專利名稱：單核苷酸多態性試紙條快速檢測方法及其試紙條的制作方法
技術領域：
本發明涉及核酸序列中單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism(SNP))的檢測方法，特別是SNP的快速檢測和分型技術領域的核酸快速診斷技術。更具體地說，本發明涉及利用擴增技術、單核苷酸延伸技術和核酸試紙條檢測技術快速檢測核酸序列中的單堿基突變的方法。本發明還涉及用于上述單核苷酸多態性快速檢測和分型技術領域的核酸快速診斷的試紙條。本發明還涉及了在快速檢測核酸序列中單核苷酸多態性的試劑盒方面的用途。
背景技術：
單核苷酸多態性(SNP)是指在基因組水平上，特定核苷酸位置上存在兩種或兩種以上不同的堿基，引起DNA序列的多態性，其中任何一種等位基因在群體中的頻率不小于1％。SNP已成為繼限制性酶切片斷長度多態(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)，短串聯重復序列(ShortTandem Repeat，STR)多態標記后的第三代分子遺傳標記，隨著人類基因組測序工作的完成，SNP的篩選及其檢測正成為研究者們廣泛關注的焦點。SNP的數量十分龐大，估計人類30億堿基中約有3×106個SNP位點。自從發現SNP后，研究者們就致力于其檢測技術的研究與開發。目前用于SNP檢測的方法大多以PCR技術為基礎，與熒光、質譜法、基因芯片或直接測序等方法結合，大規模，自動化的檢出SNP或進行SNP初篩，已進入SNP檢測的高通量時代。但這些方法大都操作復雜、價格昂貴、檢測時間長，而且需要大型的儀器設備為前提的檢測技術，并不適合于基層醫院和醫療條件尚不完備的地區。下面就幾種現有SNP檢測技術進行概述。
1限制性酶切片斷長度多態(RFLP)利用限制性內切酶的酶切位點的特異性，用兩種或兩種以上的限制性內切酶作用于同一DNA片斷，如果存在SNP位點，酶切片斷的長度和數量則會出現差異，根據瓊脂糖凝膠電泳的結果就可以判斷是否有SNP位點以及出現的堿基替換的類型。該技術應用的前提是SNP位點必須含有該限制內切酶的識別位點，這就在一定程度上限制了RFLP技術在SNP位點篩選和分型中的應用。
2寡核苷酸連接分析(OLA)OLA技術是通過設計兩種能與靶序列DNA精確并列雜交的寡核苷酸來完成的。寡核苷酸雜交后，DNA連接酶可使其正常配對的相鄰堿基以共價連接，而錯配的相鄰堿基可通過調節連接酶和NaCl濃度防止其連接。連接產物可以通過凝膠電泳或固相印跡雜交的方法進行檢測，根據這些檢測結果就可以進行SNP的分型。由于連接反應的條件很嚴格，如連接反應體系中鹽的濃度及連接酶和DNA的比例等，所以此種分型技術很容易出現假陰性結果，造成SNP位點的漏檢或錯檢。
3基因芯片基因芯片，又稱為DNA微探針陣列(Micro-array)。雖然僅用一張芯片，就可以通過芯片上密集排列的已知序列的探針，與若干靶序列進行互補匹配雜交，從而達到同時檢測多個基因的多態性的目的。但這些產品價格昂貴，供貨周期長，并需要專用的儀器和設備來完成SNP的檢測，費用高和操作復雜，目前國內基因芯片研究生產中用到的試劑、耗材主要依靠進口，這也成為基因芯片研究SNP的瓶頸。
4實時熒光定量PCR(Real-time Quantitive PCR)根據熒光共振的原理，利用熒光檢測裝置檢測供試者-接受者之間的熒光變化，從而進行SNP的分型。實時熒光PCR法不需要PCR反應后的操作過程來進行基因分型，在PCR完成的同時即可以得到檢測結果，將PCR污染的風險降至最低，但是其對反應試劑及反應條件有嚴格要求，而且需要價格昂貴的特殊的檢測裝置，如7900全自動高通量實時熒光定量PCR檢測儀或7700熒光PCR檢測儀。
5.變性—高壓液相色譜法(DHPLC)此法應用高效液相色譜儀來完成。其核心部分是帶正電荷的DNA分離柱，DNA將根據其雙鏈與DNA分離柱的親和力的強弱而被先后洗脫下來，從而達到分離的目的。目的片斷經PCR擴增后，在部分加熱變性的條件下，由于錯配堿基與正常堿基不能配對，形成異源雙鏈。整個系統溫度被維持在接近異源雙鏈DNA片斷的Tm值，所以正常配對的DNA片斷和異源雙鏈DNA片斷在進行液相色譜時，由于異源配對DNA片斷含有錯配堿基，發生部分解鏈，單鏈DNA所帶負電荷比雙鏈少，所以異源雙鏈DNA先被洗脫下來。SNP的有無最終表現為色譜峰的峰形或數目差異。
該方法的主要優點是自動化程度較高，速度快，適合高通量篩查；靈敏度高，尤其適于大片斷DNA分析，分辨率高達1bp1～1.5kb。其缺點位只能檢測出樣品有無突變，而不能測出突變類型，也不能檢測出純合突變；同時DHPLC系統非常精密，對試劑和環境要求較高，易產生誤差。
6.毛細管電泳測序分型(CE)這是現在檢測SNP比較準確的方法之一。其主要流程是PCR擴增目的片斷→PCR產物純化，回收→4種熒光標記(dNTP)測序反應→去除多余的引物，熒光物質及離子→測序儀上電泳并用測序軟件分析。DNA遺傳分析儀使用4種熒光染料標記引物，進行堿基的DNA合成，經電泳分離后，用激光激發獲取片斷信息，可以直接測序檢測SNP的突變類型及其位置，效率達到100％，所以對一些比較小的，外顯子相對較少的基因的SNP檢測可以直接測序。但測序檢測SNP的方法需要較多的勞力，且花費昂貴，所以對一些較大的，外顯子較多的基因不宜用測序法直接檢測，也不適用于臨床對大量的標本進行檢測。
7.DNA序列分析技術1)直接測序法(Sanger測序法)如果希望大規模、準確、快速發現SNP，Sanger測序法越來越成為主流技術。由ABI公司推出的DNA遺傳分析儀使用4種熒光染料標記引物，取代了原來的手工測序的同位素標記，這就使得測序和分析時間大大縮短。由于最近兩年來測序的成本日益降低，而且DNA Sanger測序能夠準確、直接反應序列的差異，所以目前國際上應用最為廣泛的還是通過直接測序法來進行SNP的研究。但是從操作周期來看，Sanger測序法從樣品的處理到給出報告至少需要3-4天，還是不能及時地滿足一些研究者和臨床醫學檢測對于時間上的需要，而且價格也比較昂貴。
2)DNA焦磷酸序列分析技術(Pyrosequencing)DNA焦磷酸序列分析技術是在底物混合物(包括APS和Luciferin)存在的情況下，由DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯化學發光反應，通過其特有的計算機軟件將發出的可見光信號轉變為一個峰值，然后根據峰值的大小和反應中摻入的核苷酸數目進行SNP的分型。Pyrosequencing是一種不依賴平板或毛細管電泳，不依賴DNA的熒光標記/激發/檢測的DNA序列分析技術，因此相應的儀器系統無須熒光分子的激發和檢測裝置，所以操作簡便，花費比Sanger測序法要小得多。但是該方法也有它的局限性，它的讀序能力小于直接測序法，一次反應只可以達到十幾個到幾十個堿基。
8單堿基延伸法(SBE)單堿基延伸法，又稱為微測序法(Minisequencing)，是指一個寡核苷酸探針的3’端堿基緊挨于多態性堿基，探針在合適的底物ddNTP存在的情況下，延伸一個堿基，延伸上的堿基就是多態性堿基。由于ddNTP是終止單核苷酸，延伸后的探針將不能再次延伸，因此被稱為單堿基延伸法。以這種技術為平臺，根據對延伸產物檢測方法不同，衍生出很多檢測SNP的方法，如單堿基延伸標簽陣列技術(Single Base Extension-Tag，SBE-Tag)，單堿基延伸結合質譜法(Single Base Extension-mass spectrometry，SBE-MS)，單堿基延伸結合基因芯片法等等。上述幾種SBE技術，均需要特殊的檢測儀器，而且花費高昂，技術條件要求高，不適合于一般的實驗室和醫院檢驗室應用。
本發明利用先進的核酸擴增、單核苷酸延伸和核酸試紙條快速檢測技術發明的一種操作簡單、時間短、價格低廉的檢測技術。可以廣泛地應用于所有與單核苷酸多態性檢測相關的領域。
發明內容
概述隨著特定種類生物基因組的全部或部分SNP的發現以及一些特定SNP數據庫的建成，SNP的功能研究逐步轉為科學家們研究的重點。特定DNA區域的特定SNP在特定群體的序列驗證和頻率分析以及SNP與特定生理或病理狀態關系的研究成為SNP功能研究的主要方面。但上述各種方法大都需要專門的分析儀器，不僅價格昂貴，而且操作復雜，專業性強，所以應用上述技術在一般的分子和細胞生物學實驗室和臨床檢驗室進行與SNP有關的研究和檢測受到了限制。
本發明人在我們原有的核酸薄膜層析快速檢測方法及其試紙條專利技術(申請號CN200610003429.1)的基礎上，結合單堿基延伸技術(SBE)發明出一種新的快速SNP檢測和分型的方法——單核苷酸多態性(SNP)試紙條快速檢測方法及其試紙條。本發明的目的在于為人們提供一種操作簡單，價格低廉和檢測結果準確的對已知SNP進行檢測和分型的方法，從而使得與SNP有關的研究工作在基層科研機構及醫院的檢驗科順利開展。
上述發明(申請號CN200610003429.1)提供了用于核酸擴增物檢測的試紙條，其包括在帶有不干膠的襯墊7按順序有樣品墊1、有色顆粒結合物墊2、纖維膜3和吸水濾紙墊4，上述各部分在相鄰處部分重疊，纖維膜上還設有檢測線5和質控線6，其中有色顆粒結合物墊2上的有色顆粒有抗A抗體包被，檢測線5上有抗B抗體包被，質控線6上有抗A抗體。纖維膜通常為硝酸纖維素膜或尼龍膜。
核酸擴增物檢測試紙條的基本結構如附
圖1所示。
因此，一方面，本發明提供核酸試紙條檢測兩種多態堿基SNP的方法，其包括1)用抗A抗體包被有色顆粒；2)用抗B抗體包被纖維膜；3)根據檢測的多態位點設計探針寡核苷酸鏈，探針的3’末端位于待檢SNP位點的前一個堿基，探針的5’末端用抗原A標記；4)擴增上述步驟3)的含有待檢SNP的DNA；5)將5’末端抗原A標記的探針與擴增物雜交，DNA聚合酶在擴增后的探針的3’末端用抗原B標記的雙脫氧單核苷酸以待檢SNP為模板延伸一個堿基，此時探針已被抗原A和抗原B雙重標記；6)在檢測時，上述步驟5)得到的探針所帶有的抗原A首先與顆粒表面的抗體A結合，形成探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A的有色顆粒復合物；7)上述步驟6)得到的有色顆粒復合物在溶液中通過毛細現象沿纖維膜向上流動，當復合物遇到固定于膜上的抗體B線條時，待檢的探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A復合物與線條上的抗體B結合，形成線條抗體B-探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A的有色顆粒復合物，有色的線條抗體B-探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A的顆粒復合物滯留在線上，形成肉眼可見的有色線條，此為陽性；8)在步驟5)時，如果加入帶有抗原B的雙脫氧單核苷酸(ddNTP)與模板上的單核苷酸不形成互補，則不能發生延伸，此時探針只帶有抗原A，則在步驟6)中形成的探針抗原A-顆粒抗體A的有色復合物將不能與膜上的抗體B檢測線結合而越過此線，不能形成肉眼可見的有色線條。此為陰性；9)如果被檢樣品為純合子，則試紙條顯示一條有色線條；如果被檢樣品為雜合子，則試紙條顯示二條有色線條。
另一方面，本發明還提供核酸試紙條檢測多種多態堿基SNP的檢測和分型方法，其包括1)用抗A抗體包被有色顆粒；2)用抗B抗體包被纖維膜將兩種以上無色特異性抗體B以線條狀固定于同一條膜上，形成兩條以上的檢測線；
3)根據檢測的多態位點設計和標記探針寡核苷酸鏈，探針的3’末端位于待檢SNP位點的前一個堿基，探針的5’末端用抗原A標記；4)擴增含有待檢SNP的DNA；5)將5’末端抗原A標記的探針與擴增物雜交，DNA聚合酶在探針的3’末端用兩種以上的抗原B-ddNTP中的一種與多態性堿基配對，以待檢SNP為模板延伸一個堿基，此時探針已被抗原A和抗原B雙重標記；6)檢測時，上述步驟5)的探針所帶有的抗原A首先與顆粒表面的抗體A結合，形成探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A的有色顆粒復合物；7)上述步驟6)得到有色顆粒復合物在溶液中通過毛細現象沿纖維膜向上流動，當復合物遇到固定于膜上的兩條以上的抗體B線條時，待檢的探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A復合物與線條上相關的抗體B結合，形成線條抗體B-探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A的有色顆粒復合物，有色的線條抗體B-探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A的顆粒復合物滯留在線上，形成肉眼可見的有色線條，不同的有色線條位置代表不同的堿基；8)如果被檢樣品為純合子，則試紙條顯示一條有色線條；如果被檢樣品為雜合子，則試紙條顯示二條有色線條；9)根據核酸檢測試紙條的顯色判讀結果對所檢測的SNP進行分析和分型。
另一方面，本發明提供了用于上述檢測和分型方法的試紙條。
另一方面，本發明還提供了上述檢測和分型方法及其試紙條的用途，尤其是在以下領域中的應用與SNP直接相關的人類遺傳性疾病的分子診斷、細菌和病毒等其它病原微生物耐藥基因突變的檢測、人體藥物反應差異性的檢測與篩查、人類健康遺傳基礎的SNP的篩查與分型、人群中某些疾病易感基因的篩查、器官移植中供體和受體間的配對選擇(HLA分型)和法醫學中罪犯身份的鑒別及親子鑒定等。
附圖的簡要說明附圖1是關于用于本發明的核酸試紙條的基本結構示意圖附圖2是關于本發明的核酸試紙條檢測兩種SNP方法的基本原理示意圖；附圖3是關于本發明的核酸試紙條檢測多種多態SNP方法的基本原理示意圖；附圖4顯示實施例1的ACTN3基團R577X的SNP檢測和分型結果；附圖5是實施例2的Leber’s病線粒體DNA G11778A的SNP檢測圖；
發明內容詳述本發明的方法及其試紙條就是在靶核酸擴增物的基礎上，利用單堿基延伸技術，以核酸試紙條為檢測手段進行SNP的檢測和分型。主要原理是根據抗原和其特異性抗體的免疫學特異性結合，將核酸片段固定在核酸檢測試紙條上，然后通過可視的呈色乳膠顆粒在試紙條上顯色而檢測出結果。
因此，本發明提供核酸試紙條檢測兩種多態堿基SNP的方法，其包括1)用抗A抗體包被有色顆粒將一種特異性抗體(抗A抗體，無色)吸附于有色顆粒，如膠體金顆粒，乳膠顆粒等，在顆粒表面形成抗體包被；2)用抗B抗體包被纖維膜將另一特異性抗體(抗B抗體，無色)以線條狀固定于膜上，形成檢測線，所述膜通常為硝酸纖維膜或尼龍膜)。
3)根據檢測的多態位點設計和標記相應的探針寡核苷酸鏈探針的3’末端位于待檢SNP位點的前一個堿基，探針的5’末端用抗原A標記；4)擴增含有待檢SNP的DNA；采用PCR或其它方法擴增含有待檢SNP的DNA片段，PCR反應完成后，在PCR產物加入熱敏磷酸酶，直接降解其中未參加反應的脫氧單核苷酸分子(dNTP)，除去dNTP對以后SBE單堿基延伸過程中的干擾；然后加熱95℃使熱敏磷酸酶熱失活，以免其降解SBE反應中的抗原標記的雙脫氧單核苷酸分子ddNTP；5)探針的單堿基延伸和第二次標記將5’末端抗原A標記的探針與擴增物雜交，DNA聚合酶在探針的3’末端用抗原B標記的雙脫氧單核苷酸(抗原B-ddNTP)以待檢SNP為模板延伸一個堿基，這時探針的5’和3’末端已分別標記上抗原A和B；6)形成探針與顆粒的復合物在檢測時，上述步驟5)的探針所帶有的抗原A首先與顆粒表面的抗體A結合，形成探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A的有色顆粒復合物。
7)探針顆粒復合物與檢測線的結合上述步驟6)的有色顆粒復合物在溶液中通過毛細現象沿纖維膜向上流動，當復合物遇到固定于膜上的抗體B線條時，待檢的探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A復合物與線條上的抗體B結合，形成線條抗體B-探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A的有色顆粒復合物(雙抗體雙抗原夾心)。有色的線條抗體B-探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A的顆粒復合物滯留在線上，形成肉眼可見的有色線條，此為陽性，即突變；8)在步驟5)的SBE反應時，如果加入帶有抗原B的ddNTP(如加入ddATP)與模板上的單核苷酸(如A，G或C)不形成互補，不能發生延伸，此時探針只帶有抗原A，在步驟6)中形成的探針抗原A-顆粒抗體A的有色顆粒復合物將不能如步驟7)中所述與膜上的檢測線結合而越過此線，不能形成肉眼可見的有色線條，此為陰性，即正常。
9)如果被檢樣品為純合子(如A/A)，則試紙條顯示一條有色線條(A線條)；如果被檢樣品為雜合子(如A/G)，則試紙條顯示二條有色線條(A和G線條)。
本發明的上述核酸試紙條檢測兩種多態堿基SNP方法的的基本步驟如附圖2中所示。
另一方面，本發明還提供了利用核酸試紙條檢測多種多態堿基SNP的檢測和分型方法，其包括1)用抗A抗體包被有色顆粒將特異性抗體(抗A抗體，無色)吸附于有色顆粒(如膠體金顆粒，乳膠顆粒等)，在顆粒表面形成抗體包被；2)用抗B抗體包被纖維膜將兩種以上，例如四種特異性抗體(抗B1，抗B2，抗B3，抗B4抗體，無色)以線條狀固定于同一條膜上，形成兩條以上，例如四條檢測線；3)根據檢測的多態位點設計和標記相應探針寡核苷酸鏈探針的3’末端位于待檢SNP位點的前一個堿基，探針的5’末端用抗原A標記；4)擴增含有待檢SNP的DNA；用PCR或其它方法擴增含有待檢SNP的DNA片段，PCR反應完成后，在PCR產物加入熱敏磷酸酶，直接降解其中未參加反應的脫氧單核苷酸分子(dNTP)，除去dNTP對以后SBE單堿基延伸過程中的干擾；然后加熱95℃使熱敏磷酸酶熱失活，以免其降解SBE反應中的抗原標記的雙脫氧單核苷酸分子ddNTP；5)探針的單堿基延伸和第二次標記將5’末端抗原A標記的探針與擴增物雜交；在SBE反應時，根據多態位點的堿基類型加入兩種以上，例如四種不同的標記的ddNTP(如抗原B1-ddTTP，抗原B2-ddATP，抗原B3-ddGTP，抗原B4-ddCTP)，DNA聚合酶在探針的3’末端用四種抗原B-ddNTP中的一種與多態性堿基配對，以待檢SNP為模板延伸一個堿基，這時探針的5’和3’末端已分別標記上抗原A和B；6)探針與顆粒復合物的形成檢測時，上述步驟5)的探針所帶有的抗原A首先與顆粒表面的抗體A結合，形成探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A的有色顆粒復合物。
7)探針顆粒復合物與檢測線的結合上述步驟6)的有色顆粒復合物在溶液中通過毛細現象沿纖維膜向上流動，當復合物遇到固定于膜上的四條抗體B線條時，待檢的探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A復合物與線條上相關的抗體B結合，形成線條抗體B-探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A的有色顆粒復合物(雙抗體雙抗原夾心)。有色的線條抗體B-探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A的顆粒復合物滯留在線上，形成肉眼可見的有色線條。不同的有色線條位置代表不同的堿基(A，T，C或G，見附圖3)。
8)如果被檢樣品為純合子(如A/A)，則試紙條顯示一條有色線條(A線條)。如果被檢樣品為雜合子(如A/G)，則試紙條顯示二條有色線條(A和G線條，見附圖3)。
9)根據核酸檢測試紙條的顯色判讀結果對所檢測的SNP進行分析和分型。
本發明的上述核酸試紙條檢測多種多態堿基SNP的方法的基本步驟示于附圖3中。
本發明說明書及權利要求書中所使用的技術術語解釋引物DNA合成的起始物。一般為一對單鏈寡核苷酸，在與模板雜交后，DNA合成從其3’末端開始。
探針探測靶核酸(DNA或RNA)的單鏈寡核苷酸。通常有可檢測的信號分子標記，如半抗原，熒光等。
標記將可檢測的信號分子(如半抗原，熒光，放射性等)與單鏈寡核苷酸相偶連的方法。
雜交特指互補的DNA單鏈通過堿基配對形成雙鏈結構。
核酸脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的通稱。
抗原和半抗原具備免疫原性的物質。通常為大分子蛋白質或細胞組分。但有些小分子也具備免疫原性，被稱為半抗原(Hapten)。半抗原常被用于標記探針。
抗體能與抗原或半抗原特異性結合的蛋白質分子。
復合體由兩種或兩種以上分子特異性結成的結合物。
免疫試紙條用于快速檢測的醫學工具。又稱為呈色薄膜層析。
核酸聚合酶合成核酸長鏈的酶類。分為DNA聚合酶和RNA聚合酶兩大類。
在本發明的上述方法中，所使用的抗A抗體可選自親和素、抗地高辛抗體或抗熒光染料抗體，其中抗熒光染料抗體選自抗Cy3抗體、抗Cy5抗體、抗Tetramethylrhodamine抗體、抗AlexaFluor抗體、抗Rhodamine抗體、抗Fam抗體、抗FitC抗體等。其中優選的抗體為親和素、抗地高辛抗體或抗FitC抗體。
在本發明的檢測方法中，所使用的另一種標準的通用抗體，無色的抗B抗體可選自上述標準的通用抗體，但應選用與抗A抗體不同的抗體。
在本發明的上述方法中，所使用的抗原A和抗原B可以是標準的通用抗原或半抗原。尤其適用于本發明方法的用于標記探針的抗原或半抗原選自生物素、地高辛或熒光染料，其中所述熒光染料選自Cy3、Cy5、Tetramethylrhodamine、AlexaFluor、Rhodamine、Fam、FitC，等。優選的抗原或半抗原為生物素、地高辛或FitC。探針的5’末端和3’末端應選用不同的抗原或半抗原標記。
用于吸附抗A抗體的有色顆粒可以是，如膠體金顆粒、乳膠顆粒等。所述膜通常為硝酸纖維素膜或尼龍膜。在本發明的上述方法中，所使用的DNA聚合酶可選自Klenow DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶，Vent DNA聚合酶，Bst DNA聚合酶，或Thermo sequenase。這些DNA聚合酶在商業上可由例如美國的NewEngland Biolabs，獲得。
本發明的突出的有益效果是以核酸檢測試紙條為檢測平臺，從樣品提取開始到給出確定SNP分析和分型結果，整個操作周期短，只需要2-3個小時。判讀簡單同時又不需要任何特殊儀器，使得這種檢測方法的操作復雜性和SNP檢測成本大大降低。SNP檢測試紙條對于實驗的條件和環境要求不高，所以在一般的分子實驗室和醫院檢驗科即可以完成全部實驗。SNP檢測試紙條與基因芯片，基因測序的比較
SNP檢試紙條以其特異、簡單、快捷的特性可以獲得很廣泛的應用，如1.與SNP直接相關的人類遺傳性疾病的分子診斷；2.人群中可以確定人類健康遺傳基礎的SNP的篩查與分型3.人體藥物反應差異性檢測與篩查；4.人群中某種疾病易感基因的篩查；5.病原體已知耐藥基因的檢測；6.器官移植中供體和受體間的配對選擇7.法醫研究中罪犯身份的鑒別及親子鑒定8.運動員基因型的篩選如下實施例僅用于舉例說明本發明，并不構成對本發明的保護范圍的任何限制。
實施例實施例1.ACTN3基因R577X單核苷酸多態性的檢測與分型ACTN3基因是第一個被證實與人體健康和運動能力表型有關的骨骼肌結構性基因，其編碼的產物為α-輔肌動蛋白-3(ACTN3)。ACTN3的577位密碼子發生了突變由野生型577R(CGA)突變為577X(TGA)，使該基因的終止密碼子提前出現，導致人體內α-輔肌動蛋白-3缺乏。有證據證明ACTN3基因的577R等位基因型對于要求有力量和速度性的活動有益，R等位基因使得機體內表達出功能性α-輔肌動蛋白-3蛋白，有利于肌肉進行快速有力的收縮；而X等位基因則在某種程度上對慢速和持久性肌肉收縮提供了一個良好的分子基礎。
鑒于以上ACTN3基因R577X這個SNP分型的意義，本申請專利發明的SNP試紙條對ACTN3第577位點多態性進行檢測。具體實施如下1)取樣棉拭子取檢測者的口腔脫落細胞，然后應用杭州優思達生物技術有限公司所生產的微量DNA快速提取試劑盒進行核酸提取。
2)聚合酶鏈反應(PCR)模板被檢者基因組DNA引物 0.2微摩正向引物ACTN3PF5’GAGTGCTGGGCTGGAAGA 3’反向引物ACTN3PR5’CGGGCTGAGGGTGATGTA 3’dNTP 0.2毫摩緩沖液MgCl23毫摩KCl 50毫摩Tris-HCL(pH 9.0) 10毫摩Triton-100 1％Taq DNA聚合酶 0.8單位PCR反應總體積微20微升。
PCR反應程序如下 PCR產物大小302bp3)降解PCR反應正剩余的dNTPPCR產物 20微升緩沖液Bis Tris-Propane50毫摩MgCl21毫摩ZnCl20.1毫摩熱敏磷酸酶1單位總體積微30微升反應程序37℃，15分鐘熱敏磷酸酶滅活80℃，20分鐘4)單堿基延伸(檢測C、T和A)模板上述dNTP降解后的PCR產物 30微升延伸引物 0.1微摩5’FITC-AGCCACTGCCCGAGGCTGAC 3’(正向)
生物素-ddCTP，/生物素-ddTTP/生物素-ddATP 0.5微摩緩沖液Tris-HCl(pH 9.5) 26毫摩MgCl26.5毫摩熱測序酶0.5單位總體積微40微升SBE反應程序如下95℃60秒；72℃90秒5)檢測結果將延伸產物全部滴于核酸試紙條上，在10分鐘判讀結果。
核酸試紙條檢測SNP和測序結果見附圖4，由附圖4的檢測結果可以看出，被檢者ACTN3577(C/T)位多態位點基因型為雜合型。SNP核酸試紙條檢測結果與測序結果一致。
實施例2.Leber’s病線粒體DNA G11778A單核苷酸多態性的檢測與分型Leber’s遺傳性視神經病(Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON)是一種母性遺傳的雙眼視神經疾病。1988年W.allace等人首先報告線粒體DNA(mtDNA)第11778核苷酸位點原發性突變(G→A)可引起LHON。迄今發現和本病相關的mtDNA位點突變已有25個，在近年的報告中3460或14484等原發性位點突變的LHON及原發和繼發突變并存的LHON患者，其臨床表現類似11778位點突變者，臨床醫生很難根據其臨床表現進行鑒別，因此分子生物學基因檢查成為鑒別不同病因的Leber’s病的首選方法。鑒于對于線粒體G11778A位點分型對于Leber’s遺傳性視神經病的診斷意義，應用本專利新發明的SNP檢測試紙條對G11778A位點多態性進行檢測。具體實施如下1)取樣被檢者外周靜脈抗凝血(凍存)5μl，應用杭州優思達生物技術有限公司所生產的微量DNA快速提取試劑盒進行核酸提取，用以基因擴增。
2)聚合酶鏈反應(PCR)為排除基因組中假基因對線粒體基因擴增的干擾，需要進行兩次擴增，以第一擴增產物為模板進行二次擴增，然后利用第二次擴增產物進行SBE。
引物 0.2微摩第一次擴增引物Nd4P_out_F5’TCACTCTCACTGCCCAAAA 3’Nd4P_out_R5’GGAGAATGGGGGATAGGTGT 3’第二次擴增引物Nd4P_in_F5’CTTCACCGGCGCAGTCATTC 3’Nd4P_in_R5’AGGCGAGGTTAGCGAGGCTT 3’dNTP0.2毫摩緩沖液MgCl23微摩KCl 50微摩Tris-HCl(PH 9.0) 10微摩氚核-100 1.0％Taq DNA聚合酶 0.8單位總體積為 20微升PCR反應程序如下第一對引物 第二對引物 產物大小801bp(第一對引物)182bp(第二對引物)3)降解第二次PCR反應中剩余的dNTP模板上述PCR產物 20微升緩沖液Bis Tris-Propane 50毫摩MgCl21毫摩ZnCl20.1毫摩熱敏磷酸酶 1單位總體積為30微升反應程序37℃，15分鐘熱敏磷酸酶滅活80℃，20分鐘。
4)單堿基延伸(檢測G和A)模板上述dNTP降解后的PCR產物30微升延伸引物 0.1微摩5’FITC-TCAAACTACGAACGCACTCACAGTC 3’(正向)生物素-ddGTP/生物素-ddATP0.5微摩緩沖液Tris-HCL(pH 9.5)26毫摩MgCl26.5毫摩熱測序酶 0.5單位總體積為40微升SBE反應程序如下95℃60秒72℃90秒5)檢測結果將延伸產物全部滴于核酸試紙條上，在10分鐘判讀結果。核酸試紙條檢測SNP結果見附圖5，由附圖5的結果可以看出，在被檢者線粒體ND4基因11778位點發生突變，由G轉變為A，與測序結果一致。
權利要求
1.一種核酸試紙條檢測兩種多態堿基SNP的方法，其包括1)用抗A抗體包被有色顆粒；2)用抗B抗體包被纖維膜；3)根據檢測的多態位點設計探針寡核苷酸鏈，探針的3’末端位于待檢SNP位點的前一個堿基，探針的5’末端用抗原A標記；4)擴增上述步驟3)的含有待檢SNP的DNA；5)將5’末端抗原A標記的探針與擴增物雜交，DNA聚合酶在擴增后的探針的3’末端用抗原B標記的雙脫氧單核苷酸以待檢SNP為模板延伸一個堿基，此時探針已被抗原A和抗原B雙重標記；6)在檢測時，上述步驟5)得到的探針所帶有的抗原A首先與顆粒表面的抗體A結合，形成探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A的有色顆粒復合物；7)上述步驟6)得到的有色顆粒復合物在溶液中通過毛細現象沿纖維膜向上流動，當復合物遇到固定于膜上的抗體B線條時，待檢的探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A復合物與線條上的抗體B結合，形成線條抗體B-探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A的有色顆粒復合物，有色的線條抗體B-探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A的顆粒復合物滯留在線上，形成肉眼可見的有色線條，此為陽性；8)在步驟5)時，如果加入帶有抗原B的雙脫氧單核苷酸(ddNTP)與模板上的單核苷酸不形成互補，則不能發生延伸，此時探針只帶有抗原A，則在步驟6)中形成的探針抗原A-顆粒抗體A的有色復合物將不能與膜上的抗體B檢測線結合而越過此線，不能形成肉眼可見的有色線條。此為陰性；9)如果被檢樣品為純合子，則試紙條顯示一條有色線條；如果被檢樣品為雜合子，則試紙條顯示二條有色線條。
2.一種核酸試紙條檢測多種多態堿基SNP的檢測和分型方法，其包括1)用抗A抗體包被有色顆粒；2)用抗B抗體包被纖維膜將兩種以上無色特異性抗體B以線條狀固定于同一條膜上，形成兩條以上的檢測線；3)根據檢測的多態位點設計和標記探針寡核苷酸鏈，探針的3’末端位于待檢SNP位點的前一個堿基，探針的5’末端用抗原A標記；4)擴增含有待檢SNP的DNA；5)將5’末端抗原A標記的探針與擴增物雜交，DNA聚合酶在探針的3’末端用兩種以上的抗原B-ddNTP中的一種與多態性堿基配對，以待檢SNP為模板延伸一個堿基，此時探針已被抗原A和抗原B雙重標記；6)檢測時，上述步驟5)的探針所帶有的抗原A首先與顆粒表面的抗體A結合，形成探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A的有色顆粒復合物；7)上述步驟6)得到有色顆粒復合物在溶液中通過毛細現象沿纖維膜向上流動，當復合物遇到固定于膜上的兩條以上的抗體B線條時，待檢的探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A復合物與線條上相關的抗體B結合，形成線條抗體B-探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A的有色顆粒復合物，有色的線條抗體B-探針抗原B-探針抗原A-顆粒抗體A的顆粒復合物滯留在線上，形成肉眼可見的有色線條，不同的有色線條位置代表不同的堿基；8)如果被檢樣品為純合子，則試紙條顯示一條有色線條；如果被檢樣品為雜合子，則試紙條顯示二條有色線條；9)根據核酸檢測試紙條的顯色判讀結果對所檢測的SNP進行分析和分型。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中用于標記探針的抗原A和抗原B是標準的通用抗原或半抗原，其選自生物素、地高辛或熒光染料，其中所述熒光染料選自Cy3、Cy5、Tetramethylrhodamine、AlexaFluor、Rhodamine、Fam或FitC；探針的5’末端和3’末端應選用不同的抗原或半抗原標記；所使用的抗A抗體和無色的抗B抗體是標準通用抗體，其可選自親和素、抗地高辛抗體或抗熒光染料抗體，所述抗熒光染料抗體選自抗Cy3抗體、抗Cy5抗體、抗Tetramethylrhodamine抗體、抗AlexaFluor抗體、抗Rhodamine抗體、抗Fam抗體或抗FitC抗體；抗B抗體應選用與抗A抗體不同的抗體。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述抗原或半抗原為生物素、地高辛或FitC；所述抗體為親和素、抗地高辛抗體或抗FitC抗體。
5.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述DNA聚合酶可選自Klenow DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、BstDNA聚合酶或Thermo sequenase。
6.根據權利要求1或2所述的方法，其中用于吸附抗A抗體的有色顆粒是膠體金顆粒或乳膠顆粒，所述的膜為硝酸纖維素膜或尼龍膜。
7.權利要求1-6之一所述的方法在與SNP直接相關的人類遺傳性疾病的分子診斷、細菌和病毒等其它病原微生物耐藥基因突變的檢測、人體藥物反應差異性的檢測與篩查、人類健康遺傳基礎的SNP的篩查與分型、人群中某些疾病易感基因的篩查、器官移植中供體和受體間的配對選擇和法醫學中罪犯身份的鑒別及親子鑒定中的用途。
全文摘要
本發明公開了一種核酸試紙條檢測兩種多態堿基SNP的方法。本發明還公開了一種核酸試紙條檢測多種多態堿基SNP的檢測和分型方法。此外，本發明還公開了上述檢測方法在與SNP直接相關的人類遺傳性疾病的分子診斷、細菌和病毒等其它病原微生物耐藥基因突變的檢測、人體藥物反應差異性的檢測與篩查、人類健康遺傳基礎的SNP的篩查與分型、人群中某些疾病易感基因的篩查、器官移植中供體和受體間的配對選擇和法醫學中罪犯身份的鑒別及親子鑒定中的用途。
文檔編號G01N33/544GK1847852SQ20061007870
公開日2006年10月18日 申請日期2006年5月10日 優先權日2006年5月10日
發明者尤其敏, 胡林, 王宏瑩, 徐高連 申請人:杭州優思達生物技術有限公司
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