專利名稱：游離四碘甲狀腺素檢測微粒、其制備及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及游離四碘甲狀腺素的診斷試劑，具體涉及基于光激化學發光原理的游 離四碘甲狀腺素檢測微粒、其制備及應用。
背景技術：
甲狀腺疾病是一組較常見的內分泌疾病，包括缺碘性甲狀腺腫、其他原因引起的 甲狀腺腫、甲亢、甲狀腺瘤、甲狀腺炎、甲狀腺功能減退等。甲狀腺病的發生率比較高。甲亢也就是甲狀腺功能亢進癥，它是一種臨床上十分常見的內分泌疾病。是指由 各種原因導致甲狀腺功能增強，甲狀腺激素分泌過多或因甲腺原氨酸(T4)在血液中水平 增高所導致的機體神經系統、循環系統、消化系統心血管系統等多系統的一系列高代謝癥 候群以及高興奮癥狀和眼部癥狀。甲狀腺機能減退癥系甲狀腺激素TSH合成與分泌不足，或甲狀腺激素生理效應不 好、生物效應不足而致的全身性疾病。臨床上可分為呆小病、幼年甲低、成人甲低。若功能 減退始于胎兒或新生兒期，稱為克汀病；始于性發育前兒童稱幼年型甲減；始于成人稱成 年型甲減。甲狀腺瘤是臨床常見病，其中絕大多數為良性病變，少數為癌，肉瘤、惡性淋巴瘤 等。該病女性發病率明顯高于男性，男女發病比例約1 2 3。甲狀腺炎是以炎癥為主要表現的甲狀腺疾病，包括感染性和非感染性。不少見。臨 床權威上所說的急性、亞急性及已經慢性甲狀腺炎，只表明青年疾病過程的長短，它們之間 無內在聯系，也不互相轉變，每種具有發表不同的病因、有著臨床特點、病理過程及固有的結局。四碘甲狀腺素3，5，3' ,5' -tetraiodo-L-thyronine縮寫T4，是從甲狀腺濾泡 上皮分泌產生的激素，釋放入血后，T4絕大部分都與TBG結合，通過與細胞核內特異受體蛋 白結合，誘導該蛋白產生活性構象，使其DNA結合部位與DNA的特定部位有效結合，從而激 活DNA的轉寫過程，達到調節基因表達的生物功能。其中約0. 03%的總血清T4呈游離狀 態(FT4)，是T4的生理活性形式，是甲狀腺代謝的真實反映，與結合激素動態平衡，維持正 常的生理功能。FT4比T4更靈敏，更有意義。FT4測定是臨床常規診斷的重要部分，可作為 甲狀腺抑制治療的檢測手段，當懷疑甲狀腺功能紊亂時，常作TSH、FT3和FT4三項聯檢，確 認甲狀腺疾病以及追蹤療效。因此，檢測血清FT4對于甲狀腺功能亢進、甲狀腺功能減低及 甲狀腺腫瘤的診斷或鑒別診斷，對甲狀腺功能相關疾病的發展過程、療效及預后評估中具 有十分重要的意義。血清中FT4濃度高于正常值，可能是(1)甲狀腺機能亢進；(2)甲狀腺激素不敏 感綜合癥；(3)低T3綜合癥；(4)某些藥物影響(如乙胺碘呋酮等)。血清中濃度低于正常值，可能是(1)甲狀腺疾病原發性甲狀腺功能低下癥、亞 臨床甲減、新生兒甲減；(2)藥物影響抗甲狀腺藥物；(3)甲亢治療過量可導致下降。免疫學檢測是基于抗原和抗體的特異性反應進行檢測的一種手段，由于其可以利用同位素、酶、化學發光物質等對被檢測信號進行放大和顯示，因此常被用于檢測蛋白質， 激素等微量生物活性物質。我國免疫學檢測基本經歷了放射免疫檢測(興起于20世紀70年代，現仍普遍使 用于縣級以上醫院)；酶聯免疫檢測(興起于20世紀80年代，各臨床機構普遍使用)；以化 學發光為代表的光生物學標記及免疫檢測技術(20世紀90年代開始推廣使用，產品步入成 長期)三個階段。這一衍變過程主要是基于對檢測方法的敏感性、準確性、以及操作簡捷性 的需求的不斷提高而決定的。化學發光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay)是近十年來在世界范圍內 發展非常迅速的非放射性免疫分析技術。檢測原理是以發光物質作為信號放大系統并籍助 其發光強度直接測定免疫結合。由于其高靈敏度，檢測范圍寬等優點，已成為放射性免疫分 析與普通酶免疫分析的取代者，是免疫學檢測重要的發展方向。但目前國內自行研制的化學發光檢測試劑，大多為非均相反應，采用化學底物直 接標記，通過化學反應激發。其分析過程與傳統酶標檢測類似，需反復清洗與分離，檢測耗 時長，自動化程度不高。國外廠家檢測試劑隨發光基質與檢測形式而各不相同。以Abbott， Bayer與Chiron等公司為代表的化學激發，即以化學發光底物直接標記抗原或抗體進行免 疫測定。最常用的為吖啶酯，在堿性環境中可被過氧化氫氧化而發光。BD則以AKP，金鋼 脘為基質采用酶促化學發光。Roche為則采用電化學發光(electrochemiluminescence， ECL)，發光底物二價的三聯吡啶釕及反應參與物三丙胺在電極表面失去電子而被氧化。氧 化的三丙胺失去一個H+而成為強還原劑，將氧化型的三價釕還原為激發態的二價釕，隨即 釋放光子而恢復為基態的發光底物。這一過程在電極表面周而復始地進行，不斷地發出光 子而常保持底物濃度的恒定。因反應過程中牽涉到分離清洗，自動化設計復雜，儀器相當昂 貴。此外，發光基質的穩定性也是一大問題。光激化學發光法通過引入激光技術與納米微球技術，成功地解決了上述不足。因 反應在均相中進行，既加快了反應速度，又避免了反復分離與清洗步驟，能有效降低檢測背 景值，減少反應時間，并可實現自動化操作。
發明內容
本發明的目的是提供一種可用于定量檢測血清中游離四碘甲狀腺素的檢測微粒， 其制備、檢測條件及應用。本發明的技術原理本發明的游離四碘甲狀腺素檢測試劑及試劑盒與光激化學發光檢測技術相關，光 激化學發光免疫技術是一種利用化學發光物質發射的光波進行免疫測定的方法。該技術主 要整合了高分子微粒技術，有機合成，蛋白質化學與臨床檢測相關領域的研究。本發明之所以能檢測血清中的游離四碘甲狀腺素的水平，是由于在均相條件下， 將內部帶有染料的感光微粒(納米級)以及包被有三碘甲腺原氨酸(T3)。并且內部帶有發 光化合物的發光微粒(納米級)的混合物作為試劑和檢測樣品混合。T3又名三碘甲腺原氨 酸，是一種從甲狀腺分泌出來的激素，是一組含碘的酪氨酸，以碘和酪氨酸為原料在甲狀腺 腺細胞內合成。T3分泌量較少，但其活性大，是T4的5倍。T3在甲狀腺外，可以由甲狀腺 素的脫碘化形成，兩者在結構上極為相似。血液中的T3絕大部分與TBG結合，約0. 4%的游離T3作用于靶細胞，維持正常的生理功能。約20%循環中T3由甲狀腺產生，其余80%主要來自肝臟，由T4的外環脫碘(5' D-I)轉換產生。T3分子式為C15H12I3N04，結構如下所示 由于T4和T3分子結構十分相似，因此T3可和針對T4的抗體發生微弱的結合。當血清中存在FT4時，這一脆弱的結合即被破壞，被FT4和T4抗體的結合取代。此時納米感光微粒和包被有表面抗體的納米發光微粒可迅速有效地捕捉游離四 碘甲狀腺素(FT4)，在近距離內，三者形成免疫夾心復合物。激發光照射后，納米感光微粒中 的染料被誘導激活，并釋放高能態的活性氧離子(單線態氧)。該高能態的活性氧離子被近 距離的納米發光微粒俘獲，從而傳遞能量以激活所述發光微粒中的發光化合物。數微秒后， 發光微粒中的發光化合物將釋放出高能級紅光。用光子計數器測定這些高能級光子，并通 過電腦將光子數換算為目標分子濃度，光子數的多少即精確地反映了目標分子的濃度。而 當樣本不含游離四碘甲狀腺素(FT4)時，無法在近距離形成免疫夾心復合物，活性氧離子 也無法傳遞至發光微粒表面。活性氧離子在液相中迅速衰減，檢測時則無高能級紅光產生。 具體原理參見圖1及圖2。基于上述原理，本發明第一方面提供了一種用于檢測游離四碘甲狀腺素(FT4)的 檢測微粒，為三碘甲腺原氨酸(T3)包被的發光微粒。本發明第二方面提供了一種游離四碘甲狀腺素(FT4)的檢測試劑盒，包括上述三 碘甲腺原氨酸(T3)包被的發光微粒。試劑盒中，還可包括生物素標記的抗四碘甲狀腺素抗 體(T4Ab)和親和素包被的感光微粒。在試劑盒中，上述三碘甲腺原氨酸(T3)包被的發光微粒、生物素標記的抗四碘甲 狀腺素抗體(T4Ab)和親和素包被的感光微粒分別獨立包裝，且均為混懸液。上述含有三 碘甲腺原氨酸(T3)包被的發光微粒、生物素標記的抗四碘甲狀腺素抗體(T4Ab)或親和素 包被的感光微粒的溶液的溶劑可以是常規的適合抗原抗體反應的溶劑體系，如HEPES緩沖 體系、Tris緩沖體系。三碘甲腺原氨酸(T3)包被的發光微粒的溶劑優選pH8.0的成分為T4分子式為C15H11I4N04，結構如下所示
HEPES、NaCl和EDTA-Na_2H20的HEPES緩沖液，生物素標記的抗四碘甲狀腺素抗體(T4Ab) 的溶劑優選PH8. 0的成分為Tris、NaCl和EDTA-Na_2H20的Tris緩沖液，親和素包被的感 光微粒的溶劑優選HEPES、NaCl和EDTA_Na_2H20的HEPES緩沖液，上述各種溶劑中還可添 加起封閉和蛋白保護作用的物質如BSA以及防止微粒聚集的穩定試劑如Tween20，出于對 試劑防腐以及長期儲存的考慮還可在溶劑中添加防腐劑，防腐劑優選100U/ml慶大霉素和 質量百分比為萬分之五的Proclin 300作為防腐劑。在用于定量檢測游離四碘甲狀腺素(FT4)時，上述試劑盒中還可包括含有多種已 知四碘甲狀腺素濃度的溶液。上述不同四碘甲狀腺素濃度的溶液分別獨立包裝。上述發光微粒是指填充有發光化合物和鑭系元素化合物的高分子微粒。發光化合 物可以是Dioxene (二氧雜環己烯)或thioxene (二甲基噻吩)的衍生物等，鑭系元素化合 物可以是Eu (TTA) 3/TOPO或Eu (TTA) 3/Phen等，該微粒可由市場上購得。研究發現，由于最終的檢測反應是均相反應，發光微粒的粒徑(微粒的平均直徑) 太大(>400nm)會自然沉降，影響檢測效果，微粒的粒徑太小(< lOOnm)，會使制備過程中 的清洗工作比較困難，對抗體連接工作不利，因此發光微粒的粒徑范圍應在100-400nm之 間，較好為150-300nm之間，優選250nm。發光微粒的表面官能團可以是任何能聯接蛋白質的基團，但最常用的主要有羧基 和醛基表面官能團的微粒。使用不同的微粒表面官能團，連接抗體的反應方式和條件也不 相同。鑒于獲得更好的三碘甲腺原氨酸(T3)的連接效率，試劑穩定性和連接重復性，經 試驗優選醛基表面官能團的微粒，并應用了 NaBH3CN的還原胺化反應作為抗體的連接方法。發光微粒的發光量會直接影響最終檢測的發光效果。市場提供的發光微粒發光量 一般會在150，000——350，000光子數/100 u g發光微粒范圍內，優選中等強度偏上的水平 (彡250，000光子數/100ug)發光微粒。上述三碘甲腺原氨酸(T3)包被的發光微粒中，發光微粒與三碘甲腺原氨酸(T3) 的質量比例較佳為10 (0.01-0. 1)，優選10 0.05。上述生物素標記的抗體(T4Ab)中，生物素與抗體的分子比例較佳為(10-50) 1， 優選30 1。上述感光微粒是填充有感光化合物的高分子微粒。在670-690nm光激發下，可以 產生單線態氧離子，當其與發光微粒距離足夠近的情況下，單線氧離子傳遞到發光微粒，與 發光微粒中的發光化合物反應，產生紫外光，紫外光再進一步激發鑭系元素化合物，產生 520-620nm波長光子。感光化合物可以是酞菁染料等，該微粒也可由市場上購得。上述親和素包被的感光微粒中，親和素與感光微粒的質量比例無特殊限制，較佳 為 1 (3-10)，優選 1 5。市售感光微粒均適用于本發明，微粒粒徑較佳為180-260nm，優選220nm。三碘甲腺原氨酸(T3)包被的發光微粒采用NaBH3CN的還原胺化反應法制備，反應 步驟如下1)混合將發光微粒與三碘甲腺原氨酸(T3)按質量比例為10 (0. 1-0. 5)混合 于緩沖液中； 2)反應加入緩沖液配制的NaBH3CN溶液混合并反應；
3)封閉加入緩沖液配制的Gly及NaBH3CN溶液，混勻反應后，再加入BSA溶液封 閉；4)清洗產物，獲得三碘甲腺原氨酸(T3)包被的發光微粒。其中，混合步驟中，發光微粒與三碘甲腺原氨酸(T3)的質量比例為 10 (0.1-0. 5)，優選10 0.2。反應緩沖液可為MES緩沖液、磷酸緩沖液，優選MES緩沖 液，濃度優選0. 05M,反應步驟中，反應溶液中發光微粒的濃度可為10-40mg/ml，優選20mg/ ml。改進的，三碘甲腺原氨酸(T3)包被的發光微粒可采用下述方法制得1)混合將發光微粒與三碘甲腺原氨酸混合于緩沖液中。較佳的，緩沖液為MES緩 沖液，發光微粒與三碘甲腺原氨酸的質量比例為10 (0.01-0. 1)，優選10 0.05。2)反應加入緩沖液配制的EDAC(1_乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽 酸鹽)溶液混合并反應。較佳的，緩沖液為MES緩沖液，混合溶液中，發光微粒與EDAC的優 選質量比為25 1混合。反應條件為37°C旋轉反應。一般約48小時反應充分。3)往步驟2獲得的反應液中加入緩沖液配制的BSA溶液混勻并反應。較佳的，緩沖 液為MES緩沖液。BSA溶液與步驟2獲得的反應液體積比較佳為5 8。反應條件為37°C 旋轉反應。一般約16小時反應充分。4)清洗產物，獲得三碘甲腺原氨酸包被的發光微粒。清洗的方式可以為離心法清洗或透析法清洗。透析法清洗步驟采用反應緩沖液透析，每次4-5小時，更換緩沖液4次。透析清 洗操作時間較長，且微粒損失較多，造成收率降低。離心法清洗步驟包括離心去上清，加入反應緩沖液洗滌，超聲處理打開沉淀，如此 反復3-5次。離心法清洗時離心力會使發光微粒暫時聚集在一起，但經過超聲處理可以很 容易再次分散打開，此法操作時間短，且收率較高。因此優選采用此種清洗方式。上述改進的制備方法與NaBH3CN的還原胺化反應法的主要差別在于主要反應試劑 NaBH3CN替換成了 EDAC，該試劑的替換，不僅使得反應時間與NaBH3CN的還原胺化反應法相 比縮短了 10個多小時，而且發光微粒與三碘甲腺原氨酸的交聯效率獲得了提高，節省了三 碘甲腺原氨酸用量，此外，試驗表明，該方法制得的檢測微粒與NaBH3CN的還原胺化反應法 制得的檢測微粒相比，在相同條件下反應信號更強，靈敏度更高，檢測范圍也更廣。親和素包被的感光微粒可采用NaBH3CN的還原胺化反應法制備。本發明第三方面，公開了上述游離四碘甲狀腺素的檢測試劑盒的使用方法，游離 四碘甲狀腺素的檢測試劑盒利用光激化學發光原理，采用雙抗體夾心法，可定量檢測血清 中的游離四碘甲狀腺素。游離四碘甲狀腺素(FT4)的檢測試劑盒的使用方法包括下列步驟將樣品與試劑盒中用于檢測游離四碘甲狀腺素的檢測微粒、生物素標記的抗四碘 甲狀腺素抗體(T4Ab)和親和素包被的感光微粒混合反應，而后用激發光照射反應孔，測量 每個反應孔發光光子量獲得光信號值。具體包括下列步驟1)在反應孔中加入樣品、試劑盒中用于檢測游離四碘甲狀腺素的檢測微粒和生物 素標記的抗四碘甲狀腺素抗體(T4Ab)，獲得初始反應溶液，混合反應；
2)再加入親和素包被的感光微粒獲得最終反應溶液進行反應；3)激發光照射反應孔，測量每個反應孔發光光子量獲得光信號值。上述激發光光源波長范圍為600-700nm，優選640-680nm ；反應孔發光的發射光光 源波長范圍為600-680nm，優選610_620nm ；發射光延遲時間范圍為lOOms-lOOOms ；激發光 光源的功率范圍為5-lOOmw，優選40-60w。上述游離四碘甲狀腺素(FT4)的檢測試劑盒在應用在定量檢測游離四碘甲狀腺 素(FT4)時，需根據標準曲線計算待測樣品中FT4含量。上述步驟1)的反應條件為37°C溫育10-30分鐘，優選20分鐘，步驟2的反應條件 也為37°C溫育10-30分鐘，優選15分鐘。上述初始反應溶液中，三碘甲腺原氨酸(T3)包被的發光微粒為混懸液，三碘甲腺 原氨酸(T3)包被的發光微粒的濃度無特殊限制，可以為25-200i!g/ml，優選50i!g/ml。初始反應溶液中，生物素標記的抗四碘甲狀腺素抗體也為混懸液，生物素標記的 抗四碘甲狀腺素抗體的濃度無特殊限制，可以為0. 5-1. g/ml，較佳為1 y g/ml。在最終反應溶液中，親和素包被的感光微粒為混懸液，親和素包被的感光微粒的 濃度一般控制在10-100ug/ml，可以為30-60 ii g/ml，優選40 y g/ml。上述方法中，初始反應溶液的體積無特殊限制，可以為45-75 iU，優選75iU ；最 終反應溶液的體積也無特殊限制，可以為105-250 iU，優選250 ill。上述樣品包括血清、血漿、全血或標準品。當本發明的檢測微粒及檢測試劑盒用于定量檢測游離四碘甲狀腺素(FT4)時，還 需根據標準曲線計算待測樣品中游離四碘甲狀腺素的含量。本發明是采用光激化學發光檢測技術，配合光激化學發光分析系統測定人血清樣 品中游離四碘甲狀腺素(FT4)的定量體外診斷試劑盒，可以與其它血清和臨床信息聯合用 于甲狀腺疾病的輔助診斷及相關病人治療效果的監測。本發明的游離四碘甲狀腺素(FT4) 光激化學發光檢測試劑盒靈敏度高、精密性好、檢測范圍寬、而且操作簡便、快速、成本低、 穩定性好、無環境污染和放射危害，在臨床上具有廣泛的應用前景。
圖1 光激化學發光免疫技術原理圖微粒結合形成二聚體，產生光子信號圖2 光激化學發光免疫技術原理圖未結合微粒，無光子信號產生圖3 單線態氧隨微粒間距離衰減，在大概600nm的距離，基本沒有單線氧的存在， 因此也不發光FG BEAD 發光微粒，內含發光分子；GG BEAD 感光微粒，內含感光分子；Singlet Oxygen 單線態氧,活性氧離子；A/B 兩者可直接或間接特異結合的活性分子。如在雙抗夾心檢測中，A，B為針對 靶分子C不同的表位的單克隆抗體圖4 比較試驗測試結果示意圖
具體實施例方式下面結合實施例進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明，而 非限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均 為按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆試驗手冊(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件或者制造商建議的條件進行或配置。實驗中儀器原料來源及試劑配方原料及試劑 Biotin-X-X-NHS
BSA
T3
Gly
HEPES
Tris
NaBH3CN
抗-FT4單克隆抗體 感光微粒 發光微粒 儀器
光激化學發光分析儀
紫外分光光度計
高速冷凍離心機
分析天平
分析天平
PHif
粒徑儀
酶標儀
超聲波清洗器
型號 HT 752P CR21G
ALC-2100. 2 AG285 DELTA320 Model 370 MultiSKAN MK3 KQ5200E漩渦混合器磁力攪拌器
QL-901
(79-1)2003-03
廠家
Sigma TLC ^95% Equitech/protease free Biochemika Sigma ^ 95% 經科宏達 國藥 Acros Bioventix 美國PentaTek公司 美國PentaTek公司 廠家
上海博陽醫療儀器公司 上海光譜公司 HITACHI ACCULAB METTLER METTLER Nicomp labsystem 昆山超聲儀器公司 其林貝爾 國華實施例1T3包被的發光微粒的制備抗體與發光微粒改進的制備方法如下1)發光微粒混懸液處理吸取一定量的羧基發光微粒于高速冷凍離心機中離心， 棄去上清，加入一定量MES緩沖液，超聲破碎至微粒重新懸浮，加入MES緩沖液調節發光微 粒濃度至100mg/ml。2)抗體處理T3于0. 05M pH6. 0的MES緩沖液(以下簡稱MES緩沖液)透析，透 析完成后測定濃度，并調節濃度至2mg/ml。3) MES緩沖液、100mg/ml的發光微粒混懸液(MES緩沖液)和2mg/ml的T3 (MES緩 沖液)以1 10 2.5的體積比進行混合，迅速混勻，得到反應液。4)用MES緩沖液配制40mg/ml的EDAC溶液，按照與發光微粒100mg/100uL EDAC的比加入，迅速混勻，37°C旋轉反應48小時。5)加入200mg/ml的BSA溶液(MES緩沖液)，其與反應液體積比為5 8，迅速混 勻，37。C旋轉反應16小時。6)用MES緩沖液離心清洗四次，最后用發光試劑緩沖液進行懸浮，測定粒徑和固 含量，調節濃度至10mg/ml。將上述方法與采用NaBH3CN的還原胺化反應法制得的檢測微粒進行比較。NaBH3CN還原胺化反應法的制備方法1)發光微粒處理吸取一定量的發光微粒于高速冷凍離心機中離心，棄去上清， 加入一定量PH6. 00. 05M MES緩沖液(以下簡稱MES緩沖液)，超聲細胞破碎儀上超聲至微
粒重新懸浮；2)混合T3用0. 2N NaOH配制成lmg/ml的溶液，按照10mg發光微粒0. 2mg T3 立即加入T3溶液，補加MES緩沖液至發光微粒固含量為25mg/ml，振蕩混勻得到反應液；3)反應用MES緩沖液配制25mg/mL的NaBH3CN溶液，按照與反應液3 250的體 積比加入，37°C旋轉反應68-70小時；4)封閉用MES緩沖液配制75mg/mL的Gly溶液以及25mg/mL的NaBH3CN溶液，按 照與反應液2 1 10的體積比加入上述溶液中，37°C旋轉反應2小時；5)清洗向反應好的發光抗體中加入0.1M Na2C03溶液，高速冷凍離心機離心，棄 上清，加入新鮮0. 1M Na2C03，超聲法重新懸浮，再次離心，如此清洗4次，最后用少量發光試 劑緩沖液進行懸浮；6)取樣測定清洗好的發光抗體的固含量、粒徑，用發光試劑緩沖液調節發光抗體 濃度至10mg/mL準備進行稀釋。兩者制備結果的比較1.節省了制備時間
原有制備工藝新制備工藝制備lOOmg交聯抗體的發光微粒74h64h2.提高了抗體交聯效率，節省了抗體用量
原有制備工藝新制備工藝lmg抗體交聯微粒50mg200mg3.增強了反應信號 4.提高了靈敏度 5.擴大了檢測范圍 參照上述的制備方法制備T3包被的發光微粒，并通過各項性能測試比較從以下 幾方面進行了具體工藝條件的選擇研究本實施例中涉及的各個參數的檢測方法如下1.光信號檢測方法在反應孔中分別加入25 ill樣品，再依次加入25 ill發光試劑(50iig/ml)和 25 u 1生物素化抗體試劑(1 U g/ml)。然后放入儀器(光激化學發光分析系統)，由儀器自 動按以下步驟操作振動，37°C溫育20分鐘，再自動加入175 yl親和素包被的感光微粒試 劑(40 y g/ml)后37°C溫育15分鐘。儀器自動產生激光照射微孔計算每孔發光光子量。檢測T4濃度分別為5. 5pmol/l和25. Opmol/1的質控品光信號，每個濃度做10孔 重復測定，代入公式，計算CV值。低濃度的精密性測定表示為QC L，高濃度的精密性測定表 示為QC H。2.靈敏度檢測方法檢測10孔標準品Opmol/L,計算其RLU均值(AVE)和二個標準偏差(SD)，以 AVE-2SD反代入標準曲線，得到的濃度值即為本試劑盒的分析靈敏度，經檢測兩個批號的試 劑，其分析靈敏度分別為2. 90pmol/L、2. 95pmol/L，均不高于3. 86pmol/L。
3.工藝條件選擇1)防腐劑的考察出于對試劑防腐以及長期儲存的考慮，選擇萬分之五Proc 1 in 300作為防腐劑進
行考察。檢測未添加防腐劑及添加萬分之五Proclin 300作為防腐劑的FT4測定值 彡llpmol/L的血清、正常人血清、FT4測定值彡50pmol/L的血清、BSA 0. 01M PBS。每 種條件檢測兩孔，取RLU檢測均值。結果見下表 根據以上結果可以發現以萬分之五Proclin 300作為防腐劑對試驗結果沒有明 顯影響，故選用萬分之五Proclin 300作為防腐劑。2)發光微粒與T3的反應比例發光微粒T3分別按10mg/0. 02mgU0mg/0. 05mgU0mg/0. lmg的比例包被，比較選
取最佳的包被反應比例。檢測三種不同反應比例制備好的T3包被發光微粒，其靈敏度、精密性、線性。檢測 結果如下表發光微粒與T3反應比例的比較 根據以上實驗結果可知，抗原加入量與發光微粒上包被的抗原量基本呈正比關 系，但T3抗原繼續增加時包被上的抗原達到飽和。綜合考慮QC結果及成本問題，選擇10mg 發光微粒與0. 05mg T3的反應比例。3)T3包被的發光微粒工作濃度的選取將T3包被的發光微粒用HEPES緩沖液分別配成25ug/ml、50ug/ml、75ug/ml的濃 度，比較選取最佳工作濃度。以三種不同濃度的T3包被的發光微粒，檢測其靈敏度及線性。檢測結果如下表T3包被的發光微粒工作濃度的選取 根據以上實驗結果可知，50ug/ml的T3包被的發光微粒其靈敏度、線性更佳。4)發光試劑緩沖液根據相應的文獻資料，并結合本發明的特點，選擇pH8. 0的成分為HEPES、NaCl和 EDTA-Na-2H20的HEPES緩沖液，并在其中添加起封閉和蛋白保護作用的BSA以及防止微粒 聚集穩定試劑的Tween20后作為發光試劑的緩沖液。5)清洗方式的選擇透析法清洗步驟100倍體積透析，每次4-5小時，更換緩沖液2次。透析清洗操 作時間較長，且清洗不徹底。離心法清洗步驟12000rpm離心30分鐘，清洗3次，沉淀以超聲法重懸。這種方 法清洗所用時間較短，效果好。綜合考慮選用離心法清洗。最終選擇250nm的粒徑，發光量為彡250，000光子數/lOOug的發光微粒，BSA 的0.01M pH 7. 4PBS作為稀釋液，萬分之五Proclin 300作為防腐劑，10 0. 05的FG-bead 與T3的比例，離心法清洗作為最優制備條件。實施例2生物素標記抗體的制備制備方法1)抗體處理將抗-T4抗體透析于0. 1M NaHC03溶液中，測定抗體濃度并調節至lmg/mL ；2)用 DMS0 配制 16. 17mg/mL 的 Biotin 溶液；3)標記取處理好的lmg/mL抗-T4標記抗體與配制好的Biotin溶液，二者按照 10000 54的體積比進行混合，迅速混勻。2 8°C靜置反應12 16小時；4)透析將反應好的生物素標記抗體透析于生物素標記透析緩沖液；5)將透析好的生物素化抗體吸出轉移至干凈離心管中，取樣測定抗體濃度。用生 物素標記透析緩沖液調節生物素標記抗體濃度至0. 5mg/mL。本實施例中涉及的各個參數的檢測方法如下1、生物素與抗T4抗體比例的選擇將Biotin-X-X-NHS 抗體按照20 1、30 1、40 1的不同比例進行標記，比較 選取最佳的標記比例。檢測三種不同標記比例制備好的生物素標記抗T4，其靈敏度、精密性以及線性。檢 測結果如下表抗體與生物素的標記比例比較 根據以上實驗結果可知，生物素抗T4標記比例為30 1時，其靈敏度較好，成 本也較低。故選擇30 1的比例作為生物素抗T4的標記比例。2、生物素標記抗T4抗體的緩沖液的選取將生物素標記抗T4用Tris緩沖液、PBS緩沖液分別配成lug/mL的濃度，比較選 取最佳緩沖液。Tris 緩沖液pH 8. 0,0. 1M Tris+0. 3M NaCl+25mM EDTA+0. BSA+表面活性劑 + 防腐劑；
PBS緩沖液:pH7. 4,0. 02M PBS+1% BSA+表面活性劑+防腐劑；以兩種緩沖液配制的生物素標記抗T4，檢測其靈敏度、37°C破壞7天穩定性、線 性。檢測結果如下表生物素標記抗T4緩沖液比較 根據以上實驗結果可知，把以兩種緩沖液配制的生物素標記抗T437°C破壞7后， 整體RLU都有一定程度的下降，線性無明顯變化，但Tris緩沖液比PBS緩沖液靈敏度下降 更小一些，因此選擇Tris作為試劑2的緩沖液。3、生物素標記抗T4工作濃度選取將生物素標記抗T4抗體用Tris緩沖液分別配成0. 5ug/ml、lug/ml、1. 5ug/ml的 濃度，比較選取最佳工作濃度。以三種不同濃度的生物素標記抗T4的試劑2，檢測其靈敏度、線性。檢測結果如下 表生物素標記抗T4工作濃度的選取 根據以上實驗結果可知，生物素標記抗T4的工作濃度為lug/ml時，其靈敏度、線 性更佳。實施例3親和素包被的感光微粒的制備感光微粒采用粒徑為220 士40nm的感光微粒(美國PentaTek公司)制備方法a、感光微粒混懸液處理吸取一定量的感光微粒于高速冷凍離心機中離心，棄去 上清，加入一定量MES緩沖液，超聲細胞破碎儀上超聲至微粒重新懸浮，加入MES緩沖液調 節感光微粒濃度至100mg/ml。b、親和素溶液配制稱量一定量Avidin，加MES緩沖液溶解至8mg/ml。c、混合將處理好的感光微粒混懸液、8mg/ml的Avidin以及MES緩沖液，以 2:5: 1的體積比進行混合，迅速混勻，得到反應液。d、反應MES緩沖液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應液1 25的體積比 加入，迅速混勻。37°C旋轉反應48小時。e、封閉MES緩沖液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與 反應液2 1 10的體積比加入上述溶液中，混勻，37°C旋轉反應2小時。再加入200mg/ ml的BSA溶液(MES緩沖液)，其與反應液體積比為5 8，迅速混勻，37°C旋轉反應16小 時。f、清洗向反應好的溶液中加入MES緩沖液，高速冷凍離心機離心，棄上清，加入 新鮮MES緩沖液超聲法重新懸浮，再次離心，如此清洗3次，最后用少量的感光試劑緩沖液 進行懸浮，測定固含量，用感光試劑緩沖液調節濃度至10mg/ml。實施例4標準品的制備標準品使用衛生部臨檢中心出品的游離四碘甲狀腺素定量參考品，以PBS為稀 釋液，按照濃度 0pmol/l，5pmol/l，7. 5pmol/l, 13. 5pmol/l, 30pmol/l, 75pmol/l 配制 6 個標 準品。實施例5游離四碘甲狀腺素定量檢測
首先向反應孔中分別加入樣品，再依次加入發光試劑(抗體包被的發光微粒)和 生物素標記抗體。然后放入儀器(光激化學發光分析系統)，由儀器自動按以下步驟操作 振動，37°C溫育。再自動加入親和素包被的感光微粒后37°C再次溫育。溫育結束后儀器自 動產生激光照射微孔計算每孔發光光子量。按上述方法檢測各個標準品的發光光子量，將測得的光信號值與相應的標準品濃 度采用cubic spline(三次樣條)擬和作圖即得，標準曲線呈線性。在定量測定中，根據標準曲線，按樣本實測光信號值計算每一個樣本的FT4含量， 單位是pmol/L。檢測條件的優化試驗1、溫育時間的確定試驗材料采用抗體包被的50 U g/ml的發光微粒試劑(下簡稱發光抗體試劑)和 1 u g/ml的生物素標記抗體試劑，及40 u g/ml的親和素包被的感光微粒試劑。檢驗樣本靈敏度參考品和質控品QcL，QcH。初始反應條件加樣量為樣品25 iU，發光微粒試劑25 iU，生物素標記抗體試劑 25 iil，親和素包被的感光微粒試劑為175iU，兩步溫育。1. 1第一步溫育時間的確定第一步分別實驗溫育時間分別為10min、15min、20min、30min，第二步溫育時間為 15min,比較選取最適溫育時間。以四種不同溫育時間檢測其靈敏度、精密度、線性。檢測結果如下表第一步溫育時間的比較 根據以上實驗結果可知，在其余條件相同的情況下，第一步溫育時間為20min結 果已經趨于穩定，延長第一步溫育時間已經沒有實際意義，故將第一步溫育時間確定為 20mino1. 2第二步溫育時間的確定第一步溫育時間為20min，第二步分別實驗溫育時間分別為lOmin、15min、20min、 30min,比較選取最適溫育時間。以四種不同溫育時間檢測其靈敏度、精密度、線性。檢測結果如下表第二步溫育時間的比較
系列標準品實驗結果
pmol/LIOmin 15min 20min 3 Omin 根據以上實驗結果可知，在其余條件相同的情況下，第二步溫育時間為15min結 果已經趨于穩定，延長第二步溫育時間已經沒有實際意義，故將第二步溫育時間確定為 15min。2、加樣模式的考察試驗材料采用抗體包被的50i!g/ml的發光微粒試劑(下簡稱發光抗體試 劑)1 P g/ml的生物素標記抗體試劑，及40 u g/ml的親和素包被的感光微粒試劑。檢驗樣本靈敏度參考品和質控品QcL，QcH。初始反應條件依次添加樣品、發光微粒試劑、生物素標記抗體試劑、親和素包被 的感光微粒，兩步溫育，其中第一溫育時間為20min，第二溫育時間為15min。根據關于抗原_抗體反應時間的文獻資料，并結合本方法的特點設計了兩種加樣 模式進行考察。模式1 :25ul樣品+25ul試劑l+25ul試劑2+175ul親和素包被的感光微粒試劑；模式2 :15ul樣品+15ul試劑1+15ul試劑2+60ul親和素包被的感光微粒試劑。按照以上兩種加樣模式，分別考察靈敏度、精密度、線性。結果見下表加樣模式的比較 根據以上實驗結果可知，模式1靈敏度、精密性皆好于模式2，故選擇模式1。3、親和素包被的感光微粒的濃度的篩選發光抗體濃度選用50i!g/ml，生物素化抗體的濃度選用1 P g/ml，親和素包被的 感光微粒濃度分別配制為30 u g/ml，40 u g/ml，60 u g/ml，在初始反應條件下，結果如下 根據靈敏度比較，Qc L和Qc H的測定濃度，親和素包被的感光微粒濃度在40 iig/ ml時結果最為理想。實施例6評價試驗試劑采用發光抗體試劑(50 u g/ml)、生物素標記抗體試劑(1 U g/ml)及親和素 包被的感光微粒試劑(40 u g/ml)。檢測方法在反應孔中分別加入25 u 1樣品，再依次加入25 u 1發光試劑和25 u 1 生物素化抗體試劑。然后放入儀器，由儀器自動按以下步驟操作振動，37°C溫育20分鐘， 再自動加入親和素包被的感光微粒試劑175 yl后37°C溫育15分鐘。儀器自動產生激光照 射微孔計算每孔發光光子量，根據標準曲線可以推算樣品FT4濃度，單位是pmol/L，最后打 印試驗報告。1、檢測范圍
21
本試劑盒線性檢測范圍為3. 86-75pmol/L，對其用雙對數模型擬合，劑量-反應曲 線相關系數(r)的絕對值不低于0.9900。如要準確的測定樣品中FT4濃度值，樣品中FT4 濃度值應不超出3. 86-75pmol/L標準品曲線的濃度范圍，超出此范圍的測定結果是通過標 準品曲線外延得出的計算結果。經本試劑盒對大量的臨床樣本的檢驗結果可知道，大部分 樣本結果小于75pmol/L，因此，本試劑盒設定的檢測范圍為3. 86-75pmol/L完全可滿足臨 床應用要求。2、靈敏度的檢測檢測10孔標準品Opmol/L，計算其RLU均值(AVE)和二個標準偏差(SD)，以 AVE-2SD反代入標準曲線，得到的濃度值即為本試劑盒的分析靈敏度，經檢測兩個批號的試 劑，其分析靈敏度分別為2. 90pmol/L、2. 95pmol/L，均不高于3. 86pmol/L。3、精密性檢測分別采用2個批號的FT4試劑盒對質控品QC L、QC H進行1次檢測，每次復測10 孔，每份樣品共檢測20次。得到如下結果 由上述結果可知，本產品其批內精密性小于5%，批間精密性小于10%。4、線性的檢測對除0值外其他5點標準品用雙對數或其他數學模型擬合，劑量_反應曲線相關 系數(r)的絕對值應不低于0.9900。經檢測兩個批號的試劑盒，其線性r值分別為1.000、 0. 999。5、干擾性試驗在已知濃度的臨床標本1#、2#、3#中加入250mg/dL血紅蛋白、500mg/dL甘油三酯、 10mg/dL膽紅素，以本發明的試劑盒進行檢測，結果如下表表1試劑盒1(單位pm0l/L) 表2試劑盒2(單位pmol/L) 由上述結果可知，500mg/dL甘油三酯和10mg/dL膽紅素對本產品無明顯干擾，但 250mg/dL血紅蛋白對本試劑盒檢測結果影響超過10%，因此盡量避免樣本嚴重溶血。實施例7比較試驗試劑采用發光抗體試劑(50 u g/ml)、生物素標記抗體試劑(1 U g/ml)及親和素 包被的感光微粒試劑(40 u g/ml)。收集經羅氏公司FT4試劑盒檢測過的臨床標本250份，再以本發明的CEA光激化 學發光檢測試劑盒測定每份標本，作平行比較，結果如圖4。由圖4所示的結果可知，本試劑盒檢測結果與西門子結果相關性r = 0. 970，且該 試劑盒成本底、靈敏度高、精密性好、檢測范圍寬、操作簡便、省時，適合于向臨床推廣。
實施例8試劑盒的組配將實施例1-3中按照各種方法制備的的三種試劑分別獨立包裝，組配后獲得基本 試劑盒。可用于定量檢測樣品中FT4的濃度。
權利要求
一種用于檢測游離四碘甲狀腺素的檢測微粒，為三碘甲腺原氨酸包被的發光微粒。
2.如權利要求1所述用于檢測游離四碘甲狀腺素的檢測微粒，其特征在于，所述發光 微粒的粒徑范圍為100-400nm。
3.如權利要求1所述用于檢測游離四碘甲狀腺素的檢測微粒，其特征在于，所述發光 微粒的表面官能團選自羧基或醛基。
4.如權利要求1所述用于檢測游離四碘甲狀腺素的檢測微粒，其特征在于，所述發光 微粒的發光量為150，000-350, 000光子數/100 μ g發光微粒。
5.如權利要求1-4中任一權利要求所述用于檢測游離四碘甲狀腺素的檢測微粒，其特 征在于，所述檢測微粒經如下工藝制得1)混合將發光微粒與三碘甲腺原氨酸混合于緩沖液中；2)反應加入緩沖液配制的EDAC溶液混合并反應；3)往步驟2)獲得的反應液中加入緩沖液配制的BSA溶液混勻并反應；4)清洗產物，獲得三碘甲腺原氨酸包被的發光微粒。
6.如權利要求5所述用于檢測游離四碘甲狀腺素的檢測微粒，其特征在于，所述緩沖 液為MES緩沖液。
7.如權利要求5所述用于檢測游離四碘甲狀腺素的檢測微粒，其特征在于，所述步驟 1)中，發光微粒與三碘甲腺原氨酸的質量比例為10 (0.01-0.1)。
8.如權利要求7所述用于檢測游離四碘甲狀腺素的檢測微粒，其特征在于，所述步驟 1)中，發光微粒與三碘甲腺原氨酸的質量比例為10 0.05。
9.如權利要求5所述用于檢測游離四碘甲狀腺素的檢測微粒，其特征在于，所述步驟 4)的清洗的方式為離心法清洗。
10.一種游離四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，包括權利要求1-9中任一權利要求所述用 于檢測游離四碘甲狀腺素的檢測微粒。
11.如權利要求10所述游離四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還 包括生物素標記的抗四碘甲狀腺素抗體和親和素包被的感光微粒中的一種或兩種。
12.如權利要求11所述游離四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，所述生物素標 記的抗四碘甲狀腺素抗體中，生物素與抗體的分子比例為(10-50) 1。
13.如權利要求11所述游離四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，所述親和素包 被的感光微粒中，親和素與感光微粒的質量比例為1 (3-10)。
14.如權利要求11所述游離四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，所述用于檢測 游離四碘甲狀腺素的檢測微粒、生物素標記的抗四碘甲狀腺素抗體以及親和素包被的感光 微粒分別獨立包裝，且均為混懸液。
15.如權利要求14所述游離四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，所述混懸液的 溶劑選自HEPES緩沖體系或Tris緩沖體系。
16.如權利要求15所述游離四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，所述用于 檢測游離四碘甲狀腺素的檢測微粒混懸液的溶劑為PH8. 0的成分為HEPES、NaCl和 EDTA-Na-2H20 的 HEPES 緩沖液。
17.如權利要求15所述游離四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，所述生物素標 記的抗四碘甲狀腺素抗體混懸液的溶劑為PH8. 0的成分為Tris、NaCl和EDTA-Na_2H20的Tris緩沖液。
18.如權利要求15所述游離四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，所述親和素包 被的感光微粒混懸液的溶劑為成分為HEPES、NaCl和EDTA_Na-2H20的HEPES緩沖液。
19.如權利要求14所述游離四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，所述混懸液中 還包括蛋白保護劑、防止微粒聚集的穩定試劑或防腐劑中的一種或多種。
20.如權利要求10所述游離四碘甲狀腺素的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中 還包括多種濃度已知的四碘甲狀腺素溶液，不同濃度的四碘甲狀腺素溶液分別獨立包裝。
21.如權利要求10-20中任一權利要求所述游離四碘甲狀腺素的檢測試劑盒的使用方 法，包括下列步驟1)在反應孔中加入樣品、試劑盒中用于檢測游離四碘甲狀腺素的檢測微粒和生物素標 記的抗四碘甲狀腺素抗體，獲得初始反應溶液，混合反應；2)再加入親和素包被的感光微粒獲得最終反應溶液進行反應；3)激發光照射反應孔，測量每個反應孔發光光子量獲得光信號值。
22.如權利要求21所述游離四碘甲狀腺素的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所 述激發光光源波長范圍為600-700nm。
23.如權利要求21所述游離四碘甲狀腺素的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所 述激發光光源的功率范圍為5-lOOmw。
24.如權利要求21所述游離四碘甲狀腺素的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所 述步驟1)和2)的反應條件為37°C溫育10-30分鐘。
25.如權利要求24所述游離四碘甲狀腺素的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所 述步驟1)的反應條件為37°C溫育20分鐘，步驟2)的反應條件為37°C溫育15分鐘。
26.如權利要求21所述游離四碘甲狀腺素的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所 述用于檢測游離四碘甲狀腺素的檢測微粒為混懸液，用于檢測游離四碘甲狀腺素的檢測微 粒在混懸液中的濃度為25-200 μ g/ml ；所述生物素標記的抗四碘甲狀腺素抗體為混懸液， 生物素標記的抗四碘甲狀腺素抗體在混懸液中的濃度為0. 5-1. 5 μ g/ml ；所述親和素包被 的感光微粒為混懸液，親和素包被的感光微粒在混懸液中的濃度為10-100 μ g/ml。
27.如權利要求26所述游離四碘甲狀腺素的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所 述用于檢測游離四碘甲狀腺素的檢測微粒在混懸液中的濃度為50μ g/ml ；所述生物素標 記的抗四碘甲狀腺素抗體在混懸液中的濃度為1 μ g/ml ；所述親和素包被的感光微粒在混 懸液中的濃度為40ug/ml。
28.如權利要求21所述游離四碘甲狀腺素的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所 述初始反應溶液的體積為30-75 μ 1 ；最終反應溶液的體積為100-250 μ 1。
29.如權利要求28所述游離四碘甲狀腺素的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所 述初始反應溶液的體積為75ul ；最終反應溶液的體積為250ul。
30.如權利要求21所述游離四碘甲狀腺素的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，還 包括根據標準曲線計算待測樣品中游離四碘甲狀腺素的含量。
全文摘要
本發明涉及甲狀腺疾病的輔助診斷試劑，公開了一種用于檢測游離四碘甲狀腺素的檢測微粒，為三碘甲腺原氨酸包被的發光微粒。本發明還公開了上述游離四碘甲狀腺素的檢測微粒的制備及應用。此外，本發明又進一步公開了一種測定樣品中游離四碘甲狀腺素的體外診斷試劑盒，同時公開了該試劑盒的使用方法。本發明的試劑盒可以與其它血清和臨床信息聯合用于甲狀腺疾病的輔助診斷及相關病人治療效果的監測。
文檔編號G01N33/569GK101864289SQ200910049310
公開日2010年10月20日 申請日期2009年4月14日 優先權日2009年4月14日
發明者王海蛟, 趙衛國, 陳晨輝 申請人:博陽生物科技(上海)有限公司
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