專利名稱：診斷方法
技術領域：
本發明大體上涉及基于免疫學的診斷測定的領域。更具體地，本發明涉及測定細 胞介導的免疫應答反應活性的方法。本發明還涉及用于檢測或監視疾病或病況的細胞介導 的基于免疫應答的測定。
背景技術：
在本說明書中作者提及的公開物的著錄項目按照字母順序排列于說明書末尾。本說明書中對任何現有技術的提及不是且不應該被認為是承認或以任何形式提 議該現有技術在任何國家構成公知常識的一部分。基于免疫學的診斷提供了用于檢測多種疾病狀況的重要工具。鑒于免疫系統內的 成分的特異性，所以情況尤其如此。雖然有此特異性，但是基于免疫學的診斷的靈敏性并不 總是足以檢測低水平的免疫活性，例如響應于低度感染，或者在存在持續低水平感染時。需 要開發具有更高的靈敏性的診斷測定?！N形式的基于免疫學的診斷測定包括，在分離的細胞培養物或全血培養物中以 抗原或有絲分裂原刺激T-細胞，然后檢測效應分子，例如由激活的T-細胞(也稱為效應 T-細胞)產生的細胞因子。一般使用諸如酶免疫測定、多重珠子分析、ELISpot和流式細胞 術等技術檢測效應分子。此類測定對于檢測疾病特異性的T-細胞應答是有用的。在一種形式的測定中，使用全血在相對短的時間段內(通常少于M小時)測定 T-細胞應答。此類測定在診斷肺結核感染中是有用的。但是，這些類型的測定的一個障礙 在于調節性T-細胞(T-reg細胞)(其抑制效應T-細胞應答)的影響。已經開發了需要選 擇性除掉T-reg細胞的方法，但是這是耗時的，降低了定量分析的能力并降低了靈敏性。另 外，這些方法沒有考慮到擴大免疫應答的T-細胞。需要一種改進的基于免疫細胞介導的測定。此類測定可用于檢測或監視受試者中 的多種疾病和病況，并用于監測治療程序。
發明內容
本發明提供了通過增強的效應分子的產生來檢測細胞介導的免疫應答活性的方 法。雖然也可能進行細胞分離和消除步驟，但是本發明的測定可以使用全血進行，無需費 力的細胞分離或消除步驟。本發明的測定顯示出增強的靈敏性。在一個實施方式中，效應 T-細胞和與待測疾病或病況相關的抗原接觸，然后或同時，與調節T-細胞、尤其是τ-reg細 胞活性或功能的試劑接觸。本發明的方法在檢測或監視受試者的疾病或病況，包括疾病或 病況的水平或階段中是特別有用的，所述疾病或病況是例如致病試劑引起的感染、自身免疫病、癌癥和炎性病況。其它病況包括暴露于毒性試劑，例如鈹。本發明的測定還可用于監 測治療程序。因此，本發明的一個方面涉及測定受試者中細胞介導的免疫應答活性的方法，所 述方法包括，將來自受試者的T-細胞來源與調節T-細胞或其子集的功能或活性的試劑以 及抗原接觸，針對該抗原的細胞介導的免疫應答是待測的；并測定來自所述T-細胞的免疫 效應分子的存在或水平的升高，其中所述免疫效應分子的存在或水平是受試者的細胞介導 的響應性水平的指征。本發明的另一個方面提供了用于測定受試者中細胞介導的免疫應答活性的方法， 所述方法包括，將來自受試者的T-細胞來源與調節T-細胞或其子集的功能或活性的試劑 以及抗原接觸，針對該抗原的細胞介導的免疫應答是待測的；并測定來自所述T-細胞的免 疫效應分子的存在或水平的升高，其中所述免疫效應分子的存在或水平是受試者的細胞介 導的響應性水平的指征，其中所述響應性水平是選自下列的疾病或病況的存在、不存在、水 平或階段的指征致病試劑引起的感染、自身免疫病、癌癥、炎性病況和暴露于毒性試劑。本發明的另一個方面涉及檢測受試者中疾病或病況的存在、不存在、水平或階段 的測定法，所述方法包括，將來自受試者的T-細胞來源與調節T-細胞或其子集的功能或 活性的試劑以及抗原接觸，針對該抗原的細胞介導的免疫應答是待測的；并測定來自所述 T-細胞的免疫效應分子的存在或水平的升高，其中所述免疫效應分子的存在或水平是所述 疾病或病況的指征。本發明的另一個方面提供了用于監視對于受試者的疾病或病況的治療程序產生 的響應的方法，所述方法包括，將來自受試者的T-細胞來源與用于該治療程序的試劑接 觸，并測定來自所述T-細胞的免疫效應分子的存在或水平的升高，其中所述免疫效應分子 的存在或水平是所述治療程序的功效的指征。本發明的方法也可以稱為“測定”。本文中的測定尤其可用于評估受試者的一般免 疫響應性，或用于檢測針對特定疾病狀況例如自身免疫病、乳糜瀉、癌癥，或由致病生物體 或試劑引起的感染的響應性。T-細胞的來源方便地是全血，但是本發明涉及使用任何T-細 胞來源，包括含有T-細胞的分級的樣品，以及已經經過細胞分離和/或消除的樣品。任選 地，向反應混合物中加入單糖，例如右旋糖或葡萄糖。提及“全血”包括未經稀釋的全血，以 及以總樣品測定體積(即反應混合物)的大約10%至大約100%的體積在測定中使用的全 血。在具體的實施方式中，通過試劑靶向T-細胞樣品中的τ-reg細胞以進行功能或活 性修飾。修飾可以是抑制具有免疫阻抑功能的T-reg細胞，或者是增加具有免疫刺激功能 的特定細胞。所述試劑的例子包括CD25配體、針對編碼諸如Janus激酶I(JAKl)或酪氨酸 激酶2 (TYK2)的分子的特定基因或mRNA的正義或反義寡核苷酸，以及刺激試劑，例如包含 CpG的寡核苷酸，其通過toll-樣受體(TLR)和/或通過其它機制發揮作用。因此，本發明 提供了 CD25配體、與編碼JAKl或 Κ2分子的遺傳材料(RNA或DNA)互補或同源的寡核苷 酸的用途，其用于擴大或增強免疫細胞介導的測定的靈敏性。本文涉及的寡核苷酸可以具 有修飾的骨架或者具有化學修飾的核苷酸或核苷，例如硫代磷酸酯修飾的寡核苷酸?？梢允褂靡环N類型的試劑，或者可以一起使用兩種或所有三種類型的試劑。受試者可以是人或非人動物。因此，本發明具有人類醫藥、獸醫藥和家畜上的應用。人類代表實施本發明的特別有用的受試者。因此，在具體的實施方式中，本發明涉及用于檢測人類受試者的疾病或病況的存 在、不存在、水平或階段的方法，所述方法包括，將構成反應混合物總體積的至少10%的全 血與抑制調節性T-細胞功能的試劑以及抗原接觸，針對該抗原的細胞介導的免疫應答是 待測的；并測定來自所述T-細胞的免疫效應分子的存在或水平的升高，其中所述免疫效應 分子的存在或水平是所述疾病或病況的指征。試劑盒和皮膚測試也構成本發明的部分內容。在一個實施方式中，樣品是全血，其被收集在含有抗原或向其中加入了抗原的收 集管中以進行溫育。一般而言，血液保持在存在肝素的情況下。肝素可以在加入血液的時 候存在于管中，或者隨后加入肝素。血液收集管的使用與標準的自動化實驗室系統是相容 的，這些易于進行大規模分析和隨機獲得取樣。血液收集管還會使操作損失最小化并減少 實驗室向全血和血漿的暴露，因此，降低了實驗室人員接觸致病試劑例如人類免疫缺陷病 毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)或丙肝病毒(HCV)的風險。此外，相對于以前使用的對孔培養板 而言，使用收集管進行溫育賦予了測定更高的靈敏性。本發明提供了加強的細胞介導的免疫測定，因此，在一個實施方式中，包括使用收 集管，任選地包括單糖例如右旋糖和與抗原及調節T-細胞功能或活性的試劑一起溫育的 步驟。所述溫育步驟通常是大約5至大約50小時。免疫效應分子一般是細胞因子，例如但不限于IFN- γ或白細胞介素(例如IL-2、 IL-4、IL-6、IL-10、IL-12或IL13，或轉化生長因子β [TGFi3 ]，或粒細胞集落刺激因子 [G-CSF]或粒細胞巨噬細胞集落刺激因子[GM-CSF])。可以在分子自身的水平上或者編碼 該分子的基因表達的程度上測定免疫效應分子的存在或水平。詳細描述在本說明書全文中，除非上下文另有需要，否則詞語〃包含(comprise)“或其變 體例如〃包含(comprises)“或〃包含(comprising)“應理解為暗示包括指明的元素或 整體或元件或整體的集合，但不排除任何其它的元素或整體或元件或整體的集合。除非另有指明，否則本發明不限于特定的測定成分、生物材料或反應試劑等，因為 它們是可變的。還應該理解，本文使用的術語僅僅是為了描述具體實施方式
，不是為了限 制。必須注意，本說明書中使用的單數形式〃 一個(a)“、“ 一個(an)“和〃該 (the)“包括復數形式，除非上下文另有明確說明。因此，例如，提及“T-細胞”包括單個 T-細胞，還包括兩個或更多個T-細胞；提及“效應分子”包括單個效應分子，還包括兩個或 更多個效應分子；提及“本發明”包括本發明的單個或多個方面；等等。本文使用的術語例如“試劑”、“反應試劑”、“化合物”和“細胞”是指化學或生物實 體，其參與檢測細胞介導的應答或此類應答的水平的測定中。提及“試劑”、“反應試劑”、“化合物”和“細胞”還包括兩個或更多個此類實體的組 合?！敖M合”還包括多部分的例如兩部分的組合物，其中分開地提供試劑并分開地使用或分 散，或者在分散前混合在一起。例如，多部分的測定包(multi-part assay pack)可以具有 分開保持的兩個或更多個試劑。因此，本發明的這個方面包括這樣的抗原和T-細胞調節 劑，它們是干燥的并且松散的，或者固定于測定包中的腔室壁或固體載體上。
本發明部分基于增加從刺激的T-細胞產生效應分子。這能夠得到評估受試者的 細胞介導的免疫響應性的更靈敏的測定。因此，本發明提供了通過測定從目標抗原刺激的 效應T-細胞產生的效應分子的存在或水平來檢測、評估或監視受試者中的細胞介導的應 答的測定，所述抗原是例如與疾病或病況相關的抗原。T-細胞或T-細胞的子集與調節T-細 胞功能或活性的試劑、尤其是調節τ-reg細胞功能或活性的試劑接觸。一般而言，所述試劑 抑制T-reg細胞的阻抑功能。因此，本發明提供了測定受試者中細胞介導的免疫活性的響 應性的方法，進而提供了用于診斷感染性疾病、致病性狀況、免疫能力水平和針對內源性或 外源性抗原的T-細胞響應性的標志物以及評估暴露于毒性試劑例如鈹的方法。因此，本發明的一個方面涉及用于測定受試者中細胞介導的免疫應答活性的方 法，所述方法包括，將來自受試者的T-細胞來源與調節T-細胞或其子集的功能或活性的試 劑以及抗原接觸，針對該抗原的細胞介導的免疫應答是待測的；并測定來自所述T-細胞的 免疫效應分子的存在或水平的升高，其中所述免疫效應分子的存在或水平是受試者的細胞 介導的響應性水平的指征。本發明的另一個方面提供了用于測定受試者中細胞介導的免疫應答活性的方法， 所述方法包括，將來自受試者的T-細胞來源與調節T-細胞或其子集的功能或活性的試劑 以及抗原接觸，針對該抗原的細胞介導的免疫應答是待測的；并測定來自所述T-細胞的免 疫效應分子的存在或水平的升高，其中所述免疫效應分子的存在或水平是受試者的細胞介 導的響應性水平的指征，其中所述響應性水平是選自下列的疾病或病況的存在、不存在、水 平或階段的指征致病試劑引起的感染、自身免疫病、癌癥、炎性病況和暴露于毒性試劑。本發明的另一個方面涉及檢測受試者中疾病或病況的存在、不存在、水平或階段 的測定法，所述方法包括，將來自受試者的T-細胞來源與調節T-細胞或其子集的功能或 活性的試劑以及抗原接觸，針對該抗原的細胞介導的免疫應答是待測的；并測定來自所述 T-細胞的免疫效應分子的存在或水平的升高，其中所述免疫效應分子的存在或水平是所述 疾病或病況的指征。還提供了調節T-細胞或T-細胞子集的功能或活性的試劑用于制備診斷測定的用 途，所述診斷測定通過將抗原或有絲分裂原與包含T-細胞的材料一起溫育并且檢測效應 分子的存在或升高來測定細胞介導的免疫響應性。這種用途包括用于檢測或監視以下疾病或病況的存在、不存在、水平或階段致病 試劑引起的感染、自身免疫病、癌癥、炎性病況和/或暴露于毒性試劑，例如鈹。提及T-細胞功能或活性的調節包括對調節性T-細胞(T-reg細胞)的調節。更 具體地，其包括抑制T-reg細胞的阻抑功能。此外，測定“免疫效應分子”包括測定一種或 多種不同類型的分子。調節T-reg細胞的試劑也包括在本文中，例如CD25配體；針對編碼 JAKl或 Κ2的遺傳材料的正義或反義寡核苷酸；包含CpG的寡核苷酸；作為TLR調節劑的 寡核苷酸；以及其它TLR調節劑。本發明的另一個方面提供了測定受試者中細胞介導的免疫應答活性的方法，所述 方法包括，將來自受試者的T-細胞來源與調節調節性T-細胞或其子集的功能或活性的試 劑以及抗原接觸，針對該抗原的細胞介導的應答是待測的；并測定來自所述T-細胞的免疫 效應分子的存在或水平的升高，其中所述免疫效應分子的存在或水平是受試者的細胞介導 的響應性水平的指征。
本發明的另一個方面提供了用于測定受試者中細胞介導的免疫應答活性的方法， 所述方法包括，將來自受試者的T-細胞來源與調節調節性T-細胞或其子集的功能或活性 的試劑以及抗原接觸，針對該抗原的細胞介導的免疫應答是待測的；并測定來自所述T-細 胞的免疫效應分子的存在或水平的升高，其中所述免疫效應分子的存在或水平是受試者的 細胞介導的響應性水平的指征，其中所述響應性水平是選自下列的疾病或病況的存在、不 存在、水平或階段的指征致病試劑引起的感染、自身免疫病、癌癥、炎性病況和暴露于毒性 試齊LU本發明的另一個方面涉及檢測受試者中疾病或病況的存在、不存在、水平或階段 的測定法，所述方法包括，將來自受試者的T-細胞來源與調節調節性T-細胞或其子集的功 能或活性的試劑以及抗原接觸，針對該抗原的細胞介導的免疫應答是待測的；并測定來自 所述T-細胞的免疫效應分子的存在或水平的升高，其中所述免疫效應分子的存在或水平 是所述疾病或病況的指征。在具體的實施方式中，T-reg細胞是活性被抑制的免疫應答阻抑細胞。因此，在一個實施方式中，本發明涉及用于測定受試者中細胞介導的免疫應答活 性的方法，所述方法包括，將來自受試者的調節性T-細胞來源與選自下列的試劑接觸(i) 阻抑性調節性T-細胞的抑制劑；和(ii)免疫增強細胞或其子集的激活劑；然后將所述 T-細胞與抗原接觸，針對該抗原的細胞介導的應答是待測的；并測定來自所述T-細胞的免 疫效應分子的存在或水平的升高，其中所述免疫效應分子的存在或水平是受試者的細胞介 導的響應性水平的指征。另一個實施方式提供了測定受試者中細胞介導的免疫應答活性的方法，所述方法 包括，將來自受試者的調節性T-細胞來源與選自下列的試劑接觸(i)阻抑性調節性τ-細 胞的抑制劑；和(ii)免疫增強細胞或其子集的激活劑；然后將所述T-細胞與抗原接觸，針 對該抗原的細胞介導的應答是待測的；并測定來自所述T-細胞的免疫效應分子的存在或 水平的升高，其中所述免疫效應分子的存在或水平是疾病或病況的存在、不存在、水平或階 段的指征。在相關的實施方式中，提供了選自⑴阻抑性調節性T-細胞的抑制劑；和(ii)增 強免疫系統的細胞或其子集的激活劑的試劑用于制備診斷測定的用途，所述診斷測定通過 將抗原或有絲分裂原與包含T-細胞的材料一起溫育并檢測效應分子的存在或升高來測定 細胞介導的免疫響應性。提及“受試者”包括人類或非人類物種，包括靈長類、家畜動物(例如綿羊、牛、豬、 馬、驢、山羊)、實驗室試驗動物(例如小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、倉鼠)、寵物(例如狗、貓)、鳥 類(例如家禽、觀賞鳥類)、爬行動物和兩棲動物。因此，本發明具有人類醫藥上的應用，以 及家畜和獸醫和野生動物上的應用。但是，最優選地，受試者是人類并且細胞介導的免疫應 答測定具有以下應用篩選針對致病微生物、病毒和原生動物的響應性、產生自身免疫病、 乳糜瀉的潛在可能，或監視自身免疫病、乳糜瀉，以及用于監視受試者對腫瘤挑戰的響應。免疫效應分子可以是響應于細胞激活或抗原刺激所產生的多種分子中的任意 種。雖然干擾素(IFN)例如IFN-Y是特別有用的免疫效應分子，但其它的還包括多種細 胞因子，例如白細胞介素(IL)，例如IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12或IL13，腫瘤壞死因 子α (TNF-α)、轉化生長因子β (TGF-β )，集落刺激因子(CSF)，例如粒細胞集落刺激因子(G-CSF)或粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，另外還有許多其它的，例如補體或補 體途徑中的成分。T-reg功能的抑制劑或調節劑的例子包括⑶25配體，例如但不限于⑶25的多克 隆或單克隆抗體或其抗原結合片段，CD25的人源化的或去免疫化的多克隆或單克隆抗體， 或重組或合成形式的多克隆或單克隆抗體。所述試劑的其它例子包括針對編碼Jarms酪 氨酸激酶1 (JAKl)或酪氨酸激酶2 (TYK2)的mRNA或DNA (即遺傳材料)的正義或反義核 酸分子，或JAKl或 Κ2蛋白的小分子抑制劑。提及“小分子”包括如國際專利公開號WO 2005/1186 中描述的免疫球蛋白新抗原受體(IgNAR)。合適的試劑的其它例子有，刺激試 劑，例如CpG分子，其通過Toll-樣受體(TLR)和/或其它機制發揮作用。因此，包含CpG 的寡核苷酸和作為TLR調節劑的寡核苷酸也構成本發明的一部分。可以使用單一類型的試劑，或者可以應用兩種或更多種類型的試劑。例如，可以使 用⑶25配體和JAK1/ITK2正義或反義寡核苷酸；⑶25配體和TLR調節劑；JAK1/ITK2正義 或反義寡核苷酸和TLR調節劑；或CD25配體、JAK1/TYK2正義或反義寡核苷酸和TLR調節 劑進行測定?；蛘?，僅應用一種類型的試劑。在另一個替代性實施方式中，使用包含CpG的 寡核苷酸和TLR調節劑?？梢詫押塑账徇M行修飾，例如具有化學修飾的骨架，例如含磷骨架和/或化學 修飾的核苷或核苷酸。因此，本發明的另一個方面提供了測定受試者中細胞介導的免疫應答活性的方 法，所述方法包括，將來自受試者的T-細胞來源與調節T-細胞或其子集的功能或活性的 CD25配體以及抗原接觸，針對該抗原的細胞介導的免疫應答是待測的；并測定來自所述 T-細胞的免疫效應分子的存在或水平的升高，其中所述免疫效應分子的存在或水平是受試 者的細胞介導的響應性水平的指征。本發明的另一個方面提供了測定受試者中細胞介導的免疫應答活性的方法，所述 方法包括，將來自受試者的τ-細胞來源與調節T-細胞或其子集的功能或活性的針對JAKl 和/或 Κ2遺傳材料的正義或反義寡核苷酸以及抗原接觸，針對該抗原的細胞介導的免疫 應答是待測的；并測定來自所述T-細胞的免疫效應分子的存在或水平的升高，其中所述免 疫效應分子的存在或水平是受試者的細胞介導的響應性水平的指征。本發明的另一個方面提供了測定受試者中細胞介導的免疫應答活性的方法，所述 方法包括，將來自受試者的τ-細胞來源與調節T-細胞或其子集的功能或活性的CpG分子 以及抗原接觸，針對該抗原的細胞介導的免疫應答是待測的；并測定來自所述T-細胞的免 疫效應分子的存在或水平的升高，其中所述免疫效應分子的存在或水平是受試者的細胞介 導的響應性水平的指征。"CpG分子”意思是包含CpG序列或基序的寡核苷酸。本發明延伸至Toll-樣受體 (TLR)功能或免疫系統的其它方面的任何調節劑。因此，本發明延伸至選自⑶25配體、針對編碼JAKl或 Κ2的遺傳材料的正義或 反義核酸分子、和免疫刺激試劑(例如包含CpG的寡核苷酸，其通過TLR和/或其它機制發 揮作用)的試劑用于制備診斷測定的用途，所述診斷測定通過將抗原或有絲分裂原與包含 T-細胞的材料一起溫育并檢測效應分子的存在或升高來測定細胞介導的免疫響應性。這些方面包括使用上述的特定試劑用于檢測受試者的疾病或病況的存在、不存在、水平或階段，所述疾病或病況是例如致病試劑引起的感染、自身免疫病、癌癥、炎性病 況、或暴露于毒性試劑，例如鈹。試劑，例如CD25配體、反義分子和CpG分子可以自由地存在于反應管中，或者固定 于固體載體，例如珠子或反應管的側壁或底部。試劑還可以是干燥的形式，其在使用前或使 用過程中復原。類似地，抗原可以自由地存在于或者固定于反應管中，例如固定于反應管本 身或珠子或其它固體載體上。在一個實施方式中，從受試者收集的樣品一般置于血液收集管中。血液收集管包 括采血管或其它類似的管。方便地，當樣品是全血時，所述血液收集管是肝素化的?；蛘?， 在采集血液之后向管中加入肝素。雖然特別考慮到全血作為最方便的樣品，但本發明延伸 至其它包含免疫細胞的樣品，例如淋巴液、腦液、組織液和呼吸液，包括鼻和肺液，以及經過 細胞消除的樣品。提及“全血”包括未經稀釋的全血，例如使用組織培養基、介質、試劑、賦 形劑等稀釋。在一個實施方式中，術語“全血”包括這樣的測試樣品(即反應混合物)，其包 含至少10%體積的全血。術語“至少10%體積”包括反應混合物總測定體積的10，11，12， 13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37， 38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62， 63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87， 88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99和100%體積的血液體積。不脫離包含“全血，，的 樣品，可以加入另外的試劑，例如培養基、酶、賦形劑、抗原等。血液收集管的使用與標準的自動化實驗室系統是相容的，這些易于進行大規模分 析和隨機獲得取樣。血液收集管還會使操作損失最小化并減少實驗室向全血和血漿的暴 露，因此，降低了實驗室人員接觸致病試劑，例如HIV、乙肝病毒(HBV)或丙肝病毒(HCV)的 風險。將溫育步驟與收集管組合在一起是特別有效的，并且增強了測定的靈敏性，如在 存在樣品糖例如右旋糖或葡萄糖的情況下溫育細胞的可選特征一樣。在從受試者中采血之后延長的時間段后，細胞介導的免疫系統的細胞喪失引發全 血中的免疫應答的能力，并且在采血后M小時，不受破壞的應答經常被嚴重減弱或者不存 在。人力和特定塑料器皿需求的減少允許在護理地點(例如醫生辦公室、診所、門診機構和 獸醫診所或農場)進行以抗原刺激細胞介導的免疫。一旦完成抗原刺激，則不再存在對新 鮮和活性細胞的需求。IFN-γ和其它細胞因子或免疫效應分子在血漿中是穩定的，因此，可 以儲存或運輸樣品，無需類似于那些用于其它感染性疾病或其它疾病診斷中的標準血清樣 品的特定條件或迅速的時間要求。溫育步驟可以是5至50小時，例如5至40小時或8至M小時，或之間的時間段， 包括 5,6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30， 31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49 或 50 小時。能測定細胞介導的免疫力對于評估受試者針對致病試劑(例如微生物或病毒或 原生動物)引起的感染作出響應、引發自身免疫應答(例如自身免疫性糖尿病中的)或提 供抵抗癌癥或其它腫瘤病況的保護的能力，或檢測炎性病況，或檢測受試者對于毒性試劑 例如鈹的暴露或對其的敏感性具有重要意義。相應地，提及“測定受試者中細胞介導的免 疫應答”包括感染性和自身免疫病的免疫診斷、免疫能力標志物和針對內源性或外源性抗原的T-細胞應答的檢測(包括測定疫苗功效)，以及炎性疾病、癌癥的標志物和毒性試劑。 重要的是，通過抑制阻抑性T-reg細胞或者刺激增強免疫系統的細胞，會增大所述測定的 靈敏性。因此，現在可以檢測例如低水平的感染。致病性或感染性試劑包括細菌、原生動物和病毒。細菌的例子包括革蘭氏陽性和 革蘭氏陰性微生物，例如分支桿菌屬(Mycobacterium)、葡萄球菌屬Staphylococcus)、鏈 球菌屬(Streptococcus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌屬(Salmonella)、梭 菌屬(Clostridium)、志賀氏菌屬(Shigella)、變形菌屬(Proteus)、桿菌屬(Bacillus)、 嗜血桿菌屬(Hemophilus)、包柔氏螺旋體菌屬(Borrelia)等。結核分支桿菌 (Mycobacteriumtuberculosis)是特別有用的試劑，以及由于結核分支桿菌感染引起的病 況，例如肺結核(TB)。病毒的例子包括肝炎病毒(乙肝病毒和丙肝病毒)、皰疹病毒和人 類免疫缺陷病毒(HIV)以及由其引起的疾病。原生動物包括瘧原蟲屬(Plasmodium)、癬菌 (Ringworm)、肝臟原生動物等。其它致病性試劑包括真核細胞，例如酵母和真菌。本文涉及的要檢測的自身免疫病尤其包括斑禿、強直性脊柱炎、抗磷脂綜合 征、自身免疫性艾迪森氏病、多發性硬化、腎上腺的自身免疫病、自身免疫性溶血性貧血、 自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睪丸炎、白塞病、大皰性類天皰瘡、心肌癥、口炎性 腹瀉-皮炎、慢性疲勞綜合征(CFIDS)、慢性炎癥性脫髓鞘、慢性炎癥性多發性神經病、 Churg-Strauss綜合征、瘢痕性類天皰瘡、crest綜合征、冷凝集素病、克羅恩病、皰疹樣皮 炎、盤狀狼瘡、原發性混合型冷球蛋白血癥、纖維肌痛、腎小球性腎炎、格雷氏癥、格林-巴 利綜合征、橋本氏甲狀腺炎、特發性肺纖維化、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、IgA腎病、 胰島素依賴性糖尿病(I型)、扁平苔蘚、狼瘡、梅尼埃病、混合性結締組織病、多發性硬化、 重癥肌無力、心肌炎、尋常性天皰瘡、惡性貧血、結節性多動脈炎、多軟骨炎、多腺體綜合征、 風濕性多肌痛、多發性肌炎與皮肌炎、原發性無丙種球蛋白血癥、原發性膽汁性肝硬化、牛 皮癬、雷諾氏現象、賴特綜合征、風濕熱、風濕性關節炎、肉狀瘤病、硬皮病、干燥綜合癥、僵 人綜合征、系統性紅斑狼瘡、高安氏動脈炎、顳動脈炎/巨細胞動脈炎、潰瘍性結腸炎、葡萄 膜炎、脈管炎和白癲風。一般而言，在這些個體中評估潛在的或真實的細胞介導的響應性具有重要意義。 本發明的方法還可用于檢測這些病況的存在或不存在以及疾病進展的水平或階段。涉及的其它疾病病況包括炎性疾病病況。本發明涉及的炎性疾病病況的例子包括但不限于導致產生發紅、腫脹、疼痛，以及 某些區域的熱感的疾病和病癥，其是為了保護受損傷或疾病影響的組織?？梢允褂帽景l 明的方法治療的炎性疾病包括但不限于，痤瘡、心絞痛、關節炎、吸入性肺炎疾病、積膿癥、 腸胃炎，炎癥、腸炎、NEC、壞死性小腸結腸炎、盆腔炎、咽炎、PID、胸膜炎、喉嚨發炎、發紅 (redness)、發紅(rubor)、喉嚨痛、胃炎和尿道感染、慢性炎癥性脫髓鞘性多發性神經病、慢 性炎癥性脫髓鞘性多發性神經根性神經病，慢性炎癥性脫髓鞘性多發性神經病，慢性炎癥 性脫髓鞘性多發性神經根性神經病。癌癥治療在一定意義上也依賴于細胞介導的免疫力。本文涉及的癌癥包括特征 在于失控的細胞生長(即形成腫瘤)(那些細胞不進行分化成特化和不同細胞的任何分化) 的一組疾病和病癥。此類疾病和病癥包括ABLl原癌基因、AIDS相關的癌癥、聽神經瘤、急 性淋巴細胞性白血病、急性髓性白血病、腺樣囊性癌、腎上腺皮質癌、原因不明性骨髓化生(agnogenic myeloid metaplasia)、脫發、肺泡軟組織肉瘤、肛門癌、血管肉瘤、再生障礙性 貧血、星形細胞瘤、共濟失調毛細血管擴張癥、基底細胞癌(皮膚)、膀胱癌、骨癌、腸癌、腦 干膠質瘤、腦和中樞神經系統腫瘤、乳腺癌、中樞神經系統腫瘤、類癌腫瘤、宮頸癌、兒童腦 腫瘤、兒童癌癥、兒童白血病、兒童軟組織肉瘤、軟骨肉瘤、絨毛膜癌、慢性淋巴細胞性白血 病、慢性髓性白血病、結腸直腸癌、皮膚T-細胞淋巴瘤、隆突性皮膚纖維肉瘤、促纖維增生 性小圓形細胞腫瘤、導管癌、內分泌癌、子宮內膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤文氏肉瘤、肝外膽 管癌、眼癌、眼睛黑色素瘤、視網膜母細胞瘤、輸卵管癌、范可尼貧血、纖維肉瘤、膽囊癌、胃 癌、胃腸癌、胃腸類癌腫瘤、泌尿生殖系統癌癥、生殖細胞瘤、妊娠-滋養細胞疾病、神經膠 質瘤、婦科癌癥、血液系統惡性腫瘤、毛細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、遺傳性乳腺癌、組 織細胞增生癥、何杰金氏病、人乳頭狀瘤病毒、葡萄胎、高鈣血癥、下咽癌、眼內黑色素瘤、胰 島細胞癌、卡波西氏肉瘤、腎癌、朗格漢斯細胞-組織細胞增生癥、喉癌、平滑肌肉瘤、白血 病、Li-Fraumeni綜合征、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴水腫、淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、非 何杰金淋巴瘤、男性乳腺癌、腎惡性橫紋肌樣瘤、髓母細胞瘤、黑色素瘤、merkel細胞癌、間 皮瘤、轉移性癌、口癌、多發性內分泌腫瘤、蕈樣肉芽腫、骨髓增生異常綜合征、骨髓瘤、骨髓 增生性疾病、鼻癌、鼻咽癌、腎母細胞瘤、神經母細胞瘤、神經纖維瘤病、奈梅亨斷裂綜合征、 非黑色素瘤皮膚癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、眼癌、食道癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、造口術 卵巢癌、胰腺癌、副鼻竇癌、副甲狀腺癌、腮腺癌、陰莖癌、外周性神經外胚層腫瘤、垂體癌、 真性紅細胞增多癥、前列腺癌、稀少癌癥和相關病癥、腎細胞癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉 瘤、羅特穆德-湯姆遜綜合癥、唾液腺癌、肉瘤、神經鞘瘤、Sezary綜合征、皮膚癌、小細胞肺 癌(SCLC)、小腸癌、軟組織肉瘤、脊髓腫瘤、鱗狀細胞癌(皮膚)、胃癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸 腺癌、甲狀腺癌、移行細胞癌(膀胱)、移行細胞癌(腎-骨盆-輸尿管)、滋養細胞癌、尿道 癌、泌尿系統癌、uroplakins、子宮肉瘤、子宮癌、陰道癌、外陰癌、瓦爾登斯特氏巨球蛋白血 癥禾口 Wilms瘤。多種抗原中的任意個可用于測定中，例如那些對特定生物、病毒、自身抗原或癌細 胞特異性的。或者，更加一般性的試劑可用于測試細胞介導的免疫應答的一般能力，此類試 劑包括有絲分裂原。后者的例子包括來自結核分支桿菌的純化的蛋白衍生物(PPD)和破傷 風類毒素。但是，一般而言，任意的肽、多肽或蛋白、碳水化合物、糖蛋白、磷脂、磷蛋白或磷 脂蛋白或非蛋白類化學試劑可以用于測定系統中作為抗原或有絲分裂原。如上所述，免疫效應分子的檢測可以在蛋白或磷酸水平進行。因此，提及免疫效應 分子的“存在或水平”包括直接的和間接的數據。例如，高水平的細胞因子mRNA是顯示細 胞因子水平升高的間接數據。免疫效應分子的配體在檢測和/或定量這些分子中是特別有用的。針對免疫效應 分子的抗體是特別有用的。本文涉及的測定的技術是本領域已知的，并且包括，例如，放射 免疫測定、夾心式測定、ELISA和ELISpot。提及“抗體”包括抗體的部分、哺乳動物源化(例 如人源化)抗體、去免疫化抗體、重組或合成的抗體，以及混雜和單鏈抗體。對于人類中的 皮試而言，本文中特別考慮到人源化或去免疫化抗體用于檢測效應分子。多克隆和單克隆抗體都可通過使用免疫效應分子或其抗原性片段進行免疫來獲 得，每種均可用于免疫測定。獲得這兩種類型的血清的方法是本領域熟知的。多克隆血清 優選性較低，但是可以通過使用有效量的免疫效應分子或其抗原性部分注射合適的實驗動物、從該動物收集血清并通過任意已知的免疫吸附技術分離特異性血清來相對容易地制 備。雖然通過該方法制備的抗體實質上可用于任意類型的免疫測定，但是它們一般不是優 選的，因為產品具有潛在的異質性。單克隆抗體用于免疫測定是特別有用的，因為能夠大量地生產它們，并且產品具 有同質性。可以通過本領域技術人員熟知的技術來制備用于生產單克隆抗體的雜交瘤細胞 系，其衍生自無限增殖細胞系與針對免疫原性制劑致敏的淋巴細胞的融合。因此，本發明的另一個方面涉及用于檢測來自受試者的包含T-細胞的樣品中的 免疫效應分子的方法，所述方法包括，將樣品或樣品的等分試樣與對于免疫效應分子或其 抗原性片段特異性的抗體在足以形成抗體-效應分子復合物的條件下接觸一段時間，然后 檢測該復合物，其中在抗原與T-細胞和調節調節性T-細胞功能的試劑一起溫育之后產生 所述免疫效應分子?！皹悠贰卑ㄈ蚱浣M分。該方法包括在平坦的或球形的固體載體上的微陣列和 巨陣列。微陣列或巨陣列是有用的。多種免疫測定技術是可獲得的，可以參見美國專利號4，016，043,4, 424，279和 4，018，653。以下描述了一種類型的測定。將未經標記的抗體固定于固體基質上，將樣品(其 免疫效應分子(例如細胞因子)是待測的)與結合分子接觸。溫育適當的時間段后(足 以允許形成抗體-免疫效應分子復合物的時間段)，加入對效應分子特異性的第二抗體并 且溫育，所述第二抗體上標記了能夠產生可檢測信號的報告分子，溫育時間為允許形成抗 體-效應分子-標記抗體的另一種復合物。洗掉任何未反應的材料，通過觀察報告分子產 生的信號來測定效應分子的存在。結果可以是定性的——僅僅通過簡單觀察可視信號；也 可以是定量的——通過與含有已知數量抗原的對照樣品進行比較。這種一般化的技術對于 本領域技術人員是熟知的，其可以是多個變體中的任意項。在這些測定中，將對于免疫效應分子具有特異性的第一抗體共價地或被動地結合 至固體表面。所述固體表面通常是玻璃或聚合物，最常使用的聚合物是纖維素、聚丙烯酰 胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固體載體可以是管、珠子、球、微平板圓盤的形式， 或任何其它適合于進行免疫測定的表面。結合方法是本領域熟知的，一般由下列組成交 聯、共價結合或物理吸附，洗滌聚合物-抗體復合物以準備用于測試樣品。然后向固相復合 物中加入待測樣品的等分試樣，并在適當的條件下(例如，在大約20°C至大約40°C)溫育 足夠長的時間段(例如，2-120分鐘，或更方便的是過夜溫育)以允許抗體中存在的任何亞 基的結合。溫育結束之后，洗滌并干燥抗體亞基固相，并與對于效應分子的一部分具有特異 性的第二抗體一起溫育。所述第二抗體連接至報告分子，所述報告分子用于指示所述第二 抗體與所述效應分子的結合。這種測定具有很多變體。一種特別有用的變體是同時測定，其中將所有的成分或 很多的成分基本上同時混合。此外，可以通過針對所述第一抗體的標記抗體的結合來測定 抗體與細胞因子的結合。本說明書中使用的“報告分子”意思是通過其化學性質提供分析型可鑒定信號的 分子，所述信號允許檢測與抗原結合的抗體。檢測可以是定性的或定量的。這種類型的測定 中最常使用的報告分子是酶、熒光團或包含放射性核的分子(例如放射性同位素)和化學發光分子。表1中提供了合適的熒光團的例子。在酶免疫測定的情形中，一般通過戊二醛 或高碘酸鹽將酶綴合至第二抗體。但是，可以容易地認識到，存在多種不同的綴合技術，技 術人員可以輕易獲得這些技術。通常使用的酶包括辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β -半 乳糖苷酶和堿性磷酸酶等。與特異性酶一起使用的底物一般選擇為，經過相應的酶水解之 后，產生可檢測的顏色變化。合適的酶的例子包括堿性磷酸酶和過氧化物酶。除了如上所 述的發色底物，還可以使用產生熒光的底物，其產生熒光產物。在所有的情況中，向第一抗 體-抗原復合物中加入酶標記的抗體，使其結合，然后洗掉過量的試劑。然后向抗體-抗 原-抗體復合物中加入含有合適底物的溶液。底物將與連接至第二抗體的酶反應，產生定 性的可視信號，通常通過分光光度法可進一步定量測定所述信號，以給出存在于樣品中的 抗原數量的指征。本發明同樣延伸至基本上同時的測定。或者，可以將熒光化合物(例如熒光素和若丹明)化學地偶聯至抗體，但不改變抗 體的結合能力。當使用特定波長的光照射使其激活時，熒光色素標記的抗體吸收光能，使分 子的狀態誘導為可激發性，然后發射可以使用光學顯微鏡可視檢測的特征性顏色的光。使 熒光標記的抗體與第一抗體-抗原復合物結合。洗掉未結合的試劑后，將剩余的三元復合 物暴露于合適波長的光，觀察到的熒光指示目標抗原的存在。免疫熒光和酶免疫測定技術 在本領域都是非常完善的，對于本發明的方法是特別優選的。但是，也可以使用其它報告分 子，例如放射性同位素、化學發光或生物發光分子。存在多種可以利用的其它檢測系統，包括膠體金，所有這樣的檢測系統都包含在 本發明中。本發明還涉及遺傳測定，例如涉及PCR分析，以檢測編碼免疫效應分子的遺傳序 列的RNA表達產物。在一個實施方式中，使用引物對進行PCR，一般使用能夠產生可區分的信號的相同 或不同報告分子來標記所述引物對中的一個引物或兩個引物。使用熒光團對于本發明的實 施是特別有用的。合適的熒光團的例子可以選自表1的列表。其它標記物包括發光和磷光 以及紅外染料。這些染料或熒光團還可用作抗體的報告分子。表1.合適的熒光團的列表
權利要求
1.用于測定受試者中細胞介導的免疫應答活性的方法，所述方法包括，將來自受試者 的T-細胞來源與調節T-細胞或其子集的功能或活性的試劑以及抗原接觸，針對該抗原的 細胞介導的免疫應答是待測的；并測定來自所述T-細胞的免疫效應分子的存在或水平的 升高，其中所述免疫效應分子的存在或水平是受試者的細胞介導的響應性水平的指征。
2.權利要求1的方法，其中所述受試者是人。
3.權利要求1或2的方法，其中所述樣品是未經稀釋的全血。
4.權利要求1或2的方法，其中所述樣品是全血，其構成待測樣品體積的大約10%至 100%。
5.權利要求4的方法，其中所述全血構成待測樣品體積的大約50%至100%。
6.權利要求5的方法，其中所述全血構成待測樣品體積的大約80%至100%。
7.權利要求3-6任一項的方法，其中所述全血收集在含有抗原的管中。
8.權利要求3-7任一項的方法，其中所述全血收集在含有肝素的管中。
9.權利要求1的方法，其中所述試劑抑制T-調節細胞的功能或活性。
10.權利要求9的方法，其中所述試劑選自以下一種或多種CD25配體；針對編碼JAKl 或 Κ2的遺傳材料的正義或反義寡核苷酸；包含CpG的寡核苷酸；作為TLR調節劑的寡核 苷酸；和TLR調節劑。
11.權利要求10的方法，其中所述⑶25配體是抗-⑶25抗體。
12.權利要求10的方法，其中所述寡核苷酸是硫代磷酸酯化的。
13.權利要求1的方法，其中所述免疫效應分子是細胞因子。
14.權利要求13的方法，其中所述細胞因子是IFN-γ。
15.權利要求1的方法，其中通過針對所述免疫效應分子的特異性抗體來檢測所述免 疫效應分子。
16.權利要求15的方法，其中使用ELISA來檢測所述免疫效應分子。
17.權利要求16的方法，其中使用ELISpot來檢測所述免疫效應分子。
18.權利要求1-17任一項的方法，其中所述免疫響應性是受試者中疾病或病況的指征。
19.權利要求18的方法，其中所述疾病或病況選自致病試劑引起的感染、自身免疫 病、炎性病況和暴露于毒性試劑。
20.權利要求19的方法，其中所述疾病或病況是由選自分支桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球 菌屬、包柔氏螺旋體菌屬、大腸桿菌、沙門氏菌屬、梭菌屬、志賀氏菌屬、變形菌屬、桿菌屬、 皰疹病毒和人類免疫缺陷病毒(HIV)的致病試劑引起的感染，以及由其產生的疾病。
21.權利要求19的方法，其中所述疾病或病況是結核分枝桿菌感染或肺結核(TB)。
22.權利要求19的方法，其中所述疾病或病況是肝炎病毒感染。
23.權利要求19的方法，其中所述疾病或病況是選自下列的自身免疫病斑禿、強直性 脊柱炎、抗磷脂綜合征、自身免疫性艾迪森氏病、多發性硬化、腎上腺的自身免疫病、自身免 疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睪丸炎、白塞病、大皰性類天皰瘡、 心肌癥、口炎性腹瀉-皮炎、慢性疲勞綜合征(CFIDS)、慢性炎癥性脫髓鞘、慢性炎癥性多發 性神經病、Churg-Mrauss綜合征、瘢痕性類天皰瘡、crest綜合征、冷凝集素病、克羅恩病、 皰疹樣皮炎、盤狀狼瘡、原發性混合型冷球蛋白血癥、纖維肌痛、腎小球性腎炎、格雷氏癥、格林-巴利綜合征、橋本氏甲狀腺炎、特發性肺纖維化、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、 IgA腎病、胰島素依賴性糖尿病(I型)、扁平苔蘚、狼瘡、梅尼埃病、混合性結締組織病、多發 性硬化、重癥肌無力、心肌炎、尋常性天皰瘡、惡性貧血、結節性多動脈炎、多軟骨炎、多腺體 綜合征、風濕性多肌痛、多發性肌炎與皮肌炎、原發性無丙種球蛋白血癥、原發性膽汁性肝 硬化、牛皮癬、雷諾氏現象、賴特綜合征、風濕熱、風濕性關節炎、肉狀瘤病、硬皮病、干燥綜 合癥、僵人綜合征、系統性紅斑狼瘡、高安氏動脈炎、顳動脈炎/巨細胞動脈炎、潰瘍性結腸 炎、葡萄膜炎、脈管炎和白癲風。
24.權利要求23的方法，其中所述自身免疫病是乳糜瀉。
25.權利要求23的方法，其中所述自身免疫病是自身免疫性糖尿病。
26.權利要求19的方法，其中所述疾病或病況是選自下列的癌癥:ABL1原癌基因、 AIDS相關的癌癥、聽神經瘤、急性淋巴細胞性白血病、急性髓性白血病、腺樣囊性癌、腎上腺 皮質癌、原因不明性骨髓化生、脫發、肺泡軟組織肉瘤、肛門癌、血管肉瘤、再生障礙性貧血、 星形細胞瘤、共濟失調毛細血管擴張癥、基底細胞癌(皮膚)、膀胱癌、骨癌、腸癌、腦干膠 質瘤、腦和中樞神經系統腫瘤、乳腺癌、中樞神經系統腫瘤、類癌腫瘤、宮頸癌、兒童腦腫瘤、 兒童癌癥、兒童白血病、兒童軟組織肉瘤、軟骨肉瘤、絨毛膜癌、慢性淋巴細胞性白血病、慢 性髓性白血病、結腸直腸癌、皮膚T-細胞淋巴瘤、隆突性皮膚纖維肉瘤、促纖維增生性小圓 形細胞腫瘤、導管癌、內分泌癌、子宮內膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤文氏肉瘤、肝外膽管癌、 眼癌、眼睛黑色素瘤、視網膜母細胞瘤、輸卵管癌、范可尼貧血、纖維肉瘤、膽囊癌、胃癌、胃 腸癌、胃腸類癌腫瘤、泌尿生殖系統癌癥、生殖細胞瘤、妊娠-滋養細胞疾病、神經膠質瘤、 婦科癌癥、血液系統惡性腫瘤、毛細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、遺傳性乳腺癌、組織細 胞增生癥、何杰金氏病、人乳頭狀瘤病毒、葡萄胎、高鈣血癥、下咽癌、眼內黑色素瘤、胰島細 胞癌、卡波西氏肉瘤、腎癌、朗格漢斯細胞-組織細胞增生癥、喉癌、平滑肌肉瘤、白血病、 Li-Fraumeni綜合征、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴水腫、淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰 金淋巴瘤、男性乳腺癌、腎惡性橫紋肌樣瘤、髓母細胞瘤、黑色素瘤、merkel細胞癌、間皮瘤、 轉移性癌、口癌、多發性內分泌腫瘤、蕈樣肉芽腫、骨髓增生異常綜合征、骨髓瘤、骨髓增生 性疾病、鼻癌、鼻咽癌、腎母細胞瘤、神經母細胞瘤、神經纖維瘤病、奈梅亨斷裂綜合征、非黑 色素瘤皮膚癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、眼癌、食道癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、造口術卵巢 癌、胰腺癌、副鼻竇癌、副甲狀腺癌、腮腺癌、陰莖癌、外周性神經外胚層腫瘤、垂體癌、真性 紅細胞增多癥、前列腺癌、稀少癌癥和相關病癥、腎細胞癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、 羅特穆德-湯姆遜綜合癥、唾液腺癌、肉瘤、神經鞘瘤、Sezary綜合征、皮膚癌、小細胞肺癌 (SCLC)、小腸癌、軟組織肉瘤、脊髓腫瘤、鱗狀細胞癌(皮膚)、胃癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺 癌、甲狀腺癌、移行細胞癌(膀胱)、移行細胞癌(腎-骨盆-輸尿管)、滋養細胞癌、尿道 癌、泌尿系統癌、uroplakins、子宮肉瘤、子宮癌、陰道癌、外陰癌、瓦爾登斯特氏巨球蛋白血 癥禾口 Wilms瘤。
27.用于測定受試者中細胞介導的免疫應答活性的方法，所述方法包括，將來自受試者 的T-細胞來源與調節T-細胞或其子集的功能或活性的試劑以及抗原接觸，針對該抗原的 細胞介導的免疫應答是待測的；并測定來自所述T-細胞的免疫效應分子的存在或水平的 升高，其中所述免疫效應分子的存在或水平是受試者的細胞介導的響應性水平的指征，其 中所述響應性水平是選自下列的疾病或病況的存在、不存在、水平或階段的指征致病試劑引起的感染、自身免疫病、癌癥、炎性病況和暴露于毒性試劑。
28.用于檢測受試者中疾病或病況的存在、不存在、水平或階段的測定法，所述方法包 括，將來自受試者的T-細胞來源與調節T-細胞或其子集的功能或活性的試劑以及抗原接 觸，針對該抗原的細胞介導的免疫應答是待測的；并測定來自所述T-細胞的免疫效應分子 的存在或水平的升高，其中所述免疫效應分子的存在或水平是所述疾病或病況的指征。
29.權利要求觀的方法，其中所述受試者是人。
30.權利要求觀或四的方法，其中所述樣品是未經稀釋的全血。
31.權利要求觀或四的方法，其中所述樣品是全血，其構成待測樣品體積的大約10% 至 100%。
32.權利要求31的方法，其中所述全血構成待測樣品體積的大約50%至100%。
33.權利要求32的方法，其中所述全血構成待測樣品體積的大約80%至100%。
34.權利要求30-33任一項的方法，其中所述全血收集在含有抗原的管中。
35.權利要求30或34任一項的方法，其中所述全血收集在含有肝素的管中。
36.權利要求觀的方法，其中所述試劑抑制T-調節細胞的功能或活性。
37.權利要求36的方法，其中所述試劑選自以下一種或多種CD25配體；針對編碼 JAKl或 Κ2的遺傳材料的正義或反義寡核苷酸；包含CpG的寡核苷酸；和TLR調節劑。
38.權利要求37的方法，其中所述⑶25配體是抗-⑶25抗體。
39.權利要求37的方法，其中所述寡核苷酸是硫代磷酸酯化的。
40.權利要求觀的方法，其中所述免疫效應分子是細胞因子。
41.權利要求40的方法，其中所述細胞因子是IFN-γ。
42.權利要求觀的方法，其中通過針對所述免疫效應分子的特異性抗體來檢測所述免 疫效應分子。
43.權利要求42的方法，其中使用ELISA來檢測所述免疫效應分子。
44.權利要求43的方法，其中使用ELISpot來檢測所述免疫效應分子。
45.權利要求觀至44任一項的方法，其中所述疾病或病況選自致病試劑引起的感 染、自身免疫病、炎性病況和暴露于毒性試劑。
46.權利要求45的方法，其中所述疾病或病況是由選自分支桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球 菌屬、大腸桿菌、沙門氏菌屬、梭菌屬、志賀氏菌屬、變形菌屬、桿菌屬、嗜血桿菌屬、肝炎病 毒、皰疹病毒和人類免疫缺陷病毒(HIV)的致病試劑引起的感染，以及由其產生的疾病。
47.權利要求46的方法，其中所述疾病或病況是結核分枝桿菌感染或肺結核(TB)。
48.權利要求46的方法，其中所述疾病或病況是肝炎病毒感染。
49.權利要求45的方法，其中所述疾病或病況是選自下列的自身免疫病斑禿、強直性 脊柱炎、抗磷脂綜合征、自身免疫性艾迪森氏病、多發性硬化、腎上腺的自身免疫病、自身免 疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睪丸炎、白塞病、大皰性類天皰瘡、 心肌癥、口炎性腹瀉-皮炎、慢性疲勞綜合征(CFIDS)、慢性炎癥性脫髓鞘、慢性炎癥性多發 性神經病、Churg-Mrauss綜合征、瘢痕性類天皰瘡、crest綜合征、冷凝集素病、克羅恩病、 皰疹樣皮炎、盤狀狼瘡、原發性混合型冷球蛋白血癥、纖維肌痛、腎小球性腎炎、格雷氏癥、 格林-巴利綜合征、橋本氏甲狀腺炎、特發性肺纖維化、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、 IgA腎病、胰島素依賴性糖尿病(I型)、扁平苔蘚、狼瘡、梅尼埃病、混合性結締組織病、多發性硬化、重癥肌無力、心肌炎、尋常性天皰瘡、惡性貧血、結節性多動脈炎、多軟骨炎、多腺體 綜合征、風濕性多肌痛、多發性肌炎與皮肌炎、原發性無丙種球蛋白血癥、原發性膽汁性肝 硬化、牛皮癬、雷諾氏現象、賴特綜合征、風濕熱、風濕性關節炎、肉狀瘤病、硬皮病、干燥綜 合癥、僵人綜合征、系統性紅斑狼瘡、高安氏動脈炎、顳動脈炎/巨細胞動脈炎、潰瘍性結腸 炎、葡萄膜炎、脈管炎和白癲風。
50.權利要求49的方法，其中所述自身免疫病是乳糜瀉。
51.權利要求49的方法，其中所述自身免疫病是自身免疫性糖尿病。
52.權利要求46的方法，其中所述疾病或病況是選自下列的癌癥ABL1原癌基因、 AIDS相關的癌癥、聽神經瘤、急性淋巴細胞性白血病、急性髓性白血病、腺樣囊性癌、腎上腺 皮質癌、原因不明性骨髓化生、脫發、肺泡軟組織肉瘤、肛門癌、血管肉瘤、再生障礙性貧血、 星形細胞瘤、共濟失調毛細血管擴張癥、基底細胞癌(皮膚)、膀胱癌、骨癌、腸癌、腦干膠 質瘤、腦和中樞神經系統腫瘤、乳腺癌、中樞神經系統腫瘤、類癌腫瘤、宮頸癌、兒童腦腫瘤、 兒童癌癥、兒童白血病、兒童軟組織肉瘤、軟骨肉瘤、絨毛膜癌、慢性淋巴細胞性白血病、慢 性髓性白血病、結腸直腸癌、皮膚T-細胞淋巴瘤、隆突性皮膚纖維肉瘤、促纖維增生性小圓 形細胞腫瘤、導管癌、內分泌癌、子宮內膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤文氏肉瘤、肝外膽管癌、 眼癌、眼睛黑色素瘤、視網膜母細胞瘤、輸卵管癌、范可尼貧血、纖維肉瘤、膽囊癌、胃癌、胃 腸癌、胃腸類癌腫瘤、泌尿生殖系統癌癥、生殖細胞瘤、妊娠-滋養細胞疾病、神經膠質瘤、 婦科癌癥、血液系統惡性腫瘤、毛細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、遺傳性乳腺癌、組織細 胞增生癥、何杰金氏病、人乳頭狀瘤病毒、葡萄胎、高鈣血癥、下咽癌、眼內黑色素瘤、胰島細 胞癌、卡波西氏肉瘤、腎癌、朗格漢斯細胞-組織細胞增生癥、喉癌、平滑肌肉瘤、白血病、 Li-Fraumeni綜合征、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴水腫、淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰 金淋巴瘤、男性乳腺癌、腎惡性橫紋肌樣瘤、髓母細胞瘤、黑色素瘤、merkel細胞癌、間皮瘤、 轉移性癌、口癌、多發性內分泌腫瘤、蕈樣肉芽腫、骨髓增生異常綜合征、骨髓瘤、骨髓增生 性疾病、鼻癌、鼻咽癌、腎母細胞瘤、神經母細胞瘤、神經纖維瘤病、奈梅亨斷裂綜合征、非黑 色素瘤皮膚癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、眼癌、食道癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、造口術卵巢 癌、胰腺癌、副鼻竇癌、副甲狀腺癌、腮腺癌、陰莖癌、外周性神經外胚層腫瘤、垂體癌、真性 紅細胞增多癥、前列腺癌、稀少癌癥和相關病癥、腎細胞癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、 羅特穆德-湯姆遜綜合癥、唾液腺癌、肉瘤、神經鞘瘤、Sezary綜合征、皮膚癌、小細胞肺癌 (SCLC)、小腸癌、軟組織肉瘤、脊髓腫瘤、鱗狀細胞癌(皮膚)、胃癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺 癌、甲狀腺癌、移行細胞癌(膀胱)、移行細胞癌(腎-骨盆-輸尿管)、滋養細胞癌、尿道 癌、泌尿系統癌、uroplakins、子宮肉瘤、子宮癌、陰道癌、外陰癌、瓦爾登斯特氏巨球蛋白血 癥禾口 Wi Ims瘤。
53.權利要求46的方法，其中所述疾病或病況是對鈹的敏感性或暴露于鈹。
54.用于檢測人類受試者中疾病或病況的存在、不存在、水平或階段的方法，所述方法 包括，將構成反應混合物總體積的至少10%的全血與抑制調節性T-細胞功能的試劑以及 抗原接觸，針對該抗原的細胞介導的免疫應答是待測的；并測定來自所述T-細胞的免疫效 應分子的存在或水平的升高，其中所述免疫效應分子的存在或水平是所述疾病或病況的指 征。
55.治療患有致病性感染、自身免疫病癥或癌癥或具有患上所述病況或病癥的傾向的受試者的方法，所述方法包括，將來自受試者的T-細胞來源與調節T-細胞或其子集的功 能或活性的試劑以及抗原接觸，針對該抗原的細胞介導的免疫應答是待測的；并測定來自 所述T-細胞的免疫效應分子的存在或水平的升高，其中所述免疫效應分子的存在或水平 是受試者的細胞介導的響應性水平的指征，細胞介導的響應性水平是所述病況或病癥的存 在、不存在、水平或狀態的指征；然后治療所述病況或病癥。
56.用于測定受試者中細胞介導的免疫應答的試劑盒，所述試劑盒是多成分的形式， 其中第一成分包含多個血液收集管，第二成分包含用于免疫效應分子的基于抗體的檢測工 具，第三成分包含一套說明書，所述說明書包含權利要求1或觀的步驟。
57.調節T-細胞或T-細胞子集的功能或活性的試劑用于制備診斷測定的用途，所述診 斷測定通過將抗原或有絲分裂原與包含T-細胞的材料一起溫育并檢測效應分子的存在或 升高來測定細胞介導的免疫響應性。
58.選自(i)阻抑性調節性T-細胞的抑制劑；和(ii)增強免疫系統的細胞或其子集 的激活劑的試劑用于制備診斷測定的用途，所述診斷測定通過將抗原或有絲分裂原與包含 T-細胞的材料一起溫育并檢測效應分子的存在或升高來測定細胞介導的免疫響應性。
59.選自CD25配體、針對編碼JAKl或 Κ2的遺傳材料的正義或反義核酸分子、包含 CpG的寡核苷酸和TLR調節劑的試劑用于制備診斷測定的用途，所述診斷測定通過將抗原 或有絲分裂原與包含T-細胞的材料一起溫育并檢測效應分子的存在或升高來測定細胞介 導的免疫響應性。
全文摘要
本發明大體上涉及基于免疫學的診斷測定領域。更具體地，本發明涉及測定細胞介導的免疫應答反應活性的方法。本發明還涉及用于檢測或監視疾病或病況的細胞介導的基于免疫應答的測定。
文檔編號G01N33/49GK102105786SQ200980128871
公開日2011年6月22日 申請日期2009年7月14日 優先權日2008年7月25日
發明者A·J·雷德福, J·L·霍華德, J·S·羅斯爾 申請人:賽樂思迪斯有限公司
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