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一種食品中百草枯和敵草快殘留量的測定方法
【專利摘要】本發明涉及一種食品中百草枯和敵草快殘留量的測定方法。本發明的樣品前處理是用甲醇水溶液提取食品樣品中的百草枯和敵草快，并選擇C18和PSA分散固相萃取劑對提取液進行凈化，最后結合高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜，通過化合物離子的精確質量數實現食品中殘留百草枯和敵草快的定性和定量測定。百草枯的平均回收率80.6%～96.8%，相對標準偏差為3.9%～7.1%，定量限10μg/kg；敵草快的回收率80.8%～97.3%，相對標準偏差為3.5%～7.8%，定量限10μg/kg。本發明能有效降低食品中百草枯和敵草快殘留檢測中的基質干擾，具有操作簡便、快速、準確、靈敏度高及重復性好的優點，是對已有QuEChERS方法的補充和改進。
【專利說明】一種食品中百草枯和敵草快殘留量的測定方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于農藥殘留量的測定【技術領域】，具體地說涉及一種食品中百草枯和敵草快殘留量的測定方法。
【背景技術】
[0002]在水果、蔬菜、糧谷等農作物種植過程中，農田雜草對農作物產量和品質產生重要影響。除草劑在農業生產中的使用，不僅節省了大量繁重的除草體力勞動和機械除草作業，更重要的是減少了因草害造成的農產品產量和品質的損失，得到可觀的經濟效益。但是隨著人們對食品安全問題的關注，除草劑殘留對人類健康的危害也倍受關注。
[0003]百草枯(paraquat)化學名1，1，- 二甲基_4，4，-聯吡啶陽離子，屬于有機雜環類季銨鹽除草劑。作為廣譜性除草劑應用廣泛，2011年百草枯銷售額在全球除草劑銷售中排名第2。百草枯對人畜具有較強的毒性作用，攝入后對生物體的還原-氧化活性影響很大，對肺、心、肝、腎等都有害，目前百草枯中毒尚無有效治療方法。我國、國際食品法典委員會(CAC)、美國、歐盟和日本等國家對百草枯均制定了殘留限量標準，在水果、蔬菜、魚、肉等多種食品中的最大殘留限量0.01?3.5mg/kg。
[0004]敵草快(diquat)化學名1，1，_乙撐_4，4，_聯吡啶陽離子屬于有機雜環類非選擇性除草劑。用于馬鈴薯、棉花、大豆、玉米、高粱、亞麻、向日葵等作物催枯，當作物成熟時殘余綠色部分和雜草迅速枯干，可以提早收割；用于農田雜草防除:夏玉米免耕除草、果園雜草生長旺盛期進行雜草葉面處理。敵草快對屬于中等毒性除草劑，對皮膚和眼睛有刺激作用。我國、美國、歐盟和日本等國家對敵草快均制定了殘留限量標準，在水果、蔬菜、魚、肉等多種食品中的最大殘留限量0.05?2mg/kg。
[0005]QuEChERS方法作為新發展起來的樣品前處理技術，是代表快速、簡單、價廉、高效、穩定和安全(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)的樣品前處理方法。具有回收率高，分析農藥范圍廣，處理速度快，溶劑使用量少，操作簡便等優點。目前國際廣泛認可使用的QuEChERS方法有歐盟制定的EN15662和美國官方分析化學師協會的A0AC2007.01標準方法。2個方法都包括提取、凈化2個步驟:1用乙腈或含1%乙酸的乙腈提取樣品，通過加入緩沖鹽混合物進行鹽析萃取實現乙腈和樣品所在水相的液-液分離；2用分散固相萃取劑和無水硫酸鎂對提取溶液凈化，分散固相萃取劑依據樣品基質和待測化合物的性質，可選擇PSA、GCB、C18EC等。但都必須加入無水硫酸鎂以除去中乙腈中殘留的水分。
[0006]但是百草枯和敵草快屬于強極性季銨鹽類化合物，極易溶于用水，難以用乙腈從水相中萃取，因此無法采用現有QuEChERS方法進行樣品前處理。通常百草枯及敵草快前處理采用固相萃取柱凈化，方法較復雜，回收率低，對操作人員要求較高；或不經凈化直接檢測，基質干擾大，對儀器污染嚴重。因此尋求和建立適應百草枯和敵草快殘留檢測的QuEChERS前處理方法是非常必要的。

【發明內容】
[0007]本發明的目的是提供一種食品中百草枯和敵草快殘留量的測定方法，以彌補現有技術的不足。
[0008]本發明的另一目的是提供一種樣品前處理方法，以彌補現有國際廣泛認可使用的QuEChERS方法無法用于百草枯和敵草快殘留檢測的不足。
[0009]本發明的樣品前處理是對已有QuEChERS方法的補充和改進，由于百草枯和敵草快極易溶于水的特性，現有QuEChERS方法用乙腈或含I %乙酸的乙腈從水相中鹽析萃取的提取方法無法實用，本發明選用甲醇水溶液為提取溶劑從樣品中直接提取，保證了百草枯的提取效率。在凈化步驟，因為提取溶劑主要是水，所以現有方法加入無水硫酸鎂除以去除提取液中殘余水分的方法并不可行，因此本發明僅使用分散固相萃取劑對提取液進行凈化，而不加入無水硫酸鎂，且分散固相萃取劑只能選擇C18和PSA。
[0010]因此，本發明的檢測，其前處理是首先用甲醇水溶液提取食品樣品中的百草枯和敵草快，再選擇C18和PSA分散固相萃取劑對提取液進行凈化，最后結合高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜(LC-Q T0F)，通過化合物離子的精確質量數實現準確定性和定量分析，以彌補現有技術中對百草枯和敵草快殘留檢測無法使用QuEChERS方法前處理的技術缺陷，達到提高LC-Q TOF檢測的靈敏度，實現食品中百草枯殘留的準確分析。
[0011]本發明的測定方法包括如下步驟:
[0012](I)提取
[0013]稱取均質化的食品樣品于具塞塑料離心管中，加甲醇水溶液渦旋振蕩，離心；
[0014](2)凈化
[0015]移取(I)獲得的上清液于塑料離心管中，加入基質分散固相萃取劑，渦旋振蕩，離心，吸取上清液過0.22 μ m濾膜，所得樣品液待測定；
[0016](3)配制基質標準工作溶液
[0017]將空白樣品按上述步驟(I)、(2)處理，用該空白樣品基質溶液在10?1000 μ g/L范圍內配制百草枯和敵草快系列濃度標準工作液；
[0018](4)液相色譜一四極桿飛行時間串聯質譜(LC-Q T0F)測定
[0019]a)定量測定:將步驟(3)中的各濃度基質標準工作液進行LC-Q TOF測定，以各濃度基質標準工作液的色譜峰面積對其相應濃度進行回歸分析，得到標準工作曲線；在相同條件下將步驟(2)得到的樣品液注入LC-Q TOF進行測定，測得樣品液中目標化合物的色譜峰面積，代入標準曲線，得到樣品液中目標化合物含量，然后根據樣品液所代表試樣的質量計算得到樣品中目標化合物殘留量。
[0020]b)定性測定:檢測步驟(2)得到的樣品液中目標化合物，若其準分子離子色譜峰保留時間與基質標準工作溶液一致；且其準確質量數與濃度相當基質標準溶液中目標化合物的準確質量數的相對標準偏差不超過5ppm時，則判斷該樣品中存在目標化合物；若上述兩個條件不能同時滿足，則判斷不含目標化合物。
[0021]上述步驟(2)中優選甲醇水溶液的體積濃度是20%。。
[0022]上述步驟(2)中基質分散固相萃取劑由C18和PSA組成，每毫升提取液中C18和PSA加入量分別為50mg。
[0023]上述步驟(4)中液相色譜的流動相為A:甲醇和流動相B:含0.1%甲酸-5mmol/L甲酸銨水溶液，采用A:B體積比20:80等度洗脫，流速:0.2mL/min。[0024]上述步驟(4)中液相色譜的色譜柱為親水色譜柱(HILIC)。
[0025]上述步驟(4)中質譜檢測使用電噴霧源(ESI)正離子模式，毛細管電壓為+4000V，霧化氣壓力為275.8kPa，干燥氣為氮氣，干燥氣溫度為350°C，干燥氣流速為10.0L/min，參比離子 m/zl21.050873 與 m/z922.009798，掃描范圍 50_1100m/z。
[0026]上述步驟(4)中質譜檢測使用一級全掃描模式，百草枯準分子離子的準確分子量186.1159，敵草快準分子離子的準確分子量184.3322。
[0027]上述步驟(I)和(2)中的渦旋振蕩時間是lmin。
[0028]上述步驟(I)和(2)中的離心5000r/min,離心時間3?5min。
[0029]上述步驟(I)?(4)中樣品接觸到的包括離心管在內的容器均應為塑料材質制成。
[0030]本發明的有益效果在于:
[0031]本發明能有效降低食品中百草枯和敵草快殘留檢測中的基質干擾，將此前處理方法結合HPLC-Q TOF應用于食品中百草枯和敵草快定性確證和定量檢測，百草枯平均回收率80.6%?96.8%,相對標準偏差(RSD)為3.9%?7.1% ;敵草快的回收率80.8%?97.3%,相對標準偏差(RSD)為3.5%?7.8%。本發明具有操作簡便、快速、準確、靈敏度高及重復性好的優點，是對已有QuEChERS方法的補充和改進。完全能滿足我國和歐盟、美國、日本對相應產品安全檢測的技術要求，將為保障我國人民食品安全及對外出口貿易健康發展提供有力的技術支撐。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為10ng/mL基質標準百草枯提取離子色譜圖。
[0033]圖2百草枯標準質譜圖。
[0034]圖3為10ng/mL基質標準敵草快提取離子色譜圖。
[0035]圖4敵草快標準質譜圖。
【具體實施方式】
[0036]現以以下實施實例來說明本發明，但并不是限制本發明的范圍。
[0037]本發明實施例中使用的儀器與試劑:
[0038]T18Basic 均質器(IKA, Germany) ;CR21G III型高速冷凍離心機(Hitachi, Japan)；MS3型旋渦混合器(IKA, Germany) ; 1200高效液相色譜-6520四級桿飛行時間質譜(Agilent, USA) ；PSA 分散固相萃取劑(Agilent，USA)；C18 分散固相萃取劑(Agilent，USA)。
[0039]試劑:甲醇(HPLC級,Merke, Germany )；甲酸銨(HPLC 級，CNW, Germany );甲酸(HPLC級，CNW, Germany)。
[0040]標準物質:百草枯純度為97.5%，敵草快純度為99.0%，均購自德國DrEhrenstorfer 公司。
[0041]實施例1:蘋果中百草枯和敵草快殘留量的檢測
[0042](I)樣品前處理
[0043]稱取均質化的蘋果樣品10.0g于50mL具塞塑料離心管中，加入IOmL甲醇水溶液，潤旋lmin, 5000r/min離心5min。離心后,取2mL上清提取液至裝有IOOmg C18和IOOmg PSA的離心管中，潤旋lmin, 5000r/min離心3min。取上清液過0.22 μ m濾膜后,所得樣品液供液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜(LC-Q TOF)測定。
[0044](2)標準工作溶液的配制
[0045]分別稱取25±0.1mg百草枯、敵草快標準品于25mL塑料容量瓶中，用乙腈溶解，定容得其標準儲備液濃度1000.0 μ g/mL ;分別移取百草枯和敵草快標準儲備液各1.0mL置于IOOmL塑料容量瓶中，用乙腈定容得到10.0 μ g/mL混合標準中間液；
[0046]用經檢測不含百草枯和敵草快的蘋果作為空白樣品，通過上述前處理步驟制備空白基質溶液，將標準中間液用空白基質溶液稀釋配制成10、20、50、100、200、500、1000ng/mL系列基質標準工作溶液。
[0047](3)液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜(LC-Q T0F)測定
[0048]定量測定:將步驟(3)中的各濃度基質標準工作液進行LC-Q TOF測定，以各濃度基質標準工作液的色譜峰面積對其相應濃度進行回歸分析，得到標準工作曲線；在相同條件下將步驟(2)得到的樣品液注入LC-Q TOF進行測定，測得樣品液中目標化合物的色譜峰面積，代入標準曲線，得到樣品液中目標化合物含量，然后根據樣品液所代表試樣的質量計算得到樣品中目標化合物殘留量。
[0049]其中色譜條件為HILIC色譜柱(2.1mmX 100mm, 1.7 μ m;美國Waters);流動相:甲醇和含0.1%甲酸-5mmol/L甲酸銨水，以體積比20:80等度洗脫；流速:0.2mL/min ；柱溫:30°C ;進樣量:2yL0
[0050]其中質譜參數為:電噴霧源(ESI)正離子模式掃描；干燥氣溫度350°C，干燥氣流速10L/min，霧化氣壓力275 .8kPa，毛細管電壓4kV，毛細管出口電壓190V，掃描方式:一級全掃描，參比離子 m/zl21.050873 與 m/z922.009798，掃描范圍 50_1100m/z。
[0051]定性鑒定:檢測步驟(2)得到的樣品液中目標化合物，若其準分子離子色譜峰保留時間與基質標準工作溶液一致；且其準確質量數與濃度相當基質標準溶液中目標化合物的準確質量數的相對標準偏差不超過5ppm時，則判斷該樣品中存在目標化合物；若上述兩個條件不能同時滿足，則判斷不含目標化合物。
[0052]標準工作曲線和檢出限:
[0053]以基質標準工作溶液的色譜峰面積對其相應濃度進行回歸分析，得到標準工作曲線。以3倍信噪比(S/N)對應的樣品中目標化合物濃度作為檢出限(L0D)，10倍信噪比(S/N)對應的樣品中目標化合物濃度作為定量限(L0Q)，獲得各目標化合物的檢出限和定量限。結果見表1。
[0054]表1百草枯的保留時間、回歸方程、相關系數、定量限和檢出限
[0055]
I保留時間(min) I回歸方程I相關系數I定量限Ug/kg) I檢出限(ug/kg)
百草枯 3.65Y=11019.1307Χ-44748.6835 0.9990 105
敵草快 3.85Υ=5822.0997Χ-45428.5839 0.9992 105
[0056]加標回收率和重復性:
[0057]用經檢測不含百草枯的蘋果作為空白樣品，加入低中高不同濃度水平的百草枯和敵草快混合標準溶液，添加30min后按上述處理步驟進行殘留量測定，將測定濃度與農藥理論添加濃度進行比較，得到農藥添加回收率，每個添加水平平行測定6次，得其相對標準偏差，測定結果見表2。由表2可以看出，在3個加標水平上，百草枯的回收率為80.6%?96.8%,相對標準偏差(RSD)為3.9%?7.1%，敵草快的回收率80.8%?97.3%,相對標準偏差(RSD)為3.5%?7.8%。說明本發明方法的回收率較高，重復性好。
[0058]以上的實施例僅是對本發明的優選實施方式進行描述，并非對本發明的范圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通工程技術對本發明的技術方案作出的各種變型和改進，均應落入本發明的權利要求。
【權利要求】
1.一種食品中百草枯和敵草快殘留量的測定方法，其特征在于包括如下步驟: (1)提取 稱取均質化的食品樣品于具塞塑料離心管中，加甲醇水溶液渦旋振蕩，離心； (2)凈化 移取上述步驟(1)獲得的上清液于塑料離心管中，加入基質分散固相萃取劑，渦旋振蕩，離心，吸取上清液過0.22 μ m濾膜，所得樣品液待測定； (3)配制基質標準工作溶液 將空白樣品按上述步驟(1)、(2)處理，用該空白樣品基質溶液在10~1000 μ g/L范圍內配制百草枯和敵草快系列濃度標準工作液； (4)液相色譜一四極桿飛行時間串聯質譜測定 a)定量測定:將步驟(3)中的各濃度基質標準工作液進行LC-QTOF測定，以各濃度基質標準工作液的色譜峰面積對其相應濃度進行回歸分析，得到標準工作曲線；在相同條件下將步驟(2)得到的樣品液注入LC-Q TOF進行測定，測得樣品液中百草枯和敵草快的色譜峰面積，代入標準曲線，得到樣品液中百草枯和敵草快含量，然后根據樣品液所代表試樣的質量計算得到樣品中百草枯和敵草快殘留量； b)定性測定:檢測步驟(2)得到的樣品液中目標化合物，若其準分子離子色譜峰保留時間與基質標準工作溶液一致；且其準確質量數與濃度相當基質標準溶液中目標化合物的準確質量數的相對標準偏差不超過5ppm時，則判斷該樣品中存在目標化合物；若上述兩個條件不能同時滿足，則判斷不含目標化合物。
2.如權利要求1所述的食品中百草枯和敵草快殘留量的測定方法，其特征是上述步驟(2)中甲醇水溶液的體積濃度為20%。
3.如權利要求1所述的食品中百草枯和敵草快殘留量的測定方法，其特征是上述步驟(2)中基質分散固相萃取劑由C18和PSA組成，每毫升提取液中C18和PSA加入量分別為50mgo
4.如權利要求1所述的食品中百草枯和敵草快殘留量的測定方法，其特征是上述步驟(4)中液相色譜的流動相為A:甲醇和流動相B:含0.1%甲酸-5mmol/L甲酸銨水溶液，采用A:B體積比20:80等度洗脫，流速:0.2mL/min。
5.如權利要求1所述的食品中百草枯和敵草快殘留量的測定方法，其特征是上述步驟(4)中液相色譜的色譜柱為親水色譜柱。
6.如權利要求1所述的食品中百草枯和敵草快殘留量的測定方法，其特征是上述步驟(4)中質譜檢測使用電噴霧源正離子模式，毛細管電壓為+4000V，霧化氣壓力為275.8kPa，干燥氣為氮氣，干燥氣溫度為350°C，干燥氣流速為10.0L/min，參比離子m/zl21.050873與m/z922.009798，掃描范圍 50_1100m/z。
7.如權利要求1所述的食品中百草枯和敵草快殘留量的測定方法，其特征是上述步驟(4)中質譜檢測使用一級全掃描模式，百草枯準分子離子的準確分子量186.1159，敵草快準分子尚子的準確分子量184.3322。
8.如權利要求1所述的食品中百草枯和敵草快殘留量的測定方法，其特征是上述步驟(I)和(2)中的潤旋振湯時間是1min。
9.根據權利要求1所述的前處理方法，其特征是上述步驟(1)和(2)中的離心5000r/min,離心時間3~5min。
10.如權利要求1所述的食品中百草枯和敵草快殘留量的測定方法，其特征是上述步驟（I)~（4)中樣品接觸到的包`括離心管在內的容器均應為塑料材質制成。
【文檔編號】G01N30/06GK103822994SQ201410096085
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月16日 優先權日:2014年3月16日
【發明者】劉靖靖, 王境堂, 吳振興 申請人:劉靖靖