專利名稱：一種檢測玉米赤霉烯酮的試劑盒及其檢測方法
技術領域：
一種檢測玉米赤霉烯酮的試劑盒及其檢測方法，屬于時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)技術領域，用于對谷物中玉米赤霉烯酮(簡稱ZEN)含量的檢測。
背景技術：
ZEN是一種雌激素真菌毒素，由禾谷鐮刀菌(F.graminearum)、三線鐮刀菌(F.tricinetum)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、黃色鐮刀菌(F.culmorum)、串珠鐮刀菌(F.oeniliforme)、木賊鐮刀菌(F.eguiseti)、燕麥鐮刀菌(F.avenaceum)、雪腐鐮刀菌(F.nivale)等多種菌種代謝產生。玉米赤霉烯酮其主要存在于玉米和玉米制品中，小麥、大麥、高粱、大米中也有一定程度的分布，其主要污染小麥、大麥、燕麥、小米、芝麻、干草和青貯飼料等。玉米赤霉烯酮具有較強的生殖毒性和致畸作用，可引起動物發生雌激素中毒癥，主要癥狀有陰道和乳腺腫脹、子宮腫大、外翻、導致動物不孕或流產，對家禽特別是豬、牛和羊的影響較大，給畜牧業帶來經濟損失；玉米赤霉烯酮可直接通過污染的谷類等作物進入人和動物體內，亦可通過被污染的肉、奶等動物性食品進入人體，它引起人中毒的癥狀主要出現無力、頭痛、頭暈、嘔吐、腹瀉和中樞神經系統的紊亂。因此為了保障人們的健康，開展食品中ZEN的衛生檢測研究是很有必要的。
歐盟委員會規則856/2005號規定了谷物食品和谷物中玉米赤霉烯酮的最大限量，20-100μg/kg，于2006年7月1日生效。目前也有許多國家制定了玉米赤霉烯酮的限量標準，奧地利規定小麥、裸麥、硬質小麥中不得超過60μg/kg，巴西、法國、羅馬尼亞、俄羅斯、烏拉圭等國也制定了限量標準。修訂的《糧食衛生標準》規定小麥、玉米中ZEN的限量為60μg/kg。
我國玉米赤霉烯酮污染較重地區主要集中在東北冷濕儲糧生態區和華東熱濕儲糧生態區。谷物在耕作、收獲、儲藏期間，若濕度較高，溫度適宜25-28℃，鐮刀菌可不斷增殖，而且在較低溫度下12℃左右或溫度高低變化的情況下，玉米赤霉烯酮毒素都可產生。
目前玉米赤霉烯酮的檢測方法主要有色譜技術和免疫分析技術。色譜技術(HPLC、GC-MS、LC-MS)由于費時，花費多，在實際應用中受到一定限制，通常作為確定性的定量檢驗方法；免疫分析技術(ELISA)是常用的現場抽樣快速篩選檢驗方法。國外的酶免試劑盒有德國R-Biopharm(檢測范圍50-4050ppt)、美國Neogen(檢測范圍25-600ppb)、Beacon(檢測范圍20-1000ppb)等公司生產的ZEN-ELISA檢測試劑盒。但由于進口試劑盒價格昂貴，在一定程度上限制了它的使用范圍。國內有研制的ZEN-ELISA試劑盒，其最低檢出濃度為1μg/L(ppb)，標準曲線的線性范圍為1-200μg/L。檢測的靈敏度和試劑的穩定性不夠，所以需要建立高靈敏的ZEN的檢測。
時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)是上世紀八十年代初發展起來的新的免疫測定技術。時間分辨熒光免疫分析法其原理是利用具有雙功能基團結構的螯合劑，其一端和鑭系元素結合，另一端和抗體分子上的自由氨基聯接，制成EU3+標記抗體，它與待測樣品中的抗原結合成免疫復合物。理想情況下，測定復合物中鑭系元素的熒光強度就能確定樣品中抗原的量，但實際上這種復合物的熒光強度相當弱，只有再加入一種增強溶液(Enhancement solution)，使鑭系元素從復合物中解離下來，并與增強液中所含的β-萘甲酰三氟丙酮(β-NTA)重新形成微膠囊，在紫外等光的激發下發射很強的熒光，增強效果上百萬倍。用時間分辨熒光儀測定其熒光強度cps，即可確定樣品中抗原的量。
發明內容
本發明的目的在于提供一種檢測玉米赤霉烯酮的試劑盒及其檢測方法，用于對谷物中玉米赤霉烯酮含量的檢測。
本發明的技術方案該檢測玉米赤霉烯酮的試劑盒是由1、96或48孔包被板，2、緩沖液，3、玉米赤霉烯酮標準，4、玉米赤霉烯酮抗體凍干品，5、銪標記的羊抗鼠抗體，6、洗滌液，7、增強液所組成。
所述緩沖液(2)為含8mmol/L NaCl、1g/L牛血清白蛋白、2g/L牛的免疫球蛋白、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸、0.1ml/L Tween-80和1g/L NaN3的pH7.8、50mmol/L Tris-HCl緩沖液；洗滌液(6)為含14.5mmol/L NaCl、0.2ml/L Tween-80和2g/L NaN3的pH7.8、50mmol/L Tris-HCl溶液；增強液(7)為含15μmol/L β-萘甲酰三氟丙酮，50μmol/L三正辛基氧化膦和1ml/L曲拉通X-100的pH3.2的鄰苯二甲酸氫鉀溶液。
所述的試劑盒其中的包被板(1)包被固相抗原，用pH9.6、50mmol/LNa2CO3-NaHCO3的緩沖液將玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白稀釋至2mg/L做為包被液，96或48孔微孔板各孔加100μl，4℃放置過夜，棄去包被液，沖洗三次，加200μl含2g/L牛血清白蛋白的pH7.2、50mmol/L的Tris-HCL緩沖液封閉，4℃放置過夜，棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置-20℃冷凍保存。
所述的試劑盒，其中的玉米赤霉烯酮標準(3)，共6瓶，玉米赤霉烯酮濃度分別為0ng/ml，0.05ng/ml，0.2ng/ml，1ng/ml，4ng/ml，20ng/ml。
所述的試劑盒，其中的玉米赤霉烯酮抗體凍干品(4)，用弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑1.2ml混合2mg玉米赤霉烯酮-鑰藍蛋白，用勻漿器混合2小時，制得油包水抗原乳化劑，取600μl制備好的油包水抗原乳化劑，制備單克隆抗體，抗體合格后用上述Tris-HCl緩沖液1∶500稀釋、分裝、凍干備用。
所述的試劑盒，其中的銪標記的羊抗鼠抗體(5)，取羊抗鼠抗體溶解于pH7.0、50mmol/L PBS 2ml，其中羊抗鼠抗體的含量為10g/L，經PD-10柱轉換緩沖液，洗脫液為含0.155mol/L NaCl的pH8.5、50mmol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液，收集蛋白峰，經紫外吸收分析定量，用上述Na2CO3-NaHCO3洗脫液稀釋羊抗鼠抗體至2g/L，取1ml稀釋后的羊抗鼠抗體加入含0.5mg的Eu3+-N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸的小瓶中，30℃磁力攪拌反應20小時，反應液經用pH7.8、80mmol/LTris-HCl緩沖液平衡的Sepharose CL-6B柱(1×40cm)層析，收集蛋白峰，用上述Na2CO3-NaHCO3洗脫液稀釋、分裝備用。
測定方法為測定的基礎是標記免疫反應。包被有ZEN-BSA的微孔板，加入ZEN標準或已處理好的樣品到各自的微孔中、再加入ZEN抗體，振蕩反應，游離的ZEN與微孔板上的ZEN-BSA競爭ZEN抗體，洗滌液洗滌，沒有連接的ZEN抗體在洗滌步驟中被除去。加入EU3+-羊抗鼠抗體，進行標記免疫反應，再用洗滌液洗滌，反應后沒有連接的EU3+-羊抗鼠抗體在洗滌步驟中被除去。加增強液振蕩后，用時間分辨熒光儀測定其熒光強度cps，熒光強度與樣品中的ZEN濃度成反比，對照標準曲線即可確定樣品中抗原的量。
其操作為取包被有玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白的微孔包被板，加入50μl的玉米赤霉烯酮標準或處理好的樣品到各自的微孔中，加50μl的以緩沖液(2)1∶20稀釋的玉米赤霉烯酮抗體的復溶液體，25-37℃振蕩0.5小時，洗滌液洗三次，加以緩沖液(2)1∶20稀釋的100μl EU3+-羊抗鼠抗體，25-37℃振蕩0.5-1小時，用洗滌液洗六次，加200μl增強液振蕩5分鐘后測量熒光強度cps，從標準曲線計算樣品中玉米赤霉烯酮的含量。
所述的檢測玉米赤霉烯酮的方法，其中的樣品處理，谷物樣品處理將谷物樣品粉碎至20目，取5克樣品放在試管中，加入提取液25ml，提取液為甲醇∶PBS＝7∶3，加塞振蕩3分鐘，過濾，濾紙采用新華1號紙，取1ml濾液用7ml蒸餾水或去離子水進行稀釋，備用。
本發明的有益效果該試劑盒結構簡單，使用方便、廉價、靈敏度高，達到0.05ng/ml。
圖1檢測玉米赤霉烯酮的試劑盒示意圖。1.96或48孔包被板，2.緩沖液，3.玉米赤霉烯酮標準，4.玉米赤霉烯酮抗體凍干品，5.銪標記的羊抗鼠抗體，6.洗滌液，7.增強液。
圖2ZEN-TRFIA標準曲線圖。
具體實施例方式
實施例1制備試劑盒和檢測玉米樣品Eu3+-羊抗鼠抗體的制備取溶解于50mmol/L PBS pH7.0的10g/L羊抗鼠抗體2ml，經PD-10柱轉換緩沖條件，洗脫液為含0.155mol/L NaCl的50mmol/L Na2CO3-NaHCO3pH8.5緩沖液。收集蛋白峰，經紫外吸收分析定量(1.46A280-0.74A260)，用上述洗脫液稀釋羊抗鼠抗體至2g/L。取1ml稀釋后的羊抗鼠抗體加入含0.5mg的Eu3+-N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)的小瓶中，30℃磁力攪拌反應20小時。反應液經用80mmol/L Tris-HCl pH7.8緩沖液平衡的Sepharose CL-6B柱(1×40cm)層析，A280監測收集蛋白峰，稀釋分裝備用。
包被板固相抗原制備將ZEN-BSA用50mmol/L Na2CO3-NaHCO3pH9.6緩沖液稀釋至2mg/L的包被液，96(或48)孔微孔板各孔加100μl，4℃放置過夜。棄去包被液，沖洗三次，加200μl含0.2％牛血清白蛋白的50mmol/LPH7.2的Tris-HCL緩沖液封閉，4℃放置過夜。棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置-20℃冷凍保存。
試劑的配制(1)標準玉米赤霉烯酮(ZEN)，共6瓶，玉米赤霉烯酮濃度分別為(0ng/ml，0.05ng/ml，0.2ng/ml，1ng/ml，4ng/ml，20ng/ml)，從玉米赤霉烯酮純品中稀釋得到，稀釋液為甲醇∶PBS＝1∶9。
(2)緩沖液8mmol/L NaCl、0.1％BSA、0.2％牛IgG、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸、0.1ml/L Tween-80和0.1％NaN3的50mmol/L Tris-HCl pH7.8。
(3)洗滌液14.5mmol/L NaCl、0.2ml/L Tween-80和0.2％NaN3的50mmol/LTris-HCl pH7.8。
(4)增強液的配制pH3.2鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液含15μmol/L β-萘甲酰三氟丙酮(β-NTA)，50μmol/L三正辛基氧化膦(TOP0)，1ml/L曲拉通X-100(TritonX-100)。
試劑盒提供的試劑每一個盒中的試劑足夠進行96個測量，盒中的材料如下(1).1×96孔板(8條×12孔，可以拆分為單孔)包被有ZEN-BSA。
(2).6×ZEN標準液，1.0ml/瓶，標準液濃度為0，0.05，0.2，1，4，20ng/ml。
(3).1×ZEN抗體凍干品，用時0.5ml蒸餾水復溶。
(4).1×EU3+-羊抗鼠抗體凍干品，用時0.5ml蒸餾水復溶。
(5).1×增強液15ml。
(6).1×洗滌液30ml，用時以蒸餾水1∶25稀釋。
(7).1×緩沖液30ml，實驗室應自備的試劑甲醇。
提取液70％甲醇溶液30ml PBS和70ml純甲醇混合制備70％甲醇溶液。
PBS緩沖液(pH7.4，0.01mol/L)。
蒸餾水或去離子水。
測定之前注意事項1.使用之前將所有試劑回升至室溫(18-30℃)。
2.使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
3.如果樣品量大建議使用多通道移液器。
4.在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋子蓋住微孔。
5.取出需用數量的微孔板及框架，將不用的微孔板放進原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于2-8℃。
具體檢測步驟如下測定玉米中的ZEN含量玉米樣品處理將玉米樣品粉碎至20目，取5克樣品放在試管中，加入提取液25ml，提取液為甲醇∶PBS＝7∶3，加塞振蕩3分鐘，過濾，濾紙采用新華1號紙，取1ml濾液用7ml PBS進行稀釋，備用。
取ZEN-BSA板條，加入50μl的ZEN標準或處理好的樣品到各自的微孔中，每個標準和樣品必須使用新的吸頭，加緩沖液1∶20稀釋的ZEN抗體50μl，移液器管尖千萬不要接觸到放進孔中的液體，37℃振蕩1小時，洗滌液洗三次，加緩沖液1∶20稀釋的EU3+-羊抗鼠抗體100μl，37℃振蕩0.5小時，用洗滌液洗六次，加200μl增強液振蕩5分鐘后測量。從標準曲線計算樣品中的ZEN含量，見表1和圖2，該例的樣品中ZEN濃度為0.76ng/ml。
表1
實施例2測定小麥中的ZEN含量操作方法同實施例1。Cps值為1256385。從標準曲線計算樣品中的ZEN含量，見表1和圖2，該例的樣品中ZEN濃度為0.51ng/ml。
實施例3測定玉米中的ZEN含量操作方法同實施例1。Cps值為1905218。從標準曲線計算樣品中的ZEN含量，見表1和圖2，該例的樣品中ZEN濃度為0.07ng/ml。
權利要求
1.一種檢測玉米赤霉烯酮的時間分辨熒光免疫分析法試劑盒，其特征是由96或48孔包被板(1)，緩沖液(2)，玉米赤霉烯酮標準(3)，玉米赤霉烯酮抗體凍干品(4)，銪標記的羊抗鼠抗體(5)，洗滌液(6)和增強液(7)所組成；所述緩沖液(2)為含8mmol/L NaCl、1g/L牛血清白蛋白、2g/L牛的免疫球蛋白、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸、0.1ml/L Tween-80和1g/L NaN3的pH7.8、50mmol/L Tris-HCl緩沖液；洗滌液(6)為含14.5mmol/L NaCl、0.2ml/L Tween-80和2g/L NaN3的pH7.8、50mmol/L Tris-HCl溶液；增強液(7)為含15μmol/L β-萘甲酰三氟丙酮、50μmol/L三正辛基氧化膦和1ml/L曲拉通X-100的pH3.2的鄰苯二甲酸氫鉀溶液。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其中的包被板(1)包被固相抗原，用pH9.6、50mmol/L Na2CO3-NaHCO3的緩沖液將玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白稀釋至2mg/L做為包被液，96或48孔微孔板各孔加100μl，4℃放置過夜，棄去包被液，沖洗三次，加200μl含2g/L牛血清白蛋白的pH7.2、50mmol/L的Tris-HCL緩沖液封閉，4℃放置過夜，棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置-20℃冷凍保存。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其中的玉米赤霉烯酮標準(3)，共6瓶，玉米赤霉烯酮濃度分別為0ng/ml，0.05ng/ml，0.2ng/ml，1ng/ml，4ng/ml，20ng/ml。
4.根據權利要求1所述的試劑盒，其中的玉米赤霉烯酮抗體凍干品(4)，用弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑1.2ml混合2mg玉米赤霉烯酮-鑰藍蛋白，用勻漿器混合2小時，制得油包水抗原乳化劑，取600μl制備好的油包水抗原乳化劑，制備單克隆抗體，抗體合格后用所述Tris-HCl緩沖液稀釋、分裝、凍干備用。
5.根據權利要求1所述的試劑盒，其中的銪標記的羊抗鼠抗體(5)，取10g/L羊抗鼠抗體溶解于pH7.0、50mmol/L的磷酸鹽緩沖液2ml，經PD-10柱轉換緩沖液，洗脫液為含0.155mol/L NaCl的pH8.5、50mmol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液，收集蛋白峰，經紫外吸收分析定量，用所述Na2CO3-NaHCO3洗脫液稀釋羊抗鼠抗體至2g/L，取1ml稀釋后的羊抗鼠抗體加入含0.5mg的Eu3+-N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸的小瓶中，30℃磁力攪拌反應20小時，反應液經用pH7.8、80mmol/LTris-HCl緩沖液平衡的1×40cm的Sepharose CL-6B柱層析，收集蛋白峰，用所述Na2CO3-NaHCO3洗脫液稀釋、分裝備用。
6.一種用權利要求1所述的試劑盒檢測玉米赤霉烯酮的方法，其特征是取包被有玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白的微孔包被板，加入玉米赤霉烯酮標準或處理好的樣品到各自的微孔中，再加入玉米赤霉烯酮抗體，振蕩反應，洗滌液洗滌，加銪標記的羊抗鼠抗體，進行標記免疫反應，洗滌液洗滌，加增強液振蕩后測量熒光強度cps，對照標準曲線計算樣品中的玉米赤霉烯酮含量。
7.根據權利要求6所述的檢測玉米赤霉烯酮的方法，其特征是其操作為取包被有玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白的微孔包被板，加入50μl的玉米赤霉烯酮標準或處理好的樣品到各自的微孔中，加50μl的以緩沖液(2)1∶20稀釋的玉米赤霉烯酮抗體凍干品的復溶液體，25-37℃振蕩0.5小時，洗滌液洗三次，加以緩沖液(2)1∶20稀釋的100μl銪標記的羊抗鼠抗體，25-37℃振蕩0.5-1小時，用洗滌液洗六次，加200μl增強液振蕩5分鐘后測量熒光強度cps，從標準曲線計算樣品中玉米赤霉烯酮的含量。
8.根據權利要求6所述的檢測玉米赤霉烯酮的方法，其中的樣品處理，谷物樣品處理將谷物樣品粉碎至20目，取5克樣品放在試管中，加入提取液25ml，提取液為甲醇∶PBS＝7∶3，加塞振蕩3分鐘，過濾，濾紙采用新華1號紙，取1ml濾液用7ml蒸餾水或去離子水進行稀釋，備用。
全文摘要
一種檢測玉米赤霉烯酮的試劑盒及其檢測方法，屬于時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)技術領域，用于對谷物中玉米赤霉烯酮(ZEN)含量的檢測。本試劑盒測定的基礎是標記免疫反應。微孔板包被有ZEN－BSA，加入ZEN標準或樣品，再加入ZEN抗體。游離的ZEN與微孔板上的ZEN－BSA競爭ZEN抗體，沒有連接的ZEN抗體被洗滌除去，加入銪標記的羊抗鼠抗體，標記免疫反應后沒有連接的銪標記的羊抗鼠抗體被洗滌除去。加增強液后，用時間分辨熒光儀測定其熒光強度cps，熒光強度與樣品中的ZEN濃度成反比，對照標準曲線即可確定被測樣品中ZEN的含量。本發明提供的檢測ZEN試劑盒結構簡單，使用方便、廉價、靈敏度高，達到0.05ng/ml。
文檔編號G01N21/25GK1963506SQ20061009760
公開日2007年5月16日 申請日期2006年11月10日 優先權日2006年11月10日
發明者黃飚, 金堅, 屠薔, 陶文沂, 時瑾, 王雪 申請人:江蘇省原子醫學研究所
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
