法，其中選擇性殺死IRTM包括(a)施用IRTM結合劑，并(b)選擇性殺死那些特異性結合所述IRTM結合劑的細胞。93.權利要求92的方法，其中所述IRTM結合劑包括至少一種抗體且所述選擇性殺死步驟是補體介導的細胞毒性。94.權利要求92的方法，其中所述IRTM結合劑包括至少一種抗體或抗原結合片段且所述選擇性殺死步驟是由偶聯至所述抗體或抗原結合片段的細胞毒性分子介導的。95.權利要求82的方法，其中調控IRTM生存力或活性包括抑制IRTM活性。96.權利要求95的方法，其中抑制IRTM活性包括抑制一種或多種IRTM分泌細胞因子或IRTM分泌趨化因子的分泌或活性。97.權利要求96的方法，其中所述IRTM分泌細胞因子是TGFβ。98.權利要求96的方法，其中抑制一種或多種IRTM分泌細胞因子或IRTM分泌趨化因子的分泌或活性包括施用IRTM分泌細胞因子/趨化因子結合劑。99.權利要求98的方法，其中所述IRTM分泌細胞因子/趨化因子結合劑選自對所述細胞因子或趨化因子特異性的抗體或抗原結合片段、對所述細胞因子或趨化因子特異性的受體或抑制所述細胞因子/趨化因子活性的小分子。100.權利要求96的方法，其中抑制一種或多種IRTM分泌細胞因子或IRTM分泌趨化因子的分泌或活性包括施用IRTM分泌細胞因子/趨化因子的拮抗劑。101.權利要求82的方法，其中所述IRTM選自TAM和ATM。102.權利要求82-101任一項的方法，其中所述受試者是人類受試者。103.權利要求82-101任一項的方法，進一步包括共施用或序貫施用一種或多種選自下組的別的治療劑細胞因子、趨化因子、細胞毒劑、抗炎劑和免疫抑制劑。104.一種用于選擇性誘導FoxP3+CD4+T調節性細胞、IL-10+CD4+Trl細胞和/或炎癥TH17細胞生長和/或增殖的方法，包括在適于正常細胞生長的條件下使幼稚T細胞暴露于TAM和/或ATM。105.權利要求104的方法，進一步包括施用一種或多種選自下組的化合物TAM激動劑、ATM激動劑、TAM分泌細胞因子/趨化因子的激動劑和ATM分泌細胞因子/趨化因子的激動劑。106.權利要求104的方法，進一步包括分離所述經過誘導的FOXP3+CD4+T調節性細胞、IL-10+CD4+Trl細胞或TH17細胞。全文摘要提供了以靶向腫瘤相關巨噬細胞活性的療法治療癌癥的方法。還提供了以使用腫瘤相關巨噬細胞和脂肪組織巨噬細胞的療法治療癌癥、炎性和自身免疫性病癥的方法。文檔編號G01N33/574GK101801462SQ200880105878公開日2010年8月11日申請日期2008年7月11日優先權日2007年7月13日發明者喬基姆·萊曼,保羅·J·戈多斯基,加尼什·A·科盧馬姆申請人:健泰科生物技術公司
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