一種測定類凝血酶活性的方法
【專利摘要】本發明涉及一種蛇毒類凝血酶的測定方法，采用酶動力學測定法，使用可控溫紫外分光光度計，經過考察孵育時間、酶濃度、線性范圍以及該方法的精密度與酶促反應動力學常數，最終確立了蛇毒類凝血酶活力的測定方法。本發明克服了傳統檢測方法中存在的檢測所用血漿或纖維蛋白原等原料性能差異大、操作人員主觀影響大，以及只能專人負責測定等不利因素，具有步驟簡單、不需做標準曲線、試驗數據清晰明了，測定結果準確可靠的優點，適用于各種來源的類凝血酶原液和制劑的活性測定、活性定義，以及質量標準控制，包括天然及重組類凝血酶。
【專利說明】一種測定類凝血酶活性的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于醫學檢測【技術領域】，具體而言，本發明涉及一種測定類凝血酶活性的方法。
【背景技術】
[0002]自1936年奧地利學者Von Klobusitzky首次從巴西矛頭峻蛇(Bothropsatrox)毒液中分離得到一種絲氨酸蛋白水解酶(類凝血酶)，即巴曲酶，至今已發現30多種蛇毒中含有類凝血酶組分，并有20多種先后得到分離和純化。
[0003]我國目前臨床上應用的蛇毒制劑大部分為類凝血酶，在臨床上有兩方面的用途。
[0004]一種為降纖作用，即巴曲克栓酶，如東菱迪芙，其作用是分解纖維蛋白原，抑制血栓形成；誘發組織型纖維蛋白溶解酶原激活劑(t-PA)的釋放，減弱纖維蛋白溶解酶原激活劑的抑制因子的活性，促使纖維蛋白溶解；增加血液流動性，防止血栓形成。主要用于缺血性腦血管病、急性心肌梗塞、突發性耳聾、急性腦梗塞、不穩定心絞痛等，其療效確切，不良反應輕微。
[0005]另一種為止血作用，即巴曲止血酶,如立止血、巴曲亭、邦亭、速樂涓等,可用于多種原因引起的出血，特別是應用于傳統止血藥無效的出血病人，療效確切，未發現明顯的不良反應。
[0006]迄今為止，巴曲酶活性測定主要有兩種方法:其中血漿凝固法最常用，根據血漿凝固的時間判定巴曲酶的效價。另外一種方法是纖維蛋白原凝集法，根據纖維蛋白凝塊生成的快慢判斷巴曲酶的效價。但這兩種方法，無論血漿還是纖維蛋白原都來源復雜，不同廠家差異較大，即使是同一廠家的產品，不同批次間差異也較大，并且二者的存放時間長短也會影響活性測定，更何況是以目測判斷結果，受檢測者主觀干擾較大。
[0007]合肥兆科藥業有限公司申請了巴曲酶活性測定方法，以降纖酶為標準品，測得巴曲酶也以降纖酶活力Bu為巴曲止血酶活力單位，測定方法采用傳統的酶固定時間測定法，這類方法不僅耗時長，而且很難保證反應為零級反應(反應速度直接與被測酶活力成正比，而與底物濃度無關)，因此其線性、靈敏度、準確度較差。隨著實驗分析技術的發展，酶固定時間測定法已逐步被酶動力學測定法所取代。
[0008]鑒于上述方法的局限性，尋找一種科學、高效、客觀、經濟的、精準、批間差異小的活性測定方法成為巴曲酶等類凝血酶產品的應用研究的關鍵。
【發明內容】
[0009]本發明建立了一種類凝血酶、例如蛇毒類凝血酶的酶動力學測定方法。該法又稱速率法，即用紫外分光光度計監測酶促反應體系的初速度，間接計算樣品中被測酶活力。在酶促反應中，真正能代表酶催化活性的只有酶促反應初速度。因此該法不僅準確，線性范圍大大提高、不需做標準曲線，節省試驗步驟及時間。
[0010]具體而言，本發明的檢測方法包括以下步驟:[0011]本發明提供一種測定類凝血酶活性的方法，該方法包括以下步驟:
[0012](I)用去離子水配制濃度為l_2mM的生色底物水溶液，所述生色底物為S2238、S2288、S2251、S2366、S2403 或 S2765 ；
[0013](2)用20-150mmol/L pH7.0-8.0的Tris鹽酸緩沖液或磷酸鹽緩沖液稀釋待測類凝血酶樣品，得到樣品濃度為18nmol/L-100nmol/L的稀釋液；
[0014](3)吸取步驟(2)制得的待測類凝血酶樣品稀釋液置于比色皿中，加入50μ I的步驟(I)制得的生色底物水溶液，然后補充所述Tris鹽酸緩沖液或磷酸鹽緩沖液至終體積為lmL，混勻，使得待測類凝血酶樣品的終濃度為l-25nmol/L，于37°C靜置2_25分鐘，然后在波長405nm處檢測吸光度0_20分鐘，每30秒讀數一次；
[0015](4)利用公式I計算所述待測類凝血酶樣品的活力(U):
【權利要求】
1.一種測定類凝血酶活性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)用去離子水配制濃度為l-2mM的生色底物水溶液，所述生色底物為S2238、S2288、S2251、S2366、S2403 或 S2765 ；
(2)用20-150mmol/L ρΗ7.0-8.0 的 Tris 鹽酸緩沖液或 20-150mmol/L ρΗ7.0-8.0 的磷酸鹽緩沖液稀釋待測類凝血酶樣品，得到樣品濃度為ISnmol/L-lOOnmol/L的稀釋液； (3)吸取步驟(2)制得的待測類凝血酶樣品稀釋液置于比色皿中，加入50μ I的步驟(I)制得的生色底物水溶液，然后補充所述Tris鹽酸緩沖液或磷酸鹽緩沖液至終體積為ImL,混勻，使得待測類凝血酶樣品的終濃度為l-25nmol/L，于37°C靜置2_25分鐘，然后在波長405nm處檢測吸光度0_20分鐘，每30秒讀數一次； (4)利用公式I計算所述待測類凝血酶樣品的活力(U): 公式 1: U = ΔAXVX10-9/1XtXξ 式中:U—活力單位，即產物生成速度(nmol/min) ；Δ A一樣品在反應時間中A405吸光度的變化值—反應體積(L) ;1 一光程(cm) ;t—反應時間(min) ; ξ—摩爾吸光系數，為10500 (L/moI.cm)。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述生色底物為S2238;所述水溶液的濃度為2mM。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述Tris鹽酸緩沖液為20-100mmol/L 的 pH7.0-8.0Tris 鹽酸緩沖液，優選為 20-100mmol/L 的 pH7.2-8.0Tris 鹽酸緩沖液，更優選為50mmol/L的pH7.4Tris鹽酸緩沖液；所述磷酸鹽緩沖液為20-100mmol/L的pH7.0-8.0磷酸鹽緩沖液，優選為20-100mmol/L的pH7.2-8.0磷酸鹽緩沖液，更優選為50mmol/L的ρΗ7.4磷酸鹽緩沖液。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，待測類凝血酶樣品的終濃度為l_28nmol/L，優選為l_17nmol/L。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，在37°C下靜置時間為5分鐘；檢測時間為IO分鐘。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其特征在于，所述類凝血酶為蛇毒類凝血酶，包括白眉蝮蛇來源的降纖酶、矛頭蝮蛇來源的巴曲酶、尖吻蝮蛇來源的血凝酶等，重組以及重組突變的蛇毒類凝血酶。
7.根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其特征在于，所述類凝血酶為重組定點突變巴曲酶或天然巴曲酶，其中所述重組定點突變巴曲酶的氨基酸序列相對于天然巴曲酶氨基酸序列的第45位的Arg突變為Lys。
【文檔編號】G01N1/28GK103884662SQ201410066734
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年2月24日 優先權日:2014年2月24日
【發明者】徐梅, 李娜, 李秀娜, 石皎, 薛雁, 王宏英, 薛百忠 申請人:遼寧諾康生物制藥有限責任公司
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