專利名稱：麥白、麥迪霉素全部組分含量的測定方法
技術領域：
本發明涉及大環內酯類抗生素藥品的麥白、麥迪霉素組分含量的測定方法。
麥迪霉素(Midecamycinum，Medimycin)的主要組分有麥迪霉素A1、A2、A3、A4及柱晶白霉素(Kifasamycin.Leucomycin)A6等，不同產品的各組分相對含量差別很大。日本麥迪霉素(麥迪霉素以下簡稱麥迪)中的A1高達80%以上，A6只占5%左右;國產品在88年前生產的麥迪中A1與A6含量差不多，A1還不到日本產品的一半，當然效價比日本產品低得多。為了提高質量，在89年版衛生部藥品標準中(簡稱部標)規定將國產麥迪改為麥白霉素(以下簡稱麥白)，在出廠檢驗項目中增加A1的含量測定并要求該量不得少于40%，效價不得少于850μ/mg(按干燥品計算);將測量方法從原先施行的歸一法改成外標法。1990年9月，衛生部又批準了A1不低于30%，效價不少于820μ/mg(折干)，期限為90年9月1日至91年9月1日的暫行標準。1991年6月全國第四次麥白交流會上，又提出了A1≥35%，效價≥850μ/mg(折干)，于92年3月1日執行的暫行修改標準。質量標準在短期內如此頻繁地變動，說明我國對麥白的質量情況還缺乏應有的全面了解。
當前，檢測麥白的A1含量與效價互不相關地進行著。麥白界長期認可的A1含量與效價呈正相關的看法已被否定。不少產品A1低于40%，而效價卻在900μ/mg以上;另有一些產品A1高出40%，而效價卻不到850μ/mg。原因在于麥白是多組分混合物，其效價不但與A1組分密切相關，而且也與其他組分有重要的關系。只有將全部組分都測定出來，才能了解它們各自與效價之間的內在聯系。然而測定麥白全部組分含量的方法至今還沒有，各組分與效價之間的關系更處在模糊之中。這就是不能正確制訂麥白質量標準的關鍵所在。人們迫切希望在這二方面有所突破。
關于測定麥白、麥迪組分含量的方法通常有歸一法、外標法與內標法三種(見《高壓液相色譜法》、金恒亮編，原子能出版社1987年版)。
我國最早采用歸一法測定麥白、麥迪組分。其原理是假定麥白、麥迪樣品全部組分都在232nm出峰，則有關組分在HPLC面積歸一化圖譜上的相應峰面積Si及占總峰面積的比例ai由儀器打印出來。由于麥白、麥迪的主要組分結構十分相似，次要組分含量甚微，于是近似地認為儀器對各組分的靈敏度相同，這樣，i組分的含量為Ci(歸)＝Si/∑Si＝ai……①(i為在232nm波長處出峰的組分)這種方法簡便、對稱量、定容、進樣量、儀器穩定性都沒有嚴格要求，而且不需標準品。缺點是所測出的含量很不準確。因為麥白中不在232nm出峰的部分相當多，當這部分被忽略不計后，使Ci偏高不少。例如麥白標準品(341-8801)(以下簡稱標準品)的aA1約70%，實際CA1＝49.0%，誤差極大。第三次全國麥迪交流會否定了這種方法而決定用外標法來測定A1含量。
外標法的原理在于樣品溶液在HPLC圖譜中，其各組分的含量Ci與它相應的峰面積Si成正比，與溶液的濃度(稱量W/容積V)成反比。如配制溶液的量瓶容積相同則計算A1含量的公式是CA1(外)＝(WpVSA1/WVpSA1p)CA1P＝(WpSA1/WSA1p)×49.0%……②式中CA1p為標準品的A1含量，是已知值(例如49.0%)。
符號右下角的“p”表示標準品，不寫的為樣品。
上述符號的意思以下均相同，不再解釋。
外標法測定麥白A1含量比歸一法準確，在圖譜上只要A1峰良好，即使其他峰形不良，也能進行正常測定。
外標法與部標規定的流動相與定容物相配合測定麥白、麥迪組分、缺點也非常突出①每次測定都要使用已知被測組分含量的標準品;
②HPLC圖譜峰形不佳(附
圖1和2，分別表示分離度較低和較高情況下的麥白圖譜)(a)A1與它前面相鄰的峰峰谷很高，分離度差;
(b)A1以外的峰常常裂分。
因此，用外標法可以測定A1含量而不能測定裂分組分的含量;而歸一法則完全不能使用。
附圖1的主要的測定條件全套SP8810HPLC儀;大連化學物理所生產的色譜柱(簡稱大連柱)，91050401、C18、10μm、200×4.0mm;以48%乙腈和52%0.1mol/l甲酸銨、PH＝6.0的溶液為流動相;100%甲醇定容;進樣濃度1.0mg/ml、進樣量10μl;λ＝232nm，AT＝32，Cs＝0.25cm/min，PT＝150;圖1a為標準品圖譜，1b為東北旺制藥廠產品90-7-59圖譜。
附圖2主要條件流動相中乙腈為43%，0.1mol/l甲酸銨為57%;2a為標準品圖譜，2b為東北旺制藥廠產品90-10-4圖譜;其余同附圖1。
③外標法測定誤差相當大。原因很多(a)公式②中標準品與樣品中任何一方的稱量、定容容積、組分峰的峰面積都會對含量的測定產生相當大的影響(正反比關系)。
(b)麥白、麥迪組分繁雜又非常相似。現有條件很難將A1組分與相鄰組分完全分開。要達到藥典規定的分離度，每次測定所需的時間在1小時以上，而且柱效要相當高。當前，許多單位都是在分離度非常不夠的情況下進行著，柱效也不高。這樣，電壓、流動相、柱效、室溫的細微變化就對分離度及測定值有較大的影響。即使是標準品本身，在同一天的測定中多次進樣，其峰面積就有不小的改變。
(c)樣品與標準品的A1峰及鄰近峰總有差別。在分離度不足時，峰與峰的疊加度各不相同，從而導致誤差。誤差量隨著峰形差別與分離度不足度的增減而增減。
(d)稱量、樣品轉移、定容、進樣等操作程序很多。除了產生系統誤差外，還往往產生不小的偶然誤差。
④為了減少測定誤差，就要增加儀器的穩定時間，同時標準品和樣品都需要多次進樣，從而延長測定時間和增加流動相的用量。流動相由毒品甲酸銨與劇毒、昂貴、易揮發的乙腈配制。這就對工作人員的健康和環境造成不利的影響，又提高了測定成本。
(3)內標法測定組分含量不但要使用標準品而且要在樣品中加入內標物，比外標法更麻煩。又因麥白組分幾乎布滿了整個圖譜，內標物峰位難于按排，至今未曾見聞過有人進行了這種嘗試。
關于測定麥白、麥迪組分含量的流動相與定容物組合方式，已見過的有三種
(1)乙-甲方式即部標方式“以甲酸銨液(0.1mol/l)-乙腈(100∶55)并用10%醋酸液調節、使PH值為5.9～6.1的溶液為流動相，樣品用甲醇定容?！边@種方式的缺點很多，前面已經說過。這兒不再贅述。
(2)甲-甲方式即以甲醇溶液作流動相，甲醇溶液定容。優點是不使用乙腈，毒性最小，試劑費用最低，但圖譜峰形最差，連A1峰都常常裂分，測定準確度最差。
(3)乙-乙方式即以乙腈溶液作流動相，乙腈溶液定容。優點是峰形最好，測定最準確，但所耗乙腈最多，毒性與試劑費用最高。
關于組分含量的表達方式有三種(1)部標法用C(外)表示，這種方式沒有去除樣品中水份與雜質的影響，反映的是樣品中組分含量的實際值，這個值隨樣品中水份與雜質量的變化而變化。
(2)如果用折干形式表示C(外)(折干)＝C(外)/1-水份……③可去除水份而不能去除雜質的影響，同時增加了水份測定的麻煩，并受其測定準確度的影響。
(3)如果用折純形式表示C(外)(折純)＝C(外)/(1-水分-雜質)……④既可去除水份又可去除雜質的影響，反映樣品的本質含量。但它必須測定水份與雜質量并受這二者測定準確度的影響。
綜上所述，測定麥白、麥迪組分含量的現有三種方法-歸一法、外標法、內標法;
現有流動相與定容物的三種組合方式-乙-甲方式、甲-甲方式、乙-乙方式;
現有組分含量的三種表達方式-C(外)、C(外)(折干)、C(外)(折純)都有重大的缺點。
本發明目的是提供一種既能測定麥白、麥迪的A1含量又能測定其他全部組分含量的準確、低毒、簡易、快速而廉價的方法，同時尋找一種表達組分含量既準確又方便的理想方式。
以下結合附圖，對本發明內容進行說明。
本發明采用分光光度計分別測定標準品和樣品在280、232nm波長處的吸收度比值;采用高效液相色譜儀，以適當比例的甲醇-0.03mol/l醋酸銨液、用20%醋酸液調節PH值為6.0～6.8的溶液為流動相，50%乙腈水定容樣品，以使麥白標準品的A1后、A2后能同時檢測出來、A1組分的保留時間等于9±2分為度;分別測出標準品和樣品在232、280nm處的面積歸一化圖譜，取得包括標準品A1組分在內的各組分峰面積占相應波長處總峰面積的百分數;進而用改進歸一法計算出全部組分的含量。
實施本發明步驟如下步驟1以甲醇-0.03mol/l醋酸銨液、用20%醋酸液調節PH值為6.0～6.8的溶液為流動相。
在2ml量瓶中稱入約2mg麥白或麥迪，用50%乙腈水大致定容。
流動相中甲醇、醋酸銨的具體比例及PH值可隨不同的色譜柱和儀器酌情調整，以使標準品的A1后、A2后能同時檢測出來、A1組分的保留時間RTA1等于9±2分為度。
采用全套SP8810HPLC色譜儀和大連化學物理所生產的色譜柱;以68±2%甲醇和32±2%的0.03mol/l醋酸銨溶液、并以20%醋酸液調節其PH值為6.6～6.8作為流動相;樣品以50%乙腈水定容。
步驟2用無水乙醇將麥白標準品和樣品制成約0.016mg/ml的溶液，分別用分光光度計測定其吸收度比值A280/A232。
步驟3利用步驟1配制的流動相、標準品和樣品液，在HPLC儀上依次進樣，每批一次，得到各標準品和樣品在232nm波長處的面積歸一化圖譜。如附圖3，它比附圖1、2所示的部標法圖譜要好得多。
附圖3主要條件以68%甲醇和32%0.03mol/l醋酸銨，PH＝6.8的溶液為流動相;以50%乙腈水定容;AT＝32;進樣濃度1.0mg/ml;3a為標準品，3b為蘇州產品，其余同附圖1。
3a的數據如下峰(i)面積%(ai)RT峰面積(Si)10.0973.58506620.2624.413650
30.4244.592208141.475.177665451.2935.9267425616.8476.6887827572.9137.72151834A1 8 αAlP=65.388 8.79 340872992.18110.04113695108.03512.41418861111.0918.0556821全部100.52130913b的數據如下:
峰(i)面積%(ai)RT峰面積(Si)10.0833.570220.1623.131116230.5083.673505040.7854.135412459.5475.16658215635.5316.71244975372.5397.77175055A1842.8068.89295136497.26112.52500633100.77918.0553714全部100.6894772步驟4上步完成后，調正儀器參數，依次進樣，得到各標準品和樣品分別在280nm波長處的面積歸一化圖譜如4a、4b。通常每批進樣一次。該步可以改日另測，流動相和樣品液也可以另配。
附圖4主要條件測樣品時AT＝4，測標準品時AT＝16，λ＝280nm，4a為標準品，4b為蘇州產品，其余同附圖3。
4a數據如下峰(i)面積%(bi)RT峰面積(Si)10.0942.57171820.0984.26179130.4085.45745040.9275.961693354.5156.8982483619.1367.96349614710.6289.62194176A4859.99410.47109610391.37413.8325107102.82615.2151635全部100.18270104b數據如下:
峰(i)面積%(bi)RT峰面積(Si)10.1482.56149623.2654.493294132.8825.332908749.8015.869887859.9556.82100440632.1737.85324592710.2449.03103351A4831.5310.37318105全部100.1008890步驟5用改進歸一法計算麥白、麥迪中全部組分的含量(1)原理、公式推導
根據麥白、麥迪組分對紫外光的吸收性可以一分為三第一部分以A1、A6為主，在232nm處出峰(附圖1～3)，而在280nm處不出峰;第二部分以A3、A4為主則正好相反(附圖4);第三部分是水份和雜質，它們在這二個波長處都不出峰。如用C表示組分含量則C232+C280+水份+雜質＝100%＝1.00……⑤將樣品配制成適當濃度M的乙醇溶液，根據朗伯比爾定律，對于一束穿過它的單色光，溶液的吸收度A與它的濃度和光路長度L的乘積成正比于是A232＝E232M232L……⑥A280＝E280M280L……⑦其中A、E、M分別表示樣品溶液對相應波長光線的吸收度、吸收系數、有吸收的各組分濃度之和(g/ml)。E是個常數，與麥白、麥迪的批號和濃度無關，但與光的波長和溫度有關。
根據麥白標準品和樣品在232nm處的面積歸一化圖譜，從上述3個公式及歸一化原理可知Ci(改)＝ ((1－水份－雜質)×49.0%×(A280/A232)×ai)/((1－水份－雜質)P(aAlP-49.0％)(A280／A232)P＋49.0%(A280／A232)P)(i為在232nm處出峰的組分)Ci(改)中的“改”表示用改進歸一法測定，以下“改”字省略，用分光光度計經多次準確測定得(A280/A232)p＝0.363麥白標準品經特別提純干燥，(水份)P＝0，(雜質)P＝0，于是Ci＝ (0.17787(1-水份－雜質))/(0.17787+(aAlP-0.49)(A280/A232)) ai……⑨由于Ci＝aiC232……⑩(i為在232nm處出峰的組分)則C232＝ (0.17787(1-水份－雜質))/(0.17787+(aAlP-0.49)(A280/A232)) ……(11)
C280((1－水份－雜質)(aAlP-0.49)(A280/A232))/(0.17787+(aAlP-0.49)(A280／A232)) ……(12)如果標準品和樣品在280nm處出峰的各組分歸一化百分數用bi表示，則Ci=biC280((1－水份－雜質)(aAlP-0.49)(A280/A232))/(0.17787+(aAlP-0.49)(A280／A232)) bi(i為在280nm處出峰的組分)(2)組分含量的幾種表達方式上述帶有水份項的公式，俗稱“濕”的形式。相應的組分含量用Ci(濕)、C232(濕)、C280(濕)等表示，其中，Ci(濕)與外標法測定值相當。
對A1組分，CA1(濕)＝CA1(外)……(14)如將組分按折干、折純處理，相應的組分含量用Ci(折干)、C232(折干)、C232(折純)、C280(折純)等表示。
C232(折干)＝C232(濕)/1-水份……(15)C280(折干)＝C280(濕)/1-水份……(16)Ci(折干)＝Ci(濕)/1-水份……(17)
(i為在280nm處出峰的組分)
C232(折純)= (C232(濕))/(1－水份－雜質) = 0.17787/( 0.17787+(aAlP-0.49)A280/A232) ……(20)C280(折純)＝ (C280(濕) (aAlP-0.49)(A280/A232))/(1-水份－雜質 0.17787＋(aAlP-0.49)A280/A232) ……(21)＝1-C232(折純)……(22)Ci(折純)＝ (Ci(濕))/(1－水份－雜質) ……(23)
(i為在280nm處出峰的組分)(3)測定各組分含量中的近似處理①麥白、麥迪中的雜質主要有洗滌時殘留的無機物、去離子水中的微小樹脂顆粒及塵土等，可由熾灼殘渣值來衡量。據估算雜質≌2熾灼殘渣值②對合格的麥白、麥迪產品，又不知道水份與雜質量的確切值，則可認為1-水份-雜質≌0.985＝98.5%
也可根據不同的具體情況取值。
(4)對公式的簡單分析由于ai、bi、aA1p、A280/A232與標準品和樣品的稱量、定容、樣品轉移、進樣量都沒有關系，隨儀器穩定性、分離度與室溫的變化也比較小，從而①公式(24)、(25)表明既可以不經嚴格的稱量、定容、控制進樣量，又可不經水份與雜質的測定，直接得到各組分的折純含量。Ci(折純)表示樣品中組分的本質含量，它與水份和雜質量無關，使用起來既準確又簡便，是表達麥白、麥迪組分含量的最佳方式;同時也為進一步用折純效價科學地表達其理論效價準備了條件。
②麥白、麥迪的A280/A232多數在0.20以下，至今已知的最大值為0.363。于是(aA1p-0.49)A280/A232比0.17787小得多。標準品對各組分含量的影響主要來自aA1p。aA1p本身變化不大。所以，標準品對各組分含量測定值的影響比外標法中標準品的相應影響要小得多。甚至于可以在一定的條件下，用aA1p代替當日aA1p進行測定，誤差并不大。
水份與熾灼殘渣是部標規定本來要測的，本法取其數值，不再另測。水份、殘渣的測定，因取樣量大，比較準確，而且多數情況下，水份+雜質＜＜1，即使有點誤差，無關大局，對組分含量的測定影響不大。計算折純含量時，連水份與殘渣的數據也不需要了。因此，本法既簡便又準確，精密度高，復測的次數可以大大減少。
本發明的效果如下1.本法不但可以測定麥白、麥迪的A1，而且可以同時測定其他全部組分的含量。
2.操作簡便。對稱量、定容、進樣量、HPLC儀器穩定性都無嚴格要求。
3.部標法測定A1需要各50mg標準品和樣品，而本發明只需2mg，甚至于在大多數測定中，可以不要標準品。
4.準確度、精密度相當高。對一個樣品的A1含量反復測定多少遍，絕對與相對誤差大多在2%以內。
5.測定工效比部標法大大提高，8小時內可測定14批。
6.由于流動相中，用低毒的甲醇代替了劇毒的乙腈，使測定每批樣品所需的乙腈降到1ml，比部標法節約95%以上;同時用無毒的醋酸銨代替了有毒的甲酸銨，從而大大有利于工作人員的健康，減輕對環境的污染。
7.測定每批樣品的全部組分含量試劑費低廉，比部標法節約90%以上。
8.我們進一步找到了一種根據麥白、麥迪組分含量準確、簡便、迅速、不再花錢地單靠計算得出其理論效價的新方法。開創了國內外在這方面的先例，使人們對麥白、麥迪的認識升華到了一個新的階段并能夠解釋組分與效價間在過去模糊的認識，為制訂質量標準、為生產與科研提供樣品內在本質方面的更多信息并指明提高質量的正確方向。
這種方法不但在目前可用于對生測效價值以及成品的提取、洗滌質量進行有效的復核，而且為今后快速實現菌種優劣的鑒別，對發酵、提取過程實現監控、使之最佳化創造了條件。
9.找到了一種用折純方式準確、簡便、從本質上反映麥白、麥迪組分含量的理想方法。即使樣品未經烘干、未經洗凈，含有未知的較多水份與雜質，只要這雜質不影響在232、280nm處的峰形，則測出來的組分折純含量與折純效價保持不變。
10.與部標法相比，醋酸銨用量約是甲酸銨用量(mol數)的1/5，進樣量只有原來的1/2，從而延長了柱壽。
實施例-測定標準品和蘇州樣品的各組分含量，步驟如下1.配制待測標樣品吸收度比值A280/A232的溶液。
用掏耳小勺分別取待測品1/4～1/3勺于25ml潔凈量瓶中，加入分析純無水乙醇15～20ml晃勻。
2.配制50%乙腈水。
3.配制流動相在1000ml試劑瓶中，依次加入分析純甲醇680ml和0.03mol/l醋酸銨液320ml，加入20%醋酸液16滴，晃勻，用超聲波除氣機除氣30分鐘。置于HPLC儀器旁待用。
4.配制待測的標準品、樣品液。
在2ml量瓶中約加入2mg標準品或樣品，用50%乙腈水大致定容。置于HPLC儀器旁。
5.起動SP8810HPLC儀，按圖3條件設置儀器參數。儀器基本穩定后依次進樣。
標準品和蘇州樣品在232nm波長處的面積歸一化圖譜見附圖3。圖譜良好，流動相及儀器參數不必調正。
6.用751分光光度計依次測定樣品的吸收度比值A280/A232。數據如下
本步也可以和上步同時進行。
7.第五步完成后，按圖4條件接著依次進樣，每批一次，便得到標準品和蘇州樣品在280nm波長處的面積歸一化圖譜(附圖4)。
8.用改進歸一法計算各組分含量(1)標準品，(水份)p＝0，(雜質)p＝0，①用當日aA1p計算從圖3a知aA1p＝65.388%;從圖4a得知bA4p＝59.994%則，C232P＝ (0.17787(1－水份－雜質)P)/(0.17787+(aAlp-0.49)A280/A232)= 0.17787/(0.17787+(0.65388-0.49)×0.363)=0.7494=74.9%CA1p＝C232paA1p＝0.7494×65.388%＝49.00%C280p＝(1-水份-雜質-C232)p＝1-C232p＝1-0.7494＝0.2506＝25.06%CA4p＝bA4PC280p＝59.994%×0.2506＝15.03%
用同樣方法可知其他各組分含量。
(2)蘇州樣品①如實測水份＝2%，殘渣＝0.5%則雜質≌2×殘渣＝1%＝0.01從圖3a知aA1p＝65.388%從圖3b知aA1＝42.806%從圖4b知bA4＝31.53%這時的麥白為“濕”形式，C232(濕)＝ (0。17787(1－水份－雜質))/(0.17787+(aAlP-0.49)A280/A232)= (0.17787(1-0.02-0.01))/(0.17787+(0.65388-0.49)×0.159)=0.8461=84.61%CA1(濕)＝aA1C232(濕)＝42.806%×0.8461＝36.22%C280＝1-水份-雜質-C232(濕)＝1-0.02-0.01-0.8461＝0.1239＝12.39%CA4(濕)＝bA4C280(濕)＝31.53%×12.39%＝3.907%用同樣方法可知其他各組分含量。
②已知本品為合格產品，但又不知道水份與殘渣的確切值，這時可認為1-水份-雜質≌0.985于是C232(濕)＝ (0.17787×0.985)/(0.17787+(0.65388-0.49)×0.159) ＝85.91%CA1(濕)＝42.806%×85.91%＝36.78%C280(濕)＝0.985-85.91%＝12.59%CA4(濕)＝31.53%×12.59%＝3.97%用同樣方法可知其他各組分的含量。
③將本品按折純處理
C232(折純)＝ 0.17787/(0.17787+(0.65388-0.49)×0.159) ＝87.22%CA1(折純)＝aA1C232(折純)＝42.806%×87.22%＝37.34%C280(折純)＝1-C232(折純)＝12.78%CA4(折純)＝bA4C280(折純)＝31.53%×12.78%＝4.03%用同樣方法可知其他各組分的含量。
權利要求
1.麥白、麥迪霉素全部組分含量的測定方法，其特征在于采用分光光度計分別測定標準品和樣品在280、232nm波長處的吸收度比值；采用高效液相色譜儀，以適當比例的甲醇-0.03 mol/l醋酸銨液、用20%醋酸液調節PH值為6.0～6.8的溶液為流動相，50%乙腈水定容樣品，以便麥白標準品的A1后、A2后能同時檢則出來、A1組分的保留時間等于9±2分為度；分別測出標準品和樣品在232、280nm處的面積歸一化圖譜，取得包括標準品A1組分在內的各組分的峰面積占相應波長處總峰面積的百分數；進而用改進歸一法計算出全部組分的含量。
2.按照權利要求1所說的測定方法，其特征在于采用全套SP8810 HPLC儀和大連化學物理所生產的色譜柱(91050401);以68±2%甲醇和32±2%的0.03mol/l醋酸銨溶液并以20%醋酸液調節其PH值為6.6～6.8作為流動相，樣品以50%乙腈水定容。
全文摘要
本發明涉及麥白、麥迪霉素的組分含量測定方法。本發明以適當比例的甲醇-醋酸銨、pH＝6.0～6.8的溶液作流動相，50％乙腈水定容；分別測出標準品、樣品在232、280nm波長處的面積歸一化圖譜；用分光光度計測出它們在280、232nm處的吸收度比值從而準確、低毒、簡易、快速、試劑費用低廉地測出其全部組分的含量，并根據這些含量可以進一步計算出它們的理論效價。
文檔編號G01N30/02GK1070481SQ9210963
公開日1993年3月31日 申請日期1992年8月22日 優先權日1992年8月22日
發明者張國華 申請人:國營北京市東北旺制藥廠
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
