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一種中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白含量檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開的中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白含量檢測試劑盒，包括試劑R1、試劑R2以及NGAL試劑參考標準品，其中：試劑R1：Tris10-100mM；NaCl50-200mM；BSA0.05%-1%；Tween-200.01%-0.1%；PEG0.5%-3%；NaN30.1%；試劑R2：Tris10-100mM；NaCl50-200mM；BSA--0.05%-1%；Tween-200.01%-0.1%；NaN30.1%；蔗糖1%-10%；NGAL抗體致敏膠乳微粒0.1%-1%；NGAL試劑參考標準品：Tris10-100mM；NaCl50-200mM；BSA0.05%-1%；Tween-200.01%-0.1%；EDTA0.5-5mM；NaN30.1%。本發明試劑組成構成簡單、測試靈敏度好、線性范圍廣、穩定好，測試成本低廉，精度高，便于推廣。
【專利說明】一種中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白含量檢測試劑盒
[0001]

【技術領域】
[0002]本發明涉及一種生物蛋白檢測技術方案，特別是一種中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白含量檢測試劑盒。
[0003]本申請中下列表達式的意義為:
0.01-0.2M NaCl:表示溶液中 NaCl 濃度為 0.01-0.2mol/L ；
0.1-3%鹿糖:表示每10mL溶液中加鹿糖0.l_3g。
[0004]Tris:三羥甲基氨基甲烷；
BSA:牛血清白蛋白；
EDTA:乙二胺四乙酸；
EDAC:水溶性碳二亞胺類交聯劑；
PEG:聚乙二醇；
MES:一水嗎啉乙磺酸
本申請中跟上述表達式類似之處，所表達意義均跟上述意義類似；本申請中類似表達式另有說明的除外。
[0005]

【背景技術】
[0006]中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(簡稱NGAL)是1993年在中性粒細胞內首先被發現的，與炎癥、胚胎發育、免疫應答、趨化作用、信號轉導以及多種腫瘤的發生與發展等過程相關。近年來國內外的研究表明，NGAL蛋白在多種疾發過程中具有特異性表達變化的特點，使得NGAL成為檢測疾病的生物標志物。
[0007]在發生缺血性和毒性腎損傷過程中，腎小管上皮細胞中的NGAL將顯著增加，在開始的兩個小時內，尿液和血液中NGAL水平將顯著增加，因此NGAL是早期急性腎損傷的敏感標志物。
[0008]急性腎功能損傷預后將發展成為急性腎功能衰竭。通用的診斷方法如測定血清肌酐或者半胱氨酸蛋白酶抑制劑C (Cystatin C)，只能在損傷后一天甚者幾天內檢測。有研究表明，健康志愿者尿液中NGAL含量檢測結果分布0.7-9.6ng/ml，平均值為5.3ng/ml。而血漿中的含量檢測結果為37-106ng/ml，平均值為63ng/ml。當腎損傷后，隨機檢測重病患者，尿液NGAL的濃度為110ng/ml到40000ng/ml不等。而他們EDTA抗凝血漿檢測結果為25ng/ml到3491ng/ml。根據急性腎衰竭患者檢測的90%陽性預測值判斷，尿液中NGAL的陽性判斷值為350ng/ml,而血衆檢測的陽性判斷值為400ng/ml。
[0009]目前NGAL的測定方法主要有酶聯免疫法、放射免疫法、Western-blotting以及化學發光法。酶聯免疫法自動化程度不高，且受人為因素影響較大；放射免疫法存在著環境污染問題;Western-blotting操作復雜,測定精密度低；而化學發光法靈敏度雖高,但測定線性范圍較小且檢測成本較高，需要特定化學發光檢測儀，這些原因導致其應用范圍較小。
[0010]膠乳增強免疫透射比濁法也是測定人血漿或尿液中NGAL濃度的常用方法，該方法對儀器設備要求不高，沒有環保和操作人員自身防護等問題。與其他測定方法比較，該方法簡便快速、靈敏可靠，普通自動或半自動生化分析儀就可，有較大應用范圍，較大的實用價值。
[0011]NGAL濃度在正常人尿液中低于10ng/ml，在重度腎病患者尿液中濃度可高達7000ng/ml以上。如此寬廣的濃度范圍，對檢測試劑盒靈敏度和線性范圍均提出了較高的要求。目前市場上已有膠乳增強免疫透射比濁法測定人血漿或尿液中NGAL濃度的試劑盒，但這些試劑盒無法同時滿足寬線性范圍和高靈敏度的要求，因此需要稀釋樣本才能測定高濃度NGAL，這在使用上帶來了不便。
[0012]


【發明內容】

[0013]為解決上述問題，本發明公開了一種中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白含量檢測試劑盒，組成構成簡單、測試靈敏度好、線性范圍廣、穩定好，測試成本低廉，精度高，便于推廣。
[0014]本發明公開的中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白含量檢測試劑盒，包括試劑R1、試劑R2以及NGAL試劑參考標準品，其中:
試劑Rl:
Tris 1-1OOmM NaCl 50-200mM BSA 0.05%-1%
Tween-20 0.01%_0.1%
PEG 0.5%-3%
NaN3 0.1%
試劑R2:
Tris 1-1OOmM NaCl 50-200mM BSA 0.05%-1%
Tween-20 0.01%_0.1%
NaN3 0.1%
鹿糖1%_10%
NGAL抗體致敏膠乳微粒0.1%_1%，NGAL抗體致敏膠乳微粒直徑50_150nm ；
NGAL試劑參考標準品:
Tris 1-1OOmM NaCl 50-200mM BSA 0.05%-1%
Tween-20 0.01%_0.1%
EDTA 0.5-5mM NaN3 0.1%。
[0015]作為一種優選，所述試劑Rl中PEG的數均分子量為6000。
[0016]作為一種優選，所述試劑R1、試劑R2以及NGAL試劑參考標準品的酸堿度均為PH7-8。
[0017]作為一種優選，所述試劑R2中NGAL抗體致敏膠乳微粒為50_150nm聚苯乙烯乳膠微粒，其中功能基團為羧基功能基團。
[0018]作為一種優選，所述試劑R2中NGAL抗體致敏膠乳微粒通過如下步驟制得:
(1)用MES緩沖液將表面帶有羧基功能基團、直徑50-150nm的聚苯乙烯微粒稀釋至終濃度為0.5-3% (wt)，加入20-90mM EDAC，混合均勻，室溫震蕩反應20-80分鐘；
(2)離心步驟(I)混合液棄上清液，用MES緩沖液清洗兩次，最終膠乳微粒重懸于MES緩沖液至終濃度為2%，超聲進行分散，得微粒分散液；
(3)用MES緩沖液稀釋NGAL抗體至2mg/ml,與步驟(2)中微粒分散液等體積混合,于室溫反應2-4小時；
(4)將步驟(3)反應液18000rpm離心30min后,用Tris緩沖液重懸微粒,室溫封閉反應1-3小時；
(5)離心步驟(4)反應液，棄上清液，用Tris緩沖液清洗膠乳3次，最后用R2試劑保存液重懸膠乳沉淀并稀釋至1%，超聲充分分散后即獲得NGAL抗體致敏膠乳微粒。
[0019]作為一種優選，步驟(I)至步驟(3)中所述MES緩沖液為酸堿度ρΗ6.0的5OmMMES緩沖液。其中酸堿度ρΗ6.0的50mM MES緩沖液的配置步驟為，將10.6625g的MES溶于500mL去離子水中，再采用lmol/L的標準氫氧化鈉溶液調整酸堿度至PH=6，最后轉移至100mL容量瓶，標定至標準體積100mL,即可得到酸堿度pH6.0的50mM MES緩沖液。
[0020]作為一種優選，步驟(4)以及步驟(5)中所述Tris緩沖液為ρΗ7.4并且含0.5%BSA,0.1% Tween-20的50mM Tris緩沖液。50mM Tris緩沖液的配置的配置步驟為:將
6.057gTris溶于500mL去離子水中，再采用lmol/L的標準氯化氫溶液調整酸堿度至適當范圍，如PH=7，最后轉移至100mL容量瓶，標定至標準體積100mL,即可得到復合要求的50mMTris緩沖液。
[0021]機理:
采用化學交聯方法，將具有高特異性、高親和力的NGAL抗體偶聯至聚苯乙烯膠乳微粒表面的羧基官能團上，當此膠粒與樣本混合時，在促凝劑作用下，抗體與樣本中的抗原發生特異性結合，形成抗原-抗體-膠乳微粒復合物，產生一定的濁度變化。在一定范圍內，反應液吸光度值與樣本中抗原NGAL含量成正比關系。通過測定一系列已知濃度的NGAL標準品與NGAL試劑反應的吸光度，繪制標準曲線，便可根據待測樣本的吸光度值測得NGAL含量。
[0022]本發明在免疫比濁法的基礎上引入具有一定粒徑的納米微球，將抗體包被與微球表面，當抗體與樣本中的抗原結合時，形成一個更大的抗原-抗體-膠乳微粒復合物，增加了濁度變化，從而提高了檢測反應的靈敏度。另一方面，本發明采用化學偶聯的技術，將抗體固定包被在微球表面，通過增加抗體結構的穩定性以提高試劑的穩定性。本發明試圖通過計算與試驗，尋找合適的微球、交聯劑、抗體的比例，在提高檢測靈敏度的同時，降低反應的非特異性。
[0023]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1、本發明與市場上銷售的國內知名品牌NGAL試劑盒的標準曲線比較圖2、本發明NGAL檢測試劑盒檢測線性范圍
圖3、本發明試劑盒與對照試劑盒檢測臨床樣本的相關性比較

【具體實施方式】
[0025]下面結合附圖和【具體實施方式】，進一步闡明本發明，應理解下述【具體實施方式】僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
[0026]測試條件與方法
儀器:日立7060全自動生化分析儀參數設置:
波長|570nm/800nm |校正類型|非線性
樣本/R1/R2 (用量 μ I) 3?300/100 血清+Rl 時間
方法_兩點終點法加入R2后反應時間 5min
校正方法_六點定標反應方向_向上
操作步驟:雙試劑操作
樣晶3 Hl

I (Kl)300 Ul
購，5mhi
CKZ>__10 Ι?Ι_

浪句，37 TC鮮育3 Os后讀取吸光度Al ^苒孵育3fl0s后讀取吸光度值Α2 了 Δ A=Al-Al
3μ I樣品(校準品或臨床樣本)與300 μ I試劑Rl混勻，于37°C孵育5分鐘后，加入100 μ I試劑R2，混勻，37°C孵育30秒后讀取吸光度Al，再孵育5分鐘后讀取吸光度值A2，計算吸光度變化ΛΑ=Α2-Α1。以NGAL校準品濃度為X軸，以各濃度校準品測得的ΛΑ為Y軸繪制標準曲線，以待測樣本Λ A在定標曲線上對應X軸上的值即可求得其NGAL的含量。
[0027]實施例1 試劑 Rl:ρΗ7.4 Tris 50mM NaCl 150mM BSA 0.5%
Tween-20 0.1%
PEG6000 1.5%
NaN3 0.1%
試劑 R2:pH7.4
Tris 50mM
NaCl 150mM
BSA 0.5%
Tween-20 0.1%
NaN3 0.1%
鹿糖5%
NGAL抗體致敏膠乳微粒0.5%
NGAL試劑參考標準品標準品稀釋緩沖液:pH7.4 Tris 50mM NaCl 150mM BSA 0.5%
Tween-20 0.1%
EDTA 2mM NaN3 0.1%
將重組人NGAL蛋白用標準品稀釋液按標準品濃度(150、300、600、1500、3000、5000ng/ml)溶解稀釋，以國內知名品牌的NGAL試劑盒對配制的標準品進行測定和校準。
[0028]其中NGAL抗體致敏膠乳微粒制備過程為:
(1)用50mMMES緩沖液(pH6.0)將表面帶有羧基功能基團、直徑10nm的聚苯乙烯稀釋至終濃度為0.5%，加入50mM EDAC，混合均勻，室溫震蕩反應20分鐘；
(2)離心棄上清，用50mMMES緩沖液(pH6.0)清洗兩次，最終膠乳微粒重懸于50mM MES緩沖液(PH6.0)至終濃度為2%，超聲進行分散；
(3)用50mMMES緩沖液(pH6.0)稀釋NGAL抗體(多克隆抗體或單克隆抗體)至2mg/ml，與步驟(2)中活化微粒等體積混合，于室溫反應2小時；
(4)上述反應液18000rpm 離心 30min，用含 0.5% BSA,0.1% Tween-20 的 50mM Tris 緩沖液(PH7.4)重懸微粒，室溫封閉反應I小時；
(5)離心棄上清，用同一緩沖液清洗膠乳3次，最后用R2試劑保存液(50mMTris,0.15MNaCU0.5% BSA,0.1% Tween-20、0.1% NaN3、5%蔗糖)重懸膠乳沉淀并稀釋至1%，超聲充分分散后即獲得NGAL抗體致敏膠乳微粒。
[0029]實施例2 試劑Rl:pH7 Tris 1mM NaCl 125mM BSA 0.05%
Tween-20 0.05%
PEG6000 1%
NaN3 0.1%
試劑R2:pH7 Tris 20mM NaCl 10mM BSA 0.05%
Tween-20 0.08%
NaN3 0.1%
鹿糖2%
NGAL抗體致敏膠乳微粒0.1%
NGAL試劑參考標準品標準品稀釋緩沖液:pH7 Tris 40mM NaCl 70mM BSA 0.05%
Tween-20 0.03%
EDTA 5mM NaN3 0.1%
將重組人NGAL蛋白用標準品稀釋液按標準品濃度(150、300、600、1500、3000、5000ng/ml)溶解稀釋，以國內知名品牌的NGAL試劑盒對配制的標準品進行測定和校準。
[0030]其中NGAL抗體致敏膠乳微粒制備過程為:
(1)用50mMMES緩沖液(pH6.0)將表面帶有羧基功能基團、直徑50nm的聚苯乙烯稀釋至終濃度為1.5%，加入80mM EDAC，混合均勻，室溫震蕩反應30分鐘；
(2)離心棄上清，用50mMMES緩沖液(pH6.0)清洗兩次，最終膠乳微粒重懸于50mM MES緩沖液(PH6.0)至終濃度為2%，超聲進行分散；
(3)用50mMMES緩沖液(pH6.0)稀釋NGAL抗體(多克隆抗體或單克隆抗體)至2mg/ml，與步驟(2)中活化微粒等體積混合，于室溫反應4小時；
(4)上述反應液18000rpm 離心 30min，用含 0.5% BSA,0.1% Tween-20 的 50mM Tris 緩沖液(PH7.4)重懸微粒，室溫封閉反應1.5小時；
(5)離心棄上清，用同一緩沖液清洗膠乳3次，最后用R2試劑保存液(50mMTris,0.15MNaCU0.5% BSA,0.1% Tween-20、0.1% NaN3、5%蔗糖)重懸膠乳沉淀并稀釋至1%，超聲充分分散后即獲得NGAL抗體致敏膠乳微粒。
[0031]實施例3 試劑 Rl:pH7.5 Tris 10mM NaCl 50mM BSA 1%
Tween-20 0.01%
PEG6000 0.5%
NaN3 0.1%
試劑 R2:pH7.5
Tris 10mM
NaCl 50mM
BSA 1%
Tween-20 0.01%
NaN3 0.1% 鹿糖10%
NGAL抗體致敏膠乳微粒1%
NGAL試劑參考標準品標準品稀釋緩沖液:pH7.5 Tris 1mM NaCl 200mM BSA 1%
Tween-20 0.01%
EDTA 0.5mM
NaN3 0.1%
將重組人NGAL蛋白用標準品稀釋液按標準品濃度(150、300、600、1500、3000、5000ng/ml)溶解稀釋，以國內知名品牌的NGAL試劑盒對配制的標準品進行測定和校準。
[0032]其中NGAL抗體致敏膠乳微粒制備過程為:
(1)用50mMMES緩沖液(pH6.0)將表面帶有羧基功能基團、直徑75nm的聚苯乙烯稀釋至終濃度為2%，加入20mM EDAC，混合均勻，室溫震蕩反應80分鐘；
(2)離心棄上清，用50mMMES緩沖液(pH6.0)清洗兩次，最終膠乳微粒重懸于50mM MES緩沖液(PH6.0)至終濃度為2%，超聲進行分散；
(3)用50mMMES緩沖液(pH6.0)稀釋NGAL抗體(多克隆抗體或單克隆抗體)至2mg/ml，與步驟(2)中活化微粒等體積混合，于室溫反應3小時；
(4)上述反應液18000rpm 離心 30min，用含 0.5% BSA,0.1% Tween-20 的 50mM Tris 緩沖液(PH7.4)重懸微粒，室溫封閉反應2小時；
(5)離心棄上清，用同一緩沖液清洗膠乳3次，最后用R2試劑保存液(50mMTris,0.15MNaCU0.5% BSA,0.1% Tween-20、0.1% NaN3、5%蔗糖)重懸膠乳沉淀并稀釋至1%，超聲充分分散后即獲得NGAL抗體致敏膠乳微粒。
[0033]實施例4 試劑 Rl:pH7.8 Tris 20mM NaCl 200mM BSA 0.6%
Tween-20 0.02%
PEG6000 3%
NaN3 0.1%
試劑 R2:pH7.8
Tris 1mM
NaCl 200mM
BSA 0.75%
Tween-20 0.05%
NaN3 0.1%
蔗糖1% NGAL抗體致敏膠乳微粒0.8%
NGAL試劑參考標準品標準品稀釋緩沖液:pH7.8 Tris 10mM NaCl 50mM BSA 0.2%
Tween-20 0.05%
EDTA 4mM NaN3 0.1%
將重組人NGAL蛋白用標準品稀釋液按標準品濃度(150、300、600、1500、3000、5000ng/ml)溶解稀釋，以國內知名品牌的NGAL試劑盒對配制的標準品進行測定和校準。
[0034]其中NGAL抗體致敏膠乳微粒制備過程為:
(1)用50mMMES緩沖液(pH6.0)將表面帶有羧基功能基團、直徑150nm的聚苯乙烯稀釋至終濃度為3%，加入90mM EDAC,混合均勻，室溫震蕩反應45分鐘；
(2)離心棄上清，用50mMMES緩沖液(pH6.0)清洗兩次，最終膠乳微粒重懸于50mM MES緩沖液(PH6.0)至終濃度為2%，超聲進行分散；
(3)用50mMMES緩沖液(pH6.0)稀釋NGAL抗體(多克隆抗體或單克隆抗體)至2mg/ml，與步驟(2)中活化微粒等體積混合，于室溫反應2.5小時；
(4)上述反應液18000rpm 離心 30min，用含 0.5% BSA,0.1% Tween-20 的 50mM Tris 緩沖液(PH7.4)重懸微粒，室溫封閉反應3小時；
(5)離心棄上清，用同一緩沖液清洗膠乳3次，最后用R2試劑保存液(50mMTris,0.15MNaCU0.5% BSA,0.1% Tween-20、0.1% NaN3、5%蔗糖)重懸膠乳沉淀并稀釋至1%，超聲充分分散后即獲得NGAL抗體致敏膠乳微粒。
[0035]實施例5 試劑Rl:pH8 Tris 80mM NaCl 75mM BSA 0.08%
Tween-20 0.08%
PEG6000 2%
NaN3 0.1%
試劑R2:pH8 Tris 45mM NaCl 175mM BSA 0.08%
Tween-20 0.07%
NaN3 0.1%
蔗糖4%
NGAL抗體致敏膠乳微粒0.6% NGAL試劑參考標準品標準品稀釋緩沖液:pH8 Tris 70mM NaCl 175mM BSA 0.6%
Tween-20 0.08%
EDTA 3mM NaN3 0.1%
將重組人NGAL蛋白用標準品稀釋液按標準品濃度(150、300、600、1500、3000、5000ng/ml)溶解稀釋，以國內知名品牌的NGAL試劑盒對配制的標準品進行測定和校準。
[0036]其中NGAL抗體致敏膠乳微粒制備過程為:
(1)用50mMMES緩沖液(pH6.0)將表面帶有羧基功能基團、直徑125nm的聚苯乙烯稀釋至終濃度為2.5%，加入60mM EDAC,混合均勻，室溫震蕩反應65分鐘；
(2)離心棄上清，用50mMMES緩沖液(pH6.0)清洗兩次，最終膠乳微粒重懸于50mM MES緩沖液(PH6.0)至終濃度為2%，超聲進行分散；
(3)用50mMMES緩沖液(pH6.0)稀釋NGAL抗體(多克隆抗體或單克隆抗體)至2mg/ml，與步驟(2)中活化微粒等體積混合，于室溫反應3.5小時；
(4)上述反應液18000rpm 離心 30min，用含 0.5% BSA,0.1% Tween-20 的 50mM Tris 緩沖液(PH7.4)重懸微粒，室溫封閉反應2.5小時；
(5)離心棄上清，用同一緩沖液清洗膠乳3次，最后用R2試劑保存液(50mMTris,0.15MNaCU0.5% BSA,0.1% Tween-20、0.1% NaN3、5%蔗糖)重懸膠乳沉淀并稀釋至1%，超聲充分分散后即獲得NGAL抗體致敏膠乳微粒。
[0037]實施例6 試劑 Rl:pH7.2 Tris 450mM NaCl 180mM BSA 0.8%
Tween-20 0.06%
PEG6000 2.5%
NaN3 0.1%
試劑 R2:pH7.2
Tris 80mM
NaCl 85mM
BSA 0.25%
Tween-20 0.03%
NaN3 0.1%
鹿糖8%
NGAL抗體致敏膠乳微粒0.4%
NGAL試劑參考標準品標準品稀釋緩沖液:pH7.2 Tris 20mM NaCl 95mM BSA 0.8%
Tween-20 0.04%
EDTA 2.5mM
NaN3 0.1%
將重組人NGAL蛋白用標準品稀釋液按標準品濃度(150、300、600、1500、3000、5000ng/ml)溶解稀釋，以國內知名品牌的NGAL試劑盒對配制的標準品進行測定和校準。
[0038]其中NGAL抗體致敏膠乳微粒制備過程為:
(1)用50mMMES緩沖液(pH6.0)將表面帶有羧基功能基團、直徑80nm的聚苯乙烯稀釋至終濃度為1.2%，加入40mM EDAC，混合均勻，室溫震蕩反應70分鐘；
(2)離心棄上清，用50mMMES緩沖液(pH6.0)清洗兩次，最終膠乳微粒重懸于50mM MES緩沖液(PH6.0)至終濃度為2%，超聲進行分散；
(3)用50mMMES緩沖液(pH6.0)稀釋NGAL抗體(多克隆抗體或單克隆抗體)至2mg/ml，與步驟(2)中活化微粒等體積混合，于室溫反應3小時；
(4)上述反應液18000rpm 離心 30min，用含 0.5% BSA,0.1% Tween-20 的 50mM Tris 緩沖液(PH7.4)重懸微粒，室溫封閉反應2小時；
(5)離心棄上清，用同一緩沖液清洗膠乳3次，最后用R2試劑保存液(50mMTris,0.15MNaCU0.5% BSA,0.1% Tween-20、0.1% NaN3、5%蔗糖)重懸膠乳沉淀并稀釋至1%，超聲充分分散后即獲得NGAL抗體致敏膠乳微粒。
[0039]鑒于本發明方案實施例眾多，各實施例實驗數據龐大眾多，不適于于此處逐一列舉說明，但是各實施例所需要驗證的內容和得到的最終結論均接近，均可以證明本發明之試劑盒反應靈敏，對NGAL檢測性能良好，檢測結果線性程度高，便于在測試過程中得到精度較高的測試結果，故而此處不對各個實施例的驗證內容進行逐一說明。
[0040]下面以實施例1為例進行分析(如圖1-3所示)
1、檢測方法
儀器:日立7060全自動生化分析儀
參數設置:
波長|570nm/800nm |校正類型|非線性用量(樣本/R1/R2，μ I)3/300/100 _血清+Rl 時間3~5min
方法_兩點終點法加入R2后反應時間 5min
校正方法_六點定標反應方向_向上
操作步驟:樣品(標準品或臨床樣本)與試劑Rl混勻，于37°C孵育5分鐘后，加入試劑R2，混勻，37°C孵育30秒后讀取吸光度Al，再孵育5分鐘后讀取吸光度值A2，ΛΑ=Α2_Α1。以NGAL標準品濃度為X軸，以各濃度標準品測得的Λ A為Y軸繪制標準曲線，以待測樣本Λ A在定標曲線上即可求得相應NGAL的含量。
[0041]2、NGAL標準曲線
將實施例1中的NGAL試劑盒與國內知名品牌NGAL測定試劑盒(膠乳增強免疫比濁法)按照各自的檢測方法繪制標準曲線(附圖1)。本發明試劑盒空白吸光度相對較低，具有更高的靈敏度與線性范圍。
[0042]3、靈敏度檢測
測定空白液和4個不同NGAL濃度含量樣品的ΛΑ，每個樣品測10次，計算平均值和標準偏差(SD)，以樣本吸光度-3SD大于空白吸光度+3SD的樣本濃度作為NGAL檢測試劑盒的最低檢測靈敏度。從下表可見，本發明檢測試劑盒的靈敏度為10ng/ml。

【權利要求】
1.一種中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白含量檢測試劑盒，其特征在于:包括試劑R1、試劑R2以及NGAL試劑參考標準品，其中: 試劑Rl: Tris 1-1OOmM NaCl 50-200mM BSA 0.05%-1%
Tween-20 0.01%_0.1%
PEG 0.5%-3%
NaN3 0.1% 試劑R2: Tris 1-1OOmM NaCl 50-200mM BSA 0.05%-1%
Tween-20 0.01%_0.1%
NaN3 0.1% 鹿糖1%_10% NGAL抗體致敏膠乳微粒0.1%-1% NGAL試劑參考標準品: Tris 1-1OOmM NaCl 50-200mM BSA 0.05%-1%
Tween-20 0.01%_0.1% EDTA 0.5-5mM NaN3 0.1%。
2.根據權利要求1所述的中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白含量檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑Rl中PEG的數均分子量為6000。
3.根據權利要求1所述的中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白含量檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑R1、試劑R2以及NGAL試劑參考標準品的酸堿度均為pH7_8。
4.根據權利要求1所述的中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白含量檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑R2中NGAL抗體致敏膠乳微粒為50-150nm聚苯乙烯乳膠微粒，其中功能聚苯乙烯的功能基團為羧基功能基團。
5.根據權利要求1或4所述的中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白含量檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑R2中NGAL抗體致敏膠乳微粒通過如下步驟制得: (1)用MES緩沖液將表面帶有羧基功能基團、直徑50-150nm的聚苯乙烯微粒稀釋至終濃度為0.5-3% (wt)，加入20-90mM EDAC，混合均勻，室溫震蕩反應20-80分鐘； (2)離心步驟(I)混合液棄上清液，用MES緩沖液清洗兩次，最終膠乳微粒重懸于MES緩沖液至終濃度為2%，超聲進行分散，得微粒分散液； (3)用MES緩沖液稀釋NGAL抗體至2mg/ml,與步驟(2)中微粒分散液等體積混合,于室溫反應2-4小時； (4)將步驟(3)反應液18000rpm離心30min后,用Tris緩沖液重懸微粒,室溫封閉反應1-3小時； (5)離心步驟(4)反應液，棄上清液，用Tris緩沖液清洗膠乳3次，最后用R2試劑保存液重懸膠乳沉淀并稀釋至1%，超聲充分分散后即獲得NGAL抗體致敏膠乳微粒。
6.根據權利要求5所述的中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白含量檢測試劑盒，其特征在于:步驟(I)至步驟(3)中所述MES緩沖液為酸堿度pH6.0的50mM MES緩沖液。
7.根據權利要求5所述的中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白含量檢測試劑盒，其特征在于:步驟(4)以及步驟(5)中所述Tris緩沖液為ρΗ7.4并且含0.5% BSA,0.1%Tween-20 的 50mM Tris 緩沖液。
【文檔編號】G01N33/68GK104198732SQ201410431182
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月28日 優先權日:2014年8月28日
【發明者】陳媛, 張聞, 許琴, 周海濱, 王建飛 申請人:寧波瑞源生物科技有限公司