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專利名稱：食品中創傷弧菌和溶藻弧菌的pcr檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種食品中創傷弧菌和溶藻弧菌的PCR檢測方法。
背景技術：
目前，國內關于致病性弧菌的檢測方法還是傳統的微生物學檢測方法，尚不夠完善，每種檢測方法僅能檢測一種致病性弧菌，而國外的傳統微生物學檢測方法(如FDA、AOAO、ISO等)也是以單一或少數目標菌為目的設計的程序。因此，幾乎每檢測一種致病性弧菌都需配制不同的培養基和試劑，耗時又耗力。在分子生物學檢測方法方面，FDA2004標準仍是以檢測一種致病性弧菌為目的設計PCR程序，檢測不同的弧菌需要不同的反應條件。國內的檢測人員設計PCR檢測方法時也是以毒力基因為待擴增序列，而且關注的大都是O1型和O139型霍亂弧菌與副溶血弧菌，PCR方法檢測創傷弧菌的報道只有2000年有過1例，擬態弧菌、溶藻弧菌和河弧菌至今仍未見到過。
除了常見的霍亂弧菌和副溶血弧菌外，許多國家已開始關注其它致病性弧菌在食物中的存在。例如，歐共體委員會于1997年6月11日通過的368決議(97/368/EC)中明確規定“各成員國必須使用適宜的抽樣計劃和檢測方法對原產于中國的每批冷凍或加工的水產品進行微生物檢驗，以確保有關產品不存在對人類健康的危害。這種檢測必須進行，特別是檢測沙門氏菌屬和弧菌屬是否存在?！?998年和2000年我國出口到法國的鱈魚片和出口到瑞典的水產品被檢出創傷弧菌和擬態弧菌而遭取消代號處理。
目前，由于在水產品檢測中經常是一份樣品同時檢測幾種致病性弧菌，因此，有必要研究一種方法，可同時檢測多個致病性弧菌。這樣，可以在不影響檢出率的條件下加快檢測速度，減少工作量和檢測成本，以適應加入WTO后的新的形勢需求，與國際方法接軌。

發明內容
本發明提供了一種食品中創傷弧菌和溶藻弧菌的PCR檢測方法，其優點在于可同時檢測以上兩種致病性弧菌，在不影響檢出率的條件下加快檢測速度，減少工作量和檢測成本。
本發明所提供的食品中創傷弧菌和溶藻弧菌的PCR檢測方法，其特征在于其檢測步驟為待檢測的樣品經二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因組DNA，然后經PCR反應后，再經電泳、染色、漂洗，接著用凝膠成像儀觀察結果并拍照，最后經過譜圖分析即可得出檢測結果。
本發明所提供的食品中創傷弧菌和溶藻弧菌的PCR檢測方法，采用溶藻弧菌的膠原酶基因(vac，DQ097161)及創傷弧菌的溶細胞素基因(vvh，AB124802)為一組檢測溶藻弧菌和創傷弧菌。其優點在于可同時檢測以上兩種致病性弧菌，可以在不影響檢出率的條件下加快檢測速度，減少工作量和檢測成本。


圖1為本發明的流程圖。
圖2為本發明的引物序列表圖。
圖3為本發明的V.a.和V.v.的二重PCR檢測結果示意圖。
圖4為本發明實施例一的V.a.和V.v.的二重PCR檢測結果圖。
圖5為本發明實施例二的V.a.和V.v.的二重PCR檢測結果圖。
其中，圖3中，1陰性對照；2創傷弧菌產生的582bp的條帶；3溶藻弧菌產生的210bp的條帶；4從上到下依次為創傷弧菌產生的582bp的條帶和溶藻弧菌產生的210bp的條帶；5Marker(200bp-600bp)。
圖4中，1第一份面包蝦，2第二份面包蝦，3第三份面包蝦，4第四份面包蝦，5第五份面包蝦，6第六份面包蝦，7第七份面包蝦，8溶藻弧菌和創傷弧菌，9陰性對照，10100bp Marker圖5中，1第一份文蛤，2第二份文蛤，3溶藻弧菌和創傷弧菌，4陰性對照，5100bp Marker。
具體實施例方式
本發明所提供的食品中食品中創傷弧菌和溶藻弧菌的PCR檢測方法，其特征在于其檢測步驟為待檢測的樣品經二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因組DNA，然后經PCR反應后，再經電泳、染色、漂洗，接著用凝膠成像儀觀察結果并拍照，最后經過譜圖分析即可得出檢測結果。
所述的二次增菌，包括第一次增菌和第二次增菌，所述的第一次增菌，其操作步驟為在無菌條件下，取充分剪碎的樣品，加入盛有9倍量的3％的NaCl堿性蛋白胨水的滅菌容器內，在37℃±3℃條件下培養4h～15h，所述的第二次增菌，其操作步驟為吸取一定量第一次增菌的增菌液加入盛有9倍量的3％NaCl堿性蛋白胨水(APW)的滅菌試管內，在37℃±3℃條件下培養4h～15h。
所述的水煮法提取弧菌基因組DNA，其操作步驟為取培養的菌液加入離心管中，以13000rpm離心1min，棄上清液，然后加入0.6ml無菌去離子水懸浮沉淀，振蕩混勻后，96-100℃水浴10min，12000rpm離心5min，取上清液作為DNA模板，-20℃環境下儲存備用。
所述的PCR反應為二重PCR反應，其反應體系為H2O13.1μl，Buffer2.6μl，dNTP0.5μl，P(0.4*4)μl，Taq酶0.2μl，模板DNA2.0μl，總體積為20μl。其反應循環參數為94℃預變性3min；然后94℃變性1min，60℃退火1min，72℃復性1min循環35次，最后72℃延伸7min。
所述的電泳為瓊脂糖凝膠電泳，其操作步驟為PCR反應結束后以98V電壓2.5％凝膠電泳90min。
所述的染色為在溴化乙錠溶液中染色20min。
所述的譜圖分析包括陽性對照和陰性對照，對于譜圖中是否有相應特征位置條帶的出現，即可判別被檢測對象中是否有創傷弧菌和溶藻弧菌的存在。
以下結合具體實施例子說明實施例一面包蝦的檢測1.無菌操作，取25g面包蝦樣品，充分剪碎，加入盛有225ml 3％NaCl堿性蛋白胨水(APW)的滅菌容器內，37℃±1℃條件下培養4h～15h。
2.吸取1ml增菌液加入盛有9ml 3％NaCl堿性蛋白胨水(APW)的滅菌試管內，37℃±1℃條件下培養4h～15h。
3.移液槍吸取1.5ml培養的菌液，加入1.5ml離心管中13000rpm離心1min，棄上清。
4.加入0.6ml無菌去離子水懸浮沉淀，振蕩混勻，100℃水浴10min。
5.12000rpm離心5min，取上清作為DNA模板，-20℃備用。
6.加樣，做PCR7.取10μl PCR反應液進行瓊脂糖凝膠電泳。
8.EB染色20min，漂洗，拍照。
9.分析譜圖圖4中可見，在7份面包蝦增菌后提取的DNA中，均出現210bp的特征條帶，但也都沒有出現582bp的特征條帶，由此可見可見其全部含有溶藻弧菌，但沒有一份含創傷弧菌。
實施例二文蛤的檢測1.無菌操作，取25g文蛤樣品，充分剪碎，加入盛有225ml 3％NaCl堿性蛋白胨水(APW)的滅菌容器內，37℃±1℃條件下培養4h～15h。
2.吸取1ml增菌液加入盛有9ml 3％NaCl堿性蛋白胨水(APW)的滅菌試管內，37℃±1℃條件下培養4h～15h。
3.移液槍吸取1.5ml培養的菌液，加入1.5ml離心管中13000rpm離心1min，棄上清。
4.加入0.6ml無菌去離子水懸浮沉淀，振蕩混勻，100℃水浴10min。
5.12000rpm離心5min，取上清作為DNA模板，-20℃備用。
6.加樣，做PCR7.取10μl PCR反應液進行瓊脂糖凝膠電泳。
8.EB染色20min，漂洗，拍照。
分析譜圖根據圖5可見，在兩份文蛤中，只有第二份產生了210bp的條帶，說明只有第二份文蛤中含有溶藻弧菌，而且兩份都不含創傷弧菌。
權利要求
1.一種食品中食品中創傷弧菌和溶藻弧菌的PCR檢測方法，其特征在于其檢測步驟為待檢測的樣品經二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因組DNA，然后經PCR反應后，再經電泳、染色、漂洗，接著用凝膠成像儀觀察結果并拍照，最后經過譜圖分析即可得出檢測結果。
2.根據權利要求1所述的食品中創傷弧菌和溶藻弧菌的PCR檢測方法，其特征在于所述的二次增菌，包括第一次增菌和第二次增菌，所述的第一次增菌，其操作步驟為在無菌條件下，取充分剪碎的樣品，加入盛有9倍量的3％的NaCl堿性蛋白胨水的滅菌容器內，在37℃±3℃條件下培養4h～15h，所述的第二次增菌，其操作步驟為吸取一定量第一次增菌的增菌液加入盛有9倍量的3％NaCl堿性蛋白胨水(APW)的滅菌試管內，在37℃±3℃條件下培養4h～15h。
3.根據權利要求1所述的食品中創傷弧菌和溶藻弧菌的PCR檢測方法，其特征在于所述的水煮法提取弧菌基因組DNA，其操作步驟為取培養的菌液加入離心管中，以13000rpm離心1min，棄上清液，然后加入0.6ml無菌去離子水懸浮沉淀，振蕩混勻后，96-100℃水浴10min，12000rpm離心5min，取上清液作為DNA模板，-20℃環境下儲存備用。
4.根據權利要求1所述的食品中創傷弧菌和溶藻弧菌的PCR檢測方法，其特征在于所述的PCR反應為二重PCR反應，其反應體系為H2O13.1μl，Buffer2.6μl，dNTP0.5μl，P(0.4*4)μl，Taq酶0.2μl，模板DNA2.0μl，總體積為20μl。
5.根據權利要求4所述的食品中創傷弧菌和溶藻弧菌的PCR檢測方法，其特征在于所述的PCR反應循環參數為94℃預變性3min；然后94℃變性1min，60℃退火1min，72℃復性1min循環35次，最后72℃延伸7min。
6.根據權利要求1所述的食品中創傷弧菌和溶藻弧菌的PCR檢測方法，其特征在于所述的電泳為瓊脂糖凝膠電泳，其操作步驟為PCR反應結束后以98V電壓2.5％凝膠電泳90min。
7.根據權利要求1所述的食品中創傷弧菌和溶藻弧菌的PCR檢測方法，其特征在于所述的染色為在溴化乙錠溶液中染色20min。
8.根據權利要求1所述的食品中創傷弧菌和溶藻弧菌的PCR檢測方法，其特征在于所述的譜圖分析包括陽性對照和陰性對照，對于譜圖中是否有相應特征位置條帶的出現，即可判別被檢測對象中是否有創傷弧菌和溶藻弧菌的存在。
全文摘要
一種食品中創傷弧菌和溶藻弧菌的PCR檢測方法，其特征在于其檢測步驟為待檢測的樣品經二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因組DNA，然后經PCR反應后，再經電泳、染色、漂洗，最后用凝膠成像儀觀察結果并拍照，最后經過譜圖分析即可得出檢測結果。本發明的優點在于可同時檢測食品中的創傷弧菌和溶藻弧菌，可以在不影響檢出率的條件下加快檢測速度，減少工作量和檢測成本。
文檔編號G01N21/84GK1967235SQ20061006856
公開日2007年5月23日 申請日期2006年8月26日 優先權日2006年8月26日
發明者黃曉蓉, 鄭晶, 陳彬, 呂海滄 申請人:福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心