專利名稱：：蝦變應原特異性IgE的ELISA檢測試劑盒及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種定性檢測人血清中蝦變應原特異性IgE的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒及其制備方法，篩查和診斷因進食或接觸蝦類食物而引起的過敏癥。
背景技術：
：食物過敏反應是現代社會中常見的一大類疾病，其發生是因進食或接觸各種食物中的變應原而引起的，大都是由IgE介導的I型超敏反應。食物過敏反應的發病機理主要涉及兩方面因素，一是食物變應原的剌激，另一個是個體的反應性。當食物變應原進入機體后，激活特異性B細胞克隆產生針對該變應原的特異性IgE，IgE以其Fc段與肥大細胞、嗜堿性粒細胞表面的IgEFc受體(FceR)結合，使機體處于致敏狀態。當機體再次受到相同的變應原剌激時，再次進入的變應原與已結合在肥大細胞、嗜堿性粒細胞上的特異性IgE結合，引起FceR橋聯，激活肥大細胞和嗜堿性粒細胞，通過一系列膜分子行為導致細胞脫顆粒、釋放和合成組胺、激肽酶原、前列腺素、白三烯、血小板活化因子等多種生物活性介質，作用于血管、皮膚、粘膜、腺體等靶器官，引起支氣管平滑肌收縮、血管擴張、毛細血管通透性增加、組織水腫及呼吸道和消化道炎癥反應；導致支氣管哮喘，過敏性鼻炎，過敏性胃腸炎，過敏性蕁麻疹，嚴重時可引起過敏性休克。正常人血清中IgE的量極低，約為5X10—Smg/ml，用特異性變應原進行檢測時一般呈陰性反應。發生過敏反應的個體血清中IgE含量顯著升高，可比正常高出10002000倍，用特異性變應原進行檢測時都呈陽性反應。因此，應用變應原作為抗原檢測血清中的特異性IgE，是理想的I型超敏反應的臨床診斷指標之一。
發明內容本發明的目的在于提供一種特異性強、靈敏度高、方便快速地定性檢測人血清中蝦變應原特異性IgE的ELISA檢測試劑盒，用以篩查和診斷蝦類食物過敏癥。本發明的蝦變應原特異性IgEELISA檢測試劑盒，其組成包括已包被純化的蝦變應原蛋白的酶標反應板、酶標記抗體、底物顯色液、樣品稀釋液、陽性對照血清、陰性對照血清、濃縮洗滌液和終止反應液；其中包被酶標反應板的蝦變應原蛋白是從刀額新對蝦(Met即enaeusensis)組織蛋白中經過分離純化得到的純化變應原蛋白，包括分子量為21.6KDa、30KDa、33KDa、36KDa、46.2KDa、60KDa、64.8KDa、68KDa、78KDa、88.5KDa的10種蛋白質，以其中任意1種或1種以上組合包被酶標反應板作為檢測抗原。酶標記抗體辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗人IgE抗體；底物顯色液1.25mmol/L3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺(TMB)、12mmol/L過氧化脲、15mmol/L擰檬酸-5mmol/L磷酸氫二鈉緩沖液，pH5.0-5.4;樣品稀釋液75mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0-7.4，含0.1%Tween-20、慶大霉素3100u/ml、0.01%硫柳滎和0.01%山梨酸、1%牛血清白蛋白；陽性對照血清蝦變應原特異性IgE陽性血清混合物；陰性對照血清正常人血清混合物；濃縮洗滌液0.25mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.2-7.4，含1%Tween-20、0.01%硫柳汞和0.01%山梨酸；終止反應液lmol/LH2S04。本發明的蝦變應原特異性IgEELISA檢測試劑盒的制備方法，包括如下步驟(1)包被酶標反應板用純化的刀額新對蝦變應原蛋白為抗原包被酶標反應板；(2)封閉酶標反應板用封閉液封閉已包被蝦變應原蛋白的酶標反應板；(3)配制酶標記抗體；(4)配制底物顯色液；(5)配制樣品稀釋液；(6)配制濃縮洗滌液和終止反應液。本發明的蝦變應原特異性IgEELISA檢測試劑盒的使用方法，包括如下步驟(1)取待檢樣品、陽性對照血清、陰性對照血清分別加入相應的酶標反應板反應孔中，37t:孵育30分鐘，使待檢樣品以及陽性對照血清中特異性IgE與包被在酶標反應板反應孔中的蝦變應原特異性結合；(2)用洗滌液洗滌，除去未結合的雜蛋白和其它物質；(3)于酶標反應板反應孔中加入HRP標記的羊抗人IgE抗體，37。C孵育30分鐘，使HRP標記的羊抗人IgE抗體與已結合在反應孔固相的特異性IgE結合；(4)用洗滌液洗滌，除去未結合的酶標記抗體；(5)于酶標反應板反應孔中加入底物顯色液，37t:或室溫孵育15分鐘，使標記酶分解底物出現顏色反應；(6)于酶標反應板反應孔中加入終止反應液，終止酶反應后，用酶標儀在450nm波長下測定吸光值。具體實施方法下面的實施例將具體說明本發明的操作方法，但不能作為對本發明的限定。實施例一蝦變應原特異性IgEELISA檢測試劑盒的制備。本試劑盒的制備過程包括如下步驟1.包被酶標反應板用包被液(0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.5-9.6)將純化的刀額新對蝦的33KDa變應原蛋白稀釋至1Pg/ml，于96孔(或48孔)酶標反應板每孔加入50ill(變應原蛋白包被量為50ng/孔)，將加好包被抗原液的酶標反應板置濕盒內，于37t:孵育3小時，然后放置4t:過夜。次日甩去包被液，用洗滌液洗酶標反應板三次，拍干。2.封閉酶標反應板于酶標反應板每孔加入封閉液(含1XBSA、0.01%硫柳汞和0.01%山梨酸的生理鹽水)220iU，置濕盒內，于37°C孵育3小時，然后放置4°C過夜。次日甩去包被液，用洗滌液洗酶標反應板三次；將酶標反應板真空干燥，裝入帶有干燥劑的鋁箔袋內密封，貯存于4°C。3.配制酶標記抗體用樣品稀釋液將HRP標記的羊抗人IgE抗體(購自美國KPL公司)稀釋為1:1500濃度；分裝于小試劑瓶，貯存于4°C。4.配制底物顯色液底物顯色液成分為1.25mmol/L3，3'，5，5，-四甲基聯苯胺(TMB)、12mmol/L過氧化脲、15mmol/L檸檬酸-5mmol/L磷酸氫二鈉緩沖液，pH5.0-5.4。先按配液總量的8090%配制15mmol/L檸檬酸-5mmol/L磷酸氫二鈉緩沖液，調節pH至5.4;準確稱取所需量的過氧化脲加入緩沖液內，使完全溶解并充分混勻；準確稱取所需量的TMB用適量乙醇溶解，緩慢加入緩沖液內，充分混勻；最后用蒸餾水定容至配液總量；分裝于小試劑瓶，貯存于4°C。5.配制樣品稀釋液樣品稀釋液成分為75mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0-7.4，含0.1%Tween-20、慶大霉素100u/ml、0.01%硫柳滎和0.01%山梨酸、1%牛血清白蛋白。先按配液總量的8090%配制75mmol/L磷酸鹽緩沖液，調節pH至7.2;按所需量加入慶大霉素(原液8萬u/ml或4萬u/ml)、1%的硫柳汞和10%的山梨酸，使其終濃度分別為100u/ml、0.01%和0.01%，充分混勻；準確稱取所需量的牛血清白蛋白加入緩沖液內，使完全溶解并充分混勻；按所需量加入Tween-20使其終濃度為0.1%，充分混勻；最后用蒸餾水定容至配液總量；分裝于小試劑瓶，貯存于4°C。6.配制濃縮洗滌液濃縮洗滌液為20倍濃縮，成分為0.25mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.2-7.4，含1%Tween-20、0.01%硫柳滎和0.01%山梨酸。先按配液總量的8090%配制0.25mol/L磷酸鹽緩沖液，調節pH至7.4，按所需量加入1%的硫柳汞和10%的山梨酸，使其終濃度分別為0.01%和0.01%，充分混勻；按所需量加入Tween-20使其終濃度為1%，充分混勻；最后用蒸餾水定容至配液總量；分裝于小試劑瓶，貯存于4t:。7.配制終止反應液終止反應液成分為lmol/LH2S04，按常規方法配制；分裝于小試劑瓶，貯存于4°C。8.陽性對照與陰性對照將蝦變應原特異性IgE陽性血清混合均勻，用樣品稀釋液適當稀釋，使其經本試劑盒檢測的0D45。值在12之間，分裝于小試劑瓶，貯存于4°C。陰性對照血清用樣品稀釋液適當稀釋(或不稀釋)，分裝于小試劑瓶，貯存于4°C。實施例二用蝦變應原特異性IgEELISA檢測試劑盒檢測臨床疑似蝦類食物過敏癥患者血清對44例臨床疑似蝦類食物過敏癥的患者，用本發明的ELISA試劑盒檢測其血清中的蝦變應原特異性IgE，操作步驟如下1.取鋁箔包裝的48孔已包被酶標反應板1塊，平衡至室溫后，開啟包裝袋取出酶標反應板。2.設置陽性對照、陰性對照和空白孔本例設置A12孔為陽性對照孔，加入陽性對照50iU/孔；B12孔和C12孔為陰性對照孔，分別加入陰性對照50iU/孔；D12孔為空白，加入樣品稀釋液50iU/孔。3.加樣取待檢血清編號，從酶標反應板A1至All孔、B1至Bll孔、C1至Cll孑L、Dl至Dll孔依次加入待檢血清，50iU/孔；用封口膠紙封好酶標反應板反應孔，置37t:溫箱孵育30分鐘。4.洗板取濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋20倍；酶標反應板孵育結束后撕下封口膠紙，甩去反應孔中的液體，在吸水紙上拍干；于反應孔中加滿洗滌液，靜置約30秒，甩去反應孔中的液體，在吸水紙上拍干，如此重復洗板5次。5.加酶標記抗體于酶標反應板每孔加入HRP標記的羊抗人IgE50iil，用封口膠紙封好反應孔，置37t:溫箱孵育30分鐘；如步驟4洗板5次。6.加底物顯色于酶標反應板每孔加入底物顯色液50iU，置37t:溫箱或室溫下反應15分鐘。7.終止反應測OD值于酶標反應板每孔加入終止反應液50iil(或2滴)，混勻，在10分鐘內用酶標儀在450nm波長下以空白孔調零，測定吸光值(OD值)。8.結果判斷(1)以陰性對照孔OD值的平均值X2.1為閾值(cutoff值，CO值)，樣品孔0D值^cutoff值的判斷為蝦變應原特異性IgE陽性，樣品孔OD值〈cutoff值的判斷為蝦變應原特異性IgE陰性。(2)在缺乏酶標儀的基層醫院，可直接觀察判斷結果，以樣品孔與陽性對照孔進行比較，樣品孔反應液的顏色深于或等于陽性對照孔的判斷為陽性，樣品孔反應液的顏色淡于陽性對照孔的判斷為陰性。本例對臨床疑似蝦類食物過敏癥患者血清的檢測結果(表1)顯示，44份血清中有29份血清的0D值大于cutoff值(0.243)，為蝦變應原特異性IgE陽性，可確診為蝦類食物過敏癥。表144份疑似蝦過敏癥患者血清中蝦變應原特異性IgE的檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權利要求蝦變應原特異性IgE的ELISA檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒組成包括(1)已包被蝦變應原蛋白的酶標反應板；(2)酶標記抗體；(3)底物顯色液；(4)陽性對照血清；(5)陰性對照血清；(6)樣品稀釋液；(7)濃縮洗滌液；(8)終止反應液其中已包被蝦變應原蛋白的酶標反應板蝦變應原蛋白是從刀額新對蝦(Metapenaeusensis)組織蛋白中經過分離純化得到的純化變應原蛋白；酶標記抗體辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgE抗體；底物顯色液1.25mmol/L3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺(TMB)、12mmol/L過氧化脲、0.1mol/L檸檬酸-0.2mol/L磷酸氫二鈉緩沖液，pH5.0-5.4；樣品稀釋液0.07mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0-7.4，含0.1％Tween-20、慶大霉素100u/ml、0.01％硫柳汞和0.01％山梨酸、1％牛血清白蛋白；濃縮洗滌液0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.2-7.4，含1％Tween-20、0.01％硫柳汞和0.01％山梨酸；終止反應液1mol/LH2SO4。2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述包被酶標反應板的純化蝦變應原蛋白是分子量為21.6KDa、30KDa、33KDa、36KDa、46.2KDa、60KDa、64.8KDa、68KDa、78Kda和88.5KDa的10種蛋白質中的任意1種或1種以上組合作為檢測抗原。3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述酶標反應板為96孔(8條X12孔或12條X8孔)或48孔(4條X12孔)。4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒的制備方法包括如下步驟(1)包被酶標反應板用純化的刀額新對蝦變應原蛋白為抗原包被酶標反應板；(2)封閉酶標反應板用封閉液封閉已包被蝦變應原蛋白的酶標反應板；(3)配制酶標記抗體；(4)配制底物顯色液；(5)配制樣品稀釋液；(6)配制濃縮洗滌液和終止反應液。全文摘要本發明發明了一種定性檢測人血清中蝦變應原特異性IgE的ELISA試劑盒，其組成包括已包被純化的蝦變應原蛋白的酶標反應板、辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgE抗體、樣品稀釋液、TMB底物顯色液、濃縮洗滌液、終止反應液、陽性對照液和陰性對照液。本發明的試劑盒的制備工藝中，用于包被酶標反應板的抗原是從刀額新對蝦組織蛋白中分離純化的一組具有變應原活性的蛋白質，其分子量分別為21.6KDa、30KDa、33KDa、36KDa、46.2KDa、60KDa、64.8KDa、68KDa、78KDa、88.5Kda，以其中的任意1種或1種以上組合作為包被抗原。按本發明制備的蝦變應原特異性IgE檢測試劑盒，可應用于臨床上蝦類食物過敏癥的體外輔助診斷和相關科學研究。文檔編號G01N33/531GK101706501SQ200910213338公開日2010年5月12日申請日期2009年11月3日優先權日2009年11月3日發明者劉平靜,劉群英,吳興達,吳靜,鄔敏辰,陳偉申請人:江南大學
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
