專利名稱：新的在清醒大鼠中靜脈給藥和血液取樣模型的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的在清醒大鼠中靜脈給藥和血液取樣模型，包括至少步驟(a)通過隱靜脈靜脈施用化學個體，和(b)從尾靜脈取血樣。
背景技術：
總體上，制藥工業強烈地意識到將新的化學個體(NCE)投放到市場所產生的研發時間和成本。在藥物發現ADME(吸收、分布、代謝、排泄，Absorption Distribution Metabolism Excretion)領域，存在研究化學個體(CE)的早期藥物狀性質的很多不同途徑。兩個主要區域是那些涉及研究一/二個參數或終點的體外試驗系統和采用整只動物體系的體內模型。迄今為止，已有許多努力集中于研發高通量體外代謝和吸收試驗(Bajpai，M.；Adkison，K.K.Curr.Opin.Drug Discovery Dev.2000，3，63-71)以及增加生物分析試驗中分析能力的速度(Cox，K.A.；White，R.E.；Korfinacher，W.A.Comb.Chem.High Throughput.Screen.2002，5，29-37)。作為藥物發現努力的一部分，持續需要在體內藥物代謝動力學(PK)參數方面對CE進行的檢查的通量增加。為獲得CE的生物利用度和這些參數，化合物經由靜脈(iv)和口服(po)途徑給藥，在多個時間點取血樣，隨后通過例如偶聯于串聯質譜法的液相色譜(LC-MS/MS)分析目標化合物。隨后由血漿濃度時間曲線計算得到該PK參數(例如清除率、分布體積、消除半衰期和口服生物利用度)，該參數描述了在整只動物中的吸收和布置。為在CE的體內PK評估中增加通量的努力集中于混合物給藥和樣品混和集中(pooling)以使得生物分析工作負荷最小((Allen，M.C.；Shah，T.S.；Day，W.W.Pharm.Res.1998，15，93-97；Olah，T.V.；McLoughlin，D.A.；Gilbert，J.D.Rapid Commun.Mass Spectrom.1997，11，17-23；Hop，C.E.；Wang，Z.；Chen，Q.；Kwei，G.J.Pharm.Sci.1998，87，901-903和Shaffer，J.E.；Adkison，K.K.；Halm，K.；Hedeen，K.；Berman，J.J.Pharm.Sci.1999，88，313-318)。然而這些方法伴有缺點。盒式給藥會增加動物中不利效應和藥物-藥物相互作用的可能性，并且損害生物分析。對于血漿樣品的后給藥混和集中，生物分析也會由于樣品稀釋和為防止LC-MS/MS中不當的共洗脫與隨后的離子抑制的額外方法發展時間而被損害。
發明描述本發明目的在于通過設計并確立一種分析方法來增加常規大鼠PK研究的活體(in life)或體內部分的通量，該分析方法為采用隱靜脈的新iv施用途徑與血液取樣的組合，所述取樣特別是通過清醒大鼠中尾靜脈的多次血液取樣。該分析方法也可以包括合適的生物分析技術以進行對血液/血漿樣品的處理/分析和對主要PK參數的估計。
本發明因此涉及確定清醒大鼠中藥物代謝動力學參數的分析方法，包括以下步驟(a)通過隱靜脈靜脈施用化學個體；(b)從尾靜脈取血樣。
在本申請的上下文中，CE是任何天然或合成來源的化合物或化學物質，例如但不限于藥物、活性化合物、維生素、蛋白質和病毒。
隱靜脈施用在本申請的上下文中，隱靜脈是位于后肢表面以使血液從后肢流出的靜脈。
幾種關于大鼠PK研究的活體階段(給藥施用和血液取樣)的方法已經應用于工業，且所有的方法均有其優缺點。對于iv給藥途徑和取樣而言，現有技術描述如下1)分別向尾靜脈iv施用和從尾靜脈取樣；優點在于不需要準備性手術，但是血樣可能由于在施用位點殘留的殘余給藥溶液而在早期取樣時間點被污染。并且，若一個靜脈取樣不好，則其它側脈會由于取樣過度而受損；2)尾靜脈施用和經由眼窩神經叢取樣；優點在于給藥和取樣是來自兩個分離的位點且不需要準備性手術，但是動物在抽血之前必須被麻醉。在24h時期內，每只動物僅應經歷有限次的此類工序。必須采用數只動物來在所需時間點獲得足夠血樣，從而能夠構建充分的濃度時間曲線和PK參數；
3)尾靜脈施用和從頸動脈/頸靜脈連續取血；優點在于給藥和取樣是來自兩個分離的位點且可在同一動物內頻繁取出少量血樣用于充分描述血漿濃度時間曲線，但是需要準備性手術。對于經由留置的頸靜脈插管的iv施用與從尾靜脈取樣的組合，也存在相同問題；4)iv施用和從同一留置的頸靜脈插管取血；優點在于可在同一動物內頻繁取出少量血樣用于充分描述血漿濃度時間曲線，但是由于殘余的給藥溶液保持在插管中，早期時間點的血液樣品可能被污染，并且也需要準備性手術。
5)通過隱靜脈的iv施用和從麻醉大鼠的尾靜脈取血(EP 1 284 139A1，公開于2003年2月19日)。與本申請的區別在于實際上大鼠是清醒的而非被麻醉。盡管這一區別可能看上去較小，但是以前從未公開過根據本發明的方法，盡管在該科學領域進行并公開了大量的工作。顯然，本發明克服了技術偏見，且進一步提供o.a.下述優點消除了施用的化學個體與麻醉劑和/或麻藥例如戊巴比妥鈉之間的相互作用。不言而喻，在根據本發明的方法中，尤其是在測試CNS-藥物例如抗-抗焦慮藥、安定藥、抗抑郁藥和抗痛藥的情況下，可能被麻醉劑和/或麻藥的施用影響的其它參數不會受到影響。還進一步提供了在不擾亂例如大鼠的代謝的情況下以快得多的速率從同一大鼠中抽取樣品的優點，因為大鼠不需要在被麻醉之后清醒過來。
本發明的一個方面是設計并證實一種新的iv施用途徑，該途徑經由直接注射CE進入清醒大鼠的隱靜脈。該方法a.o.減少了準備性手術和康復過程(1-2天)。具有不同化學結構(n＝11)的CE經由頸靜脈或隱靜脈施用。在不同時間點采用多次血液取樣技術經由尾靜脈取血(參見下文)，為合適的CE而分析血漿樣品，并且比較兩種iv途徑之間的主要PK參數。
需要指出，隱靜脈是血液取樣現有技術中已知的(A.Hem，A.J.Smith and P.Solberg Laboratory Animals 1998，32，364-368)。
多次血液取樣對于血液取樣工序而言，有幾種用于在所需時間點收集樣品的現有技術方法。一個可能性是CE被施用到一組動物(例如n＝3)，其在合適的時間點被殺死以收集血液(通過斷頭)。其優點在于可獲得大量血液樣品，然而如今LC/MS/MS的使用允許收集并分析極小量的樣品。源自該方法的血漿濃度水平獲得自一組多只動物的血液樣品，每只動物在不同時間點被取樣。對因此，主要PK參數的數據分析和計算只能在平均血漿濃度時間曲線上進行。因此該取樣方法并不允許研究PK結果中個體之間的變化。主要缺點在于該研究需要大量動物。
本發明的另一方面在于研究新的取樣方案，其中在不同時間點從同一大鼠的尾靜脈抽取血液樣品，尤其是多個血液樣品。多次血液取樣的方法使得從單只動物獲得充分的濃度時間曲線，允許從每只動物來計算主要PK參數。以這種方式，動物之間的變化性可得以檢查，并且對一種CE進行常規生物利用度研究所需的動物數量可得以顯著減少。具有不同化學結構的CE被口服施用到大鼠內，并且血液通過單次血液取樣(斷頭)或通過在多個時間點從尾靜脈的多次取樣抽取。為合適的CE而分析樣品，并且比較兩種取樣技術之間的血漿濃度時間曲線和計算出的PK參數。需要來自每只大鼠的、數目和體積均足夠的血液樣品，以能夠構建合適的血漿濃度時間曲線，以進行合適的取出工序以及隨后的LC-MS/MS分析，但是不影響動物健康。因此，在以不同體積經過所需時期取出血液之后，得以對多次取樣對于血液學參數例如血細胞比容(Hct)的影響加以研究。
因此，本發明進一步涉及確定清醒大鼠中藥物代謝動力學參數的分析方法，其中步驟(b)中多個血液樣品從尾靜脈取得。
本發明進一步涉及確定清醒大鼠中藥物代謝動力學參數的分析方法，其中該方法進一步包括步驟(c)，其被合并在步驟(b)之后，其中采用生物分析技術分析血液/血漿樣品以確定藥物代謝動力學參數。
試驗1.材料和方法1.1.動物在研究中采用雄性SPF Sprague-Dawley大鼠(200-300g，CharlesRiver，Germany)。在研究的各個部分之前允許動物馴化1周。可隨意獲取自來水和食物。
1.2.多次血液取樣技術的確立為經由尾靜脈進行多次血液取樣，將動物置于ScientificInstrument Division(Johnson & Johnson，Pharmaceutical Research andDevelopment，division of Janssen Pharmaceutica)開發的嚙齒動物筒形限制器內。采用紅外燈將大鼠尾部溫熱以幫助取樣。用27G針將靜脈血液收集進含有EDTA(Sarstedt，Germany)的Multivette 600KE管。
1.2.1.多次血液取樣對血細胞比容水平的影響對經過所需取樣時期取出的血液體積對大鼠Hct水平的影響加以研究(每組n＝5)。比較多次(7×)0.3ml(血液體積共2.1ml)和0.4ml(血液體積共2.8ml)的血液取樣體積。在7和20分鐘、1、2、4、8和24小時抽取血液。
使用診斷儀器(Advia 120，Bayer Diagnostics，Brussel，Belgium)計算Hct的％體積，其分析全血以對白和紅血細胞、血小板和網織紅細胞進行計數。
1.2.2.確立多次取樣方法的藥物代謝動力學在口服施用之后，研究不同化學結構的血漿濃度曲線和主要的PK參數。通過多次或單次取樣方法從尾靜脈取出血液樣品。
1.2.2.1.試驗化合物和配方對于兩種方法而言，每種化合物采用相同配方以確保結果中的任何差異并非由配方影響。試驗化合物JNJ1(法呢基轉移酶化合物)，JNJ2(加蘭他敏(galantamine hydrobromide))和JNJ3(CRF拮抗劑)在軟化水或10％羥丙基--β環糊精(HP--CD)溶液中以0.25-1mg/ml的最終濃度配制。所有配方都在室溫下儲存，避光保護并且定量分析。通過胃插管法用10ml/kg的體積對動物進行口服給藥。
1.2.2.2.血液取樣在給藥化合物之后，在所需時間點取出血液樣品。對于單次取樣方法而言，在每個時間點通過斷頭殺死三只動物，并且通過放血將血液收集到10mlB-D無菌EDTA K3 Vacutainer管中。對于多次取樣技術而言，按如上所述，從尾靜脈重復收集0.3ml靜脈血液。對于每種化合物，采用3只大鼠進行完整的血漿濃度時間曲線。對于合適的化合物，采用2.4節所述的單個合格的研究LC-MS/MS方法分析血漿樣品。
1.3比較在經由頸靜脈或隱靜脈施用之后的血漿PK參數比較在清醒的大鼠中經由頸靜脈(導管)或隱靜脈(直接注射)施用之后，覆蓋了不同疾病標靶和化學種類/結構的化合物(n＝11，在此并未全部報導)的血漿濃度曲線和主要PK參數。
1.3.1.試驗化合物和配方對于兩種iv施用途徑而言，每種化合物采用相同配方以確保結果中的任何差異并非由配方影響。化合物(n＝11；其中為JNJ4(具有5HT2-拮抗作用、D2-拮抗作用和SSRI活性的安定藥)，JNJ5(NK123-拮抗劑)和JNJ6(HSD11β拮抗劑)配制為水溶液或HP-β-CD溶液(10-20％，pH范圍4-7)，最終濃度為1.25mg/ml。所有配方由甘露醇制成等滲液，在室溫下儲存，避光保護并且定量分析。對于所有化合物，配方的兩種施用途徑均以2ml/kg給藥。
1.3.2.靜脈注射途徑1.3.2.1.經由頸靜脈的iv施用在全身麻醉情況下將留置插管放入頸靜脈。在無菌條件下進行手術；進行手術的所有表面上均蓋有無菌吸水不透手術臺布(Unidrape，Vygon，France)，手術儀器在1/10的氯己定(5％)/乙醇(70％)混合物中滅菌，用無菌手術無粉手套(NuTex，Ansell Medical，Malaysia)進行手術。在30/70的O2/N2O混合物中在4％異氟烷(Forene；Abbott，England)下引入麻醉和氣管插管。在30/70的O2/N2O混合物中采用1.5％異氟烷將大鼠保持全身麻醉。從SilasticLaboratory管材(4cm，ID 0.64mm OD 1.19mm；Dow Coming，USA)和聚乙烯管材(4cm，PE 50；ID 0.58mm且OD 0.965mm；Becton Dickinson，Belgium)來構建iv導管。該導管由Loctite 404工業粘合劑(Loctite，USA)固定到一起。將導管插入頸靜脈并且推入鎖骨下以允許良好的血液抽取。導管的位置通過將血液返回到插管且隨后由肝素化鹽水(100I.U./ml；Heparin Leo，Belgium)沖洗而得以驗證。采用兩條縫線將導管固定在適當位置。用肝素化鹽水再次充滿插管以保持其通暢。該插管從皮下穿過并且采用大針穿過頸背中的小切口而穿出(externalised)。插管末端由可取出的鋼塞封閉。所有傷口采用無菌縫線縫合(Mersilk4/0，Ethicon，Belgium)。在給藥施用之前允許所有動物在單獨的籠子里恢復48小時并且自由獲取食物和自來水。配方給藥之后(n＝3，對于各化合物)，用0.1ml鹽水沖洗導管。
1.3.2.2.經由隱靜脈的iv施用用連接于聚乙烯管PE 10(ID 0.28mm和OD 0.61mm；BectonDickinson，Belgium)的針(MicrolanceTM3，27G3/4，0.4×19，BectonDickinson，Ireland)經由隱靜脈向清醒大鼠(n＝3，對于各化合物)直接注射。在施用之前，給大腿刮毛，并且在近側輕微夾捏隱靜脈以使其更加可見。在給藥施用期間用毛巾限制大鼠。
1.3.2.3.血液取樣在給藥7和20分鐘、1、2、4、8和24小時后通過多次取樣技術收集各血液樣品(0.3ml/時間點；總血量2.1ml)。對于每種化合物和每種施用途徑，針對完整的血漿濃度時間曲線，使用3-5只大鼠。采用如下所述的單個合格的研究LC-MS/MS方法為合適的化合物分析血漿樣品。
試驗方案遵照NIH公布的“Principles of Laboratory AnimalCare”(1985)。
1.4.生物分析1.4.1.方法進展根據FDA(Guidance for Industry，Bioanalytical method validation，US department of Health and Human Services，Food and DrugAdministration，CDER，2001)的生物分析方法確認(validation)在發現、早期發展或理論PK研究中并非必需的。然而，采用能夠提供具有足夠準確度和精確度的血漿濃度以產生有效決定的分析方法是必要的。為了該目的，針對每種化合物開發合格的研究LC-MS/MS方法。所得方法顯示了與FDA標準相似的準確度和精確度，這是通過校正曲線和與每一組研究樣品一起分析的獨立的質量對照樣品的統計學顯示的。此外，研究有限的血漿穩定性(37℃，2h)以覆蓋動物取樣和分析之間血漿樣品的所有變化(manipulations)。沒有研究試驗之間的準確性和精確度。
1.4.2.樣品制備對于所有的化合物，在空白EDTA大鼠血漿中構建單個校正曲線(覆蓋了預期的濃度范圍)。在大鼠EDTA血漿中以4種濃度水平，采用兩份重復制備獨立的質量對照樣品(QC)，覆蓋了整個校正范圍。用普通樣品制備方法取出研究樣品、校正和QC樣品。在樣品制備之后，在聚丙烯自動取樣器小瓶中滴定(重組)殘余物并且采用單種合格的研究方法分析。
1.4.3.LC-MS/MS用偶聯于串聯質譜法的多反應監控(MRM)液相色譜(LC-MS/MS)(API-3000或4000，Applied Biosystems，Canada)分析各等分殘余物。在不同商品名的商業性堿去活C-18柱上獲得色譜分離，這取決于待分析的化合物的色譜行為。
質譜儀在TurboIonSprayTM模式(正離子電噴射電離)下工作。對于各化合物，使質譜儀最優化以測量選擇性母子轉變(parent-daughter transition)。采用1.2版本的Analist軟件(Applied Biosystem，Canada)進行色譜峰的積分。使用線性回歸模式，從校正曲線響應通過內插法計算出最終濃度。所有化合物的準確度和精確度處于期望值內，從而允許了準確的PK計算。
1.5.數據分析使用WinNonlinTMProfessional(3.3版)進行有限的PK分析。對于單次取樣方法，在平均血漿濃度曲線(n＝3/時間點)上進行非區域(non-compartmental)數據分析。對于多次取樣方法，在獲得自各動物(n＝3)的血漿濃度曲線上進行非房室(non-compartmental)數據分析。隨后計算平均值以比較多次和單次取樣方法。計算的PK參數是觀察到的最大血漿濃度(Cmax)、達到最大血漿濃度的時間(Tmax)、血漿半衰期(t1/2)和由曲線下的面積計算得到的化合物暴露量(AUClast和AUCinf)。為比較注射途徑(頸靜脈和隱靜脈)，確定每只單獨的動物的主要參數半衰期(t1/2)、分布體積(Vdss(區域分析)或Vdz(非區域分析))、總血漿清除率(Cl)和曲線下的面積(AUClast和AUCinf)，從而允許動物之間的比較。
2.結果2.1.多次血液取樣技術的確立2.1.1.多次血液取樣對于血細胞比容水平的影響附
圖1顯示了在以0.3ml體積多次取樣之后大鼠(n ＝6)中體積％血細胞比容(Hct)。最初的血液樣品顯示Hct值為42-45體積％，中值為42％。中值Hct值略微下降，導致在最后的取樣點(t＝24h)為39％。單因素ANOVA以及事后(post hoc)學生t-實驗顯示在第5次血液樣品(t＝8和24h)后Hct水平相對于最初的時間點顯著(p＜0.05)下降。然而，這些水平(37-42％)依然在健康大鼠的期望值范圍內(36-48％)(Havenaar，R.；Ritskes-Hoitinga，J.；Meijer，J.C.；Zwart，P.Biologie en zootechniek.In Proefdieren En Dierproeven；vanZutphen，L.F.M.，Baumans，V.，Beynen，A.C.，Eds.；Wetenschappelijke uitgeverij BungeUtrecht，1991；pp.20-74)。
附圖2顯示了在以0.4ml體積多次取樣之后大鼠(n＝6)中體積％血細胞比容(Hct)。最初的血液樣品顯示Hct值為42-51體積％，中值為44％。中值Hct值略微下降，導致在最后的取樣點(t＝24h)為38％。單因素ANOVA以及事后學生t-實驗顯示在第2次血液樣品(t＝1、2、4、8和24h)后Hct水平相對于最初的時間點顯著下降。在t＝24h，這些水平為35-39％。
2.1.2.多次取樣方法的藥物代謝動力學確認表1-3中顯示了口服各化合物(此后稱為JNJ1，JNJ2和JNJ3)之后，單次或多次血液取樣后的單個或平均的基本PK參數。可從結果中看出，對于所示三種化合物，這兩種取樣技術都產生了可比較的PK參數。將JNJ1作為例子，對于多次取樣組，平均最大血漿濃度(Cmax)在1±1h達到63.6±17.5ng/ml，而單次取樣組在1h達到41.4ng/ml。對于多次取樣組，半衰期(t1/2)是2.02±0.3h，單次取樣組是1.92h。對于多次取樣組，通過AUCinf測量的暴露量是294±46ng.h/ml，而單次取樣組是224ng.h/ml。對于其它兩種JNJ化合物，該圖保持不變。從多次取樣組觀察到的血漿濃度和主要PK參數方面的動物間的變化性低。
2.2.在經由隱靜脈或頸靜脈施用之后的血漿PK參數的比較通過兩種途徑給藥11種化合物(在此并未全部報導)。所有化合物都在血漿濃度時間曲線和主要PK參數水平顯示了可相當的結果。作為例子，在通過頸靜脈插管或直接進入隱靜脈將2.5mg/kg的化合物JNJ4、JNJ5和JNJ6單次iv施用之后的血漿濃度時間曲線和基本PK參數在表4-6中呈現并且在圖3-5中繪制。從結果中可看出，對于所示三種化合物，這兩種取樣技術都產生了可相當的血漿濃度時間曲線和主要PK參數。將JNJ4作為例子，兩種施用途徑的平均(n＝5)血漿濃度時間曲線顯示了相似的模式(附圖3)。血漿濃度單相下降，對于頸靜脈施用，計算的半衰期(t1/2)是2.9h，對于隱靜脈施用來說是3.2h(表4)。對于頸靜脈施用，估計平均血漿清除率(Cl)為1.7l/h/kg，對于隱靜脈施用是1.6l/h/kg。對于頸靜脈施用，估計平均分布體積(Vdss)為7.3l/kg，對于隱靜脈施用是7.5l/kg。對于頸靜脈施用，計算的平均暴露量(VUCinf)是1445ng.h/ml，對于隱靜脈施用是1512ng.h/ml。從關于JNJ5的圖4可看出，血漿濃度直到給藥后8小時才可檢測到。然而，可計算出相似的濃度時間曲線和相應的PK參數(表5)。
可從圖表中看出，JNJ6的血漿濃度在第一小時下降得很快，在隨后的時間點產生低血漿水平(附圖5)。來自兩種施用途徑的PK參數在血漿清除率和AUC(曲線下的面積)方面顯示了可比較的值，但是在最終血漿半衰期和分布體積的值方面顯示了較大區別(表6)。這是由于在給藥后2-24小時之間血漿濃度中的少量下降。總體上，就大鼠而言，認為該范圍的血漿半衰期長且分布體積高。根據通過該化合物進行的其它研究(在此并未報導)，該化合物廣泛分布于主要器官，這確證了在此觀察到的高分布體積值。
3.討論3.1.多次取樣技術單次血液取樣的方法是研究大鼠中血漿PK所用的數種方法之一。源自該方法的結果獲得自多只動物，在不同時間點取樣并且混和集中(在每個時間點的血液樣品或分析的數據)。隨后在混和集中的數據的平均血漿濃度時間曲線上進行對主要PK參數的數據分析和計算。該取樣方法并不允許研究動物之間的PK結果中的變化。因此探索了涉及在各動物中多次取樣的新取樣方案。從各大鼠取出足夠的血漿樣品以構建合適的濃度時間曲線，但是不影響動物健康，即以Hct的水平影響。在Hct中的變化顯示了血細胞數量改變，這可能影響很多內源或外源物質的結合和分布并且由此是藥物的PK中的重要因素。在經過所需時期以不同體積取出血液之后，檢查大鼠的Hct水平。血液樣品的多少必須是足以進行生物分析的體積，即適合抽取工序和隨后的LC-MS/MS分析。看上去在7個不同的時間點(t＝7和20分鐘、1、2、4、8和24h)經由各動物的尾靜脈以0.3ml體積進行的取樣(總體積為2.1ml/天)對大鼠的Hct值影響有限。盡管由于血樣的取出，在Hct的％體積方面有所下降，但是最后的血液樣品的值(37-42％)仍然處于健康大鼠預期值范圍(36-48％)以內。7通過0.4ml體積的取樣(總體積2.8ml)看上去對Hct值有更大的影響。體積％Hct在第二次血液樣品之后開始顯著下降并且在最后(t＝24h)血液樣品顯示出低于健康大鼠預期的值(35-39％)。這些數據顯示具有在24小時內2.1ml總體積的血液取出對于Hct水平沒有明顯影響，而在高于2.4ml的體積時，這些值開始下降到預期的健康水平之下。然而，需要提及的是這些水平是仍然是邊界。為使得取樣體積對Hct值的影響最小化，對于進一步的研究推薦每天總取樣體積為2.1ml或更低。在每個時間點從尾靜脈取出0.3ml血液使得能從每只動物抽取足夠的樣品(7)，以充分描述血漿濃度曲線和對主要PK參數的計算。
采用多次和單次取樣技術在所示化合物的血漿濃度曲線上進行的PK研究結果的比較使得該比較以及隨后的新取樣方法的確認可行。該結果闡述了在限定的時間點從三只動物取出的7份少量(0.3ml)血樣給出了與在每個時間點采用三只動物可相當的結果，且因此該多次取樣技術可用作備選方法。多次取樣方法的優點在于在不同的時間點的多個血液樣品可從同一動物抽取，從而可檢查動物間的變化性。對于該三種化合物而言，其顯示實際上動物間的變化性是低的。并且其顯著地減少了對于一種CE進行常規生物利用度研究所需的動物數量。該取樣方法是耐用且可再現的，并且現已在大鼠中的所有生物利用度研究中實施。
當采用該取樣技術時，由于來自施用位點的污染危險以及隨后的取樣問題(由于過度使用和靜脈的萎陷)，因此理想的是尾靜脈不應用作化合物的iv施用途徑。為克服這一方面，在我們的藥物發現小組中，化合物是經由留置頸靜脈導管通過注射常規施用的。然而，在麻醉條件下將留置導管放入頸靜脈是費時的(用于手術和康復時間)并且引起一些動物創傷。因此，探索了一種新的iv施用途徑，經由清醒大鼠中隱靜脈直接注射。
3.2.隱靜脈施用隱靜脈相對于頸靜脈較小，然而，經過該注射位點的血液流應當具有足夠的能力來將化合物攜帶到全身循環。這種新技術的優勢在于相比于導管的長期植入，不會出現任何血管結扎，使得動物中的血液供應保持不變。另一優勢在于由于不需要手術和康復時間，其節約了時間。這進而幫助在根據iv PK參數對NCE進行的檢查中加快通量。本研究被設計來探求經由隱靜脈的施用是否產生與使用傳統施用技術(經由頸靜脈)之一所獲得的相似PK曲線。具有化學結構與溶解性多樣性的化合物被用于顯示，這種新的技術可用于很多種化學研究，包括不同的疾病區域標靶(5)和不同配方(蒸餾水，10-20％羥基-β-環糊精)。在經由兩種不同途徑給藥12種不同化合物之后，對所得PK結果的比較顯示，直接注射進入隱靜脈，結合從尾靜脈的多次取樣，產生了與在頸靜脈施用并且采用同樣的血液取樣方法之后產生的相似血漿濃度曲線和可比較的PK結果。對于所有化合物，顯示經由兩種iv途徑的施用產生了一些個體間的血漿濃度水平變化性，但是這處于在用動物進行操作時所預期的并且可接受的范圍之內。
3.3.結論該新技術減少了準備性手術和康復所需的時間(1-2天)，并且因為濃度時間曲線可以從每只動物收集，從而允許了對主要PK參數進行動物間的比較。常規少量血液樣品的取樣對大鼠的Hct并沒有任何重大影響，且對于生物分析考慮而言是相容的。最后，如果與在每個時間點使用單個動物的那些或者包括麻醉的取樣工序相比較，其可能減少這種常規研究所需的動物數量。
結合多次取樣技術，該經由隱靜脈的新施用途徑將常規地用于藥物發現中需要iv施用的所有進一步的大鼠研究。
權利要求
1.用于確定清醒大鼠中藥物代謝動力學參數的分析方法，包括以下步驟(a)通過隱靜脈靜脈施用化學個體；(b)從尾靜脈取血樣。
2.根據權利要求1的分析方法，特征在于步驟(b)中多個血液樣品從尾靜脈取得。
3.根據權利要求1或2任一項的分析方法，特征在于該方法進一步包括步驟(c)，所述步驟(c)合并在步驟(b)之后，其中采用生物分析技術分析血液/血漿樣品以確定藥物代謝動力學參數。
全文摘要
持續需要在根據體內藥物代謝動力學(PK)參數對新化學個體(NCE)進行的檢查中增加產量。目標在于確立一種產生更高產量的新研究方法，檢查動物間變化性和減少清醒大鼠中NCE的常規生物利用度研究所需的動物數量。該設計采用經由隱靜脈靜脈(iv)施用，結合經由尾靜脈的連續血液取樣的新方法。比較了該多次取樣方法與單次取樣(斷頭)，研究了其對于血細胞比容(Tct)水平的影響。將在隱靜脈中直接注射與采用留置頸靜脈導管的iv施用相比較。采用結構不同的CE，顯示出經由隱靜脈的直接注射與從尾靜脈的多次取樣的聯合產生了可與比較方法比擬的血漿濃度和隨后的PK結果。而且，采用每天至多2.1ml的總血液取樣體積，Hct水平保持在推薦水平內。新技術通過減少準備性手術所需的時間，增加了產量，通過允許動物間主要PK參數的比較提高了質量，因為濃度時間曲線可以從每只動物中收集，并且減少了所需動物數量。
文檔編號G01N33/50GK1961213SQ200580017201
公開日2007年5月9日 申請日期2005年5月24日 優先權日2004年5月28日
發明者C·E·麥基, M·J·A·哈塞爾頓克斯, S·S·布洛克蘭德, K·伍伊茨, P·C·吉塞姆伯格, I·J·M·費爾赫文, P·M·M·B·L·蒂默曼, M·J·M·A·尼森 申請人:詹森藥業有限公司
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