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重金屬脅迫下黃孢原毛平革菌體內(nèi)cyp450含量的測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種重金屬脅迫下黃孢原毛平革菌體內(nèi)CYP450含量的測(cè)定方法，該方法包括（1）將黃孢原毛平革菌的孢子懸液接種至Kirk培養(yǎng)基中進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng)，然后加入重金屬?gòu)U水進(jìn)行脅迫培養(yǎng)，得到菌絲球；（2）將菌絲球加入Tris-HCl緩沖液中進(jìn)行超聲破碎、差速離心和溶解，得到微粒體溶液；（3）取微粒體溶液作為待測(cè)樣品先通入CO，再加入連二亞硫酸鈉，再次通入CO，靜置后，掃描待測(cè)樣品在400nm～500nm的吸光度，計(jì)算重金屬脅迫下黃孢原毛平革菌體內(nèi)CYP450的含量。本發(fā)明的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、可行、快捷、有效、且可靠。
【專利說(shuō)明】重金屬脅迫下黃孢原毛平革菌體內(nèi)CYP450含量的測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物體內(nèi)酶含量的檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種重金屬脅迫下黃孢原毛平革菌體內(nèi)CYP450含量的測(cè)定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，利用微生物處理重金屬?gòu)U水的技術(shù)得到學(xué)者的廣泛關(guān)注，研究重金屬脅迫下微生物的應(yīng)激反應(yīng)包括測(cè)定其體內(nèi)酶含量的變化勢(shì)在必行。細(xì)胞色素P450(即CYP450 )是一種以血紅素為輔基的b族細(xì)胞色素超家族蛋白酶，因還原型細(xì)胞色素P450與一氧化碳復(fù)合物在450nm處有一吸收峰，故命名為細(xì)胞色素P450。它發(fā)現(xiàn)于1958年，并于1962年因其光譜性質(zhì)定名為細(xì)胞色素P450。細(xì)胞色素P420 (即CYP420)是CYP450失活狀態(tài)下的產(chǎn)物。細(xì)胞色素可催化體內(nèi)多種反應(yīng)，發(fā)揮多種作用，包括氧化-還原作用、環(huán)氧化作用、N-脫羥基作用、O-脫羥基作用、S-氧化和羥基化作用。細(xì)胞色素P450可代謝大約25萬(wàn)種外源性物質(zhì)，包括藥物，環(huán)境中的化合物和污染物，如鹵化烴、多環(huán)芳香烴、芳基胺、除草劑，還有自然界中的植物產(chǎn)物等。除了人體，細(xì)胞色素P450亦廣泛地存在于動(dòng)植物和微生物中。通過(guò)對(duì)黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)基因組的全序列分析發(fā)現(xiàn),它擁有148個(gè)細(xì)胞色素P450基因(酵母菌只有3個(gè))，分屬于12個(gè)不同的細(xì)胞色素P450家族，表明該菌具有極為豐富的細(xì)胞色素P450基因資源，也暗示著黃孢原毛平革菌中的細(xì)胞色素P450在催化轉(zhuǎn)化難降解有機(jī)物方面有巨大潛力。因此，在醫(yī)學(xué)、經(jīng)濟(jì)作物改良、藥品檢驗(yàn)、環(huán)境污染物檢測(cè)等各個(gè)領(lǐng)域急需一種快捷有效的方法對(duì)生物體內(nèi)CYP450含量進(jìn)行檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種簡(jiǎn)單、可行、快捷、有效、可靠的重金屬脅迫下黃孢原毛平革菌體內(nèi)CYP450含量的測(cè)定方法。
[0004]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種重金屬脅迫下黃孢原毛平革菌體內(nèi)CYP450含量的測(cè)定方法，包括以下步驟:
[0005](I)菌絲球的培養(yǎng):將黃抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)的抱子懸液接種至Kirk培養(yǎng)基中進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng)，恒溫振蕩培養(yǎng)后向含黃孢原毛平革菌的Kirk培養(yǎng)基中加入重金屬?gòu)U水進(jìn)行脅迫培養(yǎng)，脅迫培養(yǎng)后過(guò)濾并用Tris-HCl緩沖液洗滌，得到重金屬脅迫后的黃孢原毛平革菌菌絲球；
[0006](2)微粒體的提取:將上述重金屬脅迫后的黃孢原毛平革菌菌絲球加入Tris-HCl緩沖液中在冰浴下進(jìn)行超聲破碎，得到破碎液，對(duì)破碎液進(jìn)行差速離心，得到微粒體沉淀物，將微粒體沉淀物溶解于Tris-HCl緩沖液中，得到微粒體溶液；
[0007](3)CYP450含量的測(cè)定:用Bradford法對(duì)上述微粒體溶液中的總蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行測(cè)定，取兩份微粒體溶液作為待測(cè)樣品和對(duì)照樣品(即參比樣品)分別加入樣品池和對(duì)照池(即參比池)中進(jìn)行基線調(diào)零，然后向樣品池的待測(cè)樣品中先通入CO，再加入連二亞硫酸鈉，再次通入CO，靜置后，掃描待測(cè)樣品在400nm?500nm的吸光度，通過(guò)微粒體溶液中的總蛋白質(zhì)濃度和待測(cè)樣品在450nm處的吸光度計(jì)算重金屬脅迫下黃孢原毛平革菌體內(nèi)CYP450
的含量。
[0008]上述的測(cè)定方法中，所述黃孢原毛平革菌的孢子在所述Kirk培養(yǎng)基中的濃度優(yōu)選 IX IO6 ?2.5X IO6 個(gè)/mL。
[0009]上述的測(cè)定方法中，所述恒溫振蕩培養(yǎng)的條件優(yōu)選為:溫度35°C?39°C，振蕩速度140rpm?170rpm,培養(yǎng)時(shí)間70h?75h。
[0010]上述的測(cè)定方法中，優(yōu)選的，所述重金屬?gòu)U水中的重金屬離子在所述含黃孢原毛平革菌的Kirk培養(yǎng)基中的濃度控制在5 μ mol/L?150 μ mol/L，所述脅迫培養(yǎng)的時(shí)間為6h ?8h。
[0011]上述的測(cè)定方法中，優(yōu)選的，步驟(I)和步驟(2)中所述TriS-HCl緩沖液的主要成分為:50mmol/L?100mmol/L的三輕甲基氨基甲燒，10mmol/L?20mmol/L的乙二胺四乙酸二納(EDTA-Na2), lmmol/L ?2mmo1 /I,的 MgCl2.6H2O, lmmol/L ?2mmo1 /I,的苯甲基橫酸氣(PMSF)，lmmol/L?2mmol/L的二硫蘇糖醇(DTT)，溶劑為去離子水；所述Tris-HCl緩沖液的pH值通過(guò)HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)，pH值為7.5?8.5。
[0012]上述的測(cè)定方法中，所述超聲破碎的條件優(yōu)選為:超聲功率400w?600w，總超聲時(shí)間3min?5min，單次超聲持續(xù)2s?4s，單次超聲間隔8s?12s。
[0013]上述的測(cè)定方法中，所述差速離心優(yōu)選離心三次(分別稱為一次離心、二次離心和三次離心)，包括以下步驟:先將所述破碎液于2°C?4°C下一次離心IOmin?15min，離心力為8600Xg?lOOOOXg，然后取一次離心所得上清液于2°C?4°C下二次離心15min?25min，離心力為18000Xg?21000Xg，再取二次離心所得上清液于2°C?4°C下三次離心
1.5h?2h，離心力為IlOOOOXg?120000Xg，去除上清液，得到微粒體沉淀物。
[0014]上述的測(cè)定方法中，步驟(3)中兩次通入CO的時(shí)間均為30s?90s，通氣流量均為3mL/min ?10mT ,/mi η η
[0015]上述的測(cè)定方法中，所述連二亞硫酸鈉的用量?jī)?yōu)選IOmg?20mg。
[0016]上述的測(cè)定方法中，所述靜置的時(shí)間優(yōu)選3min?9min,更優(yōu)選5min?6min。
[0017]本發(fā)明中重金屬脅迫下黃孢原毛平革菌體內(nèi)CYP450和CYP420含量的計(jì)算公式如下:
[0018]CYP450 含量=(A450-A490) / ( ε 450_棚.L.C)
[0019]CYP420 含量=(Α420-Α490) / ( ε 420_490.L.C)
[0020]其中，CYP450含量和CYP420含量的單位為nmol/mg蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)指微粒體溶液中的總蛋白質(zhì)；A450為吸收光譜中450nm處的吸光度，A420為吸收光譜中420nm處的吸光度，A490為吸收光譜中490nm處的吸光度，CYP450吸光系數(shù)ε 450_頓為91L/(mmol.cm)，CYP420吸光系數(shù)ε 420_490為110L/(mmol.cm) ;C為單位體積待測(cè)微粒體樣品溶液中總蛋白質(zhì)的濃度，用Bradford法測(cè)定,單位為mg/mL微粒體溶液；L為比色皿厚度,單位為cm,—般為 1cm。
[0021]在本發(fā)明中，由于CYP420是CYP450的失活形式，二者有密切聯(lián)系，因此在測(cè)定黃孢原毛平革菌體內(nèi)CYP450含量的同時(shí)還測(cè)定了 CYP420的含量。
[0022]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:[0023]本發(fā)明的方法采用Kirk培養(yǎng)基培養(yǎng)黃孢原毛平革菌，使黃孢原毛平革菌體內(nèi)產(chǎn)生更多的CYP450，為準(zhǔn)確測(cè)定CYP450含量提供基礎(chǔ)保障。本發(fā)明使用的Tris-HCl緩沖液對(duì)生物化學(xué)過(guò)程干擾很小，不與鈣、鎂離子及重金屬離子發(fā)生沉淀，另外，Tris-HCl緩沖液是弱堿性溶液，DNA在這樣的溶液中會(huì)被去質(zhì)子化，從而提高其溶解性，與其它緩沖液相比，Tris-HCl緩沖液能夠提供一個(gè)更加適宜的緩沖環(huán)境。本發(fā)明通過(guò)超聲破碎的方法有效提高了黃孢原毛平革菌菌絲球的破碎度，通過(guò)三次差速離心的方法提高了 CYP450的分離率，獲得了更多CYP450，對(duì)準(zhǔn)確可靠地測(cè)定CYP450的含量具有重要意義。本發(fā)明對(duì)微粒體溶液采用兩次通入CO的方法，能夠確保CYP450與CO的充分結(jié)合；通氣后靜置一段時(shí)間，能夠使CYP450充分還原，以獲得更大CYP450產(chǎn)量，能夠更加準(zhǔn)確可靠地測(cè)定CYP450含量。綜上所述，本發(fā)明對(duì)重金屬脅迫下黃孢原毛平革菌體內(nèi)CYP450含量的測(cè)定方法簡(jiǎn)單、可行、快捷、有效、且準(zhǔn)確可靠，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、經(jīng)濟(jì)作物改良、藥品檢驗(yàn)、環(huán)境污染物檢測(cè)等各個(gè)領(lǐng)域。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中黃孢原毛平革菌經(jīng)濃度為150 μ mo I/L的Cd2+脅迫培養(yǎng)后所得微粒體溶液的CO結(jié)合差光譜。
【具體實(shí)施方式】
[0025]以下結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體優(yōu)選的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0026]實(shí)施例1:
[0027]本實(shí)施例中采用的菌種為黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)BKM-Fl767，購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為ATTC96007，優(yōu)選采用該菌株，但不限于此。
[0028]一種本發(fā)明的重金屬脅迫下黃孢原毛平革菌體內(nèi)CYP450含量的測(cè)定方法，包括以下步驟:
[0029](I)菌絲球的培養(yǎng)
[0030]將黃孢原毛平革菌孢子粉末從固體培養(yǎng)基上刮入無(wú)菌水中制成孢子懸液，將孢子懸液接種到含200mL Kirk培養(yǎng)基的錐形瓶中(錐形瓶的容量為500mL)，使每毫升Kirk培養(yǎng)基含有IXlO6-2.5 X IO6個(gè)分生孢子；將含黃孢原毛平革菌孢子的錐形瓶放入振蕩培養(yǎng)箱中，控制溫度為37°C，振蕩速度為150rpm，振蕩培養(yǎng)70h ;振蕩培養(yǎng)完成后，向錐形瓶的培養(yǎng)基中加入含Cd2+廢水進(jìn)行脅迫培養(yǎng)(脅迫培養(yǎng)的溫度一般與振蕩培養(yǎng)的溫度相同，下同)，Cd2+在培養(yǎng)基中的濃度為150μmol/L，脅迫培養(yǎng)8H后，過(guò)濾并用Tris-HCl緩沖液沖洗，Tris-HCl緩沖液中含有50mmol/L的三羥甲基氨基甲烷、10mmol/L EDTA-Na2、ImmoI/LMgCl2.6H20、lmmol/L PMSF 和 lmmol/L DTT，溶劑為去離子水，pH 值為 8.0,由 HCl 調(diào)節(jié)(本實(shí)施例中的Tris-HCl緩沖液均按此配置)，得到Cd2+脅迫后的黃孢原毛平革菌菌絲球。
[0031](2)微粒體的提取
[0032]將濕重為7.5g的上述Cd2+脅迫后的黃孢原毛平革菌菌絲球加入5mL Tris-HCl緩沖液中混合均勻，然后在冰浴條件下用超聲破碎儀進(jìn)行超聲破碎，超聲功率為450w，總超聲時(shí)間為4min，單次超聲持續(xù)4s，單次超聲間隔8s，得到破碎液；對(duì)破碎液進(jìn)行差速離心(共離心三次)，先取8mL破碎液于4°C下一次離心lOmin，離心力為8600 X g，然后取一次離心所得上清液于4°C下二次離心15min，離心力為20400 X g，再取二次離心所得上清液于4°C下三次離心1.5h，離心力為114000Xg，去除上清液后，得到微粒體沉淀物；將微粒體沉淀物溶解于7mLTris-HCl緩沖液中，得到微粒體溶液；
[0033](3)CYP450含量的測(cè)定
[0034]用Bradford法測(cè)定上述微粒體溶液中的總蛋白質(zhì)濃度為0.402mg/mL,首先取兩份3mL微粒體溶液分別作為待測(cè)樣品和對(duì)照樣品(即參比樣品)加入到樣品池和對(duì)照池(即參比池)中，樣品池和對(duì)照池均為厚度Icm的比色皿，將樣品池和對(duì)照池先置于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(島津UV-2550，下同)中進(jìn)行基線調(diào)零，然后取出樣品池，以3mL/min的通氣流量向樣品池中通入一氧化碳(CO),通入時(shí)間為60s,再向樣品池中加入20mg連二亞硫酸鈉,最后再次以3mL/min的通氣流量向樣品池中通入一氧化碳30s，靜置6min后，將樣品池重新置于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)中，掃描所得待測(cè)樣品在400nm?500nm處的吸收光譜，即CO結(jié)合差光譜，如圖1所示，A450為0.2686, A420為0.2702, A490為0.2607，通過(guò)計(jì)算得到CYP450為0.2148nmol/mg蛋白質(zhì)，CYP420為0.2160nmol/mg蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)指微粒體溶液中的總蛋白質(zhì)，下同)。CYP420是由部分CYP450失活得到，CYP420的出現(xiàn)，說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中會(huì)有部分CYP450失活。此外，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，待測(cè)樣品通入CO后，靜置時(shí)間對(duì)測(cè)量結(jié)果具有明顯影響，當(dāng)靜置時(shí)間為5min?6min時(shí)，可獲得最大CYP450和CYP420含量值。
[0035]實(shí)施例2:
[0036]本實(shí)施例中采用的菌種為黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)BKM-Fl767，購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為ATTC96007，優(yōu)選采用該菌株，但不限于此。
[0037]一種本發(fā)明的重金屬脅迫下黃孢原毛平革菌體內(nèi)CYP450含量的測(cè)定方法，包括以下步驟:
[0038](I)菌絲球的培養(yǎng)
[0039]將黃孢原毛平革菌孢子粉末從固體培養(yǎng)基上刮入無(wú)菌水中制成孢子懸液，將孢子懸液接種到6組各含200mL Kirk培養(yǎng)基的錐形瓶中，使每毫升Kirk培養(yǎng)基含有I X IO6?
2.5 X IO6個(gè)分生孢子；將6組含黃孢原毛平革菌孢子的錐形瓶放入振蕩培養(yǎng)箱中，控制溫度為37°C，振蕩速度為150rpm，振蕩培養(yǎng)72h ;振蕩培養(yǎng)完成后，向6組錐形瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基中分別加入含不同濃度Cd2+的廢水進(jìn)行脅迫培養(yǎng)，Cd2+在6組培養(yǎng)基中的濃度分別為O、5 μ mol/L、25 μ mol/L、50 μ mol/L、100 μ mol/L 和 150 μ mol/L,脅迫培養(yǎng) 8h 后，過(guò)濾并用Tris-HCl緩沖液沖洗，Tris-HCl緩沖液中含有50mmol/L的三羥甲基氨基甲烷、10mmol/LEDTA-Na2、lmmol/L MgCl2.6H20、lmmol/L PMSF 和 lmmol/L DTT，溶劑為去離子水，pH 值為
8.0，由HCl調(diào)節(jié)(本實(shí)施例中的Tris-HCl緩沖液均按此配置)，得到不同濃度Cd2+脅迫后的黃孢原毛平革菌菌絲球。
[0040](2)微粒體的提取
[0041]將上述6組不同濃度Cd2+脅迫后的黃孢原毛平革菌菌絲球(每組濕重均為7.5g)分別加入6組5mL Tris-HCl緩沖液中混合均勻，然后在冰浴條件下用超聲破碎儀進(jìn)行超聲破碎，超聲功率為500w，總超聲時(shí)間為4min，單次超聲持續(xù)4s，單次超聲間隔8s，得到破碎液；對(duì)破碎液進(jìn)行差速離心(各組均離心三次)，每組先取8mL破碎液于4°C下一次離心lOmin，離心力為8600 X g，然后取一次離心所得上清液于4°C下二次離心20min，離心力為20400Xg，再取二次離心所得上清液于4°C下三次離心1.5h，離心力為114000Xg，最后去除上清液，得到微粒體沉淀物；將微粒體沉淀物溶解于7mL Tris-HCl緩沖液中，得到微粒體溶液；
[0042](3)CYP450含量的測(cè)定
[0043]用Bradford法對(duì)上述制得的6組微粒體溶液中的總蛋白質(zhì)濃度分別進(jìn)行測(cè)定，得到的蛋白質(zhì)濃度分別為 0.7839mg/mL, 0.8374mg/mL, 0.6599mg/mL, 0.6431mg/mL,
0.6703mg/mL, 0.5816mg/mL(對(duì)應(yīng)的 Cd2+ 脅迫濃度分別為 0、5 μ mol/L、25 μ mol/L、50 μ mol/L、100 μ mol/L和150 μ mol/L),每組的具體處理過(guò)程如下:取兩份3mL微粒體溶液分別作為待測(cè)樣品和對(duì)照樣品加入到樣品池和對(duì)照池中，樣品池和對(duì)照池均為厚度Icm的比色皿，將樣品池和對(duì)照池先置于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)中進(jìn)行基線調(diào)零，然后取出樣品池，以3mL/min的通氣流量向樣品池中通入一氧化碳，通入時(shí)間為60s,再向樣品池中加入20mg連二亞硫酸鈉，最后再次以3mL/min的通氣流量向樣品池中通入一氧化碳30s,靜置5min后,將樣品池重新置于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)中，掃描所得待測(cè)樣品在400nm-500nm處的吸收光譜，即CO結(jié)合差光譜，CYP450含量和CYP420含量的計(jì)算結(jié)果見(jiàn)下表I。
[0044]表I不同濃度Cd2+脅迫下黃孢原毛平革菌體內(nèi)CYP420和CYP450的含量
[0045]
【權(quán)利要求】
1.一種重金屬脅迫下黃孢原毛平革菌體內(nèi)CYP450含量的測(cè)定方法，包括以下步驟: (1)菌絲球的培養(yǎng):將黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)的孢子懸液接種至Kirk培養(yǎng)基中進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng),恒溫振蕩培養(yǎng)后向含黃孢原毛平革菌的Kirk培養(yǎng)基中加入重金屬?gòu)U水進(jìn)行脅迫培養(yǎng)，脅迫培養(yǎng)后過(guò)濾并用Tris-HCl緩沖液洗滌，得到重金屬脅迫后的黃孢原毛平革菌菌絲球； (2)微粒體的提取:將上述重金屬脅迫后的黃孢原毛平革菌菌絲球加入Tris-HCl緩沖液中在冰浴下進(jìn)行超聲破碎，得到破碎液，對(duì)破碎液進(jìn)行差速離心，得到微粒體沉淀物，將微粒體沉淀物溶解于Tris-HCl緩沖液中，得到微粒體溶液； (3)CYP450含量的測(cè)定:用Bradford法對(duì)上述微粒體溶液中的總蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行測(cè)定，取兩份微粒體溶液作為待測(cè)樣品和對(duì)照樣品分別加入樣品池和對(duì)照池中進(jìn)行基線調(diào)零，然后向樣品池的待測(cè)樣品中先通入CO，再加入連二亞硫酸鈉，再次通入CO，靜置后，掃描待測(cè)樣品在400nm?500nm的吸光度，通過(guò)微粒體溶液中的總蛋白質(zhì)濃度和待測(cè)樣品在450nm處的吸光度計(jì)算重金屬脅迫下黃孢原毛平革菌體內(nèi)CYP450的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述黃孢原毛平革菌的孢子在所述Kirk培養(yǎng)基中的濃度為I X IO6?2.5 X IO6個(gè)/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述恒溫振蕩培養(yǎng)的條件為:溫度35°C?39°C，振蕩速度140rpm?170rpm，培養(yǎng)時(shí)間70h?75h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述重金屬?gòu)U水中的重金屬離子在所述含黃孢原毛平革菌的Kirk培養(yǎng)基中的濃度控制在5 μ mo I/L?150 μ mol/L,所述脅迫培養(yǎng)的時(shí)間為6h?8h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于，步驟(I)和步驟(2)中所述Tris-HCl緩沖液的主要成分為:50mmol/L?100mmol/L的三輕甲基氨基甲燒，10mmol/L?20mmol/L的乙二胺四乙酸二納，Immol/I,?2mmo1 /I,的 MgCl2.6H2O, Immol/I,?2mmo1 /I,的苯甲基橫酰氟，lmmol/L?2mmol/L的二硫蘇糖醇,溶劑為去離子水；所述Tris-HCl緩沖液的pH值通過(guò)HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)，pH值為7.5?8.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述超聲破碎的條件為:超聲功率400w?600w，總超聲時(shí)間3min?5min，單次超聲持續(xù)2s?4s，單次超聲間隔8s?12s。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述差速離心包括以下步驟:先將所述破碎液于2°C?4°C下一次離心IOmin?15min,離心力為8600Xg?IOOOOXg,然后取一次離心所得上清液于2°C?4°C下二次離心15min?25min,離心力為18000Xg?21000Xg,再取二次離心所得上清液于2 °C?4 °C下三次離心1.5h?2h，離心力為IlOOOOXg?120000Xg，去除上清液，得到微粒體沉淀物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1?7中任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其特征在于，步驟(3)中兩次通入CO的時(shí)間均為30s?90s,通氣流量均為3mL/min?10mL/min。
9.根據(jù)權(quán)利要求1?7中任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述連二亞硫酸鈉的用量為IOmg?20mg。
10.根據(jù)權(quán)利要求1?7中任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述靜置的時(shí)間為3min ?9min。
【文檔編號(hào)】G01N21/31GK103454232SQ201310399917
【公開(kāi)日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月5日
【發(fā)明者】曾光明, 張企華, 陳桂秋, 黃健, 杜堅(jiān)堅(jiān), 陳安偉, 易斌, 駱其超, 周穎, 官嵩 申請(qǐng)人:湖南大學(xué)