專利名稱：應用電化學方法快速檢測細菌的方法
技術領域：
本發明涉及應用電化學方法快速檢測細菌的方法。
背景技術：
致病細菌一直是嚴重危害人類健康的“隱形殺手”。為了減少其對人類的危害需要進行科學的研究如活菌計數、分類鑒別、敏感程度等。目前最常用而相對精準的活菌計數方法為瓊脂板菌落計數法，此法是通過將樣本稀釋到適當倍數后培養M小時，使菌培養形成離散的菌落，然后人工進行計數。而鑒別細菌種類則要經上述培養后進行一系列生化試驗來實現。此法不但檢測時間長，還浪費大量人力、物力。細菌的快速檢測方法的研究早在20 世紀60年代就開始進行了研究，一直持續發展到現在。目前細菌的快速檢測方法可分為以下幾類活細胞計數法、儀器檢測、核酸檢測等。上述方法雖檢測時間有所縮短，但所需免疫試劑昂貴且通常毒性較大，所需儀器也同樣昂貴，并且操作復雜，專一性和選擇性差。電化學是研究電能與化學能之間的相互轉化及轉化過程中有關規律的科學。電化學測試方法具有1.簡單易行，可將難以測定的化學參數之間轉變為容易測定的電參數進行測定。2.靈敏度高，即使是微量的物質變化也可以通過電流或電量的變化進行測定。 3.實時行好，利用高精度的特點，可以檢測出微反應量，并對其進行定量。電化學差分脈沖伏安法具有高靈敏度可逆電極反應物質靈敏度可達10_7mOl/l，不可逆電極反應物質靈敏度可達10_6mol/l ；分辨能力強；選擇性強允許前放電物質的量大，前放電物質的濃度比待測物質濃度高50000倍亦不干擾測定。交流阻抗也叫電化學阻抗譜(EIS)，它是一種以小振幅的正弦波電位(或電流)為擾動信號，對體系的影響小，并且擾動與體系的響應之間近似呈線性關系，這就使測量結果的數字處理變得簡單。分子識別一直是分析化學家感興趣的問題。伴隨超分子絡合物的形成會出現顏色變化、電化學信號的改變等各種功能。據此有望建立起高選擇性、靈敏快速的分子識別方法。碳硼烷衍生物是由硼元素和碳元素形成的多面體硼烷簇化合物，在水、氧及其他各種條件下具有很高的化學穩定性。碳硼烷易于被化學衍生，其硼氫頂點易于發生親電取代反應，強堿還可以奪取碳氫頂點的質子。碳硼烷的獨特性質使得設計和合成新型的碳硼烷化合物成為材料化學、生物化學共同關注的熱點話題。
發明內容
本發明提供應用電化學方法快速檢測細菌的方法，可以實現活菌計數、細菌種類鑒別、以及臨床樣本中的耐藥菌株和敏感菌株的區分，檢測普適性強，速度快，靈敏度高，特異性好，檢測效率高；避免了使用昂貴的免疫試劑或檢測試劑盒；對樣本的要求不高，不需要經過復雜處理，在復雜的樣本條件下均可進行；所用設備可實現微型化和便攜化。所述應用電化學方法快速檢測細菌的方法為，應用超分子識別及具有穩定電化學活性的碳硼烷衍生物或阿霉素作為細菌標識物探針分子，在電極上滴加菌液，隨后立即滴加標識物探針分子與細菌特異結合，然后檢測差分脈沖響應信號。優選，利用單一標準菌株懸液獲得的差分脈沖譜來鑒別細菌的種類；或者利用單一標準菌株懸液獲得的差分脈沖峰電位的值來鑒別臨床病原菌的耐藥程度高低；或者利用單一標準菌株懸液獲得的差分脈沖峰電流的值來計算細菌的量。所述單一標準菌株優選為金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，鮑曼不動桿菌，肺炎克雷伯氏菌或奇異變形桿菌。另一種應用電化學方法快速檢測細菌的方法為，用菌懸液作為電解液，應用超分子識別及具有穩定電化學活性的碳硼烷衍生物或阿霉素作為細菌標識物探針分子，在菌懸液中加入標識物探針分子與細菌特異性結合，然后檢測交流阻抗曲線。優選，利用單一標準菌株懸液獲得的系統阻抗譜與所得阻抗值對比，鑒別細菌的種類；或者利用單一標準菌株懸液獲得的電化學阻抗值來計算靶細菌的量。所述單一標準菌株優選為金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，鮑曼不動桿菌，肺炎克雷伯氏菌或奇異變形桿菌。另一種應用電化學方法快速檢測細菌的方法為，在電極上修飾所測細菌并進行培養，應用超分子識別及具有穩定電化學活性的碳硼烷衍生物或阿霉素作為細菌標識物探針分子，使檢測標識物探針分子與電極上修飾的細菌特異性結合，然后檢測差分脈沖伏安信號。優選，利用單一標準菌株懸液獲得的差分脈沖譜來鑒別細菌的種類；或者利用單一標準菌株懸液獲得的差分脈沖峰電位的值來鑒別臨床病原菌的耐藥程度高低；或者利用單一標準菌株懸液獲得的差分脈沖峰電流的值來計算細菌的量。所述單一標準菌株優選為金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，鮑曼不動桿菌，肺炎克雷伯氏菌或奇異變形桿菌。優選，應用上述電化學方法快速檢測細菌時，所選取的頻率范圍為102HZ-l(fHZ。本發明利用不同的探針分子與細菌特異性結合，導致電化學響應信號的差異來檢測細菌的種類、數量或耐藥程度。具體的操作可以是檢測探針分子的電化學響應信號作為空白值，然后檢測探針分子與細菌特異性結合后的電化學響應信號，與空白值進行比較。將待測菌液與前述單一標準菌株懸液獲得的響應譜圖進行對比，從而獲得檢測細菌的種類、 數量或耐藥程度。伏安測定是采用電化學工作站與由一個工作電極、對電極和參比電極組成的三電極系統。工作電極采用碳電極或氧化銦錫等電極，對電極為鉬絲，參比電極為銀絲，組成普通的三電極系統。在三電極系統中，只需取用少量菌液及識別分子組成檢測液，利用差分脈沖法得到單一細菌的響應譜圖。測量方案可以使用細菌與探針分子混合后在電極上測量或者在電極上修飾細菌然后使用探針分子與之結合的方法。對于前者，具有更敏捷更即時的優點。本發明的有益效果(1)幾種探針分子均具有高度的特異性與靈敏性，對供試菌株金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，鮑曼不動桿菌，肺炎克雷伯氏菌，奇異變形桿菌等都有很好的檢測活性。( 相關探針分子及其納米復合物制劑對兩種金黃色葡萄球菌(敏感性和耐藥性)有很好的檢測區分能力，能夠通過觀測峰電流和峰電位及阻抗等來進行區分。目前國內外采用電化學方法快速檢測細菌還處于探索階段。
具體實施方式
實施例11. 1探針分子溶液的配制將幾種探針分子衍生物分別用PBS配制成高濃度母液， 再用 PBS 分別稀釋成濃度為 l*10-4mol/l、4*10-4mol/l、8*10-4mol/l、12*10-4mol/l、。藥物探針于_4°C保存。實驗前，將探針藥物取出搖勻，進行電化學實驗。1. 2實驗菌株及培養方法標準菌株大腸桿菌(ATCC8739)，金黃色葡萄球菌 (CGMCC1.89)，肺炎克雷伯氏菌(ATCC700600)，鮑曼不動桿菌(ATCC19606)，奇異變形桿菌 (ATCC12453)等。臨床耐藥菌株金黃色葡萄球菌(SA321)，肺炎克雷伯氏菌(KP450)，鮑曼不動桿菌(AB135)，奇異變形桿菌(PM102)。LB液體培養基1% (w/v)胰蛋白胨，0.5% (w/ ν)酵母抽提物，1 % (w/v)氯化鈉，高壓蒸汽滅菌30min后，用2mol/ml的NaOH調整pH至 7.2-7.4。LB瓊脂板為LB液體培養基中加入0.5% (w/v)瓊脂粉，高壓蒸汽滅菌后，冷卻至 50°C倒板，冷凝即得。培養方法用接種環從4°C保存的固體斜面培養基上挑取少量菌落， 接種于固體LB培養基平面上，37°C恒溫箱中培養24h后，用接種環挑取3-5個菌落轉移至無菌試管中，用LB培養基稀釋并混勻，調整菌液濃度至1. OX 105-5. OX 105CFU/ml作MIC測定用菌懸液。取ITO電極，將其切割成0. 5*5. Ocm的條狀，分別用丙酮、無水乙醇、二次蒸餾水洗凈吹干備用。將阿霉素溶液15 μ 1滴于電極上，使其在0. 5*0. 5cm的面積上鋪展，加入對電極和參比電極，得到DPV曲線。此曲線作為對比試驗中的空白試驗。取已調好濃度的菌液10 μ 1滴于電極上，隨后滴加10 μ 1濃度為4*10_4mOl/l的探針溶液，得到相關電活性分子探針與不同菌作用后的差分脈沖伏安曲線。由曲線看出不同菌種的峰值處在不同的位置，其間相差的大小足以用肉眼看出。在不同菌種的作用下得到的電活性探針分子的相關峰電流和峰電位也有較明顯的差異。同沒有菌液的空白試驗相比較，峰的位置以及大小有明顯的改變。實施例21. 1探針分子溶液的配制將幾種探針分子衍生物分別用PBS配制成高濃度母液， 再用 PBS 分別稀釋成濃度為 l*10-4mol/l、4*10-4mol/l、8*10-4mol/l、12*10-4mol/l、。藥物探針于_4°C保存。實驗前，將探針藥物取出搖勻，進行電化學實驗。1. 2實驗菌株及培養方法標準菌株大腸桿菌(ATCC8739)，金黃色葡萄球菌 (CGMCC1.89)，肺炎克雷伯氏菌(ATCC700600)，鮑曼不動桿菌(ATCC19606)，奇異變形桿菌 (ATCC12453)等。臨床耐藥菌株金黃色葡萄球菌(SA321)，肺炎克雷伯氏菌(KP450)，鮑曼不動桿菌(AB135)，奇異變形桿菌(PM102)。LB液體培養基1% (w/v)胰蛋白胨，0.5% (w/ ν)酵母抽提物，1 % (w/v)氯化鈉，高壓蒸汽滅菌30min后，用2mol/ml的NaOH調整pH至 7.2-7.4。LB瓊脂板為LB液體培養基中加入0.5% (w/v)瓊脂粉，高壓蒸汽滅菌后，冷卻至 50°C倒板，冷凝即得。培養方法用接種環從4°C保存的固體斜面培養基上挑取少量菌落， 接種于固體LB培養基平面上，37°C恒溫箱中培養24h后，用接種環挑取3-5個菌落轉移至無菌試管中，用LB培養基稀釋并混勻，調整菌液濃度至1. 0X 105-5. 0X 105CFU/ml作MIC測定用菌懸液。將阿霉素溶液15μ 1滴于印刷電極上，使其在電極面積上鋪展，并覆蓋住對電極和參比電極，電化學方法得到DPV曲線。此曲線作為對比試驗中的空白試驗。取已調好濃度的菌液10 μ 1滴于印刷電極上，隨后滴加20 μ 1濃度為4*10_4mOl/l的探針溶液直至鋪滿電極。運用電化學分析方法進行檢測，得到不同菌作用后的相關差分脈沖伏安曲線。由曲線看出不同菌種的峰值處在不同的位置，其間相差的大小足以用肉眼看出。在不同菌種的作用下得到的電活性探針分子的相關峰電流和峰電位也有較明顯的差異。同沒有菌液的空白試驗相比較，峰的位置以及大小有明顯的改變。
權利要求
1.一種應用電化學方法快速檢測細菌的方法，其特征在于，應用超分子識別及具有穩定電化學活性的碳硼烷衍生物或阿霉素作為細菌標識物探針分子，在電極上滴加菌液，隨后立即滴加標識物探針分子與細菌特異結合，然后檢測差分脈沖響應信號。
2.如權利要求1所述的應用電化學方法快速檢測細菌的方法，其特征在于，利用單一標準菌株懸液獲得的差分脈沖譜來鑒別細菌的種類；或者利用單一標準菌株懸液獲得的差分脈沖峰電位的值來鑒別臨床病原菌的耐藥程度高低；或者利用單一標準菌株懸液獲得的差分脈沖峰電流的值來計算細菌的量。
3.如權利要求2所述的應用電化學方法快速檢測細菌的方法，其特征在于，所述單一標準菌株為金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，鮑曼不動桿菌，肺炎克雷伯氏菌或奇異變形桿菌。
4.一種應用電化學方法快速檢測細菌的方法，其特征在于，用菌懸液作為電解液，應用超分子識別及具有穩定電化學活性的碳硼烷衍生物或阿霉素作為細菌標識物探針分子，在菌懸液中加入標識物探針分子與細菌特異性結合，然后檢測交流阻抗曲線，得出阻抗值。
5.如權利要求4所述的應用電化學方法快速檢測細菌的方法，其特征在于，利用單一標準菌株懸液獲得的系統阻抗譜與所得阻抗值對比，鑒別細菌的種類；或者利用單一標準菌株懸液獲得的電化學阻抗值來計算靶細菌的量。
6.如權利要求5所述的應用電化學方法快速檢測細菌的方法，其特征在于，所述單一標準菌株為金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，鮑曼不動桿菌，肺炎克雷伯氏菌或奇異變形桿菌。
7.一種應用電化學方法快速檢測細菌的方法，其特征在于，在電極上修飾所測細菌并進行培養，應用超分子識別及具有穩定電化學活性的碳硼烷衍生物或阿霉素作為細菌標識物探針分子，使檢測標識物探針分子與電極上修飾的細菌特異性結合，然后檢測差分脈沖伏安信號。
8.如權利要求7所述的應用電化學方法快速檢測細菌的方法，其特征在于，利用單一標準菌株懸液獲得的差分脈沖譜來鑒別細菌的種類；或者利用單一標準菌株懸液獲得的差分脈沖峰電位的值來鑒別臨床病原菌的耐藥程度高低；或者利用單一標準菌株懸液獲得的差分脈沖峰電流的值來計算細菌的量。
9.如權利要求8所述的應用電化學方法快速檢測細菌的方法，其特征在于，所述單一標準菌株為金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，鮑曼不動桿菌，肺炎克雷伯氏菌或奇異變形桿菌。
全文摘要
本發明涉及應用電化學方法快速檢測細菌的方法，應用超分子識別及具有穩定電化學活性的碳硼烷衍生物或阿霉素作為細菌標識物探針分子，在電極上滴加菌液，隨后立即滴加標識物探針分子與細菌特異結合，然后檢測差分脈沖響應信號；或者用菌懸液作為電解液，應用超分子識別及具有穩定電化學活性的碳硼烷衍生物或阿霉素作為細菌標識物探針分子，在菌懸液中加入標識物探針分子與細菌特異性結合，然后檢測交流阻抗曲線。本發明可實現活菌計數、細菌種類鑒別、以及臨床樣本中的耐藥菌株和敏感菌株的區分，檢測普適性強，速度快，靈敏度高，特異性好，檢測效率高；避免了使用昂貴的免疫試劑或檢測試劑盒。
文檔編號G01N27/26GK102375009SQ201110272369
公開日2012年3月14日 申請日期2011年9月14日 優先權日2011年9月14日
發明者呂夏毅, 周研研, 李水紅, 王雪梅 申請人:東南大學
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
