專利名稱：用于檢測廣譜細菌的方法、肽和生物傳感器的制作方法
相關申請本申請要求2004年6月9日提交的美國臨時申請No.60/578,811和2003年11月3日提交的美國臨時申請No.60/516,692的優先權。在此引入上述申請的完整教導作為參考。
背景技術：
傷口感染是美國健康花費的主要原因。所有手術傷口的大約5％被微生物感染，該數字對于進行腹部手術的患者來說明顯更高(10-20％)。細菌物種，如葡萄球菌是最常從感染的傷口分離的。這可能是因為人類是環境中的葡萄球菌的天然儲存處，任何特定時間都有最高達50％的群體在此集群。集群速度在醫院設置中顯著更高，在健康護理工作者和患者中都是如此。而且，醫院環境中集群的生物容易抗很多形式的抗微生物治療，這是由于在經常使用抗生素的醫院環境中存在的強選擇壓力。葡萄球菌通常是作為共生體攜帶的，但是，有了表皮的破口，它們可以導致嚴重的，甚至威脅生命的感染。
葡萄球菌是手術傷口感染中最常見的致病劑；其它包括，但不限于，釀膿鏈球菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌、粘質沙雷氏菌、奇異變形菌、陰溝腸桿菌、無硝不動桿菌、肺炎克雷伯氏菌和大腸桿菌。由于任何上述生物導致的手術后感染都是醫院的重要關注。預防所述感染的最常見途徑是施用預防性抗生素藥物。盡管通常是有效的，但該策略具有不希望的培育細菌的抗性株的作用。由于有利于抗性株的生長，不應該鼓勵常規使用預防性抗生素。
代替常規的預防，更好的方法是實施良好的傷口控制，即，在手術前、手術過程中和手術后保持手術區沒有細菌，并且在愈合過程中仔細監測該部位是否有感染。正常監測方法包括密切觀察傷口部位是否愈合緩慢、炎癥和膿的體征，以及測量患者的體溫以發現是否有發熱的體征。不幸的是，很多癥狀僅僅在感染已經存在后才能發現。此外，患者出院后，他們負責監測自己的健康，對于不熟練的患者來說，感染癥狀可能是不明顯的。
能夠檢測廣譜細菌，特別是在感染早期發生癥狀前檢測廣譜細菌的系統或生物傳感器對于患者和健康工作者都是有益的。如果患者能夠在出院/離開診所后準確監測傷口的狀況，那么可以足夠早地開始合適的抗微生物治療，以預防更嚴重的感染。
發明概述已經發現合成的酶底物，即，人α-1蛋白酶抑制劑，可以用于測試系統，以鑒定多種微生物物種，如通常感染傷口的細菌。
人α-1蛋白酶抑制劑(α1-PI)是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的成員。絲氨酸蛋白酶抑制劑是作為導致蛋白酶抑制的不可逆自殺底物起作用的絲氨酸蛋白酶抑制劑家族。蛋白酶是在致病細菌中的常見毒力因子，有時用于破壞宿主防御。在絲氨酸蛋白酶抑制劑家族(抑制劑已經在名稱絲氨酸蛋白酶抑制劑中固有)中，α-1蛋白酶抑制劑(α1-PI)是主要的和最充分研究的成員之一。α-1參與從激活的中性粒細胞分泌彈性蛋白酶的調節，其又控制宿主結締組織的降解(Salvesen，GS et al.，″Human plasma proteinase inhibitors″，Ann.Rev.Biochem.，52655-709(1983)，在此引入作為參考)。這一類獨特的絲氨酸蛋白酶抑制劑具有特征性的暴露的反應位點環(RSL)結構域。重要的是，已經證明α1-PI的RSL容易受到宿主和細菌來源的許多蛋白酶的切割，導致α1-PI的滅活。
可以設計測試系統，以便同時鑒定多種(例如，至少2種、至少5種或至少10種)不同的微生物物種，如通常感染傷口的那些。例如，它可以鑒定某些類型的致病細菌共有，但不存在于非致病細菌中的酶。例如，可以用細菌基因組數據庫的基于計算機的信息學鑒定所述酶。通過將酶用作檢測系統的基礎，可以設計非常敏感的測試，因為甚至非常小量的酶也可以催化顯著量底物的轉換。
因此，本發明描述了一種通過檢測樣品中細菌的分子標志的存在或不存在，檢測樣品中一種或多種微生物，例如細菌的存在或不存在的方法。
“分子標志”是可以用于檢測樣品，如傷口或體液中微生物(如細菌、真菌或病毒)的存在或不存在的任何分子。具體地，待檢測的分子標志包括蛋白，如微生物分泌的蛋白，其在微生物的細胞表面上表達，或在病毒或朊病毒感染的細胞的表面上表達。在一種實施方案中，該酶是細菌蛋白酶。
一方面，本發明描述了檢測樣品中一種或多種細菌的存在或不存在的方法，包括以下步驟在導致由細菌產生和/或分泌的酶對底物進行修飾的條件下，使樣品與可檢測性標記的合成絲氨酸蛋白酶抑制劑反應位點環(RSL)結構域肽底物接觸；并且檢測底物的修飾或底物修飾的不存在。底物的修飾表明樣品中細菌的存在，底物修飾的不存在表明樣品中不存在細菌。
底物可以是合成的。例如，它可以來源于天然或非天然存在的RSL結構域，并且可以與野生型絲氨酸蛋白酶抑制劑的RSL具有相同或等同的活性。它也可以包含絲氨酸蛋白酶抑制劑RSL結構域的變體、類似物或片段或由絲氨酸蛋白酶抑制劑RSL結構域的變體、類似物或片段組成。在一種實施方案中，底物包含SEQ ID NO1、2或3。在一種實施方案中，底物是下文描述的CPI1、CPI2或CPI3。
細菌可以是，例如，傷口特異性細菌，如金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、釀膿鏈球菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌、粘質沙雷氏菌、奇異變形菌、陰溝腸桿菌、無硝不動桿菌、肺炎克雷伯氏菌和大腸桿菌。
另一方面，本發明描述了檢測受試者中傷口感染的存在或不存在的方法，包括以下步驟a)在導致由細菌產生和/或分泌的酶對底物進行修飾的條件下，使從受試者中的傷口獲得的樣品與可檢測性標記的合成絲氨酸蛋白酶抑制劑RSL結構域肽底物接觸；和b)檢測底物的修飾或底物修飾的不存在。底物的修飾表明受試者中存在傷口感染，底物修飾的不存在表明受試者中不存在感染。
另一方面，本發明描述了檢測受試者中傷口感染的存在或不存在的方法，包括以下步驟a)在導致由細菌產生和/或分泌的酶對底物進行修飾的條件下，使從受試者的傷口與由細菌產生和/或分泌的酶的可檢測性標記的合成絲氨酸蛋白酶抑制劑RSL結構域肽底物接觸；和b)檢測底物的修飾或底物修飾的不存在。底物的修飾表明受試者中存在傷口感染，底物修飾的不存在表明受試者中不存在感染。
另一方面，本發明描述了用于檢測樣品中細菌，例如傷口特異性細菌的存在或不存在的生物傳感器，包含固體支持物和可檢測性標記的合成絲氨酸蛋白酶抑制劑RSL結構域肽底物，其中所述底物附著于固體支持物。可以用熒光或比色染料標記肽，用于檢測細菌蛋白酶對肽的切割。
另一方面，本發明描述了用于檢測傷口感染的試劑盒，包含用于檢測樣品中細菌的存在或不存在的生物傳感器和用于檢測作為傷口感染的致病劑的細菌的存在的一種或多種試劑。例如，該試劑可以用于檢測由細菌分泌的酶。具體地，該試劑可以用于檢測生物傳感器的底物的修飾。
附圖簡述
圖1A和1B。圖1A描述了α-1蛋白酶抑制劑(α1-PI)RSL序列(SEQ ID NO4)上的切割位點的相對位置。圖1B描述了CPI1肽(SEQ ID NO1)、CPI2肽(SEQ ID NO2)和α-1蛋白酶抑制劑(人)(SEQ ID NO3)的序列。
圖2A-2D。圖2A和2B是含有過夜細菌培養物、測定底物(圖2A，CPI1肽；圖2B，CPI2肽)和含有150mM NaCl的反應緩沖液(pH7.2)的樣品隨時間(以秒為單位)的相對熒光圖。圖2C和2D是含有過夜細菌上清液、測定底物(圖2C，CPI1肽；圖2D，CPI2肽)和含有150mM NaCl的反應緩沖液(pH 7.2)的樣品隨時間(以秒為單位)的相對熒光圖。
圖3A-3D。圖3A和3B是含有48小時細菌培養物、測定底物(圖3A，CPI1肽；圖3B，CPI2肽)和反應緩沖液的樣品隨時間(以秒為單位)的相對熒光圖。圖3C和3D是含有48小時細菌上清液、測定底物(圖3C，CPI1肽；圖3D，CPI2肽)和反應緩沖液(pH 7.2)的樣品隨時間(以秒為單位)的相對熒光圖。
圖4A和4B說明用CPI2肽獲得的糞腸球菌(采用107、106、105和104個細胞/ml的濃度系列)的傳感器數據。圖4A顯示在365nm UV光源下與細菌一起溫育的傳感器的圖像。圖4B顯示獲自數字化照片的每個濃度的強度數據。
圖5A和5B說明用CPI2肽獲得的銅綠假單胞菌(采用107、106、105和104個細胞/ml的濃度系列)的傳感器數據。圖5A顯示在365nmUV光源下與細菌一起溫育的傳感器的圖像。圖5B顯示獲自數字化照片的每個濃度的強度數據。
圖6A和6B說明用CPI2肽獲得的金黃色葡萄球菌(采用107、106、105和104個細胞/ml的濃度系列)的傳感器數據。圖6A顯示在365nmUV光源下與細菌一起溫育的傳感器的圖像。圖6B顯示獲自數字化照片的每個濃度的強度數據。
圖7A和7B說明用CPI2肽獲得的釀膿鏈球菌(采用107、106、105和104個細胞/ml的濃度系列)的傳感器數據。圖7A顯示在365nm UV光源下與細菌一起溫育的傳感器的圖像。圖7B顯示獲自數字化照片的每個濃度的強度數據。
圖8A和8B說明用CPI2肽獲得的粘質沙雷氏菌(采用107、106、105和104個細胞/ml的濃度系列)的傳感器數據。圖8A顯示在365nmUV光源下與細菌一起溫育的傳感器的圖像。圖8B顯示獲自數字化照片的每個濃度的強度數據。
圖9A-9C是說明與不同濃度的細菌相對溫育40小時的柱狀圖。(A＝106CFU；B＝105CFU；C＝104CFU)(Staph＝金黃色葡萄球菌；Serratia＝粘質沙雷氏菌；Strep＝唾液鏈球菌；PA14＝銅綠假單胞菌；Entero＝糞腸球菌)。
圖10A-10D是說明從傷口敷料提取的細菌的相對熒光的圖片(肽底物CPI2)(反應緩沖液1×PBS)。(A傷口樣品1-8號；傷口樣品11-20號；C傷口樣品20-30號；傷口樣品31-35號)。
圖11顯示了從穩定性研究過程中采集的多個樣品測量的熒光的圖片。
圖12顯示了從暴露于傷口病原體的多個株后可檢測性標記的底物測量的相對熒光的圖片。
發明詳述作為正常生長過程的一部分，很多微生物分泌許多酶到它們的生長環境中。這些酶具有許多功能，包括，但不限于，營養物質的釋放、抗宿主防御的保護、細胞包膜合成(細菌中)和/或維持、以及其它未確定的功能。許多微生物，如細菌，也在細胞表面產生暴露于細胞外環境(并且與其相互作用)的酶。
能夠檢測產生和/或分泌的這些酶的存在的系統能夠等同地表明產生/分泌細菌的存在。或者，能夠檢測產生和/或分泌的這些酶的不存在的系統能夠等同地表明產生/分泌細菌的不存在。所述檢測系統可用于檢測或診斷感染，例如，傷口感染。
本發明涉及將底物，如合成絲氨酸蛋白酶抑制劑RSL結構域肽底物用于檢測由廣譜細菌產生或分泌的酶的存在或不存在。此處用到的“合成”是指非天然存在的肽。合成肽可以衍生自絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員(如α1-PI)的全長或野生型反應位點環(RSL)(例如，是其變體、類似物或片段)。在一種實施方案中，根據此處舉例說明的方法制備合成肽底物。然后可以用可檢測的標記對合成底物進行標記，以便在它們各自的酶特異性與其反應的條件下，它們進行修飾，例如，觀察到的可見顏色改變。用于本發明的底物包括合成或天然存在的任何分子，如包含可以與本發明的酶相互作用的RSL序列的切割位點的分子。以前已經報道過α-1蛋白酶抑制劑(α1-P1)的RSL序列上的切割位點的相對位置(Nelson，D.et al.，″Inactivation ofalphal-proteinase inhibitor as a broad screen for detecting proteolyticactivities in unknown samples，″Anal.Biochem.，260(2)230-36(1998))并且示于圖1A。底物的例子包括此處描述的底物，以及本領域公知的這些酶的底物。在一種實施方案中，底物包含序列EAAGAMFLEAIPK(SEQ ID NO1)。在另一種實施方案中，底物包含EGAMFLEAIPMSIPK(SEQ ID NO2)。其它實例包括衍生自α1-P1的熒光肽，例如Edans-EAAGAMFLEAIPK-Dabcyl(CPI1)和Edans-EGAMFLEAIPMSIPK-Dabcyl(圖1B)。
用于本發明的底物也包括比色和/或熒光成分和肽，并且與微生物產生和/或分泌的至少一種蛋白相互作用。在一些方案中，底物的肽部分與微生物的蛋白相互作用。在其它實施方案中，底物的至少一個比色成分部分與微生物的蛋白相互作用。
底物的實例描述于2003年1月31日提交的Mitchell C.Sanders等的PCT申請PCT/US03/03172中，該申請的名稱是“檢測微生物的方法”，在2003年8月7日公開為WO 03/063693；也描述于2004年6月9日提交的Mitchell C.Sanders等的美國申請No.60/578,502，該申請的名稱是“比色底物、比色傳感器和使用方法”。在此引入這些申請的完整教導作為參考。
可以用合成絲氨酸蛋白酶抑制劑RSL結構域肽底物檢測多種(即，超過1種，例如，至少2、3、4、5、10、15、20、25或更多種)傷口病原體，如細菌。用于本發明的細菌檢測方法中的酶優選是傷口特異性酶。如此處使用的，傷口特異性酶是由致病細菌產生和/或分泌，但不由非致病細菌產生和/或分泌的酶。致病細菌的實例包括，但不限于，葡萄球菌(例如，金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或腐生葡萄球菌)、鏈球菌(例如，釀膿鏈球菌、肺炎鏈球菌或無乳鏈球菌)、腸球菌(例如，糞腸球菌或屎鏈球菌)、棒桿菌物種(如白喉棒桿菌)、芽孢桿菌(例如，炭疽芽孢桿菌)、利斯特氏菌(單核細胞增生利斯特氏菌)、梭菌物種(例如，產氣莢膜梭菌、破傷風梭菌、肉毒梭菌、艱難梭菌)、奈瑟氏球菌物種(例如，腦膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌)、大腸桿菌、志賀氏菌物種、沙門氏菌物種、耶爾森氏菌物種(例如，鼠疫耶爾森氏菌、假結核耶爾森氏菌或小腸結腸炎耶爾森氏菌)、霍亂弧菌、彎曲桿菌物種(例如，空腸彎曲桿菌或胚胎彎曲桿菌)、幽門螺桿菌、假單胞菌(例如，銅綠假單胞菌或鼻疽假單胞菌)、流感嗜血桿菌、百日咳博德特氏菌、肺炎支原體、解脲尿支原體、嗜肺軍團菌、蒼白密螺旋體、問號鉤端螺旋體、布氏疏螺旋體、分枝桿菌(例如，結核分枝桿菌)、麻風分枝桿菌、放線菌物種、諾卡氏菌物種、衣原體(例如，鸚鵡熱衣原體、砂眼衣原體或肺炎衣原體)、立克次氏體(例如，立氏立克次氏體、普氏立克次氏體或紅恙蟲立克次氏體)、布魯氏菌(例如，流產布魯氏菌、馬耳他布魯氏菌或豬布魯氏菌)、奇異變形菌、粘質沙雷氏菌、陰溝腸桿菌、無硝不動桿菌、肺炎克雷伯氏菌和土拉熱弗朗西絲氏菌。優選地，傷口特異性細菌是葡萄球菌、鏈球菌、腸球菌、芽孢桿菌、梭菌物種、大腸桿菌、耶爾森氏菌、假單胞菌、奇異變形菌、粘質沙雷氏菌、陰溝腸桿菌、無硝不動桿菌、肺炎克雷伯氏菌或麻風分枝桿菌。例如，傷口特異性酶可以由金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、釀膿鏈球菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌、奇異變形菌、粘質沙雷氏菌、陰溝腸桿菌、無硝不動桿菌、肺炎克雷伯氏菌和/或大腸桿菌產生和/或分泌。
此處用到的“修飾”是指底物的改變，例如通過切割或其它直接或間接可檢測的方法。本發明的酶可以通過切割修飾底物，例如，蛋白或多肽，并且可以檢測所述修飾，以確定樣品中病原體的存在或不存在。一種通過檢測由酶進行的底物修飾的方法是用兩種不同的染料標記底物，其中當分子，例如，染料或比色物質緊密相鄰時，其中一種染料用于淬滅向另一種染料的熒光共振能量轉移(FRET)，并且可以通過熒光測量。
FRET是一種距離依賴性激發狀態相互作用的過程，其中一種熒光分子的發射與另一種熒光分子的激發相偶聯。用于共振能量轉移的典型受體和供體對由4-[[-(二甲基氨基)苯基]偶氮]苯甲酸(DABCYL)和5-[(2-氨基乙基氨基]萘磺酸(EDANS)組成。EDANS由336nm光的照射激發，并且發射波長為490nm的光子。如果DABCYL部分位于EDANS的20埃內，該光子將被有效吸收。DABCYL和EDANS將連接于肽底物的相對末端。如果底物是完整的，FRET將是非常有效的。如果肽被酶切割，兩種染料將不再緊密相鄰，并且FRET將是無效的。切割反應之后可以觀察DABCYL熒光的減弱或EDANS熒光的增強(失去淬滅)。
如果要修飾的底物是蛋白、肽或多肽，可以用標準重組蛋白技術產生底物(例如，參見Ausubel et al.，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，(1998)，在此引入其完整教導作為參考)。此外，也可以用重組技術制備本發明的酶。通過充分供應酶或它們的底物，可以確定修飾的精確位點。
用監測酶和底物之間的相互作用的可檢測標記對底物進行標記，并且檢測任何底物修飾，例如，由所述相互作用導致的底物或標記的切割。可檢測標記的實例包括可以摻入底物的多種染料，例如，此處描述的那些，自旋標記、抗原標志、表位標志、半抗原、酶標記、輔基、熒光材料、pH敏感材料、化學發光材料、生色染料、比色成分、生物發光材料和放射性材料。合適的酶標記的例子包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和乙酰膽堿酶；合適的輔基的實例包括，鏈親和素/生物素和親和素/生物素；合適的熒光材料的實例包括傘形酮、熒光素、熒光素異硫氰酸酯、羅丹明、二氯三嗪胺熒光素、丹磺酰氯和藻紅素；化學發光材料的實例包括魯米諾；生物發光材料的實例包括熒光素酶、蟲熒光素和水母發光蛋白，合適的放射性材料的實例包括125I、131I、35S和3H。可檢測標記的其它實例包括Bodipy、Pyrene、Texas Red、IAEDANS、丹酰氮丙啶、IATR和熒光素。這些標記的琥珀酰酯、異硫氰酸酯和碘乙酰胺也是可商購的。在一種實施方案中，用熒光探針和淬滅染料分子標記底物。
可以用監測蛋白和底物之間的相互作用的至少一種比色成分對底物進行標記，并且檢測任何底物修飾，例如，由所述相互作用導致的肽或標記的切割。以此方式，比色成分作為標記或標志，以表明修飾的存在或不存在，以便發現樣品中微生物的存在或不存在。在一些實施方案中，比色成分與肽共價連接。
在一些實施方案中，該蛋白切割包括(至少一種)比色成分的底物的至少一部分。例如，如果底物包括藍色比色成分和黃色比色成分，未切割的底物可以表現為綠色。在蛋白切割包括黃色比色成分的底物的一部分后，底物可以表現為藍色。
在一些實施方案中，底物的修飾包括水解肽中的至少一個肽鍵，并且導致肽的至少一部分從底物切除。切除的部分包括至少一種比色成分，導致可見的顏色改變。在其它實施方案中，底物的修飾包括從肽切割至少一種比色化合物，導致可見的顏色改變。
比色成分作為標記或標志。在一種實施方案中，至少一種比色成分是與其它比色成分不同的顏色。比色成分的實例包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和乙酰膽堿酶；合適的輔基的實例包括，鏈親和素/生物素和親和素/生物素。在本發明的一種實施方案中，底物包括具有至少兩種比色成分的肽，其中每種比色成分包含不同的顏色，并且其中底物附著于固體支持物。底物的修飾可以包括切割底物的至少一部分，其中該部分包括比色成分之一，并且該切割導致可見的顏色改變。
檢測是否存在細菌，或診斷有傷口感染的樣品可以是，例如，傷口(如受試者的傷口表面)、體液，如血液、尿或傷口液(例如，在傷口部位產生的膿)。樣品或固體支持物也可以是細菌可以包含在其上/其中的任何物品，例如，導管、袋(如尿收集袋、血液收集袋或血漿收集袋)、盤、聚合物、膜、樹脂、玻璃、海綿、收集樣品的物品、容納樣品的物品、觀察器、過濾器、透鏡、泡沫、織物、紙、縫線、探測尺、抹布、試管、微量滴定板的孔、隱形眼鏡洗液或來自屋子或建筑物，例如健康設施的檢查室或手術室、浴室、廚房或加工或生產設施的區域的抹布。
本發明也描述用于檢測(一種或多種，例如，至少2種、至少5種、至少10種、至少20種、至少30種、至少50種、至少75種、或至少100種)傷口病原體，如此處描述的細菌，并且用于給用戶指出感染的存在的生物傳感器。該生物傳感器可以用于健康設施或家用，以檢測受感染的傷口。它可以包含(一種或多種)廣譜底物，所述底物與鄰近傷口或正在監測是否有細菌污染的其它體液的固體支持物偶聯。優選地，該底物是與標記共價結合的合成絲氨酸蛋白酶抑制劑RSL結構域肽底物，因此具有檢測信號，在底物-標記鍵蛋白水解時該檢測信號表明細菌的存在。
生物傳感器的制備是通過首先用一種或多種，并且優選大量可檢測的標記，例如，生色或熒光離去基團標記本發明的底物。最優選地，標記基團提供了僅僅在信號經蛋白水解而脫離底物時才激活的潛伏信號。生色離去基團包括，例如，對-硝基analide基團。如果底物與由細菌分泌到傷口或其它體液或存在于細菌細胞表面上的酶接觸，則酶修飾底物，其修飾方式導致所述修飾的檢測，所述修飾例如是吸光度的改變，所述改變可以作為顏色改變(例如，固體支持物，如傷口敷料上的顏色改變)而肉眼檢測，或采用本領域的標準分光光度技術檢測。
生物傳感器是固體支持物，例如，傷口敷料(如繃帶或紗布)、要求無菌或無微生物污染(污染物)的任何材料，例如，聚合物、膜、樹脂、玻璃、海綿、盤、觀察器、過濾器、透鏡、泡沫、織物、紙、蘸棒或縫線，或任何容納或收集樣品的物品(如，容納體液的容器，如，尿收集袋、血液或血漿收集袋、試管、導管、抹布或微量滴定板的孔)。
典型地，如果固體支持物與傷口或樣品直接接觸，則固體支持物由適于消毒的材料制成。在本發明的一種實施方案中，生物傳感器可以直接與傷口接觸。在某些情況下，用無菌覆蓋物或層防止在所述直接接觸后的傷口或體液污染。如果使用所述無菌覆蓋物，它們將具有使其適于消毒的特性，但是不干擾酶/底物相互作用。優選地，生物傳感器與傷口接觸的部分也是非粘附性的，以便容易將生物傳感器從樣品表面取出。例如，如果生物傳感器包含傷口敷料，該敷料與傷口接觸足夠酶底物反應的時間，然后從傷口取出敷料，以便不對傷口或周圍組織導致進一步損傷。
用可檢測標記，例如，生色染料進行合適標記，并且附著或摻入傳感器裝置的廣譜底物(如，適于檢測一種以上病原體或細菌的底物)可以用作分泌上述酶的多種致病細菌的存在或不存在的指標。
本發明的生物傳感器也可以任選包含致病細菌產生和/或分泌的酶的一種或多種額外底物(例如，至少2種、至少5種、至少10種、至少20種、至少30種、至少50種、至少75種或至少100種底物)。當使用一種以上底物時，可以對每一種進行標記，以便將其與另一種底物進行區分(例如，采用不同的可檢測標記)，并且/或者，每一種底物可以位于固體支持物上的特定區域。
具有疏水離去基團的底物可以與疏水表面非共價結合。或者，親水或疏水底物可以通過二硫化物或伯胺、羧基或羥基與表面偶聯。將底物偶聯于固體支持物的方法是本領域公知的。例如，采用非必須的反應末端，如不影響與傷口病原體反應的游離胺、羧酸或SH基團，可以將熒光和生色底物與固體底物偶聯。例如，可以采用10倍摩爾過量的N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)或N-環己基-N’-2-(4-甲基-嗎啉)乙基碳二亞胺-對-甲苯磺酸鹽(CMC)在4℃下，在調整到pH 4.5的蒸餾水中使游離胺與底物上的羧基偶聯2小時，以便刺激縮合反應，從而形成肽鍵。可以用DTT或TCEP還原SH基團，然后通過N-e-馬來酰亞胺基己酸(EMCA)與表面上的游離氨基偶聯(Griffith et al.，Febs Lett.，134261-263(1981)，在此引入作為參考)。
本發明的多肽也可以包含廣譜肽底物，如此處描述的絲氨酸蛋白酶抑制劑RSL結構域肽底物的片段和變體，或由所述片段和變體組成。變體包括由與微生物中的這些肽底物，如α1 RSL結構域相同的基因座編碼的顯著同源的多肽，即等位基因變體，還包括其它變體。變體也包括來源于生物中的其它基因座，但與此處描述的肽底物具有顯著同源性的多肽。變體也包括與這些肽底物具有顯著同源性或同一性，但來源于另一生物的多肽，即，直向同源物。變體也包括與這些肽底物具有顯著同源性或同一性，但通過合成產生的多肽。體也包括與這些肽底物具有顯著同源性或同一性，但通過重組方法產生的多肽。
可以通過將序列進行最優比較目的的比對，確定兩個氨基酸序列的同一性百分比(例如，可以將空位引入第一個序列的序列中)。然后比較相應位置的氨基酸，兩個序列之間的同一性百分比是序列共有的相同位置數的函數(即％同一性＝相同位置數/位置總數×100)。在某些實施方案中，為比較目的而進行比對的氨基酸序列的長度是肽底物序列，例如，α1 RSL結構域序列長度的至少30％，優選至少40％，更優選至少60％，甚至更優選至少70％、80％、90％或100％。可以通過公知方法，例如，采用數學算法完成這兩個序列的實際比較。所述數學算法的優選的非限定性實例描述于Karlin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，905873-5877(1993)，在此引入作為參考。所述算法整合到BALST程序(2.2版)中，如Schaffer等的描述(Nucleic AcidsRes.，292994-3005(2001)，在此引入作為參考)。當利用BLAST和Gapped BLAST程序時，可以使用各個程序的缺省參數。在一種實施方案中，檢索的數據庫是非冗余(NR)數據庫，并且序列比較的參數可以設定為無過濾；預期值為10；字長為3；矩陣是BLOSUM62；空位耗費的存在值為11，延伸值為1。
在另一種實施方案中，可以用GCG軟件包(Accelrys Inc.，SanDiego，California)中的GAP程序確定兩個氨基酸序列之間的同一性百分比，該程序使用Blossom 63矩陣或PAM250矩陣，空位權重是12、10、8、6或4，長度權重為2、3或4。在另一實施方案中，可以用GCG軟件包(Accelrys Inc.)中的GAP程序確定兩個核酸序列之間的同一性百分比，該程序使用的空位權重是50，長度權重是3。
此處描述了其它優選的序列比較方法。
本發明也包括這樣的多肽底物，其具有較低的同一性程度，但具有足夠的相似性，以便行使一種或多種與肽底物行使的功能相同的功能，如作為細菌如傷口特異性細菌產生或分泌的酶的底物。相似性是通過保守氨基酸取代確定的。所述取代是這樣的取代，即，多肽中的特定氨基酸被具有相似特征的另一種氨基酸取代。保守取代很可能是表型沉默的。一般認為的保守取代是脂族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile之間的彼此替代；羥基殘基Sre和Thr之間的彼此交換；酸性殘基Asp和Glu的交換；酰胺殘基Asn和Gln之間的取代；堿性殘基Lys和Arg之間的交換；和芳族殘基Phe和Tyr之間的替代。關于哪些氨基酸改變可能是表型沉默的指導可以參見Bowie et al.，Science，2471306-1310(1990)，在此引入作為參考。
功能性變體也可以包含與α1 RSL結構域中的氨基酸相似的氨基酸的取代，該取代不導致功能改變或導致不顯著的改變。或者，所述取代可以一定程度上正或負影響功能。非功能性變體通常含有一個或多個非保守氨基酸取代、缺失、插入、反向或截短，或含有關鍵殘基或關鍵區域中的取代、插入、反向或缺失，所述關鍵區域包括感染特異性蛋白酶的蛋白水解切割位點。
可以通過本領域公知的方法，例如，定點誘變或丙氨酸掃描誘變，鑒定本發明的肽底物中對酶，如蛋白酶的切割必須的氨基酸(Cunningham et al，Science，2441081-1085(1989)，在此引入作為參考)。后一種程序在分子的每個殘基導入了單個丙氨酸突變(每個分子一個突變)。
本發明也包括肽底物或其功能性變體的多肽片段，包括與此處描述的合成或天然存在的肽底物，如α1 RSL結構域序列具有60％、70％、80％、90％或95％序列同源性的生物活性片段。本發明也包括此處描述的多肽的變體的片段。生物活性片段包括保留了作為由細菌，例如傷口特異性細菌產生或分泌的酶的底物的能力的片段。
片段可以是離散的(不與其它氨基酸或多肽融合)，或者可以在更大的多肽內。此外，一些片段可以包含在單個更大的多肽內。在一種實施方案中，設計用于在宿主中表達的片段可以具有與多肽片段的氨基末端融合的異源前多肽和多肽原區域以及與片段的羧基末端融合的額外的區域。
本發明的生物傳感器和多肽可以用于任何需要檢測細菌，特別是致病細菌的存在與否的場合。例如，可以用此處描述的生物傳感器檢測在健康設施，特別是手術室中的工作表面收集的細菌。可以由細菌分泌或存在于細菌表面上的酶修飾的底物，或一種以上的底物被標記并且共價結合于收集底物，如抹布尖上的棉纖維。當使用一種以上底物時，可以對每一種都進行標記，以便將其與另一種底物區分(例如，用不同的可檢測標記)，并且/或者，每一種底物都可以位于固體支持物上的特定區域。抹布尖被用于擦拭懷疑被細菌污染的表面。將抹布尖置于培養基中，并且溫育，溫育條件是這樣的，即，如果存在結合的、標記的底物的特異性酶，則該條件允許標記的底物被修飾。
本發明也描述了用于檢測此處描述的傷口特異性細菌的試劑盒。該試劑盒可以包含固體支持物，例如，具有多個孔的固體支持物(例如，微量滴定板)，該支持物上連接、偶聯或附著了可檢測性標記的底物(如絲氨酸蛋白酶反應位點環(RSL)結構域肽底物)。提供了用于提供一種或多種緩沖液的裝置。也可以提供陰性對照和/或陽性對照。本領域技術人員可以很容易推斷合適的對照。采用緩沖液制備懷疑被病原體(如此處描述的細菌)污染的樣品。將樣品、陰性對照和陽性對照的等分樣品置于其自身的孔中，使其反應。確定觀察到底物修飾，例如顏色改變的孔為含有微生物病原體。所述試劑盒對于檢測受試者中的傷口感染特別有用。
本發明也包括這樣的試劑盒，其中包含生物傳感器，如包裝的無菌傷口敷料，并且包含進行所述檢測測定必須的任何額外試劑。
實施例現在將通過以下實施例詳細舉例說明本發明，這些實施例不打算以任何方式進行限制。
實施例1用于檢測樣品中細菌不存在或存在的細菌的制備采用本領域的標準方法，37℃下在劇烈振蕩的條件下(約200rpm)，在Brain Heart Infusion(BHI)培養液中使每一種以下細菌物種的培養物生長過夜金黃色葡萄球菌；釀膿鏈球菌；粘質沙雷氏菌；大腸桿菌；銅綠假單胞菌(PA14)；銅綠假單胞菌(GSU3)；和糞腸球菌。過夜生長后，獲得每種培養物的1ml樣品，通過12,000xg離心5分鐘，從培養物上清液除去細胞。將剩余的培養物上清液儲存在冰上直到需要(小于1小時)。按照下文的描述測定細菌中酶的存在或不存在。
或者，不從培養物上清液分離細菌細胞，而是在含有仍然處于培養液中的懸浮液中的細胞的樣品上進行測定。生長48小時(兩天)后，重復該程序。
實施例2從傷口敷料提取細菌，用于確定傷口樣品中細菌的不存在或存在從St.Vincent Wound Clinc，Erie，PA的醫學主任和Penn NorthCenters for Advanced Wound Care的創始人Thomas Serena博士處獲得了35塊新鮮的冷凍傷口敷料。敷料被分類為本研究的醫學廢品，沒有獲得傷口或患者的信息。敷料來自于隨機傷口并且在同一天收集和運輸。在干冰上運送敷料，到達后立即在-80℃下儲存。
提取在分析的當天，從冰箱取出敷料，解凍到足以鋪開的程度，以便切割。所有的工作都是在無菌條件下進行，并且依照血攜帶的病原體指南。代表了寬范圍的敷料大小和滲出物。大多數敷料是紗布型的，一些包括了吸收中心(即，看起來沒有包括水膠體或完全傷口控制敷料)。從每個敷料切下2×3.5cm的長方形(面積是7cm2)。在大敷料的情況下選擇敷料的最有代表性的部分。
獲得了寬范圍的敷料顏色和滲出物。將敷料放置于裝有3ml無菌PBS的15ml無菌錐形試管中，在4℃下進行提取過夜。在浸漬敷料后立即有一些樣品使PBS成為白色絮狀(樣品2、3、9、14、22、26和27)。我們懷疑這些敷料樣品含有來自于傷口處理的銀。提取敷料后，記錄每種溶液的顏色。收集每個提取物的3份0.5ml等分樣品，用于儲存和檢測。
切割反應是在100μl總體積中，在37℃下用10μl傷口樣品提取物、3μl CPI2肽底物(5mg/mL，溶于水/DMSO中)進行的。在熒光板讀數器上接著進行反應，該讀數器采用335nm的激發波長和485nm的發射波長(圖10A-10D)。
實施例3采用α1-PI RSL序列的變體進行的廣譜測定設計兩種肽底物，CPI1和CPI2，以包括RSL序列的所有切割位點，如圖1A和1B所示。用熒光探針edans(5-((2-氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸)和淬滅染料分子dabcyl((4-(4-(二甲基氨基)苯基)偶氮)苯甲酸)標記肽底物。
(CPI1)Edans-EAAGAMFLEAIPK-Dabcyl(SEQ ID NO1)(CPI2)Edans-EGAMFLEAIPMSIPK-Dabcyl(SEQ ID NO2)使細菌在培養箱中在5mL BHI(Brain Heart Infusion)培養基中生長過夜。將得到的每種培養物分成兩個樣品。一個用作培養物，另一個通過離心旋轉，并且收集上清液。測定是在添加了150mM NaCl(PBS)的20mM tris緩沖液(pH 7.2)中進行的。切割反應是在100μL的總體積中，在37℃下用7μL培養物或上清液和3μL肽底物(5mg/mL，溶于水/DMSO中)進行的。在熒光板讀數器上接著進行反應，該讀數器采用335nm的激發波長和485nm的發射波長。
第一組實驗是通過將細菌培養物(培養基和細胞)直接添加到測定溶液中而進行的。第一個測定使用過夜(1天)生長細胞和上清液和作為底物的肽CPI1和CPI2。如圖2A和2B所示，用肽底物觀察到了很多細菌的蛋白酶活性。
為了確定哪些細菌分泌了蛋白酶，采用獲自過夜生長細菌培養物的細菌上清液，用肽CPI1和CPI2進行相似實驗。如圖2C和2D所示，結果與細菌培養物的結果相似，表面分泌了蛋白酶。
在第二組實驗中，用48小時(兩天)生長細胞和上清液進行了相似測定。該測定用CPI1和CPI2作為底物。按照前面對第一組實驗的描述進行本測定，區別是此處采用5μL細菌上清液。結果示于圖3A-D。
實施例4生物傳感器表面的顯色可以通過使用一些不同類型的相互作用使分子與表面附著。典型地，可以用疏水、靜電或共價相互作用使蛋白與表面附著。可以購買到許多具有多種表面特性的膜和樹脂。可以對表面進行化學修飾，以提供需要的表面特性。
可以購買到用于蛋白和肽結合的轉移膜。它們由帶正電和帶負電的聚合物，如離子交換膜盤濾器和樹脂組成。硝酸纖維素膜提供了疏水和靜電相互作用。玻璃纖維膜提供了能夠容易被化學修飾以添加官能團的疏水表面。也存在提供與蛋白和肽共價結合的反應性官能團的修飾的聚合物膜。
也可以利用膜或樹脂上的多種官能團和交聯劑來共價連接蛋白。交聯劑含有兩個反應基團，從而提供將兩個靶官能團共價連接的途徑。靶定蛋白的最常見的官能團是胺、硫醇、羧酸和醇基團，它們用于形成分子內交聯。交聯劑可以是同雙官能的或異雙官能的，各種長度的交聯劑的選擇是可以商購的。
金屬螯合(親和結合)相互作用可以給生物分子提供更強的鍵。構建到肽底物內的組氨酸標志可以用于與鎳結合樹脂連接。基于連續的組氨酸殘基與樹脂(Sepharose)結合的能力純化帶有組氨酸標志的肽，所述樹脂含有由共價連接的氨三乙酸(NTA)固定化的鎳離子。基于添加了組氨酸標志的CPI2制備包含CGAMFLEAIPMSIPAAAHHHHH(SEQ ID NO5)的CPI3肽。用比色染料在半胱氨酸基團標記CPI3。在本實施例中，使用了一種remazol染料，即，Reactive Black 5(RB5)。該染料產生了暗藍色，在595nm處有峰值吸收。
CPI3-Reactive Black 5標記的肽通過組氨酸標志與NTA樹脂結合。NTA樹脂產生沒有非特異性結合的高水平肽結合。
37℃下用銅綠假單胞菌(PA14)切割NTA樹脂上的標記的CPI3過夜。用放置在裝有樹脂和細菌的試管中的帶正電的膜(Pall SB6407)收集切割的肽。對照樣品由NTA樹脂上的CPI3和磷酸緩沖液(PBS)中的帶正電的膜組成。與示出的對照相比，在具有細菌的樣品中帶正電的膜上獲得了強的顏色改變。膜上的顏色改變表明，切割了CPI3，帶有染料的被切割的部分彌散到膜上，產生藍色。
賴氨酸肽標志可以用于連接于表面，如UltraBindTM(Pall GelmanLaboratory，Ann Arbor，MI)。UltraBind是用醛基團修飾的聚醚砜膜，所述醛基團用于與蛋白共價結合。蛋白直接與UltraBind表面反應。也可以用交聯鏈將蛋白或肽連接于表面。例如，通常用碳二亞胺，即EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺，鹽酸鹽)將羧酸基團連接于胺。用交聯劑連接肽，使得能夠選擇接頭鏈，以便將肽延伸離開膜表面，而仍然與其共價結合。通過交聯劑進行的肽連接可以最優化，使得細菌酶能夠獲得肽。這使得傳感器的反應時間最優化，因為肽的可獲得性與該參數直接相關。
實施例5表面傳感器敏感性確定CPI2是廣譜傳感器的良好候選物。
表面傳感器的構建如下使用的膜Pall SB6407使用的肽CPI2使用的量8μg
空氣干燥傳感器，在-20℃下儲存過夜。將傳感器加樣到無菌96孔板，以進行敏感性研究。
37℃下在5ml BHI(Brain Heart Infusion)培養基中使糞鏈球菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、釀膿鏈球菌和粘質沙雷氏菌在培養箱中生長過夜，并且稀釋到每個實驗特定的濃度。用PBS(pH 7.4)稀釋每株細菌，以便在550nm處獲得大約0.52的光密度(OD)。設定該OD代表大約108個細胞/ml細菌。用PBS稀釋108個細胞/ml每種細菌的儲液，以獲得107、106、105和104個細胞/ml的濃度系列。敏感性測試是將107、106、105和104個細胞/ml(細胞)的濃度系列的每一個的100μL置于一行傳感器上。每個敏感性測試由暴露于100L PBS的傳感器組成。
在4、24和48小時采集每個板的數據。數據由在相對統一的條件下(光、暴露時間等)用Kodak DC290數碼相機采集的每個板的顏色(熒光)圖像組成。用國家衛生部(NIH)開發的一種公共的結構域圖像加工和分析程序NIH ImageJ分析圖像。分析由測量每個孔內的強度值組成(即，選擇中所有象素的強度值的和除以象素數)。象素的值是0-1。ImageJ將0顯示為白色，值為1的象素為黑色。所有傳感器敏感性數據對時間作圖是從0-1的指數進位，其趨勢準確反映了圖像中所見。
用107、106、105和104個細胞/ml的濃度系列測試的糞鏈球菌傳感器的結果示于圖4A和4B。
用107、106、105和104個細胞/ml的濃度系列測試的銅綠假單胞菌傳感器的結果示于圖5A和5B。
用107、106、105和104個細胞/ml的濃度系列測試的金黃色葡萄球菌傳感器的結果示于圖6A和6B。
用107、106、105和104個細胞/ml的濃度系列測試的釀膿鏈球菌傳感器的結果示于圖7A和7B。
用107、106、105和104個細胞/ml的濃度系列測試的粘質沙雷氏菌傳感器的結果示于圖8A和8B。
CPI2肽底物由腸球菌、假單胞菌、葡萄球菌、鏈球菌和沙雷氏菌的蛋白酶有效切割。當與大腸桿菌細胞或上清液一起溫育時，CPI2肽底物沒有被切割。在未感染的傷口液體存在下，CPI2肽沒有被切割。在細菌的最高濃度，很多上述熒光測定表現出淬滅，這是通過一些107和106樣品的熒光水平下降而證實的。用膜上更少的底物重復該測定，以減少熒光淬滅。
在傳感器研究結束時(40小時)比較每個傳感器的反應性，以確定從每個傳感器獲得的相對信號。結果示于圖9A-9C。CPI2肽在105CFU可以有效檢測大多數病原體。所有五種細菌(大腸桿菌除外)在105個細菌/ml的濃度產生強信號。但是，在104個細菌/ml的濃度，沒有觀察到沙雷氏菌產生可以測量到顯著高于背景的信號。
可以采用合適的對照更透徹地分析CPI2肽與無害細菌以及與傷口液體的交叉反應性。也可以確定CPI2肽底物對傷口敷料和在體內豬研究中的適用性。
盡管具體示出了本發明，并且參考其優選實施方案進行了描述，本領域技術人員應該理解，可以對其進行多種形式和細節的改變而不背離所附權利要求所包含的本發明的范圍。
實施例6壓過(PUSH-THROUGH)測定CPI3肽是用于檢測多種病原體的廣譜肽CPI2的帶有5-組氨酸標志的形式。在N末端添加了半胱氨酸以便用以下染料進行標記CPI3[Ac]-CGAMFLEAIPMSIPAAAHHHHH-[OH]。
用四甲基羅丹明碘乙酰胺(TMRIA)染料(可購自Molecular Probes，Eugene，Oregon)在半胱氨酸基團上標記CPI3肽。在含有過量TMRIA染料的PBS pH 7.4中進行標記反應。計算出染料與肽的比例為大約1.0。
大約1mg TMRIA染料標記的CPI3通過肽上的5-組氨酸標志與1ml鎳-氨三乙酸(Ni-NTA)瓊脂珠(獲自Qiagen，Valencia，California)結合。基本所有的CPI3都與Ni-NTA珠結合，這是由溶液失去顏色而證明的。
將50μl珠體積的CPI3-TMRIA置于試管中，加入200μl 1×104或1×105cfu/ml糞腸球菌，在室溫下溫育5分鐘。細菌蛋白酶切割CPI3，使得染料-肽片段從Ni-NTA珠釋放。通過用微量離心機短暫離心，從溶液分離珠。從試管取出相當于獲得105、106、107cfu等同物的體積和細菌濃度(如100μl的1×105cfu/μl)并且置于1ml注射器尖端。將未添加細菌的磷酸緩沖液用作對照。然后將注射器置于背后襯有濾紙的聚偏1，1-二氟乙烯(PVDF)膜上的大小匹配的O-環的頂端，推動注射器的活塞以強迫液體通過膜。染料-肽片段保留在PVDF膜表面，僅僅是未連接染料的液體通過濾紙。5分鐘后，暴露于107cfu/mL液體的PVDF膜表現出最亮的顏色反應，而暴露于106cfu/mL液體的PVDF膜表現出低于暴露于107cfu/mL液體的膜的顏色反應。5分鐘后，暴露于105cfu/mL液體的PVDF膜表現出低于暴露于106cfu/mL液體的膜的顏色反應，而暴露于0cfu/mL液體的膜沒有表現出可分辨的顏色反應。
實施例7可檢測性標記的底物的穩定性為了評估可檢測性標記的底物的長期穩定性或活力，用HRP可檢測性標記CPI2底物，并且附著于AffiGel珠。將珠子在40℃總共老化35天。在35天老化過程中的多個間隔取出珠子樣品，暴露于含有106CFU/ml銅綠假單胞菌的溶液或對照緩沖液PBS。暴露于細菌的珠子產生了暗藍色信號，而暴露于對照的珠子則沒有產生。圖11說明了測量的在穩定性研究中采集的多個樣品的顏色圖。數據表明珠子非常穩定，不具有任何隨時間破壞可檢測信號的問題，表明珠子非常耐用。
實施例8株間可操作性將CIP2熒光共振能力轉移(FRET)肽暴露于糞鏈球菌的5種不同的臨床株(獲自科羅拉多大學)。肽與所有5個菌株強反應。圖12舉出了暴露于各個菌株后測量的相對熒光的圖像。數據表明，可檢測性標記的肽將檢測傷口病原體的不同菌株的存在。
實施例9與HRP綴合的CPI2肽的反應性CPI2肽與辣根過氧化物酶(HRP)綴合，然后與多種珠(如affigel和瓊脂糖珠)偶聯，用于液相和固相測定。將一些珠子暴露于含有106CFU/ml銅綠假單胞菌的溶液。在ABTS和過氧化氫存在下形成了暗藍色，表明細菌的存在。可檢測的顏色信號在少于4分鐘內就開始工作，表明可檢測性標記的珠子可以用作用于檢測有害病原體的精確測試的快速廣譜點。
實施例10臨床抹布樣品測試CPI2肽與辣根過氧化物酶(HRP)綴合，然后與多種珠(如affigel和瓊脂糖珠)偶聯，用于液相和固相測定。從馬塞諸塞大學醫學院獲得已經暴露于患者傷口的抹布樣品。用以下方案測試抹布樣品中細菌的存在1)用PBS對HRP-珠進行1∶10稀釋，以形成珠漿。將10微升漿加入過濾板的每個孔。
2)將10微升每個冷凍的傷口樣品加入80微升PBS中。然后將得到的溶液加入過濾板中的孔。
3)將板溫育4分鐘，然后將濾板旋轉到含有US生物穩定液底物(1.46mM ABTS和H2O2)的另一塊板中。
4)顯色1分鐘后，在405nm用微量滴定板讀數器進行讀數。
在ABTS和過氧化氫存在下，含有傷口病原體的樣品變成暗藍色。
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<223>合成肽序列<400>3Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met1 5 10 15Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys20<210>4<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Glu Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met SerIle Pro Lys1 5 1015<400>4Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile Pro Pro Glu15 10 15<210>5<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽序列<400>5
Cys Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile Pro Ala Ala1 5 10 15Ala His His His His His20
權利要求
1.檢測細菌存在或不存在的方法，包括以下步驟a)在導致由細菌產生的酶對底物進行修飾的條件下，使樣品與可檢測性標記的合成絲氨酸蛋白酶抑制劑反應位點環結構域肽底物接觸；和b)檢測底物的修飾或底物修飾的不存在，底物的修飾表明樣品中存在細菌，底物修飾的不存在表明樣品中不存在細菌。
2.權利要求1的方法，其中所述細菌是傷口特異性細菌，選自金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、釀膿鏈球菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌、粘質沙雷氏菌、奇異變形菌、陰溝腸桿菌、無硝不動桿菌、肺炎克雷伯氏菌和大腸桿菌。
3.權利要求1或2的方法，其中所述酶是蛋白酶。
4.權利要求1-3的任意一項的方法，其中所述底物是用熒光探針和淬滅染料分子標記的。
5.權利要求1-4的任意一項的方法，其中所述底物是用選自下組的標記進行標記的自旋標記、抗原標志、表位標志、半抗原、酶標記、輔基、熒光材料、pH敏感材料、化學發光材料、比色成分、生物發光材料和放射性材料。
6.權利要求1-5的任意一項的方法，其中所述底物包括選自下組的至少一種肽EAAGAMFLEAIPK、EGAMFLEAIPMSIPK、KGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVK、GAMFLEAIPMSIPPE和CGAMFLEAIPMSIPAAAHHHHH。
7.權利要求1-6的任意一項的方法，其中所述樣品選自受試者的傷口表面和體液。
8.權利要求1-7的任意一項的方法，其中所述底物是在固體支持物上。
9.權利要求1-8的任意一項的方法，其中所述固體支持物選自傷口敷料、容納體液的容器、盤、觀察器、過濾器、透鏡、泡沫、織物、紙、縫線、蘸棒、抹布、尿收集袋、血液收集袋、血漿收集袋、試管、導管、抹布和微量滴定板的孔。
10.權利要求1-9的任意一項的方法，其中所述固體支持物包含需要無微生物污染物的材料。
11.權利要求1-10的任意一項的方法，其中所述支持物包含至少兩種不相似的比色成分，并且底物附著于固體支持物，其中底物的修飾包括切割底物的至少一部分，該部分包含比色成分之一，該切割導致可見的顏色改變。
12.權利要求1-11的任意一項的方法，其中所述比色成分與肽共價連接。
13.用于檢測樣品中細菌的存在或不存在的生物傳感器，該生物傳感器包含a)固體支持物，和b)可檢測性標記的合成絲氨酸蛋白酶抑制劑反應位點環(RSL)結構域肽底物，所述底物附著于所述固體支持物。
14.權利要求13的生物傳感器，其中所述底物是由選自下組的傷口特異性細菌產生的蛋白的特異性底物金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、釀膿鏈球菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌、粘質沙雷氏菌、奇異變形菌、陰溝腸桿菌、無硝不動桿菌、肺炎克雷伯氏菌和大腸桿菌。
15.權利要求14的生物傳感器，其中所述蛋白是蛋白酶。
16.權利要求13-15的任意一項的生物傳感器，其中所述底物是用熒光探針和淬滅染料分子標記的。
17.權利要求13-16的任意一項的生物傳感器，其中所述底物是用選自下組的標記進行標記的自旋標記、抗原標志、表位標志、半抗原、酶標記、輔基、熒光材料、pH敏感材料、化學發光材料、比色成分、生物發光材料和放射性材料。
18.權利要求13-17的任意一項的生物傳感器，其中所述底物包括選自下組的至少一種肽EAAGAMFLEAIPK、EGAMFLEAIPMSIPK、KGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVK、GAMFLEAIPMSIPPE和CGAMFLEAIPMSIPAAAHHHHH。
19.權利要求13-18的任意一項的生物傳感器，其中所述固體支持物選自傷口敷料、容納體液的容器、盤、觀察器、過濾器、透鏡、泡沫、織物、紙、縫線、蘸棒、抹布、尿收集袋、血液收集袋、血漿收集袋、試管、導管、抹布和微量滴定板的孔。
20.權利要求13-19的任意一項的生物傳感器，其中所述固體支持物包含需要無微生物污染物的材料。
21.權利要求13-20的任意一項的生物傳感器，其中所述支持物包含至少兩種與肽共價連接的不相似的比色成分。
22.一種分離的肽，包含可檢測標記和選自下組的氨基酸序列EAAGAMFLEAIPK、EGAMFLEAIPMSIPK、KGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVK、GAMFLEAIPMSIPPE和CGAMFLEAIPMSIPAAAHHHHH。
全文摘要
此處公開了通過使樣品與衍生自α1－蛋白酶抑制劑的反應位點環(RSL)結構域的修飾的肽底物接觸，檢測傷口感染和檢測樣品中細菌，例如傷口細菌的存在或不存在的方法。在本發明中，我們證明了沒有α1－蛋白的這些肽底物可以有效用作肽底物。由細菌產生和/或分泌的酶對該肽底物的修飾或修飾的不存在，可以作為樣品中存在或不存在細菌的指標。本發明也描述了檢測樣品中細菌的存在或不存在的方法。
文檔編號G01N33/543GK1902494SQ200480039725
公開日2007年1月24日 申請日期2004年11月3日 優先權日2003年11月3日
發明者S·塞巴斯蒂安, G·J·科爾帕斯, D·L·埃利斯-布斯拜, J·M·哈弗爾德, M·C·桑德斯 申請人:伊西康公司, 表達構想公司
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