專利名稱：一種蛋白質的制作方法
技術領域：
本發明涉及金結合蛋白，含有該金結合蛋白的復合蛋白，和其在檢測其靶物質中 的應用。
背景技術：
隨著最近半導體微加工技術的進展，通過使設備小型化使得半導體工業顯著發 展。以光刻法為代表的微加工技術最近已經達到了幾百納米的精加工精度。上述技術使用 的材料和設備能夠有效地用于許多方面，并且預期用于光通信、電通信等以及生物技術和 能量等許多領域。但是，當考慮在100納米或更小的規格上加工作為現有微加工技術的擴 展時，除技術挑戰以外，工業應用還面臨許多挑戰，包括與加工有關的時間和費用。隨著適 用領域的增多，強烈需要制造精細結構的新技術作為以上技術的替代。在此情況下，已經利用產生在原子或分子水平上控制的所需結構和性質的自下而 上方法代替常規自上而下加工技術對新材料積極進行了研究和開發。生產精細結構的自下 而上技術的例子包括其中在金屬表面上控制分子排列的分子裝置的研發，并且已經研究了 利用物質自裝配的方法的應用作為一種這樣的分子排列控制技術。該研究的最近的一個例 子是，Lindsay等(Science，300 :p. 1413,2003)利用自裝配單層檢測了分子轉換功能，在該 單層中在其各自分子末端具有硫醇基的鏈烷硫醇和鏈烷二硫醇定位在金基板上。眾所周知，以核酸和蛋白質為代表的生物分子在原子水平控制下構建為精確的結 構而發揮其功能。這些生物分子的性質的應用也已經研究，以將這些生物分子應用于多種 裝置，在該裝置中生物分子排列在金屬、金屬氧化物或半導體基板上。生產基板上排列有生 物分子的精細結構的技術對于開發這種裝置的第一步是至關重要的。例如，當考慮在金基 板上固定脫氧核糖核酸(DNA)或在上面固定具有各種功能的具有氨基酸序列的肽時，普遍 地知道能夠化學合成該DNA或肽，并且用硫醇基(-SH)化學修飾這些物質的末端，從而利用 S-Au表面吸附將這些物質設置在金基板上。利用這個事實，已經對在金上固定有DNA或肽 的實驗系統及其向裝置的轉化進行了研究。另一方面，作為酶、抗體等起作用的蛋白質具有高分子量。因此，化學合成這些具 有高分子量的化合物以形成高級結構而同時保持發揮其功能的能力是非常困難的。盡管當 前進行了許多研究，但事實是同時具有高級結構和所需功能的功能性蛋白質在大多數情況 下仍然未能合成(Science，302 :p. 1364,2003)。當功能性蛋白質被固定在基板材料上時， 與基板的結合通常如下進行用以硅烷偶聯劑為代表的多種表面處理劑處理該基板，向該 蛋白質中引入能夠與經受表面處理的該基板的表面結合的官能團(Pr0te0miCS，3 :p. 254， 2003)。然而已經指出，這種將反應性官能團引入功能性蛋白質中通常通過化學修飾進行， 并且非選擇性地確定引入位點。因此，該功能性蛋白質以功能性較低的形狀被固定在基板上，并且可能由于該功能性蛋白質的功能表達位點的修飾而使最終活性降低。也可以通過基因工程方法向蛋白質中引入結合位點以產生融合蛋白。作為一個例 子，已知這樣一種方法，其中通過基因工程將所有位點或已知與低分子化合物生物素結合 的(鏈霉)親和素的生物素結合位點引入所需蛋白質的N-或C-末端，然后該所需蛋白質 表達為融合蛋白，隨后通過排列在所需基板表面上的生物素固定。另外，最近公開了另一技術。在該技術中，由5個或更多氨基酸組成的肽能夠與用 于固定的基板材料結合。該肽可以與所需蛋白質融合產生融合蛋白，從而在基板上結合并 固定所需蛋白質。Belcher等披露了一種通過噬菌體展示方法由12個氨基酸組成的肽，該 肽能夠特異性識別含有GaAs的某些晶體表面(Nature，405 :p. 665，2000)，從而產生了利用 生物材料自裝配的能力研究裝置的新的可能性。另外，Belcher等公開了用于其他半導體 (PbS, CdS)的由7-14個氨基酸組成的肽的氨基酸序列(W0 03/029431)。Brown等披露了 具有重復結構的肽的一些例子，該結構具有由14個殘基組成的氨基酸序列的單元，顯示金 親和力(Nature Biotechnology，15 :ρ· 269，1997)。迄今通過上述噬菌體展示方法已經獲 得了具有對金屬(Au、Pt、Pd、Ag)、金屬氧化物(Si02、ZnO、Cr203、Fe2O3)或半導體的親和力 的許多其他肽。通過對基板材料具有親和力的這種肽將需要的生物分子固定在基板上，由于生物 分子之間或與不同基板之間的相互作用，也可以以自裝配方式構建循環地具有所需功能和 形狀的結構。例如，Belcher等披露了一種技術，其中展示與ZnS顆粒結合的ZnS-親和性 肽的M13噬菌體通過自裝配排列，從而產生液晶樣膜(Science，296 =892,2002)。另外，一些實例顯示通過如上所述的基因工程產生了與基板結合位點融合的所需 功能性蛋白質，從而使該功能性蛋白質可以固定在基板上功能性位點之外的所需位點。但 是，當對基板材料具有親和力的肽直接或通過由幾個氨基酸組成的接頭連接到功能性蛋白 質末端，然后與固相(例如基板)結合而實現蛋白質固定時，該功能性蛋白質的活性位點 (例如構成抗體的抗原結合位點的幾個氨基酸殘基)靠近基板并且與基板表面發生某些相 互作用(例如靜電作用)，引起結構改變等，導致可能不能充分發揮所需功能。甚至當接頭 設計為更長時，在分子運動方面具有高自由度的作為接頭的肽仍然可能排列靠近功能性位 點，其功能可能受到抑制。由于上述問題，本發明人具有了一個想法，即上面固定有功能性聚合材料包括功 能性蛋白質接頭的基板結合位點需要具有功能性部分(支架)作為與基板保持一定距離而 不抑制所固定的蛋白質的所需活性的間隔區，以及與基板結合的位點。作為具有這種支架的分子識別分子，最眾所周知的是抗體。抗體是在自身防御機 制中起作用的一類蛋白質，其特異性識別并結合侵入動物體液中的外源物質表面上的多種 結構，這些外源物質然后被免疫系統解毒。抗體的多樣性(用于結合多種外源物質的具有 不同氨基酸序列的抗體數)據估計為每只動物有IO7至IO8個不同種類。其結構是由具有 兩個長鏈和兩個短鏈的多肽鏈形成的，長多肽鏈(重鏈)和短多肽鏈(輕鏈)分別被稱為 重鏈和輕鏈。這些重鏈和輕鏈各自具有可變區和恒定區。輕鏈是由一個可變區(VL)和一個 恒定區(CL)的兩個結構域組成的多肽鏈，而重鏈是由一個可變區(VH)和三個恒定區 (CH1-CH3)的四個結構域組成的多肽鏈。上述每個結構域具有由大約110個氨基酸組成的圓柱形結構，并且形成反向平行排列的β片層的層結構，這種層結構通過一個SS鍵結合， 形成高度穩定的結構。而且，眾所周知，抗體與多種抗原種的結合是由上述每個可變區(VH 或VL)的三個互補決定區(CDR)中氨基酸序列的多樣性引起的。CDR，三個為VH的，三個為 VL的，被構架區分開排列，并且識別目標識別位點中官能團的空間結構，從而允許高特異性 的分子識別。上述CDR的多樣性歸因于當骨髓干細胞分化為作為抗體產生細胞的B淋巴細胞時 在抗體基因座中發生的DNA重排。眾所周知，重鏈中由VH、D和JH基因片段組成的部分，和 輕鏈中由νλ或Vk和JX或!^基因片段組成的部分，經歷DNA重排，從而產生抗體。這 種DNA重排在每個B細胞中獨立地發生，一個B細胞只產生一種抗體。但是，個體中的全體 B細胞可以產生各種各樣的抗體。迄今已經利用抗體形成機制在動物免疫系統中人工產生了能夠與上述特定物質 結合的抗體，并且已經應用于多個工業領域。產生方法的一個例子是這樣一種方法，其中以 固定間隔用目標抗原性物質與佐劑一起免疫動物(例如兔、山羊或小鼠)，收集其血清中存 在的抗體。如上獲得的抗體是幾種抗體的混合物，它識別免疫中所用抗原性物質表面上的 多種結構。含有與一種抗原結合的幾種抗體的血清被稱為多克隆抗體。另一方面，所要免疫的動物的脾臟中存在產生可與目標抗原結合的抗體的多種B 淋巴細胞。將這種抗體形成B淋巴細胞與建立的腫瘤細胞融合，從而產生雜交瘤細胞。如 上所述，一個B淋巴細胞產生一種抗體，并且建立了一個系統，它能夠傳代培養產生一種抗 體的B淋巴細胞作為雜交瘤。如上所述產生的抗體被稱為單克隆抗體。作為使用抗體的上述結構作為錨的分子識別結構，JP 05-055534Α公開了識別兩 種不同抗原的多結合抗體，和用其形成多層的方法。根據這種技術，能夠獲得識別第一抗原 和第二抗原的融合抗體。另外，第一抗原、融合抗原和第二抗原連續排列在基板表面，從而 允許不經化學修飾而形成多層。但是，為了獲得其公開的融合蛋白，必須使用動物細胞，這 就面臨關于成本效率和操作復雜性的問題。除此之外，當形成多層時，必須包括將可被融合 蛋白識別的抗體排列在基板表面上的步驟。已知通過用某種蛋白水解酶處理上述抗體獲得的抗體片段，Fab、Fab，或F(ab，)2， 具有類似于親本抗體的結合抗原的能力。同樣，對于上述VH、VL或作為其復合物的Fv，甚至由VH或VL組成的復合物，具 有通過由幾個氨基酸組成的肽連接的一個區的羧基末端和另一個區的氨基末端的單鏈 Fv(SCFV)，或其類似物，已知具有類似于親本抗體的結合抗原的能力。Skerra和Better披露了一種方法，其中當大腸桿菌表達抗體基因時產生Fab-型 和Fv-型抗體片段，該抗體片段的N末端通過基因工程方法添加了分泌信號序列(Science， 240 :P. 1038，1988 ；Science, 240 :ρ· 1041，1988)。另外，JP 07-501451 A 公開了一種多價抗 原結合抗體及其產生方法，JP 08-504100 A公開了一種多價、多結合抗體及其產生方法。這 兩種技術揭示了結合蛋白是含有與一種或多種抗原結合的抗體可變區部分(VH和/或VL) 的蛋白質。JP 07-501451公開了識別泛癌抗原TAG-72和熒光素的結合蛋白和識別它們兩 者的一種雙特異性抗體的結構和氨基酸序列，以及編碼它們的堿基序列。JP 08-504100 A 在實施例中公開了一種二價雙特異性結合蛋白，它由針對已知蛋白質(細胞膜蛋白，癌抗 原CEA，FcRYl等)或低分子化合物的抗體片段復合物組成。
然而，在上述公開內容中，沒有公開關于直接識別和結合以無機物質為代表的基 板材料表面的結合蛋白的技術。因此，當生產在基板上排列結合蛋白的結構時，必須通過公 知的方法進行這種排列，例如，包括化學修飾基板或上述結合蛋白以將該結合蛋白通過共 價鍵排列在該基板上的方法。類似地，當結合蛋白與金屬或半導體物質的細粒結合時，也必 須化學修飾將要結合的顆粒或結合蛋白。這種化學修飾通常針對在蛋白質分子中大量含有 的氨基殘基或羧基，參與該反應的位點是非選擇性的。因此，發揮所需活性的位點可以是基 板結合的或標記的位點，結果，蛋白質的所需活性可能降低。而且，這個問題可能不僅存在 于向微裝置轉化的技術中，而且也存在于傳感元件如生物傳感器的生產中。因此，重要的是 在基板上固定捕獲靶物質的分子如抗體，而同時保持足以發揮其捕獲功能的分子定向。正在進行研究，其中向具有類似于上述抗體的構架的蛋白質增加識別多樣性分 子的能力。其例子包括 anticolin(MolecularBiotechnology，74 :ρ· 257，2001 中的綜述) 和III型纖連蛋白結構域(J. Mol. Biol, 284 :p. 1141,1998)。Anticolin是在脂籠蛋白 (Iipocalin)的基礎上改變的捕獲蛋白。脂籠蛋白是由160至180個氨基酸殘基組成的蛋 白質，其在轉運和貯存具有低水溶性的物質方面起作用。關于結構，脂籠蛋白是由8個β 片層組成的桶狀結構。脂籠蛋白能夠通過連接8個β片層的4個環結構識別和結合目標 物質。纖連蛋白通常是由不超過100個殘基的氨基酸組成的蛋白質，它在細胞與胞外基質 的連接或細胞連接中起關鍵作用。如同上述兩種蛋白質一樣，纖連蛋白是具有β片層結 構并且通過β片層之間的環結構識別靶物質的蛋白質。通過將隨機氨基酸序列導入上述 anticolin或纖連蛋白的β片層之間的環結構中，構建了新的結合蛋白。因為這些分子除 分子識別位點外還具有由β片層組成的強分子結構，所以這些分子通過與希望的功能性 聚合材料融合而特異性識別和結合基板，從而使該聚合材料固定在該基板上。另外，預計 這些分子也具有與基板保持一定距離，而不抑制所固定的聚合材料的所需活性的間隔區功 能。但是還沒有關于以上述抗體為代表的具有組成穩定的構架的分子識別蛋白特異性識別 和結合以金屬或半導體材料為代表的無機物質的報道。另一方面，在多種物質(靶物質)的檢測領域中，迄今為止已經建立了幾種對靶物 質的檢測和/或定量等方法，特別是對于蛋白質如抗原和抗體，以及糖，凝集素，和核酸。例 如，眾所周知，標記劑與特異性識別和結合作為靶物質的糖或凝集素的抗體結合，從而允許 通過該標記劑檢測或定量該靶物質。通常，由金屬如金或有機材料如乳膠組成的細粒，被某 個波長區的激發光激發熒光的熒光物質，或以熒光物質作為反應產物的酶(例如HRP)，用 作標記劑。標記蛋白質如抗體的方法包括物理吸附法和化學鍵法，在化學鍵法中將反應性 官能團引入標記劑或待標記的物質中，用作形成化學鍵的交聯點。在下文中，將以檢測中使用的抗體作為例子描述現有技術。JP03-108115 B公開了 通過將金細粒物理吸附到抗體上用金標記該抗體的方法的實施例。根據該方法，將單克隆 抗體加入到預先調節的金膠體的分散體中，將整體進行離心沉淀，以除去上清液，將得到的 溶液洗滌幾次，產生金標記的抗體。然后將描述通過化學鍵法標記抗體的方法。抗體具有蛋白質的氨基或SH基。預 先在標記劑中提供可與這些基團反應的官能團，從而使標記劑如熒光物質與待標記物質如 抗體之間形成化學鍵。該方法的一個例子包括這樣一種方法，該方法包括引入具有可與氨 基反應的N-羥基琥珀酰亞胺基、異硫氰酸酯基、硝基芳基鹵基或酰基氯基的標記劑。廣泛用作標記蛋白質的交聯劑的N-羥基琥珀酰亞胺已知在pH 7或更高pH下可有效地與氨基 反應，并且形成高度穩定的酰胺鍵(Biochemistry, Vol. 11,pp. 2291,1972) 0蛋白質上賴氨 酸側鏈的α位和ε位的氨基在反應中可以被琥珀酰亞胺基靶向。特別是，ε位的氨基被 認為是琥珀酰亞胺的普通靶標。例如，當作為標記劑的金細粒與蛋白質如抗體化學結合時， 首先用一種化合物修飾金細粒，該化合物在一端具有至少一個SH基，而在另一端具有與蛋 白質的上述側鏈殘基高度反應性的官能團。然后，該蛋白質可以與該反應性官能團交聯，與 它們結合。但是，由于具有賴氨酸或游離α-氨基酸的殘基非選擇性地成為這些方法的反 應中的目標物，將要標記的蛋白質如抗體的功能可能受到抑制。盡管已知FITC也是具有異 硫氰酸酯基團的熒光物質，但是類似于琥珀酰亞胺，將要標記的蛋白質的所需性質可能由 于與氨基的非特異性反應而減少。此外，-SH基也可以作為交聯點。利用SH基的方法大致被分為馬來酰亞胺法和二 硫吡啶法。馬來酰亞胺法是利用具有馬來酰亞胺作為與SH基選擇性反應的基團的交聯劑 的方法，已知其允許在溫和條件下選擇性交聯。例如，當所要結合的對象是抗體時，切割抗 體分子鉸鏈區中二硫鍵的SH基與抗原識別部分無關，因此該抗體的特異性預計不受影響， 即使SH基被修飾。該SH基用作交聯點，從而允許標記劑結合而不削弱所需的功能。然而， 一個抗體在整個分子內具有16個SS鍵，包括用于保持具有互補決定區(CDR)作為抗原識 別部分的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)的結構的SS鍵。因此如果SS鍵的還原不是 位點特異性進行的，其功能可能被削弱。JP 04-070320 B公開了利用金屬硫蛋白或其片段的蛋白質標記技術，金屬硫蛋白 是能夠與多種金屬離子高親和力螯合的低分子量蛋白質。在該申請中公開了一種技術，其 中金屬硫蛋白在巰基部分與作為標記劑的金屬離子結合，并且在作為交聯點的另一官能團 如胺基、羥基或羧基處與抗體等結合。盡管與金屬離子和與待標記物質結合的位點在金屬 硫蛋白中有區別，并且能夠與將要結合的相應物質結合，但是待標記的物質的結合位點如 其他交聯方法一樣不確定，并且如上所述的問題可能仍然存在。此外，對于由于如上所述通過化學交聯的標記劑固定方法所引起的非選擇性修 飾，解決的手段包括通過基因工程的修飾方法。也能夠產生融合蛋白，其中通過基因工程方 法向蛋白質中引入結合位點。已知的一個例子是這樣一種方法，其中通過化學法將低分子 化合物生物素引入標記劑如熒光物質的末端，并且通過基因工程將已知與上述生物素結合 的完整(鏈霉)親和素或生物素結合位點引入所需蛋白質的N末端或C末端，隨后表達為 融合蛋白并且通過生物素_親和素鍵與標記劑結合。因此，低分子化合物被引入標記劑如 熒光物質中，并且通過基因工程產生了融合蛋白，在該融合蛋白中能夠識別和結合該低分 子化合物的蛋白質被引入所需蛋白質中，從而引入了選擇性結合位點。然而，上述公開的技術沒有公開任何關于選擇性識別和結合以無機物或標記劑為 代表的基板材料表面的結合蛋白分子的技術。因此，當生產結合蛋白或復合蛋白排列在基 板上的結構時，必須用公知方法進行這種排列，例如，包括化學修飾基板或上述結合蛋白以 將該結合蛋白通過共價鍵排列在基板上的方法。類似地，當結合蛋白與金屬或半導體物質 的細粒和標記劑結合時，也必須化學修飾將要結合的細粒或結合蛋白。這種化學修飾通常 針對蛋白質分子中大量包含的氨基殘基或羧基，并且參與該反應的位點是非選擇性的。因 此，發揮所需活性的位點可以是基板結合的或標記的位點，結果，蛋白質的所需活性可能降低。而且，這個問題可能不僅存在于向微裝置轉化的技術中，而且也存在于傳感元件 如生物傳感器的生產中。因此，重要的是將捕獲靶物質的分子如抗體固定在基板上，而同時 保持充分發揮其捕獲功能的分子定向。
發明內容
根據本發明的能夠與金結合的蛋白質是具有金親和力的蛋白質，其特征在于包含 金結合位點，該金結合位點含有金抗體的至少一部分。根據本發明的一個方面，提供了一種金結合復合蛋白，包含(1)第一結構域，其含有具有金親和力的蛋白質；和(2)第二結構域，其含有具有對某些物質的結合位點的蛋白質。根據本發明的另一方面，提供了一種包含基板和蛋白質的結構，其中該基板在其 表面的至少一部分中含有金，該蛋白質是具有上述構造的金結合復合蛋白。根據本發明的另一方面，提供了一種編碼具有上述構造的金結合復合蛋白的核 酸。根據本發明的另一方面，提供了含有所述核酸的載體。根據本發明的另一方面，提供了生產具有上述構造的結構的方法，包括以下步 驟(1)制備所述基板；(2)生產所述金結合復合蛋白；和(3)將該金結合復合蛋白排列在該基板上。根據本發明的另一方面，提供了用于檢測靶物質的試劑盒，包括用于形成具有上 述構造的結構的基板和金結合復合蛋白，和用于檢測靶物質與該結構結合的檢測工具。根據本發明的另一方面，提供了用于用標記劑標記靶物質的連接體，包括一個或多個與靶物質結合的位點，和一個或多個與標記劑結合的位點，其中與靶物質結合的位點和與標記劑結合的位點各自獨立地與將要結合的物質結合； 且與標記劑結合的位點和與靶物質結合的位點中的至少一個含有具有上述構造的 蛋白質。根據本發明的另一方面，提供了一種檢測靶物質的方法，其中靶物質與標記劑結 合并且被其標記，以檢測與該標記劑結合的靶物質，包括以下步驟將標記劑通過具有上述構造的連接體與靶物質結合。根據本發明的另一方面，提供了一種用于檢測靶物質的試劑盒，包括標記劑；具 有上述構造的連接體；和用于檢測該標記劑與靶物質通過該連接體結合的狀態的檢測工具。根據本發明的金結合復合蛋白包括金結合位點和結構部分。因此，當與金結合蛋 白連接和結合的功能性物質被固定在金基板表面時，這種固定不影響該功能性物質的原始 功能。而且，因為在固定中未使用試劑，該功能性物質未經受任何影響其功能的化學反應。 此外，通過與金基板保持距離，該功能性物質不會與基板發生影響其功能的相互作用。另外，本發明的金結合復合蛋白包括至少與金和某些物質結合的幾個結合位點。這允許一種結構形成至少由以下部分組成的分層體(i)在其表面至少一部分中含有金的 基板，(ii)本發明的金結合復合蛋白，和(iii)能夠與本發明的金結合復合蛋白結合的某 種物質。在這種情況下，因為本發明的金結合復合蛋白具有空間穩定的抗體可變區結構域 的β片層結構，在金基板和該某種物質之間能夠保持間距，而與金或金以外的物質(例如 標記劑)結合的金結合蛋白的結構域(例如第二結構域)不會與含金基板發生某些相互作 用，并且能夠保持結合能力。而且，這允許形成極薄且精細的分層結構。利用本發明的金結 合蛋白的這些特性，可以獲得一種檢測裝置。例如，在薄金層中提供能夠與所需物質結合的 本發明的金結合復合蛋白，并且能夠制造用于所需物質的傳感元件。其檢測方法能夠提供 光學手段，例如，應用表面等離振子共振的手段。另一方面，當提供含金物質作為標記劑時，可以使用本發明的金結合蛋白作為連 接體，用于將含金標記劑與靶物質結合。根據作為連接體的這種形式，可以獲得以下所述的 典型效果。第一個效果是，金結合蛋白具有一個或多個各自與靶物質和標記劑結合的位點， 每個結合位點彼此獨立地與將要結合的物質結合，從而提供一種極佳的連接體，該連接體 能夠標記靶物質，并且不顯示所標記的物質與靶物質結合的能力降低，這種降低被認為是 常規標記方法中由標記劑結合引起的問題。第二個效果是，連接體是生物聚合物，更特別的 是蛋白質，因此預期具有高親和力，這是由于靶物質表面與蛋白質的幾個氨基殘基相互作 用而引起的。第三個效果是，連接體是抗體可變區，預期具有結合特異性，因為在由高級結 構確定的構造中限定了結合位點。第四個效果是，標記劑是含有金的物質，從而不僅能夠測 定樣品的散射光的量，而且除了應用增強拉曼或局部等離振子原理的光學測量以外還能夠 利用其電學性質進行電測定。第五個效果是，使用本發明的連接體，可以提供同時或任選地 增加有靶物質/連接體/標記劑的檢測方法和檢測試劑盒。
圖1是一張示意圖，顯示本發明的復合蛋白的一個實施例中一種結構的構造。圖2Α和2Β是示意圖，分別顯示本發明的復合蛋白的一個實施例中一種結構的構造。圖3是一張示意圖，顯示本發明的復合蛋白的一個實施例中一種結構的構造。圖4Α和4Β是示意圖，分別顯示本發明的復合蛋白的一個實施例中一種結構的構造。圖5是一張示意圖，顯示本發明的復合蛋白的一個實施例中一種結構的構造。圖6是一張示意圖，顯示本發明的復合蛋白的一個實施例中一種結構的構造。圖7是一張示意圖，顯示本發明的復合蛋白的一個實施例中一種結構的構造。圖8是一張示意圖，顯示本發明的復合蛋白的一個實施例中一種結構的構造。圖9是顯示SI3R評價本發明獲得的VL的一個實施例的圖。圖10是顯示SI3R評價本發明獲得的VH的一個實施例的圖。圖11是用于說明本發明實施例的載體的示意圖。圖12A和12B是用于說明本發明實施例的載體的示意圖。圖13是用于說明本發明實施例的載體的示意圖。
圖14是用于說明本發明實施例的載體的示意圖。圖15是用于說明本發明實施例的載體的示意圖。圖16是用于說明本發明實施例的載體的示意圖。圖17是顯示SI3R評價本發明獲得的scFv的一個實施例的圖。圖18是實施例21中的SPR圖。圖19是實施例31中的GPC圖。圖20是實施例32中的SPR圖。圖21是實施例34中的SPR圖。圖22是實施例36中的SPR圖。圖23是實施例37中的GPC圖。圖24是實施例38中的SPR圖。圖25是實施例40中的GPC圖。圖26是實施例42中含有金細粒的溶液的吸附曲線。圖27是比較實施例3中的SPR圖。圖28是比較實施例4中的SPR圖。發明最佳實施方式在下文中將描述根據本發明的金結合蛋白，應用該金結合蛋白的復合蛋白，及其 應用。(1)金結合蛋白抗體本發明的金結合蛋白包括抗體的至少一部分。如本發明所示用于結合金的抗體的 例子包括所有脊椎動物的淋巴細胞產生的具有金親和力的抗體，和一種蛋白質，該蛋白質 具有在該抗體的氨基酸序列中含有一個或幾個氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列， 并且在結構和功能上與該抗體具有關系，即，保持需要的金親和力。盡管抗體根據其性質 (免疫或物理)的分類分為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，但是該分類中的任何抗體都可以在 本發明中使用。而且，這些抗體可以形成多聚體。例如，IgA形成二聚體，IgM形成五聚體， 只要它們是能夠與金結合的形狀就沒有問題。金結合抗體的獲得。另外，抗體也可以是IgW 和IgY，只要它們用于體外應用。作為獲得本發明的金結合抗體的方法，可以適當地選擇和進行制備抗血清的技術 和通過細胞融合產生單克隆抗體的技術，這些技術已經常規進行。例如，用本發明中所要結 合的金細粒對適于免疫的動物進行免疫，在證實抗體效價升高后，從血清中收集抗體。上 述免疫通常用如下的方法進行，其中將作為抗原的金細粒用適當的溶劑如生理鹽水溶液稀 釋至合適的濃度，將該溶液，必要時與弗氏完全佐劑一起，靜脈內或腹膜內施用于動物，共3 至4次，間隔為1至2周。這樣免疫的動物在最后一次免疫3天后解剖，使用從切下的脾臟 中獲得的脾細胞作為免疫細胞。用于免疫的金細粒的大小優選為IOnm或更小，更優選2nm 或更小。另外，更優選地，金細粒與蛋白質如血清白蛋白共價連接，使其成為半抗原。至此， 預計難以產生免疫反應的抗原也作為某種蛋白質抗原的一部分被識別，并且通過該抗原與 蛋白質抗原之間形成復合物誘導它的產生。獲得的抗體可以是多克隆的，但是，也可以作為單克隆抗體提供，從而允許選擇對金具有高特異性的克隆。單克隆抗體可以通過克隆產生它的細胞而獲得。通常，免疫 球蛋白形成細胞，例如從接受免疫的動物中采集的脾細胞，與腫瘤細胞融合，從而形成 雜交瘤(Gulfre G.，Nature 266. 550-552，1977)。例如，腫瘤細胞包括骨髓瘤細胞，如 小鼠來源的骨髓瘤 P3/X63-AG8. 653 (ATCC No. CRL-1580)、P3/NSI/l_Ag4_l (NS-I)、P3/ X63-Ag8. Ul (P3U1)、SP2/0_Agl4 (Sp2/0，Sp2)、NSO、PAI、FO 或 BW5147，大鼠來源的骨髓瘤 210RCY3-Ag. 2. 3.，和人源骨髓瘤 U-266AR1、GM1500-6TG-A1-2、UC729-6、CEM_AGR、DIRll 或 CEM-T15 ο在篩選產生單克隆抗體的細胞時，該細胞在滴定板中培養，在觀察到增殖的孔 中培養上清液與上述金細粒的反應性可以通過例如酶免疫試驗來測定，如放射免疫測定 (RIA)或酶聯免疫溶劑測定(ELISA)或免疫沉淀。或者，也可以用表面等離振子共振(SPR) 裝置定量測定金親和力。抗體片段本發明所述的抗體片段是指單克隆抗體的一部分的區域，其具體例子包括 F(ab' )2、Fab，、Fab、Fd、抗體的可變片段(Fv)、單鏈Fv(scFv)、二硫鍵穩定的Fv(dsFv)和 由重鏈可變區(VH)或輕鏈可變區(VL)組成的單結構域抗體(dAv)。此處所用的“F(ab' )2”和“Fab' ”可以通過用例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶作為 蛋白水解酶處理抗體獲得。它們是指通過在抗體鉸鏈區中兩個重鏈(H鏈)之間存在的二 硫鍵附近消化而產生的抗體片段。例如，當用木瓜蛋白酶處理IgG時，該IgG在鉸鏈區中兩 個H鏈之間存在的二硫鍵的上游被切開，產生兩個同源片段，其中由輕鏈可變區(VL)和輕 鏈恒定區(CL)組成的輕鏈(L鏈)和由重鏈可變區(VH)和重鏈恒定區I(CHl)組成的重鏈 (H鏈)通過位于C末端區的二硫鍵結合在一起。這兩個同源抗體片段中的每一個被稱為 Fab’。另外，當用胃蛋白酶處理IgG時，該IgG在鉸鏈區中兩個H鏈之間存在的二硫鍵的下 游切開，從而產生在鉸鏈區中連接的比上述兩個Fab’略大的抗體片段。該抗體片段被稱為 F(ab' )2。本發明的金結合蛋白可以是上述的Fab’或F(ab' )2。該金結合蛋白也可以是Fd 片段，其中VH和上述CHl結合在一起。另外，該金結合蛋白可以是抗體的可變片段(Fv)或其部分，例如，構成Fv的重鏈 可變區(VH)或輕鏈可變區(VL)或其部分。另一方面，對于由上述VH或VL組成的復合物， 可以使用一個區的羧基末端和另一個區的氨基末端通過由幾個氨基酸組成的肽連接在一 起的單鏈Fv(SCFv)。優選地，由上述scFv構成的VH/VL(沒有具體順序)具有由一個或多 個氨基酸組成的接頭。重要的是將氨基酸接頭的殘基長度設計為沒有抑制形成抗原與VH 或VL結合所必需的結構的結合力。作為一個具體例子，氨基酸接頭的長度通常為5-18個 殘基，更廣泛地使用和研究15個殘基。這些片段可以通過基因工程方法獲得。另外，盡管VH和VL中的任一個都可以是單結構域dAb，但是該單結構域結構通常 不穩定，因此可以通過化學修飾如PEG修飾來穩定。另外也可以使用camelid重鏈的可變 區 VHHCJ. Mol. Biol，311 :pl23，2001)和鉸口鯊(Nurse Shark)的免疫球蛋白樣分子 IgNAR 的可變區，IgNAR在體內存在并且能夠作為只含重鏈的抗體起作用。另外，當使用以人和小 鼠抗體為代表的由重鏈和輕鏈組成的抗體VH或VL作為如圖1至4所示的結構域單元時， 也可以利用僅含重鏈抗體的等同物引入VH/VL或類似的界面，以提高穩定性。
金結合位點可包括選自下組的至少一個(1)抗體重鏈可變區(VH)，變體，及其一 部分，和(2)抗體輕鏈可變區(VL)，變體，及其一部分。抗體重鏈可變區(VH)的優選例子 包括具有SEQ ID NO. :1至48的氨基酸序列中至少一個的蛋白質，抗體輕鏈可變區(VL)的 優選例子包括具有SEQ ID NO. :49至57的氨基酸序列中至少一個的蛋白質。可以同樣使 用具有金親和力并且含有一個或多個氨基酸序列的蛋白質，該氨基酸序列在SEQ ID NO. 1 至57的氨基酸序列每一個中具有一個或幾個氨基酸的缺失、取代或添加。具有金親和力的抗體片段的獲得通過酶處理獲得上述抗體用某些酶處理，以獲得一定程度地具有該抗體的抗原結合位點和抗原結 合能力的抗體片段。例如，Fab片段或其類似物可以通過用木瓜蛋白酶處理所獲得的抗體 而獲得。？(油’)2片段或其類似物可以通過用胃蛋白酶處理所獲得的抗體而獲得。除上述 酶法以外，也可以通過化學降解法產生上述抗體片段。該抗體片段可以沒有問題地使用，只 要它具有與金結合的能力。獲得根據本發明的VH或VL的上述Fab’、Fv或dAb的方法也可以是利用基因工程 方法獲得。一個例子是這樣一種方法，在該方法中產生VH或VL的基因文庫，將其廣泛表達 為蛋白質，以根據對金或靶物質的親和力選擇相應基因。基因文庫可以獲自，例如，臍帶血、 扁桃體、骨髓或外周血細胞或脾細胞。例如，從人外周血細胞中提取mRNA，并合成cDNA。然 后，利用編碼人VH或VL的序列作為探針，產生人VH或VL的cDNA文庫。例如，能夠廣泛擴 增人VH家族(VHl至7)的引物以及能夠擴增人VL的引物在本領域中已知。通過將引物與 該VH或VL的每一個組合進行RT-PCR，得到編碼該VH或VL的基因。或者，也能夠采用噬菌 體展示法。在噬菌體展示法中，編碼VH、VL或含有它們的復合物(例如Fab、SCFv)的基因 文庫與編碼噬菌體外殼蛋白的基因結合，產生噬菌粒文庫，該噬菌粒文庫隨后轉化到大腸 桿菌內，表達為具有多種VH或VL作為外殼蛋白一部分的噬菌體。這些噬菌體用于如上所 述根據對金或靶物質的親和力進行選擇。編碼由噬菌體展示為融合蛋白的VH或VL的基因 由該噬菌體中的噬菌粒編碼，因此能夠通過DNA測序來鑒定。本發明還包括編碼上述金結合蛋白的核酸。本發明進一步包括由核酸組成的組 分，其作為將要表達為蛋白質的基因載體提供，用于轉化宿主細胞(例如來源于大腸桿菌、 酵母、小鼠或人的公知的蛋白質表達細胞)，以允許上述金結合蛋白的表達。能夠由一種 表達載體表達的本發明的金結合蛋白可以從整個抗體分子或其抗體片段F(ab’)2、Fab、 Fv (scFV)、VH或VL或其復合物來選擇和設計。當一個表達載體編碼多個上述抗體片段時， 每個抗體片段可以獨立地表達為單個多肽鏈。也可能構建將這些抗體片段表達為一條多肽 鏈的載體，該多肽鏈中結構域連續地或者通過氨基酸連接。在用于表達本發明的金結合蛋白的載體的結構中，可以根據所選擇的宿主細胞， 通過整合入表達轉基因所必需的結構例如已知的啟動子，來設計和構建該載體。可以根據 所選擇的宿主細胞按照已知啟動子等結構來構建該載體。當使用大腸桿菌等作為宿主細胞 時，本發明的金結合蛋白或其組分作為外源基因產物被直接排出到細胞質外部，從而減少 了蛋白酶降解。而且，眾所周知，即使該外源基因產物對細菌有毒性，通過將該外源基因產 物分泌到細菌外部也可以減輕它的作用。大多數穿過已知的胞質膜或內膜分泌的蛋白質通 常在其前體的N末端具有信號肽，在分泌過程中該信號肽被信號肽酶切下，使前體成為成熟蛋白質。大多數信號肽具有堿性氨基酸、疏水性氨基酸和信號肽酶切割位點，它們位于N 末端。通過將編碼以pelB為代表的公知信號肽的核酸定位于編碼本發明的金結合蛋白 的核酸的5’側，可以分泌并表達該金結合蛋白。本發明的幾種金結合蛋白或由多個抗體片段組成的幾種多肽鏈也可以各自獨立 地插入一個載體中。在此情況中，編碼PelB的核酸可以位于每個結構域或者編碼該多肽鏈 的核酸的5’側，以利于分泌。或者，當金結合蛋白表達為由一個或多個結構域組成的多肽鏈 時，編碼pelB的核酸可以位于該多肽鏈的5’側，從而如上所述有利于分泌。其中如上所述 在其N末端融合有信號肽的本發明的金結合蛋白可以從周質部分和培養基上清液中純化。為了方便純化表達的蛋白質的程序，可以通過基因工程將用于純化的標簽排列在 由抗體分子形成的多肽鏈、或者每個獨立的抗體片段、或連續連接的幾個抗體片段的N或C 末端。上述用于純化的標簽的例子包括由六個連續組氨酸殘基組成的組氨酸標簽(下文稱 為HisX6)和谷胱甘肽-S-轉移酶的谷胱甘肽結合位點。引入標簽的方法的例子包括將編 碼用于純化的標簽的核酸插入上述表達載體中編碼金結合蛋白的核酸的5’或3’末端的方 法；以及使用商業上可獲得的載體引入用于純化的標簽。下文將描述利用上述表達載體產生本發明的金結合蛋白的方法。用一種用于表達 金結合蛋白的載體轉化公知的表達蛋白質的宿主細胞，該載體根據宿主細胞設計，從而利 用該宿主細胞中的蛋白質合成系統將本發明的金結合蛋白或作為其成分的多肽鏈合成到 該宿主細胞中。然后，可以從細胞內部或細胞培養上清液中純化并由此獲得積累或分泌到 宿主細胞外部或內部的所需蛋白質。例如，當使用大腸桿菌作為宿主細胞時，可以通過將編 碼以PelB為代表的公知信號肽的核酸定位于編碼本發明金結合蛋白的核酸的5’側來構建 大腸桿菌，以利于向細胞質外分泌和表達。當構成本發明的金結合蛋白的幾個多肽鏈在本發明的一種表達載體中表達時，編 碼pelB的核酸可以位于編碼每個多肽鏈的核酸的5’側，從而有利于其表達時向細胞質外 的分泌。其中如上所述在其N末端融合有信號肽的本發明的金結合蛋白，可以從周質部分 和培養基上清液中純化。在一種純化方法中，當用于純化的標簽是His-標簽時，可以使用 鎳柱純化，當用于純化的標簽是GST時，可以使用固定的谷胱甘肽柱純化。在細菌中表達的本發明的金結合蛋白也可以用不溶性顆粒獲得。在這種情況中， 可以從細胞勻漿溶液中離心不溶性顆粒，在該溶液中從培養液中獲得的細菌用弗氏壓碎器 或超聲波進行勻漿。獲得的不溶性顆粒部分可以用含有含尿素和鹽酸胍的公知變性劑的緩 沖溶液溶解，然后在變性條件下用如上所述的柱純化。對于獲得的柱洗脫級分，變性劑的清 除和活性結構的重建可以通過重折疊程序進行。可以適當地使用任何公知方法作為重折疊 程序。更具體而言，根據所需蛋白質可以使用分步透析法或稀釋法。本發明的金結合蛋白的每個結構域或每個多肽鏈可以在相同的細胞中表達，或者 可以在用另一種宿主細胞表達后彼此共存地復合。另外，使用編碼本發明的金結合蛋白的載體，也可以利用細胞提取溶液在體外表 達該蛋白質。優選使用的細胞提取溶液的例子包括大腸桿菌、麥胚和兔網織紅細胞。但是， 用細胞提取溶液合成蛋白質通常在還原條件下進行。因此，更優選的是進行一些處理用于 在抗體片段中形成二硫鍵。
13
在存在0. Tween 20的緩沖液條件下，本發明的金結合蛋白的優選解離常數 (Kd)為10_6M或更低，更優選10_8M或更低。本發明人已經通過研究證實，在上述條件下， 蛋白質材料不能附著于金上，甚至對金具有較大非特異性附著的蛋白質材料如BSA也是如 此。如果Kd值為10_6或更低，如上所述的非特異性粘附蛋白質的附著行為完全能夠被區別 開。另外，當Kd值為10_8或更低時，金結合蛋白完全可以作為用于固定的錨分子。抗體片段蛋白質的表達金結合蛋白用需要的限制性內切酶切割，例如在上述情況中用Ncol/Nhel切割， 得到編碼金結合抗體片段的DNA。可以將其導入公知的用于在宿主細胞中表達蛋白質的質 粒中，從而得到抗體片段。例如，當使用大腸桿菌作為宿主細胞并且從胞外表達或周質部分 中收集所需的抗體片段時，可以在編碼上述抗體片段的基因的上游引入公知的信號肽。信 號肽包括pelB。為了在表達后容易地從培養上清液或細菌部分中純化需要的蛋白質，可 以融合公知的用于純化的標簽。更具體而言，可以引入6個組氨酸殘基(HisX6)或谷胱甘 肽-S-轉移酶的谷胱甘肽結合位點，得到融合蛋白。對于His-標簽的情況，該融合蛋白可 以用金屬螯合柱如鎳容易地純化。對于GST標簽的情況，可以用具有上面固定有谷胱甘肽 的載體如S^harose的柱進行純化。或者，當在細菌中表達的所需蛋白質不能用不溶性顆粒獲得時，該不溶性顆粒可 以用含有尿素和鹽酸胍的公知緩沖溶液溶解，然后重折疊。可以適當地使用任何公知方法 作為重折疊方法。更具體而言，根據所需蛋白質可以使用分步透析法或稀釋法。如上所述獲得的抗體及其片段，例如Fab、(Fab，)2、Fe、VH或VL，或其復合物，甚 至在其氨基酸序列中具有一個或幾個氨基酸的缺失、取代或添加的，只要具有金親和力就 沒有脫離本發明的范圍。在存在0. Tween 20的緩沖液條件下，本發明的金結合蛋白的優選解離常數 (Kd)為10_6M或更低，更優選10_8M或更低。本發明人已經通過研究證實，在上述條件下，蛋白 質材料不能附著于金上，甚至對金具有較大非特異性附著的蛋白質材料如BSA也是如此。如果Kd值為10_6或更低，非特異性粘附蛋白質的附著行為完全能夠被區別開。另 外，當Kd值為10_8或更低時，金結合蛋白完全可以作為用于固定的錨分子。含有金的待結合物質可以從在其表面的至少一部分中含有金的多種物質中選擇并且使用含有金的待 結合物質。當通過免疫、淘選等選擇金結合蛋白時，待結合物質的表面僅由金組成，用于排 除清除與金以外的物質附著的蛋白質的污染。用于除表面以外的內核基板的材料可以選擇 并且使用(當然)金，以及多種其他已知材料。而且，待結合物質優選以顆粒形式提供，更 優選為1-100μπιΦ的細粒，從而使參與結合的比表面積增加，并且允許在淘選結束時通過 離心容易地收集。另外，如下所述，待結合物質可以是通過將金蒸發到多種商業上可獲得的 塑料板中的任一種例如培養皿或96孔滴定板上而獲得的。在這種情況中，考慮金表面的濕 潤區域和攪拌引起的分子擴散效應，優選地確定孔的大小和數目。待結合物質的形狀可以適當地選擇及使用本領域所知的形狀，如扁平、球形、針狀 或多孔的形狀。成型方法可以適當地選自物理或化學蒸汽淀積法或使用氯化金的化學生產 方法。獲得的含金表面可以預先用酸性溶液、堿性溶液、有機溶劑等洗滌，以便清除雜質如 氧化物層、副產物和污染物，并且具有需要的金暴露條件。
基板可以在多種應用中使用的結構能夠由金結合蛋白和在其表面至少一部分上形成 金的基板獲得。可以使用具有任意形狀和材料的基板，只要它在其表面至少一部分上含有 金并且能夠形成本發明的結構。本發明中使用的基板的材料可以是能夠形成本發明結構的 任何材料，包括選自下組的任何一種或多種或其復合物金屬，金屬氧化物，無機半導體，有 機半導體，玻璃，陶瓷，天然聚合物，合成聚合物，塑料。本發明使用的基板的形狀可以是能 夠形成本發明結構的任何形狀，包括選自以下形狀的任何一種或多種板、顆粒、多孔體樣、 突出、纖絲、圓柱和網狀形狀。用于形成基板的有機聚合化合物的例子包括通過選自下組的可聚合單體聚合而 生產的有機聚合化合物苯乙烯可聚合單體，如苯乙烯、α-甲基苯乙烯、β-甲基苯乙烯、 鄰甲基苯乙烯、間甲基苯乙烯，對甲基苯乙烯、2，4_二甲基苯乙烯，對-正-丁基苯乙烯、 對-叔丁基苯乙烯、對-正-己基苯乙烯、對-正-辛基苯乙烯、對-正-壬基苯乙烯、 對-正-癸基苯乙烯、對-正-十二烷基苯乙烯、對甲氧基苯乙烯、和對苯基苯乙烯；丙烯 酸酯可聚合單體，如丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸正丙酯、丙烯酸異丙酯、丙烯酸正丁 酯、丙烯酸異丁酯、丙烯酸叔丁酯、丙烯酸正戊酯、丙烯酸正己酯、丙烯酸2-乙基己基酯、丙 烯酸正辛酯、丙烯酸正壬酯、丙烯酸環己酯、丙烯酸芐酯、磷酸二甲酯丙烯酸乙酯、磷酸二乙 酯丙烯酸乙酯、磷酸二丁酯丙烯酸乙酯、和2-苯甲酰氧基丙烯酸乙酯；甲基丙烯酸酯可聚 合單體，如甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸正丙酯、甲基丙烯酸異丙酯、甲基 丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸異丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸正戊酯、甲基丙烯酸正 己酯、甲基丙烯酸2-乙基己基酯、甲基丙烯酸正辛酯、甲基丙烯酸正壬酯、磷酸二乙酯甲基 丙烯酸乙酯、和磷酸二丁酯丙烯酸乙酯；亞甲基脂肪族一元羧酸酯；乙烯基酯，如乙酸乙烯 酯、丙酸乙烯酯、苯甲酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、苯甲酸乙烯酯、和甲酸乙烯酯；乙烯基醚，如甲 基乙烯基醚、乙基乙烯基醚、和異丁基乙烯基醚；和乙烯基可聚合單體，包括乙烯基酮，如甲 基乙烯基酮、己基乙烯基酮和異丙基乙烯基酮。此外，無機固體的例子可以包括但是當然不限于粘土礦物，如高嶺土、膨潤土、 滑石和云母；金屬氧化物，如氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋅、磁鐵礦、鐵氧體、NbTa復合氧化物、 W03、In203、Mo03、V205和SnO2 ；不溶性無機鹽，如硅膠、羥基磷灰石和磷酸鈣凝膠；金屬，如金、 銀、鉬和銅；半導體化合物，如GaAs、GaP, ZnS, CdS和CdSe ；玻璃；硅；及其復合物。可以用于形成本發明基板的膜和片的例子包括但當然不限于由塑料組成的膜， 如聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、二醋酸酯、三醋酸酯、玻璃紙、賽璐珞、聚碳酸酯、聚酰亞 胺、聚氯乙烯、聚偏氯乙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯和聚酯；由如下成分組成的多孔聚 合物膜聚氯乙烯、聚乙烯醇、乙酰纖維素、聚碳酸酯、尼龍、聚丙烯、聚乙烯和特氟綸；木制 板；玻璃板；硅基板；織物，如棉花、人造絲、丙烯酸樹脂、絲和聚脂；紙，如優質紙、中質紙、 銅版紙、證券紙、再生紙、鋇白紙、高光澤印刷紙、瓦楞紙、和樹脂印相紙。注意這些膜和片的 材料也可以是光滑的或不平的。基板的例子包括由硅、二氧化硅、玻璃、石英玻璃等制成的基板，通過光刻、蝕刻 和噴砂在基板中形成的微流通道和孔，或者具有在上面形成金、銀和鉬薄膜的表面的基板； 由聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯對苯二甲酸酯(PET)、聚碳 酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)等制成的基板，和通過模制技術在其中形成的微流通道和孔；碳納米管；碳納米孔(nanohones)、富勒烯(fullerenes)、金剛石或其聚集物；由鋁、碳、富勒 烯、ZnO等構成的納米晶須；中孔性薄膜、細粒、和由SiO2、鋁硅酸鹽、其他金屬硅酸鹽、Ti02、 Sn02、Ta205等制成的單塊(monolith)結構構件；金、銀、銅、鉬等的細粒；磁鐵礦、鐵氧體、赤 鐵礦、gammna赤鐵礦、磁赤鐵礦等的三氧化二鐵細粒；鋁/硅混合物膜和利用陽極氧化由其 獲得的氧化硅納米結構構件；多孔氧化鋁薄膜；氧化鋁納米孔結構；和硅納米絲，但不限于 這些。另外，可以根據預期用途不同地選擇本發明的基板的尺寸。 靶物質檢測試劑盒用于檢測靶物質的試劑盒可以用增加了對靶物質的親和力的本發明金結合蛋白 的構造獲得。例如，用于檢測靶物質的試劑盒可以由以下成分構成用于形成上述結構構件 的基板和金結合復合蛋白；和用于檢測靶物質與該結構構件結合的檢測組件。例如，能夠檢 測含有金結合蛋白的蛋白質與靶物質的結合，使得金或含金的標記劑以與含金結合蛋白的 蛋白質結合的狀態加入靶物質中，然后進行物理或化學方法，以檢測金或靶物質。此外，當 靶物質含有金時，利用金結合蛋白對金的親和力使金結合蛋白與含金標記劑結合，然后檢 測其結合狀態。在這種情況下，使用的標記可以是下面將在連接體的描述中描述的那些。而 且，例如，可以根據物理值的變化，如光、電或熱的變化，檢測標記劑與金結合蛋白的結合。另外，增加了對標記劑的親和力的結構優選地可以是利用下面所述金結合復合蛋 白或金結合蛋白作為靶物質與標記劑之間的結合體的結構。·表面等離振子共振裝置另外，含有金結合蛋白的蛋白質與金的結合可以利用例如常規已知的表面等離振 子共振測定裝置進行定量測定。總的來說，表面等離振子共振是一種測量玻璃基板上形成 的金薄膜上折射率變化的方法，這種折射率變化是由金薄膜上自由電子之間的共振產生的 共振角的變化以及入射光從玻璃一側以不超過總反射角的入射角在玻璃與金之間的邊界 表面上產生的隱失波引起的。可以將測量的折射率的變化轉化為目標蛋白質相對于金的 量，然后評價。 解離常數(Kd)術語“解離常數(Kd) ”是指通過將“結合率(Ka)”除以“解離率(kd)”值獲得的 數值。這些速率可以用作表示單克隆抗體或其片段對金的親和力的指標。這些速率可 以用各種方法中的任一種分析。然而在本發明中，使用測量儀器BiaCOre2000 (Amersham PharmaciaBiotech, Co.，Ltd.)，根據安裝在該儀器上的分析軟件，由標準曲線確定這些速率。(2)金結合復合蛋白本發明的金結合復合蛋白包含兩個或多個結構域。在這些結構域中，至少一個結 構域含有如上所述構建的金結合蛋白。復合蛋白的例子包括如下所述構建的復合蛋白。(a) 一種復合蛋白，包括含如上所述構建的金結合蛋白的第一結構域1和含具有 特定物質特異性結合位點的蛋白質的第二結構域2。(b) 一種復合蛋白，除了第一結構域和第二結構域之外，還包括與第一結構域形成 復合物的第三結構域3和與第二結構域形成復合物的第四結構域4中的至少一個。另外，第二至第四結構域中的至少一個可以含有至少一個具有金親和力的蛋白質。在該情況下，這些結構域中的每一個可以通過引入如上所述構建的金結合蛋白而構建。 而且，第一至第四結構域也可以具有對目標結合物質的親和力，它們的親和力可以在結構 域之間獨立地調節。或者，兩個或多個結構域可以具有相似的親和力。這些結構域可以由 具有不同親和力的結構域構建。此外，選自第一至第四結構域中的至少兩個也可以包含于同一多肽鏈中。金結合 復合蛋白的這種構造的例子包括下列結構。(1)其中第一結構域和第二結構域形成一條多肽鏈的結構。(2)其中第一結構域和第二結構域通過一個或多個氨基酸結合的結構。(3)其中第三結構域和第四結構域形成一條多肽鏈的結構。(4)其中第三結構域和第四結構域通過一個或多個氨基酸結合的結構。(5)由含第一結構域和第二結構域的第一多肽鏈和含第三結構域和第四結構域的 第二多肽鏈組成的結構。(6)由含第一結構域和第二結構域的第一多肽鏈和含第三結構域和第二結構域的 第三多肽鏈組成的結構。(7)由含第一結構域和第二結構域的第一多肽鏈和含第一結構域和第四結構域的 第四多肽鏈組成的結構。(8)由至少含第一結構域、第二結構域和第三結構域的一條多肽鏈組成的結構。(9)由至少含第一結構域、第二結構域和第四結構域的一條多肽鏈組成的結構。(10)由含第一至第四結構域的一條多肽鏈組成的結構。 金結合復合蛋白作為金結合復合蛋白的組分提供的蛋白質是指含有至少一條多肽鏈的分子，該多 肽鏈是通過使至少兩個氨基酸結合在一起而形成的，其中該多肽鏈能夠折疊為特定的三維 結構以發揮其內在的功能(例如，轉換和分子識別)。另外，本發明的金結合復合蛋白是 含有至少一個金結合位點以及至少一個對金或金以外其他物質的結合位點的復合蛋白，因 而顯示多價的親和力或多特異性。例如，該復合蛋白優選地可包括具有金結合位點并且含 有抗體輕鏈可變區(VL)或重鏈可變區(VH)至少一部分的第一結構域，和具有對特定物質 (在下文中稱為靶物質)的結合位點并且含有VH或VL至少一部分的第二結構域。在下文 中，與金結合的VH和VL分別稱為VH (G)和VL (G)。與靶物質結合的VH和VL分別稱為VH⑴ 和 VL(T)。抗體重鏈可變區(VH)和抗體輕鏈可變區(VL)是分別屬于抗體重鏈和抗體輕鏈的 可變區。通常，抗體重鏈可變區(VH)和抗體輕鏈可變區(VL)中的每一個都是管狀結構，并 且由大約110個氨基酸組成，然后與以相反方向排列的β片層組形成分層結構，而該層結 構利用單S-S鍵連接，形成極穩定的結構。另外，眾所周知可變區(VH或VL)是決定抗體與 多種抗原結合的互補決定區(CDR)。VH和VL中各有三個CDR，它們彼此被具有多樣性較低 的氨基酸序列的構架區隔開，從而識別靶識別位點的官能團的空間排列，使得更高級地識 別特定分子。下文中將描述本發明的金結合復合蛋白的一個實施例。如圖1所示，金結合復 合蛋白的最小單元包括第一結構域和第二結構域。結構域組合的例子包括如(a)所示的 VH(G)-VH(T)^B (b)所示的 VH(G)-VL(T),如(c)所示的 VL(G)-VH(T)和如(d)所示的VL (G) -VL (T)。在該實施例中，獨立地，第一結構域與金結合，第二結構域與靶物質結合，在 第一和第二結構域之間不形成互補的結合位點。第一和第二結構域可以是分別獨立的多肽 鏈，或者它們可以連續地相互對齊和連接。為了簡化生產過程和功能表達，更優選的實施方 案是通過連續地連接多肽鏈而形成多肽鏈。對于通過連續連接第一結構域和第二結構域制 備的多肽鏈，第一結構域和第二結構域可以直接彼此連接，或者可以通過由一個或多個氨 基酸構成的接頭5連接。由氨基酸組成的接頭優選地是由1-10個氨基酸組成的，更優選是 由1-5個氨基酸組成的。當接頭具有11-15個氨基酸的長度時，第一結構域和第二結構域 之間的互補結合(成為scFv)可以形成，因為這些結構域由于排列而具有極少的限制。為 了防止在VH和VL之間形成互補復合物，眾所周知通過縮短接頭的長度而在結構域之間施 加結構限制是有效的。理想的是，當第一和第二結構域中的每一個與靶物質結合時造成的 結構改變不會影響所需的與靶物質結合的能力。因此，有可能設置由第二種結構如α-螺 旋組成的接頭或插入與需要的結合特性無關的多肽，只要它們不顯著影響需要的特性或生 產能力。此外，本發明的金結合復合蛋白與第一結構域形成復合物。它可包括含有VH或VL 至少一部分的第三結構域和/或含有VL或VH至少一部分的第四結構域，該第四結構域與 第二結構域形成復合物。更希望的是使第三結構域與第一結構域形成復合物，從而與第一 結構域形成互補的金結合位點。例如，當第一結構域是如圖2Α和2Β所示的VH(G)時，第三結構域優選的是能夠與 第一結構域形成FV的VL，更優選的是形成一種結構，使得通過連接第一結構域和第三結構 域形成金結合位點。如上所述，第一結構域和第三結構域形成Fv，以獲得結構穩定性并且預期防止由 于結構改變引起的功能減弱。此外，當第三結構域通過與第一結構域連接形成金結合位點 時，能夠預期結合能力進一步提高(例如，結合速率提高和解離速率受到抑制)。此外，如圖2A所示，第一結構域和第三結構域可以分別作為獨立的多肽鏈提供， 或者可以彼此連接形成多肽鏈(例如，第三結構域_第一結構域_第二結構域，如圖2B的 示意圖所示，可以適當地確定結構，以便對金和靶標發揮結合能力)。此外，作為另一個實施 例，如圖3的示意圖所示的結構可以允許。換句話說，它是由第一結構域和第二結構域組成 的多肽鏈以及第三結構域和第二結構域組成的多肽鏈構成的復合物。在該情況下，通過由 第一和第三結構域形成的Fv或Fv樣復合物實現與金的結合，然后第一結構域作為通過第 二結構域與靶物質結合的錨。此外，本發明的金結合蛋白可以包括由VH或VL的至少一部分組成的第四結構域， 它與第二結構域形成復合物。希望的是以互補的方式與第二結構域一起形成對靶物質的結 合位點。例如，如圖4A的示意圖所示，當第二結構域是VL時，第四結構域優選的是能夠與 第二結構域形成Fv的VH。更優選地，第二結構域和第四結構域連接在一起，形成針對靶物 質的結合位點。此外，如圖4B的示意圖所示，可以通過將第一、第二和第四結構域連接在一 起形成多肽鏈。特別是如果蛋白質通過第一結構域表面的至少一部分與金基板結合，而同時通過 第二和第四結構域與靶物質結合，并且當第一結構域與該基板結合時發生不可逆的結構改 變，則通過設置接頭有可能使得對第二和第四結構域的結合能力的影響最小化。
而且，本發明的金結合蛋白可以如圖5的示意圖所示構建。即，它是由第一結構域 和第二結構域組成的多肽鏈以及第一結構域和第四結構域組成的多肽鏈構建的復合物。在 此情況中，該復合物通過由第二結構域和第四結構域組成的Fv或Fv樣復合物與靶物質結 合，使第一結構域作為錨，用于上述兩條多肽鏈與金結合。此外，本發明的金結合蛋白可以包括第三和第四結構域作為組成材料。如圖6的 示意圖所示，第三和第四結構域可以是分別獨立的多肽鏈。或者，如圖7的示意圖所示，它 可以是通過在多肽鏈間連接而獲得的多肽鏈。當金結合蛋白作為連接的多肽鏈提供時，第 三結構域和第四結構域可以直接連接在一起，或者可以如圖7所示通過由一個或多個氨基 酸組成的接頭連接。接頭的長度可以限定為，如上所述，由氨基酸組成的接頭具有優選1至 10個氨基酸，更優選1至5個氨基酸的氨基酸長度。此外，如圖8的示意圖所示，第一至第四結構域可以在一條多肽鏈中連接在一起。 在這種情況中，這些結構域的排列使得第一結構域和第三結構域能夠形成復合物，然后該 復合物能夠與金結合，同時第二結構域和第四結構域能夠形成復合物，然后該復合物能夠 與金和金以外的其他物質結合。因此，接頭優選地設置在結構域之間。例如，1至5個氨基 酸位于第一和第二結構域之間或第三和第四結構域之間。另外，15至25個氨基酸位于氨基 酸的第二和第四結構域之間。在類似的結構中，第一和第二結構域以及第三和第四結構域 中的每一個或兩個可以相互取代。根據需要的金結合蛋白的性質，如對金或靶標的親和力和長期穩定性，可以適當 地選擇并且限定一條多肽鏈中每個結構域的序列。第一結構域是，例如，含有選自SEQ ID No 1至SEQ ID No 57的至少一個氨基酸 序列的結構域。在這些氨基酸序列的每一個中，只要該氨基酸保持其金親和力，即使該氨基 酸序列具有一個或幾個氨基酸的缺失、取代或添加，也沒有問題。此外，只要它顯示金親和 力，即使該氨基酸序列為氨基酸序列的一個構成部分，或者為其復合物，它也可以沒有任何 問題地用作本發明的金結合蛋白。具有SEQ ID No :1至SEQ ID No :57的本發明VH的具 體例子在SEQ ID No:58至SEQ ID No :74中表示。另外，本發明的VL的具體例子在SEQ IDNo 75 至 SEQ ID No 77 中表示。優選地，第三結構域含有選自SEQ ID No :1至SEQ ID No 57的一個或多個氨基 酸。此外，第三結構域更優選地通過根據第一結構域從SEQ ID No 58至SEQ ID No 77中 適當地選擇而限定。本發明還包括編碼上述金結合復合蛋白的核酸。另外，本發明還包括由核酸組成 的構建體，作為載體用于轉化宿主細胞(例如來自大腸桿菌、酵母、小鼠、人等的公知的蛋 白質表達細胞)。編碼能夠構成本發明金結合蛋白的第一和第三結構域的示例性核酸序列 在 SEQ ID No 98 至 SEQ ID No 116 中表示。能夠由上述一種表達載體表達的本發明金結合蛋白的每個結構域可以通過從1 至4中選擇而設計。當一種表達載體由本發明的金結合蛋白的多個結構域編碼時，每個結 構域可以表達為獨立的多肽鏈。另外，可以獲得表達為一條多肽鏈的載體結構，其中結構域 直接或者通過氨基酸結合。此外，可以根據所選擇的宿主細胞，通過向表達所需結構中引入 轉基因，如已知的啟動子，設計和構建用于本發明金結合蛋白的表達載體的結構。可以根據 所選擇的宿主細胞，參照已知啟動子等的結構來構建載體的結構。而且，當使用大腸桿菌等作為宿主細胞時，本發明的金結合蛋白是外來基因產物，被快速清除到細胞質外，從而減少 了蛋白酶的分解。此外，當基因產物可能對細菌細胞有毒時，通過分泌到細胞體外有可能減 弱其作用。通常，大多數穿過已知細胞膜或內膜分泌的蛋白質在其N末端上具有肽酶的信 號肽。在分泌步驟中，信號肽酶切割該蛋白質，使其成為成熟蛋白質。許多信號肽在其N末 端具有堿性氨基酸、疏水性氨基酸和信號肽酶的酶切位點。通過將編碼以單肽pelB為代表的公知信號肽的核酸排列在編碼本發明金結合復 合蛋白的核酸的5’末端上，可以表達并分泌該肽鏈。另外，構成本發明的金結合復合蛋白的 每個結構域或由兩個或多個結構域構成的多肽鏈可以獨立地插入一個載體中。在這種情況 下，將編碼pelB的核酸排列在編碼每個結構域或多肽鏈的核酸的5’末端上，以促進分泌。 為了將該多肽鏈表達為由一個或多個結構域組成的多肽鏈，同樣，通過將編碼pelB的核酸 排列在該多肽鏈的5’末端上可以促進這種多肽鏈的分泌。這樣，在其N末端融合有信號肽 的本發明的金結合蛋白，或者作為其組分的結構域，可以從周質部分和培養物的上清液中 純化。另外，鑒于在純化表達的蛋白質時易于進行，可以通過基因工程方法將純化標簽排列 在每個獨立結構域上或通過組合兩個或多個結構域形成的多肽鏈的N或C末端上。該純化 標簽可以是由連續排列的6個組氨酸殘基組成的組氨酸標簽(在下文中稱為His x 6)、谷 胱甘肽-S-轉移酶的谷胱甘肽結合位點，等等。作為引入該標簽的方法，例如，這樣一種方 法，其中將編碼純化標簽的核酸插入表達載體中編碼金結合蛋白的核酸的5’或3’末端，或 者利用商業上可獲得的載體引入純化標簽的方法。下文將描述利用上述表達載體產生本發明的金結合復合蛋白的方法。本發明的金結合復合蛋白或作為其組分提供的多肽鏈如下合成將根據宿主細胞 設計的用于表達金結合復合蛋白的載體轉化到用于表達常規已知蛋白質的宿主細胞中；利 用該宿主細胞中的蛋白質合成系統在該宿主細胞中產生需要的蛋白質。之后，從細胞內部 或細胞培養上清液中純化積累或分泌到宿主細胞內部或外部的目標蛋白質。例如，在使用大腸桿菌作為宿主細胞的情況下，將編碼以pelB為代表的常規已知 信號肽的核酸排列在編碼本發明金結合復合蛋白的核酸的5’末端，從而有利于分泌型表 達。為了利用一種表達載體表達兩個或多個多肽鏈以獲得組成本發明的金結合復合蛋白的 每個結構域，將編碼pelB的核酸排列在編碼每個多肽鏈的核酸的5’末端，以利于向細胞質 外的分泌。這樣，可以從周質部分和培養上清液中純化本發明的金結合蛋白，其中單一肽在 其N末端融合。作為一種純化方法，當純化標簽是His標簽，并且當柱是鎳螯合柱或GST時， 可以利用谷胱甘肽固定柱進行純化。另外，在細菌細胞中表達的本發明的金結合復合蛋白可以以不溶性顆粒的形式獲 得。在此情況下，從培養基中獲得的細菌細胞可以用弗氏壓碎器或超聲波破碎，然后從細胞 勻漿溶液中離心不溶性顆粒。將獲得的不溶性顆粒部分溶解在含有公知變性劑包括尿素和 鹽酸胍的緩沖液中，然后在如上所述的變性條件下過柱純化。獲得的柱洗脫級分可以進行 重折疊，以除去變性劑，并重新構建活性結構。使用的重折疊方法可以從本領域公知的任何 方法中適當地選擇。特別是，根據目標蛋白質，可以使用系列稀釋法、稀釋法等。本發明的金結合蛋白的每個結構域或每個多肽鏈可以在同一宿主細胞中表達，然 后復合，或者用其他宿主細胞表達，并使其共存，從而形成復合物。此外，使用編碼本發明的金結合蛋白的載體，可以從細胞提取物中體外表達蛋白質。在此適當使用的細胞提取物包括大腸桿菌、麥胚和兔網織紅細胞。但是，在上述無細胞 提取物中的蛋白質合成一般在還原條件下進行。因此，更優選的是進行任何一種處理，以在 抗體片段中形成二硫鍵。在存在0. l^Tween 20的緩沖液條件下，本發明的金結合復合蛋白具有10_6M或 更低，更優選10_8M或更低的解離常數(Kd)。在上述條件下，本發明人已經研究并證實被認 為顯示與金具有較高吸附的蛋白質材料均不能吸附到金上。當Kd值為10_6M或更低時，它 與具有非特異性吸附性的蛋白質的吸附行為完全能夠區別開。此外，10_8M或更低允許完全 能夠作為用于固定的錨分子。作為獲得具有與含金靶物質結合能力的本發明抗體重鏈可變區(VH)或抗體輕鏈 可變區(VL)的一種方法，有這樣一種方法，包括制備上述VH或VL的基因文庫；將其廣泛 地表達為蛋白質；在蛋白質與基因之間建立對應關系，以根據對金或靶物質的親和力選擇 一個。上述基因文庫可以從臍帶血、扁桃體、骨髓、外周血細胞、脾細胞等獲得。例如，從人 外周血細胞中提取mRNA以制備cDNA。然后，利用人VH-或VL-編碼序列作為探針，制備人 VH或VL的cDNA文庫。例如，能夠廣泛擴增每一家族的人VH家族(VH1-7)的引物和能夠 擴增人VL的引物在本領域中公知。將每個VH或CL、引物組合在一起進行RT-PCR，以獲得 VH-或VL-編碼基因。或者，可以使用噬菌體展示方法。噬菌體展示方法包括將用于編碼 VH、VL或含有VH或VL的復合物(例如Fab、SCFv)的基因文庫與編碼噬菌體外殼蛋白的基 因相組合；制備噬菌粒文庫；將該噬菌粒文庫轉化入大腸桿菌；表達為含有不同VH或VL作 為外殼蛋白的部分的噬菌體。使用這些噬菌體，以及上述描述，能夠根據對金或靶物質的親 和力進行選擇。在噬菌體中表達為融合蛋白的編碼VH或VL的基因在該噬菌體的噬菌粒中 編碼。因此，它可以通過DNA序列分析詳細說明。此外，從用金或靶物質免疫的動物中采集產生目標抗體的細胞，然后可以使用如 上所述相同的引物測定VH或VL的堿基序列或氨基酸序列。此外，可以根據已知抗體或其片段中可變區的氨基酸序列針對靶物質設計本發明 的第三和第四結構域。另外，當沒有獲得針對靶物質的抗體或其片段時，通過在獲得其抗體 后分析氨基酸序列如上所述進行設計是可能的。第三結構域和第四結構域可以是構成本發 明的金結合蛋白的那些結構域。這樣，用如此獲得的VH或VL堿基序列制備本發明的金結 合復合蛋白。 含金的結合物作為用于通過免疫、淘選等選擇金結合蛋白的結合物，可以使用前面在金結合蛋 白情況中舉例說明的那些。 基板本發明的金結合復合蛋白可以與基板組合，以提供能夠在多種用途中使用的結 構。能夠用于這些用途的基板是前面對于金結合蛋白舉例說明的那些。 靶物質本發明的金結合復合蛋白由具有金親和力的結構域和具有靶物質親和力的結構 域構成，因此利用蛋白質作為復合蛋白檢測靶物質是可能的。作為檢測對象提供的靶物質 可以是在使用抗原/抗體反應的相應程序中作為抗原提供的任何分子。例如，靶物質可以 大致分類為非生物物質和生物物質。
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具有高工業應用價值的非生物材料的例子包括PCB和二噁英，它們是具有不同氯 取代數目和位置的環境污染物，和破壞內分泌的物質，即所謂的環境激素(例如六氯苯、五 氯酚、2，4，5_三氯乙酸、2，4_ 二氯苯氧代乙酸、氨基連三唑、阿特拉津、甲草胺、六氯環己 烷、對硫磷、氯丹、氧氯丹(oxychlordane)、九氯(nanochlor)、1，2-二溴-3-氯丙烷、DDT、 開樂散、艾氏劑、異狄氏劑、狄氏劑、硫丹(benzoepin)、七氯、七氯環氧化物、馬拉硫磷、滅多 蟲、甲氧氯、滅蟻靈、除草醚、毒殺芬、氟樂靈、烷基酚(碳原子數為5-9)、壬基苯酚、辛基壬 基苯酚(0Ctyn0nylphen0l)、4-辛基苯酚、雙酚A、二-2-乙基己基鄰苯二甲酸酯、丁基苯基 鄰苯二甲酸酯、鄰苯二甲酸二正丁基酯、鄰苯二甲酸二環己酯、鄰苯二甲酸二乙酯、苯并芘、 2，4_ 二氯苯酚、二-2-乙基己基己二酸酯、二苯甲酮、4-硝基甲苯、八氯苯乙烯、涕滅威、苯 菌靈、開蓬(十氯酮)、manZeb (代森錳鋅)、代森錳、代森聯、賽克津、氯氰菊酯、順式氰戊菊 酯(esfenvalerate)、氰戊菊酯、撲滅司林、乙烯菌核利(vinclozolin)、代森鋅、福美鋅、鄰 苯二甲酸二戊酯、鄰苯二甲酸二己酯和鄰苯二甲酸二丙酯)。生物材料包括選自核酸、蛋白質、糖鏈、脂質和其復合物的生物材料，更特別地包 括選自核酸、蛋白質、糖鏈和脂質的生物材料。特別地，本發明可以應用含有選自下組任一 物質的任何材料DNA、RNA、適配子(aptamer)、基因、染色體、細胞膜、病毒、抗原、抗體、凝 集素、半抗原、激素、受體、酶、肽、神經鞘糖脂和鞘脂。另外，產生上述“生物物質”的細菌或 細胞本身也可以是作為本發明中目標“生物物質”的靶物質。蛋白質的具體例子包括所謂的疾病標志。其例子包括a-胎蛋白(AFP)，作為肝 細胞癌(原發性肝癌)、肝母細胞瘤、轉移性肝癌和卵黃囊瘤的標志，它是胎兒期肝細胞產 生的并且存在于胎兒血中的酸性糖蛋白；PIVKA-II，它是在肝實質疾病過程中出現的異常 凝血酶原，并且發現在肝細胞癌中特異性出現；BCA225，為原發性晚期乳腺癌和再發及轉 移性乳腺癌的標志，它是對于乳腺癌免疫組化特異的抗原糖蛋白；堿性胎兒蛋白(BFP)，為 卵巢癌、睪丸腫瘤、前列腺癌、胰腺癌、膽管癌、肝細胞癌、腎癌、肺癌、胃癌、膀胱癌和結腸癌 的標志，它是在人胎兒血清、腸和腦細胞提取物中發現的堿性胎兒蛋白；CA15-3，為進行性 乳腺癌、再發性乳腺癌、原發性乳腺癌和卵巢癌的標志，它是一種糖鏈抗原；CA19-9，為胰 腺癌、膽管癌、胃癌、肝癌、結腸癌和卵巢癌的標志，它是一種糖鏈抗原；CA72-4，為卵巢癌、 乳腺癌、結腸直腸癌、胃癌和胰腺癌的標志，它是一種糖鏈抗原；CA125，為卵巢癌(特別是 漿液性囊腺癌)、子宮體腺癌、輸卵管癌、子宮頸腺癌、胰腺癌、肺癌和結腸癌的標志，它是 一種糖鏈抗原；CA130，為上皮卵巢癌、輸卵管癌、肺癌、肝細胞癌和胰腺癌的標志，它是一 種糖蛋白；CA602，為卵巢癌(特別是漿液性囊腺癌)、子宮體腺癌和子宮頸腺癌的標志，它 是一種核心蛋白抗原；CA54/61 (CA546)，為卵巢癌(特別是粘漿液性囊腺癌)、子宮體腺癌 和子宮頸腺癌的標志，它是一種母細胞核糖鏈相關抗原；目前最廣泛地用于輔助癌癥診斷 的癌胚抗原(CEA)，目前作為腫瘤相關標志抗原最廣泛地用于輔助診斷癌癥，如結腸癌、胃 癌、直腸癌、膽管癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、子宮癌和泌尿系統癌；DUPAN-2，為胰腺癌、膽管 癌、肝細胞癌、胃癌、卵巢癌和結腸癌的標志，它是一種糖鏈抗原；彈性蛋白酶1，為胰腺癌、 胰池(pancreaticcisterna)和膽管癌的標志，它是存在于胰臟中的外分泌胰蛋白水解酶， 它特異性水解結締組織的彈性纖維彈性蛋白(構成動脈壁、肌腱等)；免疫抑制酸性蛋白 (IAP)，為肺癌、白血病、食管癌、胰腺癌、卵巢癌、腎癌、膽管瘤、胃癌、膀胱癌、結腸癌、甲狀 腺癌和惡性淋巴瘤的標志，它是以高濃度存在于人類癌癥患者腹脾水或血清中的糖蛋白；NCC-ST-439，為胰腺癌、膽管癌、乳腺癌、結腸癌、肝細胞癌、肺腺癌、和胃癌的標志，它是一 種糖鏈抗原；、~精漿蛋白(、"Sm)，為前列腺癌的標志，它是一種糖蛋白；前列腺特異性抗 原(PSA)，它是從人類前列腺組織中提取的一種糖蛋白質，并且僅存在于前列腺組織中，因 此是前列腺癌的標志；前列腺酸性磷酸酶(PAP)，用作前列腺癌的腫瘤標志，它是在酸性pH 下水解由前列腺分泌的磷酸鹽的酶；神經元特異性烯醇酶(NSE)，為肺癌(特別是肺小細 胞癌)、神經母細胞瘤、神經系統腫瘤、胰島癌、咽喉小細胞癌、胃癌、腎癌和乳腺癌的標志， 它是在神經組織和神經內分泌細胞中特異性存在的糖酵解酶；鱗狀細胞癌相關抗原(SCC 抗原)，為子宮癌(子宮頸鱗癌)、肺癌、食管癌、頭頸癌和皮膚癌的標志，它是從子宮頸鱗 癌的肝轉移灶中提取并純化的蛋白質；唾液酰Lex-i抗原(SLX)，為肺腺癌、食管癌、胃癌、 結腸癌、直腸癌、胰腺癌、卵巢癌和子宮癌的標志，它是一種糖鏈抗原；SPan-1，為胰腺癌、膽 管癌、肝癌、胃癌和結腸癌的標志，它是一種糖鏈抗原；組織多肽鏈抗原(TPA)，為食管癌、 胃癌、結腸直腸癌、乳腺癌、肝細胞癌、膽管癌、胰腺癌、肺癌和子宮癌的標志，它是單鏈多肽 鏈，與其他腫瘤標志結合尤其可用于估計進行性癌癥和再發的預測/治療進程觀察；唾液 酰Tn抗原(STN)，為卵巢癌、轉移性卵巢癌、胃癌、結腸癌、膽道系統癌、胰腺癌和肺癌的標 志，它是一種母細胞核碳水化合物抗原；細胞角蛋白(CYFRA)，為一種有效的腫瘤標志，用 于檢測肺非小細胞癌，特別是肺鱗狀細胞癌；胃蛋白酶原(PG)，為胃潰瘍(特別是低位胃潰 瘍)、十二指腸潰瘍(特別是再發的和難治性病例)、布倫納腺瘤(Brurmer' s gland oma)、 Dzo ringer Ellison綜合征和急性胃炎的標志，它是作為蛋白水解酶分泌到胃液中的兩 種胃蛋白酶(PG I，PG II)的無活性前體，作為分泌到胃液中的蛋白水解酶；C-反應蛋白 (CRP)，它是組織損傷和感染引起的在血漿中改變的急性期反應物，當由于急性心肌梗塞等 在心肌中發生壞死時顯示高水平；血清淀粉樣蛋白A蛋白(SAA)，它是組織損傷和感染引起 的在血漿中改變的急性期反應物；肌紅蛋白，為急性心肌梗塞、肌營養不良、多肌炎攻和皮 肌炎的標志，它是分子量約為17’ 500的血紅素蛋白，主要存在于心肌和骨骼肌中；肌酸激 酶(CK) (3種同工酶，來源于骨骼肌的CK-MM型，來源于腦和平滑肌的CK-BB型，和來源于心 肌的CK-MB型，和線粒體同工酶或免疫球蛋白結合型CKOiiacroCK))，為急性心肌梗塞、甲狀 腺機能減退、進行性肌營養不良和多肌炎的標志，它是主要存在于骨骼肌或心肌的可溶性 部分中的一種酶，由于細胞損傷而遷移到血液中；肌鈣蛋白T，為橫紋肌溶解、心肌炎、心肌 梗塞和腎衰竭的標志，它是分子量為39，000的蛋白質，與橫紋肌細肌絲上的肌鈣蛋白I和 C形成肌鈣蛋白復合物，并且參與肌肉收縮的調節；心室肌肌球蛋白輕鏈I，為急性心肌梗 塞、肌營養不良和腎衰竭的標志，它是在骨骼肌和心肌中均含有的蛋白質，其測量值的升高 意味著骨骼肌和心肌的疾病或壞死；或者作為應激標記最近受到越來越多關注的嗜鉻粒蛋 白A、硫氧還蛋白和8-0hdG。用于檢測靶物質的試劑盒本發明的金結合復合蛋白可以用于組成檢測靶物質的試劑盒。例如，用于檢測靶 物質的試劑盒可以這樣構成，其包括在第二結構域和任選使用的第四結構域中利用特異 性結合靶物質的抗體及其變體的金結合復合蛋白，具有含金表面的基板；和用于檢測通過 金結合復合蛋白固定在基板上的靶物質的檢測工具。通過金結合復合蛋白固定在金基板上 的靶物質可以用上述表面等離振子共振裝置檢測。可以使用這樣一種方法，其中使用在其 一部分中含有金的基板作為標記劑來檢測靶物質。上述金結合復合蛋白可以用作介導這種金基板、標記劑和靶物質的物質。使用識別和結合靶物質的抗體片段形成的金結合復合蛋 白能夠在本發明中使用。
實施例下面將要詳細描述作為本發明一個實例的能夠與金結合的蛋白質的獲得和評價。 但是，本發明不限于“實施例”中所述的內容實施例1 (抗體重鏈可變區VH文庫的制備)使用來源于成人外周血B淋巴細胞的Fab文庫作為模板，利用下列引物，按照PCR 推薦方法(TAKARA BIO INC, LA試劑盒)，將VH編碼基因進行DNA復制。引物如下。 反向引物(SEQ ID No 78)5' -TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG-3'(SEQ ID No 79)5' -TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGRTYCAGCTGGTGCAGTCTGG-3'(SEQ ID No 80)5' -TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGSTRCAGCTGCAGSAGTCRGG-3'(SEQ ID No 81)5' -TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCSARGTGCAGKTGGTGGAGTCTGG-3'(SEQ ID No 82)5' -TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGG-3'(SEQ ID No 83)5' -TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTACAGSAGTGGGG-3' 正向引物(SEQ ID No 84)5' -ATTCTCGACTGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC-3'(SEQ ID No 85)5' -ATTCTCGACTGCTAGCTGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC-3'(SEQ ID No 86)5' -ATTCTCGACTGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC-3'(SEQ ID No 87)5' -ATTCTCGACTGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC-3'(1)用Fab文庫作為模板，用引物通過PCR擴增VH編碼基因。PCR條件 95V X10min(94°C Xlmin，60°C X2min，72°C X 2min) X 35 個循環，72°C X6min。(2)制備如圖 11 所示通過改進 pLUCK(Biochem Biophys ResCommun. 218，pp682, 1996)的多克隆位點而獲得的質粒pRA-XX作為蛋白質表達載體。(在Hindlll后排列有編 碼pelB的核苷酸序列作為信號肽。然后在Ncol和EcoRI之間以Nhel/SacII/Spel的順序 排列限制性內切酶位點。編碼HisX6的核苷酸序列設置于SacII/Spel之間。另外，氨芐 青霉素抗性基因、T7啟動子、lac操縱子和T7終止序列與pluck相同)。(3)按照推薦方法用限制性內切酶在Ncol/Nhel (均獲自NewEngland Biolabs)之間切割PCR產物和質粒。用限制性內切酶切割的質粒的溶液過自旋柱400HR(AmaShamScience)。(4)用限制性內切酶切割的PCR片段的溶液利用商業上可獲得的凝膠純化試劑盒 (SV Gel and PCR Clean-up 系統Promega)純化。(5)應用商業上可獲得的T4連接酶試劑盒(Roche)按照供應商推薦的方法將上述 兩條片段混合，然后連接。結果獲得如圖12A所示的VH編碼基因插入載體。(6)用該連接產物通過電穿孔轉化大腸桿菌DS12S株。大規模制備質粒。(7)系列稀釋這些質粒溶液，每份溶液都通過電穿孔轉化大腸桿菌BL21 (DE3)。向 溶液中加入700iiL LB培養基，整體在37°C下振蕩培養1小時。培養溶液以6，OOOrpm離心 5分鐘，然后棄去650 u L上清液。(8)將剩余的上清液和沉淀部分懸浮，將該懸浮液接種于LB/Amp平板上。然后整 個置于37°C過夜。結果最終獲得含有約5X 105個克隆的抗體VH文庫。(9)然后，從三個103倍稀釋平板上任意選擇1，000個菌落，根據以下步驟制備蛋 白質粗提物。每個菌落在3mL LB/amp液體培養基中傳代培養，整體在28°C下振蕩培養6小 時。然后，加入IPTG至終濃度為ImM，整體再振蕩培養12小時。(10)接著，通過離心(10，500rpmX5min)獲得培養物部分和上清液細菌部分。(11)將得到的細菌部分加至在冰中冷卻的200iiL滲透溶液(0.5M蔗糖，1M Tris-HCl(pH 8. 0),0. 5mM EDTA)中并懸浮，整體置于冰中10分鐘。然后加入lmL冷卻的 無菌水，整體置于冰中1小時。將產物離心(6，OOOrpmX30min)后，將上清液置于透析袋 (MWC0 10,000)中，使用 Tris+0. 1% Tween 20 溶液(20mM Tris,500mM NaCl)作為外部溶 液透析18小時，每6小時更換一次外部溶液。用上述步驟中獲得的透析內部溶液作為模板用于篩選金結合抗體重鏈可變區 (VH)。實施例2 (金結合抗體重鏈可變區(VH)的篩選)制備沉積有金(厚度為lOOnm)的96孔滴定板作為篩選金結合抗體重鏈可變區 (VH)的基板。將250 yL實施例1中獲得的1，000份樣品溶液分配到各孔中，該滴定板輕輕 振蕩1小時。棄去上清液后，倒置該滴定板并在紙巾上輕拍10次除去水。進行洗滌步驟， 包括向每孔加入200 u L Tris+0. 1% Tween 20 ；輕輕振蕩滴定板10分鐘。該操作重復3 次。將200 ii L通過用Tris+0. Tween 20溶液以1 10，000稀釋HRP結合的抗-His 抗體(Invitrogen)而制備的抗體溶液分配到各孔中，輕輕振蕩滴定板1小時。然后進行 與洗滌步驟相同的操作。將各100 u L HRP底物和作為顯色劑的檢測試劑1和2 (Amasham Science)分配到各孔中，輕輕振蕩滴定板1小時。檢測魯米諾化學發光水平。如上所述觀察到化學發光的15個樣品菌落在1. 5mL LB/amp.中傳代培養，整體在 37°C下振蕩培養過夜。利用SV MiniPrep DNA純化系統(Promega)從得到的細菌中純化質 粒。如上所述獲得的17個展示VL的噬菌粒的DNA序列按照下列方法測定。測序引物設置 于表達載體的VH編碼基因上游的pelB序列部分。測序引物如下。pelB-back(SEQ ID No 88)5' -ccgct ggatt gttat tactc gc_3'用上述引物和測序反應試劑盒和供應商推薦的反應溶液組合物進行BigDye-PCR反應。溫度循環為 96°C X3min — (94°C X lmin — 50°C X lmin — 68°C X4min) X30 個循 環。然后，利用測序儀(377，ABI制造)測定通過乙醇沉淀純化的PCR產物的堿基序列。結 果獲得SEQ ID No. :58至74的每個序列。實施例3 (抗體輕鏈可變區VL文庫的制備)按照與實施例1中相同的方法，由人外周血細胞Fab文庫制備VL基因文庫。弓丨物 如下。 反向引物(SEQ ID No 89)5 ‘ -TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGMCATYCAGWTGACCCAGTCTCC-3‘(SEQ ID No 90)5 ‘ -TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGATRTTGTGATGACYCAGWCTCC-3‘(SEQ ID No 91)5 ‘ -TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAAATTGTGWTGACGCAGTCTCC-3‘(SEQ ID No 92)5 ‘ -TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGACATCGWGHTGACCCAGTCTCC-3‘ 正向引物(SEQ ID No 93)5' -TTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATTTCCACCTT GGTCCC-3‘(SEQ ID No 94)5 ‘ -TTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC-3‘(SEQ ID No 95)5' -TTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATATCCACTTT GGTCCC-3‘(SEQ ID No 96)5' -TTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCACCTT GGTCCC-3'(SEQ ID No 97)5' -TTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTAATCTCCAGTCG TGTCCC-3'另外，類似地制備將要使用的質粒，不同之處在于在如實施例1的⑵中制備用于 蛋白質表達的質粒時將NcoI/SacII之間的Nhel改變為NotI。另外，用實施例1步驟(11) 結束時獲得的VL蛋白透析內部溶液作為模板用于篩選金結合抗體輕鏈可變區(VL)。實施例4 (金結合抗體輕鏈可變區(VL)的篩選)金結合的VL的篩選以與實施例2相同的方法進行，不同之處在于用實施例3中獲 得的樣品作為篩選樣品。結果，獲得SEQ ID No. :75至77的每個序列。在下文中，從實施例1的人外周血細胞Fab基因文庫中制備噬菌粒，并篩選金結合 的VL或VH。實施例5 (展示VL的親金噬菌體組的篩選)按照下列方法制備展示VL的噬菌體文庫，并且選擇能夠與金結合的噬菌體組。(1)用于VL展示的噬菌粒利用來源于成人外周血B淋巴細胞的Fab文庫作為模板，利用SEQ ID No. 89至97 的引物復制VL編碼基因。此外，用作M13噬菌體外殼蛋白的PIII蛋白的N末端的部分缺失，并且使用以使得VL蛋白融合并表達的方式制備的展示VL的噬菌粒文庫(圖12B) (Biochem Biophys Res Commun. 1996，218，pp682)。(2)展示VL片段的噬菌體文庫的制備1)轉化通過電穿孔(外加電壓1.51^，電阻186 0，電容5011 )用1 y L VL編碼基因文 庫(350ng/ u L)轉化40 y L大腸桿菌DH12S。然后按照下列程序制備展示VL的噬菌體文庫。2)培養(i)轉化后將800 uL LB培養基加至DH12S溶液中，整體在37°C下振蕩培養1小 時(140rpm)。(ii)將20mL培養溶液加至LB培養基+終濃度為100 u g/mL的氨芐青霉素(LB/ amp.)中，整體在37°C下培養3_4小時。(iii)加入40 ii L M13K07作為輔助噬菌體，整體在lOOrpm振蕩下再培養1小時。(iv)加入50mg/mL卡那霉素溶液，至終濃度為50 u g/mL,整體在37°C下振蕩培養 (lOOrpm)。3)展示VL的噬菌體文庫的收集(i)將5mL 20%PEG/500mM NaCl加入培養溶液中，整體置于冰中1小時或數小時。(ii)通過離心(6，500rpmX35min)小心除去上清液。(iii)將沉淀物懸浮在500 u L PBS緩沖液中，制備展示VL的噬菌體溶液。4)展示VL的噬菌體文庫的滴度評價(i)將10ii L JM109甘油貯存液加至LB中，整體在37°C下振蕩培養。(ii)用LB培養基系列稀釋3)中制備的展示VL的噬菌體溶液。(iii)將 10 ii L 系列稀釋的(X 10_6 至 10_10)溶液加到 750 uL(a)OD600 約為 0. 5 的 培養溶液中，整體在37°C下振蕩培養1小時。(iv)離心(6，OOOrpmX 5min)除去 700 u L 培養上清液。(v)通過移液稀釋剩余的培養上清液和沉淀物。然后將該懸浮液接種于LB/amp. 平板上，整體置于37°C下過夜。(vi)計數具有100個或更少菌落的稀釋濃度平板上出現的菌落數，將其定義為展 示VL的噬菌體文庫的滴度值。得到的展示VL的噬菌體文庫溶液5X 109cfu/ u L(3)使用金細粒的VL淘選用如上所述制備的噬菌體文庫溶液和金細粒(1. 5 u mO :Sigma-Aldrich制造)重 復根據下列方法的淘選操作5輪，用于選擇展示金結合VL的噬菌體組。1)結合實驗⑴將 10 ii L 金細粒溶液(50mg/PBS lml)和 PBS+0. 1 % Tween20 (PBST)加至無菌 Eppendorf管(1.5mL)中的噬菌體溶液(體積為使該溶液中的噬菌體總數為l，010cfu)，使 得總體積為1，000 u L，獲得的產物作為結合反應溶液。(ii)該結合反應溶液在室溫下保持30分鐘，同時輕輕旋轉。(iii)離心(10，OOOrpmX5min) (ii)中獲得的產物，小心棄去培養上清液。
2)洗滌(非特異性吸附物的洗滌)(i)將500ii L PBST加入Eppendorf管中的金細粒中，整體在室溫下保持10分鐘， 同時輕輕旋轉。(ii)進行離心(10，000rpmX5min)，小心除去洗滌上清液。(iii)上述⑴和(ii)均重復10次。3)酸洗脫和酸洗脫級分的滴度評價吸附到2)中獲得的金細粒上的噬菌體的滴度按照下列程序評價。3)_1 酸洗脫(i)將115iiL 0. 2M Gly-HCl (pH 2. 2)加入洗滌后的金細粒中，整體在垂直旋轉 的同時保持1分鐘。(ii)進行離心(10，000rpmX5min)，收集上清液作為酸洗脫級分。(iii)加入15uL 1M Tris-HCl以中和收集的酸洗脫級分。(iv)系列稀釋中和后的1 P L酸洗脫溶液，按照滴度評價方法測定滴度值。(v)剩余的酸洗脫級分與金細粒級分快速混合，再次懸浮該混合物。3)-2滴度評價以與(2)_3)、4)相同的方法進行滴度評價，獲得下列結果。第1 輪9. 8X102cfu第2 輪1. 0X103cfu第3 輪7. 8X102cfu第4 輪1.3X103cfu第5 輪1. lX104cfu4)再感染和噬菌體擴增直到第4輪，用吸附到3)中獲得的金細粒上的噬菌體組再感染大腸桿菌，以擴增 噬菌體的數目，用于制備噬菌體溶液，以備隨后的淘選。(i)大腸桿菌JM109在20mL LB培養基中37°C (140rpm)振蕩培養，用于再感染和 噬菌體擴增。(ii)將3)中獲得的金細粒的懸浮液加至0D,為0. 3至0. 5的(a)中的大腸桿菌 培養溶液中，整體在37°C下振蕩培養1小時(140rpm)。(iii)加入氨芐青霉素至終濃度為lOOyg/mL，整體在37°C下振蕩培養2小時。(iv)加入40iiL輔助噬菌體M13K07，整體在37°C下培養1小時，振蕩速度降至 lOOrpm。(v)加入卡那霉素至終濃度為50ii g/mL，整體在37°C下振蕩培養過夜。(vi)通過與(2)_3)、4)相同的操作收集培養上清液中的噬菌體，以制備噬菌體溶 液。此外，評價該噬菌體溶液的滴度值，以證實噬菌體已經擴增。擴增后獲得的滴度值顯示如下。第1 輪2. 4X109cfu第2 輪8. lX108cfu第3 輪1. 8X109cfu第4 輪1. lX10lclcfu
(4)噬菌體 ELISA1)用于ELISA的金沉積基板的制備使用與實施例2相同的沉積有金(厚度為lOOnm)的96孔滴定板(BD，聚苯乙烯) 作為噬菌體ELISA的基板。2)展示VL的噬菌體單克隆的制備按照下列程序，從在(3)-4)第5輪滴度評價中104倍稀釋平板上表達的11個菌 落中收集噬菌粒。(i)每一菌落用 20mL LB/amp 在 37°C下培養。(ii)加入40iiL輔助噬菌體M13K07，整體在37°C下培養1小時，振蕩速度降至 lOOrpm。(iii)加入卡那霉素至終濃度為50y g/mL，整體在37°C下振蕩培養過夜。(iv)通過與(2)_3)、4)相同的操作收集培養上清液中的噬菌體，以制備噬菌體溶 液。此外，評價該噬菌體溶液的滴度值，以證實噬菌體已經擴增。擴增后獲得的滴度值顯示如下。No.138X10cfu
No.290X108cfu
No.324X109cfu
No.410X109cfu
No.597X107cfu
No.64. 4X108cfu
No.762X109cfu
No.889X107cfu
No.914X109cfu
No.101. lX1010cfu
No.114. 9X109cfu3)噬菌體溶液的制備用2)中獲得的每種噬菌體溶液制備各200 PL稀釋系列，其中根據下列組成，滴度 值從109cfu以10倍連續降低。展示VL的噬菌體溶液x ULSuper 封閉緩沖液(PIERCE) 20 u L0. 5% Tween 20/PBS :x/5 u LPBS :180-(6x/5) u L4) ELISA(i)將各80 y L系列稀釋的展示VL的噬菌體溶液分配到金沉積的滴定板上，該滴 定板在振蕩器上輕輕振蕩1小時。(ii)除去噬菌體溶液，向每孔中分配90 PL PBST，整體攪拌10分鐘，然后除去洗
滌上清液。該操作重復3次。(iii)向各孔中分配75iU HRP-抗M13免疫球蛋白/SBB/PBS溶液 (1/1,000 1 10)，該滴定板在振蕩器上輕輕振蕩1小時。
(iv)棄去免疫球蛋白溶液的上清液。然后，以90PL/孔的體積分配PBST，整體攪 拌10分鐘。該洗滌操作重復3次。(v)檢測試劑1和2 (Amasham BIOSCIENCE)分別以35 i L/孔的體積分配，使整體 反應，同時輕輕攪拌1分鐘。(vi)測量魯米諾的發光強度。提供具有高發光強度的No. UNo. 2和No. 3作為金 結合的展示VL的噬菌體克隆。為了闡明金結合VL的堿基和氨基酸序列，從上述4個噬菌體克隆中分離噬菌粒。 然后，制備表達載體來表達蛋白質，從而在表面等離振子共振(SPR)金基板上證實結合親 和力。實施例6 (親金VL蛋白的獲得)(1)噬菌粒的收集按照下列程序，從與實施例5之(3) -4)第5輪滴度評價中104倍稀釋平板上表達 的No. 7相對應的菌落中收集噬菌粒。⑴每個菌落使用1. 6mL LB/amp.在37°C下培養過夜。(ii)使用MiniPr印SV plus DNA純化系統(promega)按照供應商推薦的方法收
集噬菌粒。(2)表達載體的制備根據下列結構構建表達上述3種VL蛋白的表達載體。實施例1的圖11所示的 pRA-XX和(1)中獲得的噬菌粒分別使用Ncol和NotI通過限制性內切酶反應切割。將得到 的VL片段插入pRA-XX中制備質粒pRA-VLNo，n (n 克隆編號)，該質粒將VL編碼核酸表達 為融合蛋白(圖13)。(3)蛋白質的表達和純化如上所述獲得的用于表達VL蛋白的3種載體用來表達VL蛋白。1)轉化用上述表達載體轉化40 y L BL21 (DE3)感受態細胞。轉化在這樣的條件下進行 在冰中一42V X90sec —冰中進行熱休克。將750 u L LB培養基加入通過熱休克轉化的 BL21溶液中，整體在37°C下振蕩培養1小時。之后，以6，OOOrpm離心5分鐘，棄去650 u L 培養上清液。將剩余的培養上清液和作為沉淀物的細胞部分攪拌并且接種于LB/amp.平板 上，整體置于37°C過夜。2)預培養隨機選擇平板上的菌落，在3. OmL LB/amp.培養基中28°C振蕩培養過夜。3)主培養預培養液在750ML 2XYT培養基中傳代培養，在28°C下繼續培養。當0D_大于 0. 8時，加入IPTG至終濃度為ImM，在28°C下進一步培養過夜。4)純化(i)硫酸銨沉淀將3)中獲得的培養液以6，OOOrpm離心30min獲得培養上清液。稱量得到的培養 上清液的重量。然后逐漸加入重量為培養上清液重量60%的硫酸銨。然后將產物在4°C下 攪拌過夜。
(ii)脫鹽將(i)中獲得的溶液以8，OOOrpm離心20min，棄去上清液。向得到的沉淀物加入 并且浸沒在15mL 20mM Tris/500mM NaCl (下文中稱為Tris溶液)中4°C過夜進行溶解。 然后將得到的溶液加至用于透析的纖維素管中(Sanko Junyaku Co. , Ltd.生產)，用Tris 溶液作為外部溶液在4°C下透析進行脫鹽(外部溶液每6小時更換一次)。(iii)金屬螯合柱使用His-BincKNovagen生產)作為金屬螯合柱載體。柱的調整、加樣和洗滌步 驟都按照供應商推薦的方法在4°C下進行。作為目標的His標簽融合的VL蛋白的洗脫用 500mM咪唑/Tris溶液進行。洗脫液的SDS-PAGE (丙烯酰胺15% )證實該洗脫液具有一條帶，并且被純化。用 Tris溶液作為外部溶液再次透析該洗脫液，以除去該洗脫液中的咪唑。此外，通過將外部溶 液更換為磷酸鹽緩沖液(下文稱為PBS)進行緩沖液的替換，以制備用于SPR的VL蛋白溶液。實施例7(sra測定)實施例6獲得的VL蛋白的金結合親和力利用SH 測定。BIAcore2000(BIAcore制 造)用作sra測定裝置。同一家公司的金沉積的玻璃基板SIA-kit Au用作與該蛋白質結 合的金基板。測定在下列條件下進行。運行緩沖液PBST溫度25°C、流速20ii L/min樣品VL蛋白/PBST注射量20iiL獲得證實結合親和力的結合曲線(圖9)。實施例8 (VL蛋白的堿基和氨基酸序列的測定)按照下列方法測定如上所述獲得的VL No. 7的DNA序列。測序引物設置在VL編碼基因上游的pelB序列部分。測序引物如下。pelB-back(SEQ ID No 88)5' -ccgct ggatt gttat tactc gc_3'以與實施例2相同的方法使用上述引物和測序反應試劑盒和供應商推薦的反應 溶液組合物進行BigDye-PCR反應。溫度循環為96°C X3min— (94°C X lmin — 50°C Xlmin — 68°C X4min) X30個循環一4°C。然后利用測序儀(377，ABI制造)測定通過乙醇沉淀純化 的PCR產物的堿基序列。獲得如下結果。No. 7具有與實施例12的SEQ ID No 76相同的 堿基序列。實施例9 (親金VH-展示噬菌體組的篩選)根據下列方法制備VH-展示噬菌體文庫，以選擇具有金結合親和力的噬菌體組。(1)用于展示VH的噬菌粒以與實施例1相同的方法，使用來源于成人外周血B淋巴細胞的Fab文庫作為模
31板，以與實施例1相同的方法使用SEQ ID No. 80至89的引物。這樣，VH編碼基因被復制。 而且，用作M13噬菌體外殼蛋白的PIII蛋白的N末端部分缺失，并且使用以使得VH蛋白融 合并且表達的方式制備的展示VH的噬菌粒文庫(圖12A)。(2)展示VH的噬菌體文庫的制備除了使用⑴中獲得的產物以外，展示VH的噬菌體文庫以與實施例5之⑵相同 的方法制備。得到的展示VH的噬菌體文庫溶液lX109CfU/i!L。(3)使用金細粒的VH淘選除了使用以上⑵中制備的噬菌體文庫溶液以外，用于選擇展示金結合VH的噬菌 體組的淘選以與實施例5之(3)相同的方法進行。1)結合實驗下面進行了類似于實施例5之2)的洗滌和之3)的酸洗脫和滴度評價。第1 輪9. 8X102cfu第2 輪1. 0X103cfu第3 輪7. 8X102cfu4)再感染和噬菌體擴增再感染和噬菌體擴增以與實施例5相同的方法進行。擴增后獲得的滴度值如下所不。第1 輪2. 4X109cfu第2 輪8. lX108cfu(4)噬菌體 ELISA1)用于ELISA的金沉積基板的制備使用與實施例5相同的基板作為用于噬菌體ELISA的基板。2)展示VL的噬菌體單克隆的制備按照與實施例1相同的方法從VH淘選操作第3輪滴度評價中104倍稀釋平板上 表達的20個菌落中收集噬菌粒。得到的展示VH的噬菌體單克隆溶液的滴度值如下所示。No.1 :3. 8X10cfu
No.2 :9. 0X108cfu
No.3 :2. 4X109cfu
No.4 :1. 0X109cfu
No.5 :9. 7X107cfu
No.6 :4. 4X108cfu
No.7 :6. 2X109cfu
No.8L 9X107cfu
No.9 :1. 4X109cfu
No.101. lX1010cfu
No.114. 9X109cfu
No.129. 0X108cfu
No.132. 4X109cfu
No.141. 0X109cfu
No.159.7X10 cfu
No.164. 4X108cfu
No.176.2X109cfu
No.188.9X107cfu
No.191.4X109cfu
No.201.lX1010cfu3)噬菌體溶液的制備使用2)中獲得的每種噬菌體溶液制備各200 PL稀釋系列，其中根據下列組成將 滴度值從109cfu以10倍連續降低。展示VL的噬菌體溶液x UL可溶性VL 溶液(50ng) :x u LSuper 封閉緩沖液(PIERCE) 20 u L0. 5% Tween 20/PBS :x/5 u LPBS :179-(6x/5) u L4)噬菌體 ELISA噬菌體ELISA通過與實施例1相同的操作進行。提供發光強度均高于用于比較的 VH文庫溶液的3個克隆作為金結合的展示VH的噬菌體克隆(Nos. 2、4和6)。實施例10 (親金VH蛋白的獲得)從上述三個噬菌體克隆中分離噬菌粒，然后制備其表達載體以表達蛋白質，從而 在表面等離振子共振(SPR)金基板上證實結合親和力。此外，闡明了這些金結合VH的各自 的堿基和氨基酸序列。(1)噬菌粒的收集根據如下程序從對應于第三輪滴度評價中在104倍稀釋平板上表達的15個克隆 的菌落中收集噬菌粒。(a)每個菌落在1. 6mL LB/amp.中37 °C培養過夜。(b)利用MiniPr印s SV plus DNA純化系統(promega)，根據供應商推薦的方法收
集噬菌粒。(2)表達載體的制備表達上述3種VL蛋白的表達載體根據下列結構構建。通過改變PET_15b(Novagen)的多克隆位點制備pUT-XX。pUT-XX和以上(1)中 獲得的噬菌粒各自使用Ncol和NotI通過限制性內切酶反應切割。將得到的VH片段插入 pUT-XX中制備質粒pRA-7sn (n 上述噬菌體克隆編號)，該質粒將VH編碼核酸表達為融合 蛋白(圖14)。(3)蛋白質的表達和純化通過進行上述程序(在各系統中在下面所述的蛋白質表達和純化步驟中處理表 達載體)獲得3種VH(7s2、7s4和7s6)。1)轉化用上述2種表達載體轉化40 ii L不同的BL21 (DE3)感受態細胞溶液。在如下條件 下進行轉化在冰中一42V X90sec —在冰中進行熱休克。將750 u L LB培養基加入通過
33熱休克轉化的BL21溶液中，整體在37°C下振蕩培養1小時。之后以6，OOOrpm離心5min， 棄去650 u L培養上清液。將剩余的培養上清液和作為沉淀物的細胞部分攪拌并且接種到 LB/amp.平板上，整體置于37°C過夜。2)預培養隨機選擇平板上的菌落，用3. OmL LB/amp.培養基28°C振蕩培養過夜。3)主培養預培養液在750ML 2XYT培養基中傳代培養，在28°C下繼續培養。當0D_大于 0. 8時，加入IPTG至終濃度為ImM，在28°C下培養過夜。4)純化通過下列步驟從不溶性顆粒部分中純化目標多肽鏈。(i)不溶性顆粒的收集以上3)中獲得的培養液以6，OOOrpm離心30min，以獲得沉淀物作為細菌部分。將 產物懸浮于冰中的Tris溶液(20mM Tris/500mMNaCl)中。得到的懸浮液用弗氏壓碎器勻 漿，以獲得勻漿溶液。然后，以12，OOOrpm離心勻漿溶液15min，除去上清液獲得沉淀物作為 不溶性顆粒部分。(ii)不溶性顆粒部分的溶解向(i)中獲得的不溶性部分加入并且浸沒在10mL 6M鹽酸胍/Tris溶液中過夜。 然后產物以12，OOOrpm離心lOmin以獲得上清液作為溶解的溶液。(iii)金屬螯合柱使用His-BincKNovagen生產)作為金屬螯合柱載體。柱的調整、加樣和洗滌步驟 都按照供應商推薦的方法在室溫(20°C)下進行。作為目標的His標簽融合的VL蛋白的洗 脫用60mM咪唑/Tris溶液進行。洗脫液的SDS-PAGE(丙烯酰胺15% )證實該洗脫液具有 一條帶，并且被純化。(iv)透析使用6M鹽酸胍/Tris溶液作為外部溶液在4°C下透析上述洗脫液，以除去洗脫液 中的咪唑，從而獲得上述多肽鏈溶液。(v)重折疊按照與上述相同的方法，VHg-VLh和VHh-VLg的多肽鏈溶液分別按照下列用于除 去鹽酸胍的步驟透析(4°C )，以進行蛋白質的重折疊。a)根據每種多肽鏈的摩爾吸收系數和A 0. D. (280nm-320nm)水平，使用6M鹽酸 胍/Tris溶液制備濃度為7.5 yM的樣品(稀釋后的體積為10ml)。然后加入巰基乙 醇(還原劑)至終濃度為375 iiM(50-倍蛋白質濃縮)，用于在暗室中在室溫下還原4小時。 將樣品溶液加入透析袋(MWC0:14，000)中，提供作為用于透析的樣品。b)將用于透析的樣品浸沒在作為外部溶液的6M鹽酸胍/Tris溶液中，在輕輕攪拌 下透析6小時。c)以分步方式將外部溶液的鹽酸胍溶液濃度減至3M，然后減至2M。樣品在每一濃 度的外部溶液中透析6小時。d)向Tris溶液中加入終濃度為375 u M的氧化型谷胱甘肽(GSSG)和終濃度為 0. 4M的L-Arg，然后加入以上3)中的2M透析外部溶液，使鹽酸胍濃度為1M。樣品在pH已經用NaOH調節為8. 0(4°C )的外部溶液中在輕輕攪拌下透析12小時。e)通過與d)相同的操作制備鹽酸胍濃度為0. 5M的L_Arg Tris溶液，并且再透析 12小時。f)最后，在Tris溶液中透析12小時。透析7)完成后，以10，OOOrpm離心約20分
鐘，以分離聚集物和上清液。通過將外部溶液改變為磷酸緩沖液(下文中稱為PBS)將如上所述獲得的3種VH 溶液進行緩沖液更換，以制備用于SPR的VH蛋白溶液。實施例ii(sra測定)實施例10中獲得的VH蛋白的金結合親和力以與實施例7相同的方法利用SH 測 定。對于7s2、7s4和7s6獲得證實結合親和力的結合曲線。圖10顯示代表性實施例。通 過曲線擬合獲得下列Kd。7s2=Kd=5.0X10M-8
7s4=Kd=8.0X10M-9
7s6=Kn=3.0X10M-7實施例12 (VH蛋白的堿基和氨基酸序列的測定)如上所述獲得的3個展示VH的噬菌粒各自的DNA序列通過與實施例2相同的方 法測定。測序引物設置于位于VH編碼基因上游的pelB序列部分。使用實施例2的測序引 物，并且根據相同的程序進行透析，獲得三種不同的序列。實施例10中獲得的那些序列對 應于 SEQ ID No. 59 至 61。實施例13 (利用sra對VH/VL復合物進行的金結合實驗)制備PBST溶液，其中含有各50nM實施例6中獲得的VL克隆No. 7和實施例10中 獲得的VH克隆7s2，并且在4°C下保持一天。SPR測定按照與實施例7相同的方法用混合 溶液進行。結果，在比實施例7或實施例11更低的濃度下證實有金結合親和力。該結果提 示克隆的混合形成復合物(Fv)，由于其穩定的結構而提高了結合親和力(圖3)。實施例14 (金結合scFv的獲得)按照如下程序制備由實施例6中獲得的VL克隆No. 7和實施例10中獲得的VH克 隆7s2組成的scFv。(1)表達載體的制備能夠表達融合蛋白的表達載體，能夠由VL(No. 7)編碼基因、接頭(GGGGS)X3、 VH(7s4)編碼基因和HisX6(下文稱為His標簽)連續翻譯。一種具體制備方法在圖15中顯示。使用下列引物。scFv-B (SEQ ID No 117)5' -NNNNNCCATGGCCGGGGGCGGGGGCAGCGGGGGCGGGGGCAGCGGGGGCGGGGGCAGCCAGGTGC AGTTGGTGGAGTCT-3‘scFv-F (SEQ ID No : 118)5' -NNNNNCCGCGGAACCATTCAGATCCTCTTCT-3'(2)蛋白質的表達和純化下面使用如上所述獲得的用于表達scFv蛋白的載體表達和純化scFv蛋白。
1)蛋白質表達用上述表達載體轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，使用2xYT培養基在28°C下進行培養。 在O.D.,=約0.8時用終濃度為ImM的IPTG誘導表達，產物振蕩培養過夜。細菌體以 6，OOOrpm離心20min獲得培養上清液部分和細菌部分。這些樣品根據公知的方法電穿孔， 利用SDS-PAGE證實目標蛋白質的表達量。結果表明向培養上清液部分中的分泌極少。鑒 于此，為了從細菌部分中純化目標蛋白，按照下列程序制備樣品。首先，將細菌體重懸浮于 15mL PBS中，向該懸浮液中進一步添加25mL PBS，利用弗氏壓碎器將該混合物勻漿。得到 的勻漿溶液以12，OOOrpm離心15min獲得作為不溶性顆粒的沉淀部分。將得到的不溶性顆 粒浸入6M鹽酸胍/Tris溶液中過夜，并且溶解，獲得用于金屬螯合柱的樣品。2)通過金屬螯合柱純化用6M鹽酸胍/5mM咪唑/Tris溶液作為運行緩沖液，以與實施例2相同的方法進 行純化，不同之處為洗脫時的咪唑濃度設置為lOOmM ；展開溫度設置為室溫(20°C )。3)透析將2)中獲得的洗脫級分加到用于透析的纖維素管中(Sankojimyaku Co.，Ltd.制 造)，使用6M鹽酸胍/ImM EDTA/Tris溶液作為外部溶液在4°C下透析(每6小時更換一次 外部溶液)。4)蛋白質的重建用Tris溶液將3)中獲得的scFv溶液調節為7.5 iiM，提供作為模板。重建scFv 結構，同時通過相對于上述溶液減少外部溶液中的鹽酸甘氨酸濃度逐漸降低內部溶液中的 鹽酸胍濃度。(a)使用6M鹽酸胍/Tris溶液制備濃度為7.5 iiM的樣品，其摩爾吸收系數和 O.D. (280nm)根據目標蛋白質的氨基酸序列估計。(b)然后加入巰基乙醇(還原劑)至終濃度為375 yM，然后在暗室中在室溫 下還原4小時。(c)將樣品裝入如上所述相同的透析袋中，整體置于外部溶液(6M鹽酸胍/Tris溶 液)中，4°C透析約6小時。(d)之后每6小時更換外部溶液，共兩次。更換時，在樣品透析的同時，以分步方式 將外部溶液的鹽酸胍溶液濃度減至3M，然后減至2M。(e)然后向Tris溶液中加入氧化型谷胱甘肽(GSSG)至終濃度為375 y M以及 L-Arg至終濃度為0.4M，然后添加以上(d)中的透析外部溶液(2M)至鹽酸胍濃度為1M。樣 品在PH已經用NaOH調節為8. 0 (4°C )的外部溶液中透析約12小時。(f)按照與(e)相同的操作制備0. 5M鹽酸胍/Tris溶液，并且在4°C下透析約12 小時。(g)最后，在4°C下透析約12小時，同時將外部溶液換為Tris溶液。(h)透析完成后，產物以10，OOOrpm離心約20min，以分離聚集部分和上清液部分。 該上清液部分進行SDS-PAGE電泳，以證實目標蛋白質在上清液部分中為可溶的。結果獲得 了具有VL No. 7克隆和VH 7s2的scFv。實施例15 (利用sra評價scFv的金結合親和力)實施例14中獲得的scFv蛋白的金結合親和力利用SH 按照與實施例8相同的方法測定。獲得顯示金結合親和力的結合曲線(圖17)。實施例16 (Au特異性的證實)證實了實施例15中獲得的scFv蛋白的金特異性。將金以大小為70iim(j5 (厚度 為50nm)的環形模式沉積在大小為3mmX 5mm的硅基板上作為確證基板。基板表面依次浸在 異丙醇、丙酮和鹽酸中，每種溶液10分鐘，進行表面清洗(每次更換溶液時，表面用去離子 水清洗并且干燥)。基板浸沒在通過將實施例6中獲得的scFv溶液調節至1 y M而制備的 溶液中1小時。然后，在PBST中輕輕攪拌10分鐘清洗基板。該操作重復3次，然后棄去洗 滌溶液。然后將基板浸沒在lOOnM抗-His標簽抗體/PBST溶液中，同時在該溶液中輕輕攪 拌1小時。然后，在PBST中輕輕攪拌10分鐘清洗基板。該操作重復3次，然后棄去洗滌溶 液。此外，將基板浸沒在100 iiM視紫紅質結合的抗-IGg抗體/PBST溶液中，同時在該溶液 中輕輕攪拌1小時。然后在PBST中輕輕攪拌10分鐘清洗基板。該操作重復3次，然后棄 去洗滌溶液。之后，用熒光顯微鏡觀察該基板。結果，在沉積有金的環形部分觀察到熒光， 而在硅部分沒有觀察到熒光。因此，實施例15中獲得的scFv的金特異性得到證實。比較實施例1金沉積的硅基板按照與實施例16相同的操作進行處理，不同之處在于該基板用 luM scFv處理。用熒光顯微鏡觀察該基板，結果在硅部分和沉積有金的環形部分都沒有觀 察到熒光。實施例17 (親氧化硅肽融合的金結合蛋白的制備)在上述實施例的scFv的C末端具有親氧化硅肽IPHVHHKHPHV的蛋白質按照下列 步驟制備。(1)表達載體的制備(a)以上述實施例(實施例14)中獲得的pUT-scFv (VL#No, 7 X 7s4)作為模板，利 用下列引物進行PCR。SiscFv-B(SEQ ID No 119)5' -NNNNNCCATGGCCCAGGTGCAGTTGGTGGAGT-3'SiscFv-F(SEQ ID No : 120)5' -NNNNNCCGCGGCACGTGGGGGTGCTTGTGGTGCACGTGCATGGGGATAACCATTCAGATCCTCTT CT-3'利用商業上可獲得的PCR試劑盒(TAKARA BIO INC, LA-標簽試劑盒)按照供應商 推薦的方案進行PCR。(b)得到的PCR產物進行2%瓊脂糖電泳。然后，應用凝膠提取試劑盒(Promega) 通過粗純化從凝膠中獲得約400bp的PCR片段。序列證實該片段具有目標堿基序列。(c)pUT-scFv(7s4)和以上(b)中獲得的PCR片段用Notl/SacII酶切。然后進行 瓊脂糖電泳以純化載體側和插入側的目標片段。(d)將以上(c)中獲得的純化的核酸片段以載體插入片段=1 5的比例混合， 然后以與實施例1相同的方法進行連接反應。下面，通過與實施例6相同的方法進行轉化、質粒的收集和插入片段的證實。(3)蛋白質的表達和純化蛋白質的表達和純化使用如上所述獲得的用于表達的質粒通過與實施例10相同的方法進行，從而獲得目標蛋白質。 實施例18 (金-和HEL-結合蛋白的獲得)(1)金結合VH編碼核酸片段的調節使用下列引物gVH-B (SEQ ID No 121)5' -NNNNN CCATGG CCGAC CAGG TGCAG TTGGT GGAGT CT_3'gVH-F (SEQ ID No : 122)5' NNNNN GCTAG C GGAGA CGG TGACCAGGGT-3'制備金結合的VH(下文稱為VHg)，用于引入一種載體，該載體在金結合的VH(SEQ ID No 61)的5’末端側排列有限制性內切酶Ncol酶切位點，在其3'末端側排列有限制性 內切酶Nhel酶切位點。然后，按照供應商推薦的比例使用商業上可獲得的PCR試劑盒進行 PCR，獲得約350bp的堿基對。使用商業上可獲得的測序反應試劑盒和反應溶液組合物，利 用上述VHB-F進行BigDye-PCR反應。溫度循環設置為96°C X3min— (94°C Xlmin —50°C X lmin —68°C X4min) X30個循環一4°C，以證實獲得了含有編碼目標VH的堿基序列的片段。(2)金結合VL編碼核酸片段的調節按照與⑴相同的方法獲得核酸片段，不同之處在于使用下列引物gVL-B(SEQ ID No 123)NNNNN GCTAGC GGTGGCGGTGGCTCT GAAATTGTGTT GACGCAGTCT，禾口gVL-F (SEQ ID No : 124)NNNNN CCGCG GCACG TTTAA TCTCC AGTCG TGT制備金結合的VL (下文稱為VLg) (SEQ ID No :99)，用于插入一種載體，該載體在 金結合的VL(SEQ ID No 76)的5'末端側排列有限制性內切酶Nhel酶切位點和編碼接頭 (GGGGS)的核酸，并且在其3'末端側排列有HisX6和限制性內切酶SacII酶切位點，從而 證實獲得了具有目標VL的堿基序列的片段。(3)HEL_結合VH編碼核酸片段的調節按照與(1)相同的方法獲得核酸片段，不同之處在于使用下列引物hVH-B (SEQ ID No 126)5' -NNNNN CCATGG CCGAC GATATCCAGCTGCAGGAGTCGGGCCC-3‘，禾口hVH-F (SEQ ID No : 127)5' NNNNN GCTAG C GGAGA CGG TGACGTCTGT-3制備HEL-結合的VH(下文稱為VHh)，用于引入一種載體，該載體在HEL-結合的 VH(SEQ ID No:125)的5'末端側排列有限制性內切酶Ncol酶切位點，并且在其3 ‘末端 側排列有限制性內切酶Nhel酶切位點，從而證實該片段具有目標VL的堿基序列。(4)HEL-結合VL編碼核酸片段的調節按照與(1)相同的方法獲得核酸片段，不同之處在于使用下列引物hVL-B (SEQ ID No 129)NNNNNGCTAGCGGTGGCGGTGGCTCTGATATCGTCCTGACCCAGAG,禾口hVL-F (SEQ ID No : 130)NNNNN CCGCG GCCTT GATCT CCAGC TTGGT GC
制備HEL-結合的VL(下文稱為VLh)，用于引入一種載體，該載體在HEL-結合的 VL(SEQ ID No 128)的5'末端側排列有限制性內切酶NheI酶切位點和編碼接頭(GGGGS) 的核酸，并且在其3'末端側排列有HisX6和限制性內切酶SacII酶切位點，從而證實該片 段具有目標VL的堿基序列。實施例19 (表達載體的制備)使用以上4種核酸片段根據下列結構構建2種表達載體。(1)用于表達VHg-VLh的載體(pGHEL)的制備(圖15)(i) VHg 的插入質粒pUT-XX用限制性內切酶Ncol/Nhel (均由New EnglandBiolabs生產)切 割，并且經過自旋柱400HR(Amasham Science) 0然后用限制性內切酶Ncol/Nhel類似地 切割VHg，酶切片段用商業上可獲得的凝膠純化試劑盒(SV Gel and PCR Clean-up系統 Promega)純化。上述2個片段用商業上可獲得的T4連接酶試劑盒(Roche)按照供應商推 薦的方法混合，然后連接。用連接溶液通過熱休克轉化40 μ L JM109感受態細胞(Promega)。將產物接種在 LB/氨芐青霉素(amp.)平板上，整體置于37°C過夜。然后將平板上的任一菌落在3mL液體培養基中傳代培養，整體在37°C下振蕩培 養過夜。之后，利用商業上可獲得的MiniPr印s試劑盒(Plus Minipreps DNA純化系統 Promega)收集質粒。使用gVH-F通過測序方法證實得到的質粒的堿基序列。這樣證實了目標片段已經 插入。(ii) VLH 的插入以上1)中獲得的質粒pUT-VHg用限制性內切酶Nhel/SacII切割，并且過自旋柱 400HR(Amasham Science) 0然后，類似地用限制性內切酶Nhel/SacII切割VLh。然后按照 與以上(a)相同的方法進行連接，證實獲得了用于表達VHg-VLH的質粒(用于證實的引物 為 hVL-F)。(2)用于表達VHh-VLg的載體(pHGOLD)的制備(圖16)(iii)VHh 的插入按照與以上⑴相同的方法將VHh插入質粒pUT中，證實得到的質粒為目標質粒 (用于證實的引物為hVH-F)。(iv) VLg 的插入按照與以上(b)相同的方法將VLg插入以上(iii)獲得的質粒中，通過與1)相 同的方式證實得到的質粒為用于表達VHH-VLg的目標載體pHGOLD(用于證實的引物為 gVL-F)。實施例20 (蛋白質的表達和純化)用于表達實施例19之(ii)中獲得的VHg-VLh和實施例19之(iv)中獲得的 VHh-VLg的多肽鏈的表達載體在各自的系統中通過下面所述的表達和純化蛋白質的步驟進 行處理，獲得為多肽鏈VHg-VLh和VHh-VLg。1)轉化用上述表達載體轉化不同的40 μ L BL21 (DE3)感受態細胞溶液。在如下條件下進行轉化在冰中一420C X90sec —冰中進行熱休克。將750 μ L LB培養基加入通過熱休克 轉化的BL21溶液中，整體在37°C下振蕩培養1小時。之后，以6，OOOrpm離心5min，棄去 650 μ L培養上清液。剩余的培養上清液和作為沉淀物的細胞部分進行攪拌并且接種到LB/ amp.平板上，整體置于37°C過夜。2)預培養隨機選擇平板上的菌落，在3. OmL LB/amp.培養基中28°C振蕩培養過夜。3)主培養預培養液在750ML 2XYT培養基中傳代培養，在28°C下繼續培養。當0D_大于 0. 8時，加入IPTG至終濃度為ImM，在28°C下培養過夜。4)純化通過以下步驟從不溶性顆粒部分中純化目標多肽鏈。(i)不溶性顆粒的收集將以上3)中獲得的培養液以6，OOOrpm離心30min獲得沉淀物作為細菌部分。將 產物懸浮在置于冰中的15ml Tris溶液(20mMTris/500mM NaCl)中。得到的懸浮液用弗氏 壓碎器勻漿，獲得細菌勻漿溶液。然后將細菌勻漿溶液以12，OOOrpm離心15min，除去上清 液，獲得沉淀物作為不溶性顆粒部分。(ii)不溶性顆粒部分的溶解向以上(i)中獲得的不溶性部分加入并且浸沒在IOmL 6M鹽酸胍/Tris溶液中過 夜。然后產物以12，OOOrpm離心lOmin，獲得上清液作為溶解的溶液。(iii)金屬螯合柱使用His-Bind(Novagen生產)作為金屬螯合柱載體。柱的調整、加樣和洗滌步驟 都按照供應商推薦的方法在室溫(20°C )下進行。作為目標的His標簽融合多肽鏈的洗脫 用60mM咪唑/Tris溶液進行。洗脫液的SDS-PAGE(丙烯酰胺15% )證實該洗脫液具有一 條帶，并且被純化。(iv)透析使用6M鹽酸胍/Tris溶液作為外部溶液在4°C下透析上述洗脫液，以除去洗脫液 中的咪唑，從而獲得上述各個多肽鏈溶液。(ν)重折疊按照與上述相同的方法，VHg-VLh和VHh-VLg的多肽鏈溶液分別按照下列步驟使 用脫氯化氫的胍透析(4°C )，進行蛋白質的重折疊。(a)根據每種多肽鏈的摩爾吸收系數和Δ 0. D. (280nm-320nm)，使用6M鹽酸胍/ Tris溶液制備濃度為7. 5μ M的樣品(稀釋后的體積為10ml)。然后加入β-巰基乙醇(還 原劑)至終濃度為375μΜ(50-倍蛋白質濃縮)，然后在暗室中在室溫下還原4小時。將樣 品溶液加入透析袋(MWC0:14，000)中，提供作為用于透析的樣品。(b)將用于透析的樣品浸沒在作為外部溶液的6M鹽酸胍/Tris溶液中，在輕輕攪 拌下透析6小時。(c)以分步方式將外部溶液的鹽酸胍溶液濃度減至3M，然后減至2M。樣品在每一 濃度的外部溶液中透析6小時。(d)向Tris溶液中加入終濃度為375 μ M的氧化型谷胱甘肽(GSSG)和終濃度為0.4M的L-Arg，然后加入以上(c)中的2M透析外部溶液，使鹽酸胍濃度為1M。樣品在pH已 經用NaOH調節為8. 0(4°C )的外部溶液中在輕輕攪拌下透析12小時。(e)通過與(d)相同的操作制備鹽酸胍濃度為0. 5M的L-ArgTris溶液，并且再透 析12小時。(f)最后，在Tris溶液中透析12小時。(g)透析完成后，以10，OOOrpm離心約20分鐘，以分離聚集物和上清液。(vi) 二聚化級分的純化將以上(ν)中獲得的各5 μ M多肽鏈(VHg-VLh，VHh-VLg)溶液混合，并且置于4°C 下過夜。然后獲得在S印hadex 75柱(柱緩沖液20mM Tris,500mM NaCl，流速lml/min) 中二聚化的相當于60kDa的級分(從注射起約18分鐘)。這提供了用于Sra測定的樣品。實施例21 (通過sra測定評價金結合親和力)實施例20中獲得的二聚化蛋白質級分對于金的結合親和力利用sra測定。使用 BIAcore 2000 (BIAcore制造)作為SI3R測定裝置。使用同一公司的金沉積玻璃基板SIA_kit Au作為金基板(該級分結合到上面)。在下列條件下進行測定。使用500nM(如上所述根 據吸光度計算)實施例15中獲得的二聚化蛋白質級分作為樣品。運行緩沖液0·1% Tween 20/Tris 溶液TBST溫度25°C、流速20yL/min樣品注射量40yL獲得顯示金結合親和力的結合曲線(圖18)。 實施例22 (通過SI3R測定評價對HEL的結合親和力)樣品在實施例21中進行了金結合親和力的SHU平價后，繼續注射1 μ M HEL溶液， 利用Sra測定金結合的二聚化蛋白質級分對HEL的結合親和力。獲得顯示對于HEL的結合 親和力的結合曲線(圖18)。實施例23 (Au特異性的證實)實施例22中獲得的，金結合蛋白和HEL已經結合到上面的SI3R芯片的金基板，接 著用來進行如下實驗。向上述金基板注射1 μ M抗-HEL抗體/PBST溶液。之后，用該基板 用PBST清洗。而且，向該基板注射1 μ M視紫紅質結合的抗-IGg抗體/PBST溶液。之后， 該基板用PBST洗滌。從sra裝置中取出上述sra芯片，用熒光顯微鏡觀察該基板。結果， 在金基板上的SPR的流動通道上觀察到熒光。比較實施例2使用未用過的金沉積基板進行與實施例23相同的操作。結果，在金基板上沒有觀 察到熒光。實施例24制備通過實施例20之⑴至(ν)的步驟獲得的重旋的多肽鏈，獲得5μ M VHg-VLh/Tris 溶液。實施例25實施例24中獲得的VHg-VLh/Tris溶液用Tris溶液稀釋至500nM，按照與實施例 20相同的方法評價對金基板的結合親和力。而且，繼續注射IyM HEL溶液，以測定金結合的二聚化蛋白質級分對HEL的結合親和力。獲得顯示對金和HEL的結合親和力的結合曲線。實施例26在實施例25中，使0. 5 μ M抗-HEL抗體VL/Tris溶液共存，整體靜置過夜，制備樣
ρ
BFI ο實施例27按照與實施例15相同的方法，通過SI3R評價實施例26制備的樣品對金基板的結 合親和力。而且，按照與實施例16相同的方法，繼續注射ΙμΜ HEL，以便通過SI3R測定對樣 品的結合親和力。獲得顯示結合親和力的結合曲線。實施例28 (HEL檢測免疫色譜裝置的準備)用于檢測HEL的免疫色譜裝置如檢測本發明方法的實施例所述準備。1)用于免疫層析的、上面固定有抗-HEL抗體的多孔載體的制備將硝酸纖維素片(BAS-85,Schleicher & Schuell 生產)切成 5mmX30mm 的小 片。在距小片末端IOmm處以0. 5mg/mL的量直線施加0. 5mg/mL抗-HEL抗體溶液(Nippon Biotest Labo生產)，從而制備檢測位點。將該小片置于室溫下2小時，使液體干燥，由此 將抗體固定在小片上。該小片在脫脂奶(Difco生產)/PBST溶液中振蕩2小時，封閉。 之后，將小片置于室溫下，制備用于免疫層祈的載體。2)金標抗-HEL抗體片段和反載體(hold-back carrier)的制備(i)金標抗-HEL抗體片段的制備使用實施例20制備的金/HEL雙特異性抗體片段，按照下列步驟制備如題所述的 片段。加入金細粒(粒徑50nm，Tanaka Kikinzoku生產)分散體，與實施例20制備的金 /HEL雙特異性抗體片段充分混合，在室溫下反應3小時。產物以12，OOOrpm離心5min，以 除去未反應的金/HEL雙特異性抗體片段，然后除去上清液，獲得沉淀物。將得到的沉淀物 懸浮于l.OmL PBST中。并且在上述條件下進行離心。將得到的沉淀物懸浮在1. OmL 1% BSA/PBST 中。(ii)金標抗-HEL抗體片段反載體的制備使大小為 5mmX5mm 的 Bemliese 無紡布(Asahi KaseiCorporation 制造)浸漬 5 μ L金標抗-HEL抗體片段溶液和5 μ L各種堿基的10%水溶液，風干，制備金標抗-HEL抗 體片段反載體。3)試片(test piece)型免疫層祈裝置的準備將以上2) (ii)中制備的金標抗-HEL抗體片段反載體與以上1)中制備的用于免 疫層析的載體在距該用于免疫層析的載體一端可達2. 5mm處重疊。并且，將用于浸漬液體 樣品的載體(526號濾紙，Advantec Toyo生產)與該抗體片段反載體重疊。另外，將用于 浸漬過量樣品部分的載體(526號濾紙)與用于免疫層析的載體在距該用于免疫層析的載 體另一端可達5mm處重疊。最后，用膠帶粘貼于后側以穩定此整體，由此制成了試片型免疫 層析裝置。使用標準HEL溶液的測試證實抗-HEL抗體固定部分呈紅色。實施例29 (電測量儀器的準備)顯示了使用金電極檢測蛋白質的方法的一個實施例。1)將2個金電極置于玻璃基板上。兩個電極之間的距離設置為20 μ m。將20 μ L0. 聚-L-賴氨酸(Sigma-Aldrich)水溶液滴加至電極之間的空隙上，整體放置3小時。然后，用水洗滌該基板。之后，該基板用乙醇洗滌3次并且干燥。2)然后，根據Proteomics，3，pp254(2003)所述，將抗-HEL多克隆抗體 (ROCKLAND)固定在以上(a)中獲得的玻璃基板上，3)使實施例20制備的金/HEL雙特異性抗體片段的PBST溶液和20-nm金納米顆 粒(Tanaka Kikinzoku生產)相互反應(PBST溶液用于比較)。4)向1)中獲得的固定有抗-HEL抗體的基板上添加1 μ MHEL/PBS溶液。5)然后，向3)中獲得的產物中加入2)中獲得的金結合蛋白溶液。6)將4)中獲得的基板用PBS溶液洗滌3次。之后，將該基板浸在銀增強溶液 (Sigma-Chemical)中5分鐘，然后用水洗滌。證實與僅有PBST的對比樣品相比，電極之間 的電阻降低。實施例30 (用于在酵母中表達VHg-VHh蛋白的載體的制備)(I)NheI-VHh-SacII 片段的制備用實施例19中制備的pHGold作為模板通過PCR制備在其末端具有Nhel/SacII 的VHh片段。使用如下引物。NheI-VHh_f(SEQ ID No 131) NNNNNGCTAGCCAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTVHh-sacII_r(SEQ ID No 132)NNNNNCCCGCGGATGAGGAGACGGTGACCAGGGTT按照供應商推薦的方法用上述引物進行pfu-turbo的PCR。得到的PCR反應溶液 進行瓊脂糖凝膠(2% )電泳，證實獲得了約350bp的片段。(2) VHg-VHh DNA 片段的制備將以上(1)中獲得的VHh片段引入實施例19中制備的pGHEL的VLh部分中。將(1)中獲得的PCR 片段和 pGHEL 用 Nhel/SacII (均由 TAKARABIO INC.生產) 切割。限制性內切酶反應按照本領域技術人員推薦的方法進行。將得到的反應溶液進行瓊 脂糖電泳，然后凝膠純化(PCR片段瓊脂糖2%, pGHEL 瓊脂糖)。凝膠純化使用上述 凝膠純化試劑盒。已經證實，如上所述在限制性內切酶反應后獲得的PCR片段具有約350bp的PCR 片段和3，OOObp的質粒片段，下面按照與實施例19相同的方法獲得一種新質粒。利用測序儀測定得到的質粒的堿基序列，以證實其堿基序列為目標堿基序列(該 質粒被命名為pHgHh)。(3)酵母表達質粒的插入按照供應商推薦的相同方法進行PCR。用pPCIZ α A (Invitrogen)作為酵母(巴斯德畢赤酵母(Pichiapastris))表達質 粒。利用EcoRI和SacII在該質粒的多克隆位點處引入靶基因。使用(2)中獲得的pHgHh作為模板，通過PCR制備將要引入的基因。引物為，7s4-fff-EcoRls(SEQ ID No 133)
AAGCTGAATTCCAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTHELVH-Sac11-r(SEQ ID No 134)NNNNNCCGCGGAGACGGTGACGAGGGT得到的PCR片段和pPCIZ α A用EcoRI和SacII依次切割，通過凝膠純化按照上述 相同的方法獲得每個目標片段。按照上述方法進行連接。連接反應溶液按照與上述相同的方法轉化，并且接種于 瓊脂平板上。在此情況下的瓊脂平板為色氨酸IOg/酵母提取物5g/NaCl 5g/瓊脂15g/L 中添加Zeocin至濃度為25 μ g/L。在此條件下選擇的菌落在液體培養基(色氨酸IOg/酵 母提取物5g/NaCl 15g, Zeocin 25 μ g/L)中37°C培養過夜。收集質粒后，利用測序儀證實 序列，獲得表達VHg-VHh :VH_金接頭(GGGGS) -VH_HEL的質粒作為該實施例的目標(提供為 pPCIZ-α HH)。 實施例31 (VHg-VHh蛋白的表達/純化)VHg-VHh 的表達使用 Easy select Pichia 表達試劑盒 Ver. G (Invitrogen)進行。 轉化子的制備和蛋白質的制備和純化(金屬螯合柱)均按照本領域技術人員推薦的方法進 行。通過金屬螯合柱獲得的5mL IM咪唑洗脫級分用Tris緩沖液(20mM Tris/200mM NaCl, ImM EGTA :ρΗ 7. 9)作為外部溶液在4°C下透析。每6小時更換一次外部溶液，總共更換3次。隨后使用S印hadex 75 (Amasham Bioscience)，在4°C下通過凝膠過濾進行純化 (緩沖液條件:50mM Tris-HCl，200mM NaCl，ImM EDTA, pH 8. 0，流速0. 7mL/min)。獲得的 級分濃縮后，使用SDS-PAGE(丙烯酰胺17. 5% )和HRP-融合的抗-His抗體進行與上述相 同的western印跡分析。從而指示了目標蛋白質的級分，并且純化為單一條帶。分級分離 提示該級分為約25kDa的單體蛋白質的峰，然后進行如下的評價(圖19)。實施例32 (利用SI3R評價對金的結合親和力)實施例31中獲得的蛋白質級分對金的結合親和力利用SI3R測定。使用BIAcore 2000 (BIAcore制造)作為SI3R測定裝置。使用同一公司的金沉積玻璃基板SIA-kit Au作 為結合該級分的金基板。在下列條件下進行測定。使用500nM(如上所述根據吸光度計算) 實施例20中獲得的蛋白質級分作為樣品。該實施例的條件與實施例21相同。獲得顯示金 結合親和力的結合曲線(圖20)。實施例33 (VHg-VHh蛋白變體_1的制備)以實施例30中獲得的質粒pPCIZ- α 7s4作為模板，使用QC試劑盒(STRATAGENE 生產)獲得VHg變體(SEQ ID No 135或136)用作實施例30的金結合VH的V37L、G44E和 L45R。使用如下引物通過3次操作獲得目標質粒。連續地，每次操作向一個位點插入突變。用于向第一位點插入突變的PCR引物V37F-f (SEQ ID No 137)TTACTGGATCAACTGGTTCCGCCAGATGCCCGGV37F-r(SEQ ID No 138)CCGGGCATCTGGCGGAACCAGTTGATCCAGTAA用于向第二位點引入突變的PCR引物G44E-f (SEQ ID No 139)
44
CAGATGCCCGGCAAAGAACTGGAATGGATGGGGG44E-r (SEQ ID No 140)CCCCATCCATTCCAGTTCTTTGCCGGGCATCTG用于向第三位點引入突變的PCR引物L45F-f (SEQ ID No 141)GCCCGGCAAAGAAAGGGAATGGATGGGGATGL45F-r (SEQ ID No : 142)CATCCCCATCCATTCCCTTTCTTTGCCGGGC突變的插入根據序列證實。從轉化到蛋白質表達的程序與實施例31相同。使用 約25kDa的單體蛋白質峰進行如下的評價。實施例34 (利用SI3R評價對金的結合親和力)實施例33中獲得的蛋白質級分對金的結合親和力利用SI3R測定。使用BIAcore 2000 (BIAcore制造)作為SI3R測定裝置。使用同一公司的金沉積玻璃基板SIA-kit Au作 為結合該級分的金基板。在下列條件下進行測定。使用500nM(如上所述根據吸光度計算) 實施例33中獲得的蛋白質級分作為樣品。該實施例的條件與實施例21相同。獲得顯示金 結合親和力的結合曲線(圖21)。實施例35 (VHg-HEL scFv蛋白變體的制備)進行替換，以獲得與HEL結合的scFv (SEQ ID No 143或144)融合而不是與實施 例 31 的 HEL 結合 VH 融合的蛋白質。使用 Journalof Biological chemistry, 2003, 279, PP8979所示的已經引入HEL結合scFv編碼基因的質粒作為模板，通過PCR獲得編碼HEL結 合的scFv的DNA片段。PCR按照與本領域技術人員所推薦的相同的方法進行，并且使用下 列引物。scFv-f (SEQ ID No 145)NNNNCCATGCCCGATATCGTCCTGACCCAGscFv-r (SEQ ID No 146)AGCTACCGCGGAGACGGTGACGAGGGT限制性內切酶反應之后的程序與實施例30相同，由此獲得目標質粒。根據序列證實得到的質粒含有靶基因序列。從轉化到蛋白質表達的程序與實施例 31相同。這樣獲得了約39kDa的單體蛋白質。實施例36 (利用SI3R評價對金和HEL的雙結合親和力)實施例35中獲得的蛋白質級分對金的結合親和力利用SI3R測定。使用BIAcore 2000 (BIAcore制造)作為SI3R測定裝置。使用同一公司的金沉積玻璃基板SIA-kit Au作 為結合該級分的金基板。在下列條件下進行測定。使用500nM(如上所述根據吸光度計算) 實施例31中獲得的蛋白質級分作為樣品。該實施例的條件與實施例21和22相同。獲得 顯示金結合親和力的結合曲線(圖22)。實施例37 (用于表達VHg變體-VLh的質粒的制備)將由SEQ ID No 147和148表示的DNA序列引入實施例19中獲得的表達質 粒(pGHEL)的金結合VH編碼序列中。一種插入方法包括使用上述Quick Change試劑盒 (Stratagene)，并且用pGHEL作為模板。已經證實獲得的質粒具有靶序列。然后，按照與實施例20相同的方法利用獲得的質粒進行蛋白質的表達和純化以及與VHh-VLg的二聚化。分子量約為50kDa的蛋白質級分利用S印hadex G75分級分離(圖23)。A14P-f (SEQ ID No 147)GAGCAGAGGTGAAAAAGCCAGGGGAGTCTCTGAAGA14P-r(SEQ ID No 148)CTTCAGAGACTCCCCTGGCTTTTTCACCTCTGCTC實施例38 (利用SI3R評價對金和HEL的雙結合親和力)實施例37中獲得的蛋白質級分對金的結合親和力利用SI3R測定。使用BIAcore 2000 (BIAcore制造)作為SI3R測定裝置。使用同一公司的金沉積玻璃基板SIA-kit Au作 為結合該級分的金基板。在下列條件下進行測定。使用500nM(如上所述根據吸光度計算) 實施例37中獲得的蛋白質級分作為樣品。該實施例的條件與實施例21相同。獲得顯示金 結合親和力的結合曲線(圖24)。實施例39 (表達VHg-VLg四聚體的質粒的制備)除了將實施例30的VHh更換為VHg編碼基因片段以外，按照與實施例30相同的 方法制備pPCIZ-α VHg2。用實施例10中獲得的pRA2_7s4作為模板用于制備在上述操作中使用的編碼VHg 的DNA片段，并且使用下列引物作為引物VHg-f (SEQ ID No 149)NNNNNGCTAGC GGCGGGGGCGGTAGC CAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTVHg-r (SEQ ID No : 150)NNNNNCCGCGGATGAGGAGACGGTGACCAGGGTT。根據序列證實獲得了目標質粒。實施例40 (VHg-VLg蛋白的制備)靶蛋白通過與實施例31相同的步驟純化。純化由VHg-VHg 二聚體組成的分子量 約為25kDa的蛋白質(圖25)。實施例41 (表達VHg-VLg四聚體的質粒的制備)除了將用于連接實施例39的VHg-VHg的接頭GGGGS更換為GS以外，按照與實施 例30相同的方法制備pPCIZ- a VHg4。實施例10中獲得的pRA2_7s4作為模板用于制備在上述操作中使用的編碼VHg的 DNA片段，并且使用下列引物作為引物VHg4-f (SEQ ID No 151)NNNNNGCTAGC GGCAGC CAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTVHg4-r (SEQ ID No : 152)NNNNNCCGCGGATGAGGAGACGGTGACCAGGGTT。根據序列證實獲得了目標質粒。實施例42 (金細粒凝集反應)在實施例40和44中獲得的每種蛋白質的500 μ M/PBST溶液中，金細粒(20ηπιΦ Tanaka Kikinzoku生產)在室溫下溫育。無論使用哪種蛋白質都觀察到金細粒的凝集。另 外，還觀察到金細粒/蛋白質混合物的光譜Umax)隨時間變化，觀察到擴大半個帶寬。獲得的結果提示金細粒之間的距離縮短(圖26)。比較實施例3使用500nM BSA代替500nM HEL進行與實施例36相同的操作。與BSA的結合未 被證實。顯示實施例35中獲得的對于金的蛋白質以特異性方式與HEL結合(圖27)。比較實施例4使用SI3R測定法用抗-HEL抗體(Rockland生產)評價直接固定在金基板上的蛋 白質的結合能力。(1)在 PBS 中制備 10 μ M HEL(2)以1 μ 1/min注射100 μ 1在(1)中獲得的溶液。吸附的抗體的信號為1907 R. U.(3)以與⑵相同的方式注射酪蛋白PBS溶液(4)進而，以20 μ 1/ml注射40 μ 1 酪蛋白PBS溶液，并且證實金基板被封閉。(5)隨后以20 μ 1/min注射40 μ 1 1 μ Μ，獲得圖28所示的結果。結果，鍵HEL分子的信號為11 R. U.，而固定在金基板上的抗體的信號為1907 R.U.。考慮到固定處的結構和假定一種抗體分子在基板上捕獲一種抗體，抗體捕獲靶物質 的速度計算為約6%。另一方面，上述實施例顯示本發明的20-40%的蛋白質捕獲抗原。而且，在上述實 施例中捕獲傳感器分子的蛋白質的固定不需要任何特殊試劑或過程，暗示本發明的固定方 法優于常規的物理吸附法。工業實用性本發明提供具有一個或多個金結合位點和特定物質結合位點的金結合蛋白；包 括上面固定有該金結合蛋白的金基板的結構；和使用它們的檢測裝置。在由上面固定了應用本發明獲得的金結合蛋白的結構組成的檢測裝置中，該蛋白 質固定在特異性識別金的結合位點處作為基板。因此，識別特定物質(靶物質)的蛋白質 的結合位點不固定在該基板上，而且該蛋白質被定位，同時確保距基板的距離。結果，靶物 質結合位點使基板對其結合能力的影響最小化，由此該蛋白質有效且高定位地固定在該基 板上。S卩，提示本發明能夠用于利用各種生物物質的功能改善產品的性能，該生物物質 將有機物質如生物物質固定在基板表面，以利用該有機物質的各種生理功能，該產品的代 表為生物傳感器和生物反應器。同時，本發明提供了一種用于標記靶物質的連接體，包括一個或多個與靶物質結 合的位點；和一個或多個與標記的物質結合的位點，其特征在于各自的結合位點彼此獨立 地與將要結合的物質結合。本發明的應用使得能夠不使用常規化學交聯方法而標記靶蛋 白。結果，對各種蛋白質對靶物質的結合親和力的影響，在標記時關心的影響，能夠最小化， 并且能夠提高生產效率。即，本發明能夠用于利用各種生物物質的功能改善產品的性能，該 產品如生物傳感器，其將連接體固定在基板表面上，并且利用該連接體的各種生理功能。本申請要求2004年3月31日申請的日本專利申請2004-108388號的優先權，該 日本申請在此引入作為參考。序列表0763]<110>佳能株式會社
0764]<120>金結合蛋白及其用途
0765]<130>10001551W0CN01
0766]<150>JP2004-108388
0767]<151>2004-03-31
0768]<160>152
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0781]<400>2
0782]Ser lie Lys Gln Asp Gly Ser Glu Thr Arg Tyr Gly Asp Ser Val Arg
0783]151015
0784]Gly
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0787]<212>PRT
0788]<213> 人
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0790]Glu Leu Asp Gly Gly Phe Phe Asp Phe
0791]15
0792]
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0798]Gly His Trp Met His
0799]1
0800]<210>5
0801]<211>1717<212>PRT <213> 人 <400>5
Arg lie Asp Glu His Gly Ser Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1
Asn Gly <210>6 <211>15 <212>PRT <213> 人 <400>6 Leu Gly Phe 1
5
10
15
lie Thr Pro Glu Val Val His Trp Ser Ser Asp lie 51015
<210>7 <211>5 <212>PRT <213> 人 <400>7 Arg Phe Tyr 1
<210>8 <211>16 <212>PRT <213> 人 <400>8 Arg lie Phe 1
<210>9 <211>13 <212>PRT <213> 人 <400>9 Gly Gly Asp 1
<210>10 <211>10 <212>PRT <213> 人
Trp Asn 5
Thr Asn Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Gly Ser 51015
Tyr Gly Pro Ala Leu Ala Trp Phe Asp Pro 510
10
CN
35
36
837
39
40 Lys Gly
<210>16
<211>15
<2 l 2>PRT
<213>人
<400>16
Pro Arg Arg Set Set Set Set Lys／hr Phe Set hla Leu Asp／yr
l5lo15
<210>17
<211>5
<2 l 2>PRT
<213>人
<400>17
Asp／yr hla Met Asn
l5
<210>18
<211>15
<2 l 2>PRT
<213>人
<400>18
Phe工le Arg Set Arg 6ly Phe 61y 61y／hr Pro 61u／yr Ala Ala
l5lo15
<210>19
<211>1818
<2 l 2>PRT
<213>人
<400>19
Asp／yr Arg Pro Leu 61n Phe／rp Pro 61y Arg 61n Met Asp Ala Phe
l5lo15
Asp 11e
<210>20
] <211>5
<212>PRT
<213>人
<400>20
Set／yr／rp工le Ash
l5
<210>2l
<211>1717
<212>PRT
<213> 人
<400>21
Met lie Tyr
1
Gln Gly
<210>22
<211>10
<212>PRT
<213> 人
<400>22
Leu Gly lie
1
<210>23
<211>5
<212>PRT
<213> 人
<400>23
Arg Tyr Tyr
1
<210>24
<211>1717
<212>PRT
<213> 人
<400>24
Met lie Asn
1
Gly
<210>25
<211>14
<212>PRT
<213> 人
<400>25
Glu Ser Met
1
<210>26
<211>5
<212>PRT
<213> 人
Pro Ala Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 51015
Gly Gly Arg Tyr Met Ser Arg 510
lie His 5
Pro Arg Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 51015
Pro Gly Arg Asp Val Arg Asp Gly Met Asp Val 510Gly Ala Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe His Gly 510
Leu Ala Arg Leu Asp Val 5
921340 A_說 明 書_51/90 頁
<400>26
Asp His Tyr lie His 1
<210>27 <211>14 <212>PRT <213> 人 <400>27 Pro Asn Ser 1
<210>28 <211>9 <212>PRT <213> 人 <400>28 Gly lie Leu 1
<210>29 <211>5 <212>PRT <213> 人 <400>29 Asn Tyr Ala 1
<210>30 <211>1717 <212>PRT <213> 人 <400>30 Gly Thr Leu 1
Gln Gly <210>31 <211>14 <212>PRT <213> 人 <400>31
Ala Leu Pro Thr Ser Leu Gly Pro lie Gly Tyr Leu His His 1510
lie Ser 5
Leu Met Leu Arg lie lie Asn Ser Ala Gln Lys Phe 51015
CN 10<212>PRT<213> 人<400>37Glu Leu lie Thr Gly Arg Leu Pro Thr Asp Asn Asp1510<210>38<211>5<212>PRT<213> 人<400>38Gly Tyr Tyr lie His15<210>39<211>1717<212>PRT<213> 人<400>39Trp lie Asn Pro Asn Thr Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln151015Gly<210>40<211>1818<212>PRT<213> 人<400>40Arg Ser Gly Gly Ser Gly Arg Tyr Trp Gly lie Lys Asn Asn Trp Phe151015Asp Pro<210>41<211>1717<212>PRT<213> 人<400>41Trp lie Asn Pro Asn Ser Gly Val Thr His Tyr Ala Gln Lys Phe Gln151015Gly<210>42<211>12<212>PRT
55[1075<213> 人[1076<400>42[1077Glu Leu lie[10781[1079<210>43[1080<211>5[1081<212>PRT[1082<213> 人[1083<400>43[1084Asp Tyr Tyr[10851[1086<210>44[1087<211>1717[1088<212>PRT[1089<213> 人[1090<400>44[1091Trp lie Asn[10921[1093Gly[1094<210>45[1095<211>13[1096<212>PRT[1097<213> 人[1098<400>45[1099Gly Ser Arg[11001[1101<210>46[1102<211>5[1103<212>PRT[1104<213> 人[1105<400>46[1106lie Ser Ser[11071[1108<210>47[1109<211>16[1110<212>PRT[1111<213> 人[1112<400>47[1113Glu lie Tyr
說明書
Ala Gly Arg Leu Pro Thr Asp Asn Asp 510
54/90 頁
Phe His 5
Phe Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 51015
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Pro Thr 5
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說明書
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一種蛋白質，所述蛋白質包含第一結構域和第二結構域，其中所述第一結構域包含抗體重鏈可變區(VH)或抗體輕鏈可變區(VL)，其中所述抗體重鏈可變區(VH)或抗體輕鏈可變區(VL)包含與金特異結合的區，所述蛋白質滿足KD＝3.0×10 7M以下，和其中所述第二結構域包含與靶物質特異結合的區。
2.根據權利要求1所述的蛋白質，其中所述第二結構域是抗體重鏈可變區(VH)或抗體 輕鏈可變區(VL)。
3.根據權利要求1所述的蛋白質，其中所述第二結構域是抗體重鏈可變區(VH)，所述 蛋白質進一步包含第四結構域，所述第四結構域是抗體輕鏈可變區(VL)且所述第四結構 域與所述第二結構域形成復合物。
4.根據權利要求1所述的蛋白質，其中所述第二結構域是抗體輕鏈可變區(VL)，所述 蛋白質進一步包含第四結構域，所述第四結構域是抗體重鏈可變區(VH)且所述第四結構 域與所述第二結構域形成復合物。
5.根據權利要求1所述的蛋白質，進一步包含與所述第一結構域形成復合物的第三結 構域，和與所述第二結構域形成復合物的第四結構域，其中所述第三結構域和所述第四結構域各自包含抗體重鏈可變區(VH)或抗體輕鏈可 變區(VL)，其中所述第三結構域的抗體重鏈可變區(VH)或抗體輕鏈可變區(VL)具有與金特異結 合的區，所述蛋白質滿足Kd = 3. OX IO-7M以下，和其中所述第四結構域的抗體重鏈可變區(VH)或抗體輕鏈可變區(VL)具有與靶物質特 異結合的區。
全文摘要
構建了一種利用抗金抗體和作為抗金抗體一部分的金結合側面的蛋白質。該蛋白質能夠與金特異性結合。該蛋白質或含有該蛋白質的復合蛋白能夠用于檢測靶物質。
文檔編號G01N33/532GK101921340SQ20091017745
公開日2010年12月22日 申請日期2005年3月31日 優先權日2004年3月31日
發明者今村剛士, 熊谷泉, 鹽塚秀則 申請人:佳能株式會社
專業數控銑床產品供應商
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