一種廣升麻總甾酮及廣升麻總甾酮膠囊指紋圖譜檢測技術及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及到一種中藥提取物廣升麻總甾酮及廣升麻總甾酮膠囊的指紋圖譜檢測技術及其指紋圖譜的構建方法。包括用溶劑提取制備廣升麻總甾酮及廣升麻總甾酮膠囊樣品的供試液，在一定的色譜條件下測試供試液液相色譜指紋圖譜，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(V2.0)，計算廣升麻總甾酮及廣升麻總甾酮膠囊供試液指紋圖譜的相似度，依據指紋圖譜相似度應大于0.90，從而達到控制廣升麻總甾酮及廣升麻總甾酮膠囊質量的目的。實驗證明，本發明的指紋圖譜檢測技術對廣升麻總甾酮及廣升麻總甾酮膠囊能起到很好的質量控制作用，是一種評價中藥提取物及中藥制劑生產質量的關鍵技術。
【專利說明】一種廣升麻總留酮及廣升麻總留酮膠囊指紋圖譜檢測技術 及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種中藥材提取物和膠囊的指紋圖譜檢測技術及其指紋圖譜的構建 方法。
【背景技術】
[0002] 廣升麻又稱廣東升麻，是廣東省做升麻入藥的地方習用品種，而且在廣東歷年有 出口外銷。始載于《廣東中藥》，謂："發痘疹，解毒";以根條粗長，表面黑褐色，斷面藍紫色， 質堅實，不帶蘆頭，無須根者為佳。《廣東中藥》記載：廣升麻"斷面近栓皮處之皮部綠色者 優，但不多見"。本品為菊科植物麻花頭SerratulachinensisS.Moor的干燥塊根。夏、秋 季采挖，去凈浮蘆頭及須根，烘干或曬干。本品呈長紡錘形，稍扭曲，兩端稍尖、中部稍粗，長 10-20cm，直徑0. 5-lcm，表面灰黃色、棕褐色或黑褐色，有粗縱皺紋和少數須根痕。質堅硬 而脆，易折段。斷面暗灰色或灰黃色，略呈角質狀。氣特殊；味淡，微苦澀。功能與主治是升 陽、散風、解毒、透疹。用于風熱頭痛，咽喉腫痛，斑疹不透，中氣下陷，久瀉脫肛，子宮下墜。 廣升麻已收載于中華人民共和國衛生部藥品標準中藥材第一冊第7頁及廣東省中藥材標 準（2011年）37頁。
[0003] 廣升麻總留酮是從廣升麻中提取的總留酮類有效部位，按干燥品計算，含蛻皮甾 酮（(： 27114407)應不低于50.0%。；含總甾酮按蛻皮甾酮（(： 27114407)計，應為65.0-95.0%。廣 升麻總甾酮膠囊是廣升麻總甾酮提取物制成的膠囊。規格有l〇mg和5mg兩個規格。用途： 活血祛瘀，通脈活絡，用于中風中經絡癥，用于腦卒中恢復期治療。
[0004] 中藥成分復雜，以某一成分作為控制指標已經不適合中藥質量控制的要求。中藥 指紋圖譜鑒別是借用了法醫學的指紋鑒定的概念，其應用解決了中藥中成分復雜、有效成 分不明的檢測和證明產品批間質量的穩定性的問題，為中藥質量的控制提供了一種較好的 方法。為了加強中藥注射劑的質量管理，確保中藥注射劑的質量管理，確保中藥注射劑的質 量穩定、可控、中藥注射劑在固定中藥材品種、產地和采收期的前提下，需制定中藥材、有效 部位或中間體、注射劑的指紋圖譜。2000年8月國家藥品監督管理局頒布《中藥注射劑指 紋圖譜研究的技術要求》（暫行）。國家藥典委員會也于2002年4月制定了《中藥注射劑 色譜指紋圖譜實驗研究技術指南（試行）》。
[0005] 目前對于廣升麻的化學成分文獻報道主要成分為蛻皮留酮類化合物，主要有 20-羥基蛻皮松（1)，podecdysoneC(2)，3-氧-乙酰基-20-羥基蛻皮松（3)，20-羥基蛻皮 松-20,22_縮丁醒（4)，8111(1&8七61'〇116(5)，&1：1'〇1：〇8七61'〇116〇(6)和〇&1'1：11&1]1〇8七61'〇116(7)。 關于廣升麻質量標準的研究的報道主要是對于其蛻皮留酮成分的含量的測定及限度的規 定。目前尚無廣升麻、廣升麻總留酮及廣升麻總留酮膠囊的指紋圖譜研究的報道。
[0006] 廣升麻總留酮膠囊活血祛瘀，通脈活絡，用于中風中經絡癥，用于腦卒中恢復期治 療。動物藥理和臨床試驗證實，本產品能有效促進腦部急慢性缺血后的神經恢復，抗血小板 聚集，降低梗塞率。因此為便于廣升麻總留酮膠囊的質量管理，確保其質量穩定、可控，應該 利用現代的分析技術更進一步的規范其質量。
[0007] 因此，基于對廣升麻總留酮及其它制劑的質量的穩定、可控，結合高效液相色譜指 紋圖譜技術及有關對指紋圖譜研究的技術要求和指南，探索了包括廣升麻總留酮、廣升麻 總甾酮膠囊的指紋圖譜檢測技術，包括將樣品用溶劑提取制備樣品的供試液，在一定的色 譜條件下測試供試液的高效液相色譜指紋圖譜，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》 (V2. 0)(國家藥典委員會），計算廣升麻總留酮及廣升麻總留酮膠囊指紋圖譜的相似度。進 而獲得指紋圖譜相似度數值，從而達到控制廣升麻總留酮及廣升麻總留酮膠囊質量的目 的。實驗證明，本發明的指紋圖譜檢測技術對廣升麻、廣升麻總留酮及廣升麻總留酮膠囊能 起到很好的質量控制作用，是一種評價中藥制劑生產質量的關鍵技術。
【發明內容】
[0008] 廣升麻總留酮及廣升麻總留酮膠囊是廣升麻藥材中提取的總留酮類有效部位，按 干燥品計算，含蛻皮甾酮（C27H4407)應不低于50.0%。；含總甾酮按蛻皮甾酮（C27H4407)計， 應為65. 0-95. 0%。通過對蛻皮甾酮的全波長掃描研究在243nm處有最大吸收。
[0009] 本發明的指紋圖譜檢測技術，包括將樣品用溶劑提取制備樣品的供試品溶液，在 一定的色譜條件下測試供試品試液的指紋圖譜，供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜經計算機 輔助相似度評價軟件《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（V2. 0)，（國家藥典委員會），計 算指紋圖譜相似度，獲得指紋圖譜相似度數值。依據相似度數值，將指紋圖譜檢測技術用于 廣升麻總留酮及廣升麻總留酮膠囊的質量控制。
[0010] 供試液的制備方法：取廣升麻總留酮樣品適量，精密稱定用45%甲醇適量，超聲 處理（功率300W，頻率50kHz)至全部溶解，放冷搖勻后并稀釋成每lmL含600yg的溶液濾 過，用微孔濾膜（0.45ym)過濾，取續濾液，即得廣升麻總留酮供試液。取廣升麻總留酮膠 囊20粒，精密稱定，研細。精密稱取約120mg置25ml量瓶中，加45%甲醇適量，超聲處理 (功率300W，頻率50kHz) 10分鐘，用微孔濾膜（0. 45ym)過濾，取續濾液，即得廣升麻總甾 酮膠囊供試液。
[0011] 所使用的一定的色譜條件包括如下因素：色譜柱；流動相；線性梯度洗脫程序；柱 溫：35°C;流速：1.Oml/min，紫外檢測器；檢測波長為243nm;進樣量：20iil;運行60min。
[0012] 對照指紋圖譜的獲取方法為13批廣升麻總甾酮、10批廣升麻總甾酮膠囊、按上述 供試液的制備方法制備供試品溶液，按上述色譜條件獲得高效液相色譜指紋圖譜，用指紋 圖譜相似度軟件分別對13批廣升麻總留酮、10批廣升麻總留酮膠囊指紋圖譜進行分析得 廣升麻對照圖譜、廣升麻總甾酮對照圖譜、廣升麻總甾酮膠囊對照圖譜。
[0013] 色譜柱選用的是十八烷基鍵合硅膠為填充劑的色譜柱，選用的是AgilentZORBAX SB-AQ柱。流動相，乙腈（A)-0. 04mol/L磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調pH為3. 0) (5 :95)體 系。線性梯度洗脫程序。
[0014] 經過研究，采用了如下的供試品溶液的制備方法：廣升麻總留酮供試液：取廣升 麻總留酮提取物樣品適量，精密稱定用45 %甲醇適量，超聲處理（功率300W，頻率50kHz) 至全部溶解，放冷搖勻后并稀釋成每lmL含600yg的溶液濾過，用微孔濾膜（0. 45ym)過 濾，取續濾液，即得。廣升麻總留酮膠囊供試液：取本品膠囊20粒，精密稱定，研細。精密稱 取約120mg置25ml量瓶中，加45 %甲醇適量，超聲處理（功率300W，頻率50kHz) 10分鐘， 用微孔濾膜（0.45ym)過濾，取續濾液，即得。
[0015] 經過研究，采用了如下的色譜條件：色譜柱：AgilentZORBAXSB-AQ柱 (4. 6mmX250mm，5iim);流動相：乙腈（A)-0. 04mol/L磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調pH為3. 0) (5 :95)體系，線性梯度洗脫程序：0?5minl0%?15%乙腈；5?20minl5%?19%乙腈； 20 ?30minl9 % 乙臆；30 ?40minl9 % ?35 % 乙臆；40 ?50min35 % ?80 % 乙臆；50 ? 60min80%乙腈。柱溫35°C;流速1.Oml/min;紫外檢測器檢測；檢測波長為243nm;進樣量： 20iU;運行60min。13批廣升麻總留酮、10批廣升麻總留酮膠囊樣品的指紋圖譜，用相似 度軟件進行分析，以該平均指紋圖譜為對照指紋圖譜。在此條件下獲取廣升麻總留酮、廣升 麻總甾酮膠囊的對照指紋圖譜見圖1-2
[0016]通過研究表明，廣升麻總留酮對照圖譜具有9個特征峰，圖譜總長度為60min，廣 升麻總甾酮膠囊對照圖譜具有9個特征峰，圖譜總長度為60min;廣升麻總甾酮峰3、廣升麻 總甾酮膠囊峰3均為蛻皮留酮峰。
[0017] 應用本發明，我們按合格產品的指紋圖譜相似度大于0. 90為檢驗質控標準，將廣 升麻總留酮、廣升麻總留酮膠囊的生產檢驗質量控制，所得產品質量穩定可靠，真正實現了 產品質量的穩定可控。
[0018] 廣升麻總留酮、廣升麻總留酮膠囊的指紋圖譜分析方法的建立及質量穩定性評價 的具體情況如下：
[0019] 1.1儀器與試劑
[0020] 儀器：AgilentllOO高效液相色譜儀，AgilentllOO紫外檢測器，工作站：Chem stationforLC，TU-1810紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）
[0021] 試劑：乙腈為色譜純（productofTedia，USA)，其它試劑均為分析純，水為睡哈哈 引用純凈水。
[0022] 廣升麻總甾酮（江蘇柯菲平醫藥有限公司，批號：090101、090201、090202、0901、 0902、111101、111102、111201、111202、S13-130101-M、S13-130102-M、S13-130201-M、 S13-130202-M)
[0023] 廣升麻總甾酮膠囊（江蘇柯菲平醫藥有限公司，批號：090301、090302、090303、 09001、10001、111201、S13-130301、S13-130302、S13-130303、S13-130304)
[0024] 1. 2色譜條件優化
[0025] 1. 2. 1流動相梯度的選擇
[0026] 選用了AglientZORBAXSB-AQ柱；流速：1. 0ml/min;因蛻皮甾酮的最大吸收波長 在243nm，故本實驗檢測波長暫定在243nm;柱溫暫定35°C;進樣量：20yl;考查了多種梯度 洗脫條件，實驗過程中共選擇了 4種流動相系統：
[0027] (1)甲醇：水梯度洗脫
[0028] 表1廣升麻指紋圖譜流動相梯度
【權利要求】
1. 一種廣升麻總留酮及廣升麻總留酮膠囊指紋圖譜的構建方法，包括如下步驟： A. 廣升麻總留酮供試液：取廣升麻總留酮提取物樣品適量，用45 %的甲醇溶液，超聲 處理至全部溶解，放冷搖勻后稀釋成含蛻皮留酮的溶液濾過，用微孔濾膜過濾，取續濾液， 即得；廣升麻總甾酮膠囊供試液：取廣升麻總甾酮膠囊內容物適量，精密稱取約120mg置 25ml量瓶中，加甲醇溶液適量，超聲處理，用微孔濾膜過濾，取續濾液，即得； B. 液相色譜法測定供試液指紋圖譜：將A步驟制備的供試液在一定色譜條件下進樣即 得；一定的色譜條件為：C18色譜柱；流動相：乙腈（A)-0. 04mol/L磷酸二氫鈉溶液（用磷酸 調pH為3. 0) (5 :95)體系；線性梯度洗脫程序；柱溫35°C ;流速1. Oml/min ;紫外檢測器檢 測；檢測波長為243nm ;進樣量：20 ill ;運行60min。
2. 權利要求1所述的廣升麻總留酮及廣升麻總留酮膠囊指紋圖譜的構建方法，所述的 C180DS 色譜柱，Agilent ZORBAX SB-AQ 柱尤其適用。
3. 權利要求1所述的一種廣升麻總留酮及廣升麻總留酮膠囊指紋圖譜的構建方法， 所述的對照指紋圖譜的獲得方法為：取廣升麻總留酮提取物樣品適量，精密稱定用45%甲 醇適量，超聲處理至全部溶解，放冷搖勻后并稀釋成每lmL含600 y g的溶液，過濾，取續濾 液即得；取廣升麻總留酮膠囊，各取本品膠囊20粒，精密稱定，研細。精密稱取約120mg置 25ml量瓶中，加45 %甲醇適量，超聲10分鐘使溶解，用微孔濾膜過濾，取續濾液，即得；按如 下色譜條件分析：色譜柱為Agilent ZORBAX SB-AQ柱（4.6mmX250mm，5iim)，流動相：乙腈 (A)-0. 04mol/L磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調pH為3. 0) (5 :95)體系；柱溫35°C;流速1. 0ml/ min ;紫外檢測器檢測；檢測波長為243nm ;進樣量：20ia ;線性梯度，運行60min ;獲取廣升 麻總留酮、廣升麻總留酮膠囊樣品的指紋圖譜，用相似度軟件進行分析，以該平均指紋圖譜 為對照指紋圖譜。
4. 權利要求3所述的一種廣升麻總留酮及廣升麻總留酮膠囊指紋圖譜的構建方法， 所述的一定的色譜條件下線性梯度洗脫程序，具體條件如下：乙腈（A)-0.04mol/L磷酸二 氫鈉溶液（用磷酸調口!1為3.0)(5:95)體系；線性梯度洗脫程序：0?51^1110%?15%乙 臆；5 ?SOminIS1% ?19% 乙臆；20 ?乙臆；30 ?^zOminig1% ?35% 乙臆；40 ? 501^11351%?80% 乙臆；50 ?60min80% 乙臆。
5. 權利要求4所述的一種廣升麻、廣升麻總留酮及廣升麻總留酮膠囊指紋圖譜的構 建方法，所得的廣升麻總留酮對照圖譜具有9個特征峰，以蛻皮留酮對照品峰（即3號 峰），一其峰保留時間為1，計算共有指紋峰的相對保留時間，圖譜總長度為60min，廣升 麻總甾酮膠囊對照圖譜具有9個特征峰，10mg規格膠囊的相對保留時間/min(特征峰序 號）0.70±10% (1)、0.71±10% (2)、1.00±10% (3[S])、1.13±10% (4)、1.31±10% (5)、1.44±10% (6)、1.76±10% (7)、1.90±10% (8)、2.06±10% (9) ;5mg 規格膠囊的 相對保留時間/min(特征峰序號）0.70±10% (1)、0.71±10% (2)、1.00±10% (3[S])、 1.13±10 % (4)、1.31±10 % (5)、1.44±10 % (6)、1.76±10 % (7)、1.90±10 % (8)、 2. 06±10% (9)。
【文檔編號】G01N30/02GK104458928SQ201310436233
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月24日 優先權日:2013年9月24日
【發明者】秦引林, 夏振江 申請人:江蘇柯菲平醫藥股份有限公司
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
