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專利名稱：肌酐診斷試劑盒及肌酐濃度的測定方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種肌酐診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定肌酐濃 度的測定方法，屬于醫(yī)學檢驗測定技術(shù)領域。
背景技術(shù)：
測定肌酐主要有化學測定法(Jaffe法)、酶法、高效液相層析法和 毛細管電泳法等。
化學測定法成本低廉，操作簡便，是目前國內(nèi)測定肌酐最常用的方 法之一。標本中的肌酐與苦味酸鹽作用生成黃紅色的苦味酸肌酐復合 物。此法的缺點是特異性不高，維生素C、丙酮、乙酰乙酸、甲基多 巴以及高濃度葡萄糖、蛋白質(zhì)和一些抗生素如青霉素G、頭孢西丁、 頭孢唑啉等也能與堿性苦味酸反應生成紅色。
高效液相層析法(HPLC),肌酐在弱酸性環(huán)境中帶正電荷，通過陽 離子交換層析柱可與其他成分很好分離，在234nm測定其光吸收。此 法分析的精密度高、特異性好，但本法不適于大批量臨床標本分析， 通常作為肌酐測定的參考方法，用于評價市售肌酐測定的試劑盒和某 些科研目的。檢索發(fā)現(xiàn)，申請?zhí)枮?0106198.0、申請日為1990.12.18 的中國專利申請公開了用高效液相色譜直接測定人尿中假尿嘧啶核苷 (簡稱假尿苷)，再通過分光光度法同時測出肌酐，分別用假尿苷和假
尿苷/肌酐作為鼻咽癌和肺癌的標志物。不過這個專利和本申請無關。 毛細管電泳法，血清標本用高速離心作預處理，尿液標本可用低速
離心，除去有形成分，上清液用膠束動電毛細管電泳分離后測定235nm
處吸光度。本法測定線性范圍寬，操作較為簡便，但需用特殊設備和
進行血清標本的預處理，臨床常規(guī)使用困難。
酶學測定法主要有肌酐脫亞胺酶(Creatinine deiminase )和肌
酐酶(Creatininase)兩大類。
檢索發(fā)現(xiàn)，申請?zhí)枮?2139298.6、申請日為2002. 11. 15的專利
申請公開了應用酶反應產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶配制的測定試劑。該發(fā) 明所指的酶法測定試劑并不加入測定反應所需的還原型煙酰胺輔酶或 其類似物，而加入其反應產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶或其類似物及其相應 的生成還原型輔酶所需的酶和底物系統(tǒng)，通過在試劑內(nèi)形成酶-底物 -NAD或酶-底物-NADP等慢反應系統(tǒng)，將這類氧化型輔酶或其類似物 緩慢循環(huán)還原為還原型煙酰胺輔酶或其類似物，當被還原的還原型煙 酰胺輔酶或其類似物達到一定的濃度時，該發(fā)明所指的酶法試劑就可 達到測定樣本中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、尿素、 氨、肌酐和二氧化碳等的目的。該發(fā)明的特點在于為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移 酶試劑、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、尿素養(yǎng)試劑、氨試劑、肌酐試 劑和二氧化碳試劑等的測試提供一個內(nèi)源合成丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試
劑、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、尿素養(yǎng)試劑、氨試劑、肌酐試劑和 二氧化碳試劑等反應所需要的底物一還原型煙酰胺輔酶。其缺點之一 為，這個系統(tǒng)在生成反應所需要的還原型煙酰氨輔酶的同時，也抵消 了部分丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、尿素、氨、肌酑 和二氧化碳等的活性，造成試劑測試的準確性大大降低。其缺點之二
是，該試劑在正式測試前必須事先反應一段時間，以便能夠產(chǎn)生足夠 的還原型煙酰氨輔酶，這樣一來就造成了緩不濟急的結(jié)果，給測試帶 來很大的不便。
據(jù)申請?zhí)枮?2139298.6、申請日為2002. 11. 15的專利介紹，該 系統(tǒng)由于不斷生成測定所需的NADH或NADPH，從而大大提高了試劑的 穩(wěn)定性，并大大降低試劑的生產(chǎn)成本。其實在試劑中加入NADH或NADPH 的穩(wěn)定劑已經(jīng)不是困難或增加成本的問題，反而比在試劑中增加一個 反應系統(tǒng)要經(jīng)濟得多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計量還原型 煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定 肌酐濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的肌酐診斷 試劑盒，采用該試劑盒不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生 化分析儀上進行肌酐濃度的測定，而且測定速度快、準確度高，因而 可以得到切實的推廣應用。
本發(fā)明肌酐濃度測定方法原理如下-
肌酐+水肌酐脫亞胺酶N-甲基海因+氨離子 氨離子+丙酮酸+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶 L-丙氨酸
+水+輔酶
這種方法應用肌酐脫亞胺酶(creatinine deaminase ; EC 3.5.4.21 )(偶) 聯(lián)丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogenase ; EC 1.4丄1)酶促反應終點 比色法。肌酐脫亞胺酶酶解肌酐反應產(chǎn)生氨離子，再通過(偶)聯(lián)合
丙氨酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧 化成為氧化型輔酶(在340nrn處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型 輔酶在340nm處吸光度下降的程度，通過測量340nm處吸光度下降的 程度，可以測算肌酐濃度的大小。
實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考 慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發(fā)明肌酐診斷試
劑盒較為理想
緩沖液 10Ommoi/L
穩(wěn)定劑 5Ommol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
丙酮酸 16mmol/L
肌酐脫亞胺酶 6000 U/L
丙氨酸脫氫酶 10000 U/L
本發(fā)明的肌酐診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸、肌酐脫亞胺酶、丙氨酸脫氫酶、 還原型輔酶。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑-試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸、還原型輔酶。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、肌酐脫亞胺酶、丙氨酸脫氫酶。 丙酮酸、肌酐脫亞胺酶、丙氨酸脫氫酶、還原型輔酶在試劑1或試
劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解 后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、肌酐脫亞胺酶、丙氨酸脫氫酶。 丙酮酸、肌酐脫亞胺酶、丙氨酸脫氫酶、還原型輔酶在試劑l、試 劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前 加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定肌酐濃度的方法，其還原 型可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的肌酐診斷試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 丙酮酸
肌酐脫亞胺酶 丙氨酸脫氫酶
0.25 mmol/L 16 mmol/L 6000 U/L 畫00U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑； 使用前，加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始 吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測肌酐 樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)，檢測 方法為終點法，延遲時間O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出肌酐濃 度的大小。 實施例二
本實施例的肌酐診斷試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
丙酮酸
10Ommol/L 50 mmol/L
0.25 mmol/L 12 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/
穩(wěn)定劑
肌酐脫亞胺酶 丙氨酸脫氫酶
50 mmol/L 8000 U/L 8000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始 吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測肌酐 樣品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下降 反應)，檢測方法為終點法，延遲時間O分鐘左右，檢測時間5分鐘左 右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出肌酐的 濃度大小。 實施例三
本實施例的肌酐診斷試劑為三試劑，包括
試劑1
緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶
畫mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L
試劑2
緩沖液 穩(wěn)定劑 丙酮酸
勵mmol/L 50 mmol/L 20 mmol/L試劑3
緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
肌酐脫亞胺酶 4000 U/L
丙氨酸脫氫酶 16000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定肌酐濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37°C，反應 時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7,測試主波長340nm,測試副波長 405nm，被測肌酐樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5， 反應方向為負反應(下降反應)，檢測方法為終點法，延遲時間0分鐘 左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出肌酐濃 度的大小。
總之，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分 析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好、不受內(nèi)外源 物質(zhì)的污染，便于推廣應用。
權(quán)利要求
1.一種肌酐濃度測定方法，其方法原理如下id="icf0001" file="A2006100968810002C1.gif" wi="132" he="26" top= "37" left = "38" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的大小程度，測算出肌酐濃度大小測定結(jié)果。
2. —種肌酐診斷試劑盒，主要成分包括緩沖液 20——500 mmol/L 穩(wěn)定劑 1——50mmol/L還原型輔酶 0.1——0.35 mmol/L丙酮酸 2——30mmol/L肌酐脫亞胺酶 2000——12000 U/L丙氨酸脫氫酶 4000——20000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸、肌酐脫亞胺酶、丙氨酸脫氫酶、還原 型輔酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸、肌酐脫亞胺酶、丙氨酸脫氫酶、還原型輔酶組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸、還原 型輔酶組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、肌酑脫亞胺酶、丙氨酸 脫氫酶組成。丙酮酸、肌酐脫亞胺酶、丙氨酸脫氫酶、還原型輔酶 在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述肌酑診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸、肌酐脫亞胺酶、丙氨酸脫氫酶、還原 型輔酶組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶組 成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸組成；試劑3，由緩沖液、 穩(wěn)定劑、肌酐脫亞胺酶、丙氨酸脫氫酶組成。丙酮酸、肌酐脫亞胺 酶、丙氨酸脫氫酶、還原型輔酶在試劑l、試劑2或試劑3中的位 置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定 劑14000 mmol/L或0.P/。-100。/。體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的肌酐診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定肌酐濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學檢驗測定技術(shù)領域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、丙酮酸、肌酐脫亞胺酶、丙氨酸脫氫酶、還原型輔酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的大小程度，從而測算出肌酐的濃度。采用本發(fā)明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結(jié)果。
文檔編號G01N33/70GK101169418SQ20061009688
公開日2008年4月30日 申請日期2006年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月24日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司