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用于固定配體的新型粘合表面的制作方法
【專利摘要】本發明的主題是一種復合物，包含：具有至少兩個表面的載體，其中之一具有粘合劑涂層，至少一種固定在該粘合劑表面上的配體。在本發明框架內實現的配體選自蛋白質、肽、抗體、核酸、糖或寡糖、毒素、殺蟲劑、激素、除草劑、殺真菌劑和神經遞質。
【專利說明】用于固定配體的新型粘合表面
【技術領域】
[0001]本發明涉及包含固定在涂布于載體表面之一(enduit sur I’ une des faces dusupport)的粘合劑上的至少一種配體的新型復合物(complexe)。
【背景技術】
[0002]使用固定在載體上的配體是常見的，尤其在診斷試驗領域和在生物工藝學領域。這些系統允許使用大量的分子，如在用于DNA或RNA分析的芯片的情況下。
[0003]已經廣泛描述了配體在載體上的固定(Sambrook等人，1989)。該固定方法被證實是困難、昂貴、漫長和部分有效的。它們基于吸附、離子或共價鍵合、或在凝膠或聚合物類型的基質中捕集配體。
[0004]已經開發了方法，由此專利申請WO 2005/114417描述了使用施加到粘性載體上的球狀蛋白層，隨后向球狀蛋白的層上施加交聯劑，該蛋白質催化劑通過與交聯劑的反應固定在該表面上。
[0005]文獻WO 03/072 752描述了能夠以干燥形式、高點密度固定蛋白質并具有高信噪比的在帶有聚偏二氟乙烯(PVDF)的疏水性和聚合層的剛性基底上制得的蛋白質芯片。

【發明內容】

[0006]本發明能夠通過使用包含具有至少兩個表面且其中一個表面具有粘合劑和固定在所述粘合表面上的至少一種配體的涂層的復合物克服了上述缺陷。
[0007]在本發明的上下文中，沉積在該粘合表面上的配體可以具有蛋白質性質:蛋白質、寡肽、多肽、抗體，具有核酸性質:DNA、RNA、寡核苷酸(即引物)，其還有可能是糖(寡糖或多糖)或小分子，其任選是合成的，如毒素、殺蟲劑、激素、除草劑、殺真菌劑或神經遞質。
[0008]由此，當配體為蛋白質類型時，無需對粘合表面進行預處理。
[0009]所用載體可以由玻璃或塑料板、聚酯膜或可以用粘合劑涂布的任何其它材料組成。
[0010]在本發明的特定實施方案中，該載體在其兩個表面上都具有粘合劑涂層(圖1)。
[0011]粘合劑是普通粘性聚合物，其可以具有活化表面?？梢蕴峒暗膶嵗ǚ欠磻哉澈蟿?，如苯乙烯-丁二烯共聚物、丁腈橡膠、聚(乙酸乙烯酯)及其聚合物、聚乙烯醇縮乙醛，壓敏粘合劑如聚丙烯酸酯、硅橡膠、聚(乙烯醚)，或者反應性粘合劑如雙組分聚氨酯粘合劑、環氧粘合劑、厭氧性丙烯酸類或氰基丙烯酸酯。
[0012]例如，已經使用下列材料:
[0013]-3M 7966WDL (粘合劑 3M? 200MP)
[0014]-5 Stars Double Sided Display Tape Polypropylene,
[0015]3M?0ptically Clear Overlaminating Film 76991，
[0016]Ultra Clear Removable Overlaminating Film 76991。
[0017]選擇該配體以使得與規定的抗配體(antiligand)特異性相互作用。取決于基底的性質和固定方式(通過親合力、共價等等)?？梢詫⒃撆潴w官能化以獲得更好的固定。
[0018]各種配體可以同時基質化(matrixed)到同一載體上并且該基質的設計可以進一步包括相同探針的若干復制品(圖1)。
[0019]對于蛋白質配體，無需對粘合劑表面進行預處理，配體可以直接沉積(點樣步驟(etape de spotting))到該表面上。
[0020]對于寡核苷酸配體(ligands oligonucl6otidiques),可以進行使用多官能交聯齊U(優選戊二醛)的表面預處理步驟以改善固定的配體的活性。
[0021]由此，根據另一方面，本發明的主題是包含載體的復合物，所述載體的表面之一上具有粘合劑涂層，所述粘合表面例如通過交聯劑的作用被官能化。在一種特定實施方案中，該配體也被官能化。
[0022]本發明的主題還是制備上述復合物的方法。
[0023]在本發明的特定實施方案中，配體在緩沖液，例如鹽水緩沖液(根據用作配體的生物分子的性質選擇)中稀釋并使用例如非接觸型壓電點樣儀或通過將涂布的載體浸潰在包含該配體的溶液中來沉積在涂布的載體的表面上。
[0024]當配體溶液(ligand en solution)以液滴形式沉積時,沉積液滴的尺寸以及由此在表面上形成的斑點的尺寸(50-1000微米)、斑點密度(每平方毫米1-25個)以及基質的格式可以隨著期望的應用領域和生物分子的性質而改變。
[0025]官能化載體的步驟可以在配體沉積前進行，例如用交聯劑如戊二醛處理該粘合表面。
[0026]取決于所述應用領域，可以在沉積該配體和任選在室溫下干燥的步驟后進行后處理步驟。該后處理步驟可以由加熱(例如在163°C下I分鐘)、洗滌(鹽水緩沖液等等)和/或飽和(以減少背景噪音)該復合物組成。
[0027]本發明的復合物可用于制備尤其用于分析的設備。
[0028]此類設備包含基本剛性的載體(support sub s tant i e 11 ement rigide),所述載體包含至少一個限定(d6limitant)包含至少兩個孔口(ouvertures)的內部腔室的孔,所述孔口的至少一個被本發明的復合物密封。
[0029]此類設備可以取通常用于診斷試驗或生物工藝學領域的12-、24_或96-孔板形式或微流體網絡形式。
[0030]制備此類設備的方法包括將本發明的復合物密封到載體上以便封閉該腔室的至少一個所述孔口，該粘合表面包含朝向該腔室內部取向的配體。
[0031]用配體改性的該粘合表面可以容易地與用于產生準備使用的分析工具的各種類型材料組裝(圖2和3)。
[0032]例如，粘性載體可以與無底96孔板組裝以產生常規用于分析目的的固體有底板。
[0033]該粘性載體也可以與各種微流體網絡連接，所述微流體網絡由通道、流動池或混合器組成。組裝的微流體部件可以由任何可用于此類應用的材料組成(玻璃、硅、塑料和其它聚合物材料)。
[0034]本發明的主題還是檢測和/或定量抗配體的方法，包括使用如上所述的設備或復合物。在使得配體與抗配體之間相互作用的條件下放置所述復合物或設備以便與可能含有抗配體的樣品接觸，任選加入標記的檢測分子，并最后檢測和/或定量由配體與抗配體之間相互作用產生的信號。
[0035]在此類方法中，抗配體可以源自于生物樣品如血清、血液或血漿，環境樣品如水、氣體、空氣或土壤的樣品，或者來自于農產品行業的樣品如食品。
[0036]除了由配體/抗配體相互作用組成的關鍵步驟之外，可以根據用于標記和檢測該相互作用的策略本身的要求增加一個或多個步驟(圖4)。
[0037]在這種情況下，例如，如果需要附加的標記步驟(例如，在生物素組靶與抗生蛋白鏈菌素分子之間的相互作用)，可以采用兩種策略:
[0038]-兩步驟方案:
[0039]I)培育抗配體溶液(配體/抗配體相互作用)；
[0040]2)培育標記的分子的溶液(例如共軛的抗生蛋白鏈菌素);
[0041]-一步驟方案:
[0042]I)培育含有抗配體與標記的分子的單一預混合溶液。
[0043]根據應用和要求，可以使用各種檢測方法，例如:
[0044]-使用標記的比色法，例如:
[0045]-采用堿性磷酸酶/BCIP的指示劑體系；
[0046]-米用辣根過氧化酶-ABTS的指不劑體系；
[0047]-金粒子，等等；
[0048]-使用如下的標記的化學發光法:
[0049]-辣根過氧化酶-具有化學發光底物的體系；
[0050]-堿性磷酸酶-具有化學發光底物的體系。
[0051]也可以使用放射線照相術或放射性的檢測和/或定量。
[0052]附圖描述
[0053]胤1:本發明的復合物的示意圖，顯示了(A)載體(S)，其一個表面涂有粘合劑(ad)，配體(L)固定在粘合劑上；(B)載體(S)，其兩個表面涂有粘合劑(ad)，配體(L)固定在兩個表面之一上。
[0054]Ml:本發明的設備的組件的示意圖(A)微流體網絡，(B) 96-孔板。
[0055]M3:本發明的微流體網絡的組件的示意圖。
[0056]S1:檢測樣品中抗配體的過程的示意圖。
[0057]表示檢測信號的強度與樣品中寡核苷酸(抗配體)濃度之間相互關系的曲線。
[0058]Se:表示檢測信號的強度與樣品中CRP (抗配體)濃度之間相互關系的曲線。
[0059]Ml:表示檢測信號的強度與樣品中CRP (抗配體)濃度之間相互關系的曲線。
實施例
[0060]實施例1
[0061]在粘性微量滴定板上的寡核苷酸的基質(用于定量檢測抗配體)
[0062]使用一對互補序列的合成寡核苷酸作為配體與抗配體，其顯示本發明可用于分析和用于定量檢測寡核苷酸序列。
[0063]將配體點樣到粘性載體表面上并用互補序列的寡核苷酸(抗配體)雜交。生物素-抗生蛋白鏈菌素堿性磷酸酶類型的顯色體系用于信號的比色顯色。展示了測得信號的強度與抗配體濃度之間的相互關系(圖5)。
[0064].探針的點樣
[0065]預處理
[0066]載體3M 7966WDL用在0.1M的pH5磷酸鹽緩沖液中的1%戊二醛溶液在37°C下預處理I小時。載體隨后用蒸餾水洗滌以準備用于固定該探針。
_7]
[0068]該配體(合成寡核苷酸(序列表編號1，5’ -氨基酸改性))在鹽水乙酸鹽緩沖液(0.1M乙酸鹽，0.1M KCl,0.25毫克/毫升溴酚藍，ρΗ=5.5)中稀釋已達到50微摩爾/升的最終濃度。使用壓電點樣儀(BioChip Arrayer BCA1, PerkinElmer)將該溶液點樣到粘性3Μ 7966WDL的表面上?；自陂_放空氣中在室溫下干燥。制得的斑點具有大約100微米的直徑和每平方毫米I至25個點的斑點密度。
[0069]后處理
[0070]在基質化配體和在室溫下干燥載體后，如下進行后處理:載體在163°C下加熱I分鐘，隨后通過添加PBS緩沖液進行洗滌并隨后在37°C下用PBSTA緩沖液(0.1M磷酸鹽，0.5MNaCl, pH=7.4,0.l%v/v Tween20, l%w/v BSA)培育 15 分鐘以飽和該表面。
[0071].組裝
[0072]點樣的粘合劑隨后與無底96-孔板組裝以制造標準用途的固體有底板。該載體的粘性在此是能夠通過在一個挨一個放置的兩個部件上施加溫和壓力而進行簡單組裝所必需的(圖2)。
[0073].測試
[0074]在PBSTA緩沖液中制備與堿性磷酸酶-抗生蛋白鏈菌素共軛物(I微克/毫升)混合的不同濃度的抗配體(序列表編號2)溶液。在各孔中放置200微升所得溶液，該組件隨后在點樣表面上在37°C下培育30分鐘。隨后在室溫下用I毫升PBS溶液洗滌該粘性載體。
[0075].顯色(r6v6lation)
[0076]100微升BCIP/NBT (4_溴_5_氯代吲哚基磷酸鹽/氮藍四唑)溶液加入到該板的孔中并在37°C下培育以顯色該信號(大約30分鐘)。該孔隨后用I毫升PBS洗滌。
[0077]一旦孔底部干燥，使用水平辦公掃描儀(HP)進行圖像采集。展示了測得信號的強度與抗配體濃度之間的相互關系(圖5)。
[0078]實施例2應用于救護地點診斷的夾層型免疫試驗法用粘性板上的蛋白質基質
[0079]在其中用蛋白質(配體)微陣列I官能化該粘性載體的情況下，本發明可以達到定量血清學試驗的性能，所述定量血清學試驗用于救護地點診斷類型的應用。
[0080]為了評價此類定量試驗的可靠性，使用下列體系:為了使用相應靶向生物素標記抗體充當用于檢測CRP的探針，在載體上固定抗-CRP抗體。生物素-抗生蛋白鏈菌素堿性磷酸酶型顯色體系用于信號的比色顯色。展示了測得信號的強度與靶抗體(抗配體)濃度之間的相互關系(圖6)。
[0081].配體的點樣
[0082]
[0083]使用壓電點樣儀(BioChip Arrayer BCA1,PerkinElmer)將濃度為500微克/毫升的抗-CRP抗體在乙酸鹽緩沖液(0.1M乙酸鹽，0.1M KCl,0.25毫克/毫升溴酚藍，ρΗ=5.5)中的溶液點樣到3M 7966WDL型的粘合劑表面上。不需要對該表面進行預處理。該表面在室溫下干燥30分鐘。制得的斑點具有大約100微米的直徑和每平方毫米I至25個點的斑點密度。
[0084]后處理
[0085]在微陣列的基質化和在室溫下干燥載體后，如下進行后處理:載體在+163°C下加熱I分鐘，隨后通過添加PBS緩沖液進行洗滌并隨后在37°C下用PBSTA緩沖液(0.1M磷酸鹽，0.5M NaCl, pH=7.4,0.l%v/v Tween20, l%w/v BSA)培育 15 分鐘以飽和該表面。
[0086].組裝
[0087]點樣的粘合劑隨后與無底96-孔板組裝以制造標準用途的固體有底板。該載體的粘性在此是能夠通過在一個挨一個放置的兩個部件上施加溫和壓力而進行簡單組裝所必需的(圖2)。
[0088].測試
[0089]在PBSTA緩沖液中制備靶蛋白質(CRP)、生物素-抗體共軛物(幾種濃度)與堿性磷酸酶-抗生蛋白鏈菌素共軛物(I微克/毫升)的混合溶液。在各孔中沉積200微升所得溶液，該整體隨后在37°C下培育30分鐘。隨后在室溫下用I毫升PBS溶液洗滌該粘性載體。
[0090].顯色
[0091]100微升BCIP/NBT (4_溴_5_氯代吲哚基磷酸鹽/氮藍四唑)溶液加入到該板的孔中并在37°C下培育以顯色該信號(大約30分鐘)。該孔隨后用I毫升PBS洗滌。
[0092]一旦孔底部干燥，使用水平辦公掃描儀(HP)進行圖像采集。在圖6中給出了所得圖像的實例。
[0093]實施例3在組裝的微流體系統中在應用于救護地點診斷的夾層型免疫試驗法用粘性載體上的蛋白質基質
[0094].配體的點樣
[0095]
[0096]使用壓電點樣儀(BioChip Arrayer BCA1,PerkinElmer)將濃度為500微克/毫升的抗-CRP抗體在乙酸鹽緩沖液(0.1M乙酸鹽，0.1M KCl,0.25毫克/毫升溴酚藍，ρΗ=5.5)中的溶液點樣到3Μ 7966WDL型的粘合劑表面上。不需要對該表面進行預處理。該表面在室溫下干燥30分鐘。制得的斑點具有大約100微米的直徑和每平方毫米I至25個點的斑點密度。
[0097]后處理
[0098]在微陣列的基質化和在室溫下干燥載體后，如下進行后處理:載體在+163°C下加熱I分鐘，隨后通過添加PBS緩沖液進行洗滌并隨后在37°C下用PBSTA緩沖液(0.1M磷酸鹽，0.5M NaCl, pH=7.4,0.l%v/v Tween20, l%w/v BSA)培育 15 分鐘以飽和該表面。
[0099].組裝
[0100]基質化蛋白質的粘性載體隨后與預先制造的由PVC/3M 7966WDL微通道或由蝕刻獲得的玻璃微通道所組成的微流體系統組裝。該載體的粘性在此是能夠通過在一個挨一個放置的兩個部件上施加溫和壓力而進行簡單組裝所必需的(圖3)。
[0101]?測試
[0102]在PBSTA緩沖液中制備靶蛋白質(CRP，抗配體)、生物素-抗體共軛物(幾種濃度)與堿性磷酸酶-抗生蛋白鏈菌素共軛物(I微克/毫升)的混合溶液。將50微升所得溶液注入該微流體網絡中(圖7)，該組件隨后在37°C下培育I小時。組裝的微流體系統隨后用200毫升PBS緩沖液洗滌。
[0103].顯色
[0104]將50微升BCIP/NBT (4_溴_5_氯代吲哚基磷酸鹽/氮藍四唑)溶液注入到該組裝的微流體系統中并在37°C下培育以顯色該信號(大約30分鐘)。該通道隨后用I毫升PBS洗滌。一旦該組件干燥，使用水平辦公掃描儀(HP)進行組裝的微流體系統的圖像采集。在圖7中給出了測得信號與抗配體濃度之間的相互關系。
[0105]實施例4
[0106]在粘性微量滴定板上的寡核苷酸基質(用于定量測定抗配體)
[0107]本發明可以用于分析和定量檢測寡核苷酸序列(參見實施例1)。
[0108]在本實施例中，將配體點樣到粘性載體的表面上并用互補序列的寡核苷酸(抗配體)雜交。生物素-抗生蛋白鏈菌素堿性磷酸酶類型的顯色體系用于信號的比色顯色(colorimetric revelation)
[0109].探針的點樣[0110]預處理
[0111]3M 7966WDL載體用在0.1M的pH5磷酸鹽緩沖液中的1%戊二醛溶液在37°C下預處理I小時。載體隨后用蒸餾水洗滌以準備用于固定該探針。
[0112]
[0113]該配體(合成寡核苷酸(序列表編號1，5’ -氨基酸改性))在鹽水乙酸鹽緩沖液(0.1M乙酸鹽，0.1M KCl,0.25毫克/毫升溴酚藍，pH=5.5)中稀釋已達到50微摩爾/升的最終濃度。使用壓電點樣儀(BioChip Arrayer BCA1, PerkinElmer)將該溶液點樣到3M7966WDL粘合劑的表面上?；自陂_放空氣中在室溫下干燥。制得的斑點具有大約100微米的直徑和每平方毫米I至25個點的斑點密度。
[0114]?組裝
[0115]點樣的粘合劑隨后與無底96-孔板組裝以制造標準用途的固體有底板。該載體的粘性在此是能夠通過在一個挨一個放置的兩個部件上施加溫和壓力而進行簡單組裝所必需的(圖2)。
[0116]?測試
[0117]在PBSTA緩沖液中制備與堿性磷酸酶-抗生蛋白鏈菌素共軛物(I微克/毫升)混合的不同濃度的抗配體(序列表編號2)溶液。在各孔中沉積200微升所得溶液，該整體隨后在點樣表面上在37°C下培育30分鐘。隨后在室溫下用I毫升PBS溶液洗滌該粘性載體。
[0118]?顯色
[0119]100微升BCIP/NBT (4_溴_5_氯代吲哚基磷酸鹽/氮藍四唑)溶液加入到該板的孔中并在37°C下培育以顯色該信號(大約30分鐘)。該孔隨后用I毫升PBS洗滌。
[0120]一旦孔底部干燥，使用水平辦公掃描儀(HP)進行圖像采集。展示了測得信號的強度與抗配體濃度之間的相互關系(圖8)。
【權利要求】
1.復合物，包含: -具有兩個表面的載體，其中一個表面具有粘合劑涂層， -至少一種配體， 所述固體固定在該粘合表面上，其特征在于粘合劑選自壓敏粘合劑如聚丙烯酸酯、硅橡膠、聚乙烯醚，或非反應性粘合劑如苯乙烯-丁二烯共聚物、丁腈橡膠、聚(乙酸乙烯酯)及其聚合物、聚乙烯醇縮乙醛，或反應性粘合劑如雙組分聚氨酯粘合劑、環氧粘合劑、厭氧性丙烯酸類或氰基丙烯酸酯。
2.如權利要求1所要求保護的復合物，其特征在于該配體選自蛋白質、肽、抗體、核酸、糖或寡糖、毒素、殺蟲劑、激素、除草劑、殺真菌劑和神經遞質。
3.如前述權利要求之一所要求保護的復合物，所述粘合表面被官能化，例如通過交聯劑的作用。
4.如權利要求1至3之一所要求保護的復合物，其中該配體被官能化。
5.如前述權利要求之一所要求保護的復合物，其特征在于粘合劑還涂布在該載體的另一表面上。
6.包含剛性載體的分析設備，所述載體包含至少一個限定包含至少兩個孔口的內部腔室的孔，該腔室的所述孔口的至少一個被如權利要求1至5任一項所要求保護的復合物密封。
7.如權利要求6所要求 保護的設備，選自分析板，例如12-、24_或96-孔板或微流體網絡。
8.如權利要求1至5所要求保護的復合物的用途，用于制備如權利要求6和7之一所要求保護的分析設備。
9.制備如權利要求1至5之一所要求保護的復合物的方法，包括下列步驟: a)將該配體稀釋在合適的溶液中，例如鹽水緩沖液； b)將配體溶液沉積到該粘合劑的表面上。
10.如權利要求9所要求保護的制備方法，包括預處理該粘合表面的步驟，例如用交聯劑預處理該粘合表面，該交聯劑如戊二醛。
11.制備如權利要求9或11所要求保護的復合物的方法，包括，例如于室溫，干燥由此沉積的液體的附加步驟C)。
12.如權利要求9至11任一項所要求保護的制備方法，包括加熱、洗滌和/或飽和的附加步驟d)。
13.制備如權利要求6或7所要求保護的設備的方法，包括將如權利要求1至5之一所要求保護的復合物與該載體密封以便封閉該腔室的至少一個所述孔口，該粘合表面包含朝向該腔室內部取向的配體。
14.檢測和/或定量抗配體的方法，包括下列步驟: a)具有如權利要求6或7所要求保護的設備或如權利要求1至5之一所要求保護的復合物， b)在使得配體與抗配體之間相互作用的條件下放置該設備或該復合物以便與可能含有抗配體的樣品接觸，和 c)任選加入標記的檢測分子，d)檢測和/或定量由配體與抗配體之間相互作用產生的信號。
15.如權利要求14所要求保護的檢測和/或定量抗配體的方法，其中該抗配體來自于生物樣品如血清、血液或血漿，環境樣品如水、氣體、空氣或土壤的樣品，或者來自于農產品行業的樣品如食品。
16.如權利要求14和15之一所要求保護的檢測和/或定量抗配體的方法，通過比色法、熒光、化學發光、放射線照相術或放射性的檢測。
【文檔編號】G01N33/543GK103597350SQ201280005398
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年1月12日 優先權日:2011年1月14日
【發明者】本杰明·科爾吉耶, 加埃利·萊戈夫, 席琳·曼東, 洛奇·布盧姆, 克利斯朵夫·馬奎特 申請人:國家科學研究中心, 克勞德貝爾納大學, 法國里昂國立應用科學院