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專(zhuān)利名稱(chēng)：一種蛋白芯片的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白芯片的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
生物芯片是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新的生物檢測(cè)技術(shù)，包括基因芯片、蛋白芯片、組織芯片等，具有高速度、高通量、高效率等優(yōu)點(diǎn)。與基因芯片檢測(cè)技術(shù)相比，蛋白芯片的檢測(cè)具有以下幾個(gè)難點(diǎn)不同蛋白質(zhì)之間從電荷狀況到空間結(jié)構(gòu)均有較大的差異，給樣品標(biāo)記帶來(lái)較大困難；蛋白質(zhì)無(wú)法擴(kuò)增放大的特點(diǎn)使得檢測(cè)靈敏度要求很高；反應(yīng)模式的復(fù)雜多樣給芯片的平行檢測(cè)造成困難。目前，蛋白芯片的常用檢測(cè)方法主要有如下幾種1、熒光檢測(cè)法這種方法相對(duì)成熟，大部分基因芯片均采用這種方法進(jìn)行檢測(cè)。但是，該方法需要激發(fā)光源和高精度的分光系統(tǒng)，所用的儀器和熒光染料價(jià)格昂貴，運(yùn)行成本高。
2、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法這也是蛋白芯片常用的一種檢測(cè)方法，但是，一般所檢測(cè)的蛋白樣品的濃度低，需要高靈敏度的CCD(電耦合器件)，同時(shí)化學(xué)發(fā)光的標(biāo)記物價(jià)格也相當(dāng)昂貴。
3、金屬標(biāo)記物檢測(cè)法也有文獻(xiàn)(CN 1390955A)報(bào)道了一種金屬標(biāo)記物檢測(cè)蛋白芯片的方法，在該檢測(cè)方法中蛋白樣品采用金屬直接標(biāo)記，其缺點(diǎn)是蛋白樣品易于失活且標(biāo)記率較低，標(biāo)記操作比較復(fù)雜。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種靈敏、簡(jiǎn)單、通用的蛋白芯片檢測(cè)方法。
本發(fā)明所提供的蛋白芯片的檢測(cè)方法，包括如下步驟1)用生物素標(biāo)記的待測(cè)蛋白二抗、待測(cè)蛋白與蛋白芯片進(jìn)行雜交；或者直接以生物素標(biāo)記的待測(cè)蛋白與蛋白芯片進(jìn)行雜交；2)加入膠體金標(biāo)記的親和素與蛋白芯片進(jìn)行雜交，然后，再加入銀顯色增強(qiáng)試劑進(jìn)行反應(yīng)，檢測(cè)反應(yīng)生成的銀顆粒。
其中，生物素標(biāo)記的待測(cè)蛋白二抗或生物素標(biāo)記的待測(cè)蛋白按如下步驟進(jìn)行制備在待測(cè)蛋白二抗或待測(cè)蛋白的溶液中加入生物素，混勻反應(yīng)，反應(yīng)后透析得到生物素標(biāo)記的待測(cè)蛋白二抗或生物素標(biāo)記的待測(cè)蛋白。
所述標(biāo)記過(guò)程中，待測(cè)蛋白二抗或待測(cè)蛋白的溶液濃度為1～10mg/ml，所述生物素的終濃度為0.1～5mg/ml。標(biāo)記可在室溫下進(jìn)行。
本發(fā)明方法能應(yīng)用于肝臟疾病診斷的蛋白芯片檢測(cè)，此時(shí)待測(cè)蛋白可為肝炎病毒抗原、肝癌抗原或與肝臟疾病相關(guān)的抗原蛋白等。所用的蛋白芯片含有肝炎病毒的抗體，肝癌抗原的抗體或與肝臟疾病相關(guān)的抗原蛋白的抗體等。
生物素是一種有機(jī)小分子，它具有性質(zhì)穩(wěn)定，標(biāo)記后對(duì)蛋白所產(chǎn)生的空間阻礙作用小，標(biāo)記率高等特點(diǎn)。本發(fā)明利用生物素作為聯(lián)系蛋白/抗體與信號(hào)分子的橋梁，與采用將納米金屬直接標(biāo)記蛋白方法相比，生物素法能使蛋白保持更好的活性，從而達(dá)到高的檢測(cè)靈敏度；利用生物素能與親和素產(chǎn)生很強(qiáng)的特異性作用的特性，使用膠體金標(biāo)記的親和素將膠體金試劑特異性地結(jié)合至目標(biāo)物上，而且由于生物素對(duì)蛋白質(zhì)的高標(biāo)記率使得目標(biāo)物可以同時(shí)結(jié)合多個(gè)膠體金分子，可以大大提高銀增強(qiáng)劑的顯色效果，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的高靈敏檢測(cè)，檢測(cè)限可達(dá)到1ng/ml以下。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，可以采用直接標(biāo)記待測(cè)物的方法或者采用夾心法(先標(biāo)記二抗，再進(jìn)行雜交)，能同時(shí)對(duì)多個(gè)抗原實(shí)現(xiàn)直接的檢測(cè)。本發(fā)明的檢測(cè)靈敏度已達(dá)到、部分已超過(guò)熒光檢測(cè)的靈敏度，而無(wú)需采用昂貴的熒光檢測(cè)設(shè)備和熒光標(biāo)記物，成本低廉。


圖1為熒光檢測(cè)法的檢測(cè)結(jié)果照片；圖2為本發(fā)明方法的檢測(cè)結(jié)果照片；圖3為CEA抗原檢測(cè)的灰度值與濃度的關(guān)系圖；圖4為AFP抗原檢測(cè)的灰度值與濃度的關(guān)系圖；圖5為HBsAg抗原檢測(cè)灰度值與濃度的關(guān)系圖；圖6A-圖6G分別為人鐵蛋白、觸球蛋白、銅藍(lán)蛋白、纖連蛋白、α-抗胰蛋白、IgA和IgM的相對(duì)灰度值與蛋白濃度的關(guān)系圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、本發(fā)明方法與熒光法檢測(cè)的對(duì)照實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)方法1、蛋白芯片制備蛋白芯片的制備方法參見(jiàn)文獻(xiàn)(何為，許丹科，劉志紅等。分析化學(xué)，2005，3337-40)，所用抗人白蛋白單克隆抗體購(gòu)自于南方醫(yī)科大學(xué)。
2、待測(cè)樣品的生物素標(biāo)記待測(cè)人白蛋白(人白蛋白為南方醫(yī)科大學(xué)提供)用PBS緩沖液配制成1mg/ml濃度，在此溶液中加入生物素并使其終濃度為0.5mg/mL。混均后反應(yīng)4小時(shí)后加入NH4Cl，濃度為50mmol/L，室溫下放置10分鐘。取100微升溶液放入透析器中，室溫下攪拌透析7小時(shí)后，樣品取出備用。反應(yīng)時(shí)所需各種不同濃度的人白蛋白樣品由此儲(chǔ)存液稀釋配制。
3、芯片雜交將抗體蛋白芯片放入芯片反應(yīng)盒中，加入各種濃度的生物素標(biāo)記待測(cè)人白蛋白樣品100微升，與芯片反應(yīng)1小時(shí)。清洗后加入膠體金標(biāo)記的親合素試劑(Sigma公司，美國(guó))50μL，在芯片上形成膠體金-抗原-抗體復(fù)合物。
4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)芯片清洗后，加入銀顯色增強(qiáng)試劑與抗體蛋白芯片反應(yīng)15分鐘，利用金顆粒可催化銀離子還原成金屬銀原理，在膠體金表面形成可通過(guò)目測(cè)法觀察到的銀顆粒，并用CCD攝像裝置檢測(cè)圖像，數(shù)據(jù)采用軟件處理可獲得各點(diǎn)的灰度值。
同時(shí)，以熒光檢測(cè)法作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)在熒光檢測(cè)法對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，以Cy5親和素?zé)晒鈽?biāo)記物(Sigma公司，美國(guó))取代膠體金標(biāo)記的親合素試劑，其余步驟同于上述實(shí)驗(yàn)。在芯片上形成Cy5-抗原-抗體復(fù)合物。反應(yīng)結(jié)果采用熒光掃描檢測(cè)儀(PE公司，美國(guó))檢測(cè)其熒光值。
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果熒光檢測(cè)法的檢測(cè)結(jié)果照片如圖1所示該蛋白芯片分為8個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域含有三排固定的蛋白抗體上排為陰性對(duì)照點(diǎn)，中間為抗白蛋白抗體，下排為陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)；8個(gè)反應(yīng)區(qū)加入的樣品濃度分別為A100ug/ml；B20ug/ml；C4ug/ml；D800ng/ml；E160ng/ml；F32ng/ml；G6.4ng/ml；H1.28ng/ml。
本發(fā)明方法檢測(cè)結(jié)果照片如圖2所示蛋白芯片分為8個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域含有五排固定蛋白抗體第一排為陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)，第二排陰性對(duì)照點(diǎn)，第三至第五排為抗白蛋白抗體；8個(gè)反應(yīng)區(qū)加入的樣品濃度分別為A125ng/ml；B63ng/ml；C32ng/ml；D16ng/ml；E8ng/ml；F4ng/ml；G2ng/ml；H1ng/ml。
對(duì)比兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明方法通過(guò)生物素直接標(biāo)記樣品，并通過(guò)銀增強(qiáng)途徑可以使蛋白芯片具有很高的檢測(cè)靈敏度，對(duì)于所測(cè)試的人白蛋白最低檢測(cè)濃度可達(dá)到0.1ng/mL；而對(duì)照的熒光法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)顯示，其最低檢測(cè)濃度約為6ng/ml左右。
實(shí)施例2、甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)的同時(shí)檢測(cè)1、制備抗體蛋白芯片蛋白芯片的制備方法參見(jiàn)文獻(xiàn)(何為，許丹科，劉志紅等，分析化學(xué)，2005，3337-40)，所用的抗癌胚抗原(anti-CEA)及抗甲胎蛋白(anti-AFP)抗體均購(gòu)自US Biological公司(美國(guó))。
2、二抗的生物素標(biāo)記將甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)的二抗蛋白(抗癌胚抗原及抗甲胎蛋白二抗均購(gòu)自US Biological公司)用PBS緩沖液配制成濃度為10mg/ml的待標(biāo)記溶液。在此溶液中加入生物素使其終濃度為0.5mg/mL，混均后反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)完成后加入NH4Cl，濃度為50mmol/L。室溫下放置10分鐘。取100微升溶液放入透析器中，室穩(wěn)下攪拌透析7小時(shí)后，樣品取出備用。
3、芯片雜交將抗體蛋白芯片放入芯片反應(yīng)盒內(nèi)，加入不同濃度待測(cè)的甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)樣品(US Biological公司)100微升(CEA濃度為0、0.1、0.5、1、5、10、50、100ng/ml；AFP濃度為0、0.1、0.5、2.5、12.5、62.5ng/ml)。與芯片反應(yīng)1小時(shí)后，加入生物素標(biāo)記的二抗50μL，孵育1小時(shí)；用PBS緩沖液清洗后加入膠體金標(biāo)記的親合素試劑(Sigma公司，美國(guó))50μL，在芯片上形成膠體金-抗原-抗體復(fù)合物。
4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)用PBS緩沖液清洗芯片后，加入銀顯色增強(qiáng)試劑50μL與抗體蛋白芯片反應(yīng)15分鐘，利用金顆粒可催化銀離子還原成金屬銀原理，在膠體金表面形成可通過(guò)目測(cè)法觀察到的銀顆粒，并用CCD攝像裝置檢測(cè)圖像，數(shù)據(jù)采用軟件處理可獲得各點(diǎn)的灰度值各檢測(cè)點(diǎn)的灰度與添加樣品的濃度關(guān)系分別如圖3和圖4所示，圖3為CEA抗原檢測(cè)的灰度值與濃度的關(guān)系圖，圖4為AFP抗原檢測(cè)的灰度值與濃度的關(guān)系圖。由圖可見(jiàn)，利用生物素標(biāo)記的二抗，采用夾芯式雜交方式，本發(fā)明方法具有較高的檢測(cè)靈敏度，對(duì)癌胚抗原(CEA)及甲胎蛋白(AFP)的檢測(cè)限能分別達(dá)到0.1ng/ml與0.5ng/ml。實(shí)驗(yàn)中顯示兩者同時(shí)具有很好的特異性。
實(shí)施例3、乙型肝炎病毒的檢測(cè)1、制備乙型肝炎病毒抗體芯片蛋白芯片的制備方法參見(jiàn)文獻(xiàn)(何為，許丹科，劉志紅等。分析化學(xué)，2005，3337-40)，所用的乙肝表面抗原(HBsAg)及抗乙肝表面抗原(anti-HBsAg)購(gòu)自北京科衛(wèi)試劑公司。
2、乙肝表面抗原二抗的生物素標(biāo)記將乙肝表面抗原二抗(anti-HBsAg，購(gòu)自北京科衛(wèi)試劑公司)用PBS緩沖液配制成濃度為4mg/ml的待標(biāo)記溶液，在此溶液中加入生物素并使其終濃度為2mg/mL，混均后反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)完成后加入NH4Cl濃度為50mmol/L，室溫下放置10分鐘。取100微升溶液放入透析器中，室穩(wěn)下攪拌透析7小時(shí)后，樣品取出備用。
3、芯片雜交將抗體蛋白芯片放入芯片反應(yīng)盒中，加入不同濃度的待測(cè)乙肝病毒表面抗原(HBsAg)樣品(北京科衛(wèi)試劑公司)100微升(濃度為0、0.1、1、10、100、1000ng/ml)，與芯片反應(yīng)1小時(shí)后，加入生物素標(biāo)記的二抗孵育1小時(shí)。芯片清洗后加入膠體金標(biāo)記的親合素試劑(Sigma公司，美國(guó))50μL。在芯片上形成膠體金-抗原-抗體復(fù)合物。
4、檢測(cè)清洗芯片后，加入銀顯色增強(qiáng)試劑與抗體蛋白芯片反應(yīng)15分鐘，利用金顆粒可催化銀離子還原成金屬銀原理，在膠體金表面形成可通過(guò)目測(cè)法觀察到的銀顆粒。并用CCD攝像裝置檢測(cè)圖像，數(shù)據(jù)采用軟件處理可獲得各點(diǎn)的灰度值。
HBsAg抗原檢測(cè)灰度值與濃度的關(guān)系圖如圖5所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用生物素標(biāo)記的二抗，采用夾芯式雜交方式，本發(fā)明方法建立的金屬銀增強(qiáng)方法具有較高的檢測(cè)靈敏度，對(duì)乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的檢測(cè)限達(dá)到0.5ng/ml。
實(shí)施例4、與肝臟疾病相關(guān)的其他標(biāo)志物(人鐵蛋白、α-抗胰蛋白、銅藍(lán)蛋白、IgM、IgA、纖連蛋白和觸球蛋白等)的直接標(biāo)記檢測(cè)法一、實(shí)驗(yàn)方法1、蛋白芯片制備抗人鐵蛋白、抗α-抗胰蛋白、抗銅藍(lán)蛋白、抗IgM、抗IgA、抗纖連蛋白和抗觸球蛋白等抗體購(gòu)自US Biological公司(美國(guó))，蛋白芯片的制備方法參見(jiàn)文獻(xiàn)何為，許丹科，劉志紅等。分析化學(xué)，2005，33(1)37-40.
2、待測(cè)樣品的生物素標(biāo)記待測(cè)樣品人鐵蛋白、α-抗胰蛋白、銅藍(lán)蛋白、IgM、IgA、纖連蛋白和觸球蛋白等購(gòu)自Sigma公司(美國(guó))。待測(cè)樣品用PBS緩沖液配制，在此溶液中加入生物素使其終濃度為0.5mg/mL。混均后反應(yīng)4小時(shí)，反應(yīng)完成后加入NH4Cl濃度為50mmol/L，室溫下放置10分鐘。取100微升溶液放入透析器中，室穩(wěn)下攪拌透析7小時(shí)后，樣品取出備用。
3、芯片雜交將抗體蛋白芯片放入自制的芯片反應(yīng)盒中，加入不同濃度的生物素標(biāo)記待測(cè)樣品100微升(樣品中各個(gè)蛋白的濃度值見(jiàn)圖6A-圖6G數(shù)據(jù))，與芯片反應(yīng)1小時(shí)；清洗后加入膠體金標(biāo)記的親合素試劑(Sigma公司，美國(guó))，在芯片上形成膠體金-抗原-抗體復(fù)合物。
4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)清洗芯片后，加入銀顯色增強(qiáng)試劑與抗體蛋白芯片反應(yīng)15分鐘，利用金顆粒可催化銀離子還原成金屬銀原理，在膠體金表面形成可通過(guò)目測(cè)法觀察到的銀顆粒，并用CCD攝像裝置檢測(cè)圖像，數(shù)據(jù)采用軟件處理可獲得各點(diǎn)的灰度值。
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果人鐵蛋白、觸球蛋白、銅藍(lán)蛋白、纖連蛋白、α-抗胰蛋白、IgA和IgM的相對(duì)灰度值與蛋白濃度的關(guān)系分別如圖6A-圖6G所示。本發(fā)明方法對(duì)上述蛋白的檢測(cè)靈敏度如表1所示。
表1.本發(fā)明方法對(duì)蛋白的檢測(cè)靈敏度

結(jié)果表明，在采用生物素直接標(biāo)記蛋白，并用金屬銀增強(qiáng)檢測(cè)的方法能較為靈敏地檢測(cè)多種與肝臟疾病相關(guān)的蛋白抗原，顯示了本方法的簡(jiǎn)便、靈敏、通用等諸多優(yōu)勢(shì)。
權(quán)利要求
1.一種蛋白芯片的檢測(cè)方法，包括如下步驟1)用生物素標(biāo)記的待測(cè)蛋白二抗、待測(cè)蛋白與蛋白芯片進(jìn)行雜交；或者直接以生物素標(biāo)記的待測(cè)蛋白與蛋白芯片進(jìn)行雜交；2)加入膠體金標(biāo)記的親和素與蛋白芯片進(jìn)行雜交，然后，再加入銀顯色增強(qiáng)試劑進(jìn)行反應(yīng)，檢測(cè)反應(yīng)生成的銀顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述生物素標(biāo)記的待測(cè)蛋白二抗或生物素標(biāo)記的待測(cè)蛋白按如下步驟進(jìn)行制備在待測(cè)蛋白二抗或待測(cè)蛋白的溶液中加入生物素，混勻反應(yīng)，反應(yīng)后透析得到生物素標(biāo)記的待測(cè)蛋白二抗或生物素標(biāo)記的待測(cè)蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述標(biāo)記過(guò)程中，待測(cè)蛋白二抗或待測(cè)蛋白的溶液濃度為1～10mg/ml，所述生物素的終濃度為0.1～5mg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述待測(cè)蛋白為肝炎病毒抗原、肝癌抗原或與肝臟疾病相關(guān)的抗原蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述能檢測(cè)待測(cè)蛋白的蛋白芯片含有肝炎病毒的抗體，肝癌抗原的抗體或與肝臟疾病相關(guān)的抗原蛋白的抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種蛋白芯片的檢測(cè)方法。本發(fā)明所提供的蛋白芯片的檢測(cè)方法，包括如下步驟1)用生物素標(biāo)記的待測(cè)蛋白二抗、待測(cè)蛋白與蛋白芯片進(jìn)行雜交；或者直接以生物素標(biāo)記的待測(cè)蛋白與蛋白芯片進(jìn)行雜交；2)加入膠體金標(biāo)記的親和素再與蛋白芯片進(jìn)行雜交，加入銀顯色增強(qiáng)試劑進(jìn)行反應(yīng)，檢測(cè)反應(yīng)生成的銀顆粒。本發(fā)明方法的檢測(cè)靈敏度已達(dá)到、部分已超過(guò)熒光檢測(cè)的靈敏度，而無(wú)需采用昂貴的熒光檢測(cè)設(shè)備和熒光標(biāo)記物，成本低廉。
文檔編號(hào)G01N33/576GK1743845SQ20051009367
公開(kāi)日2006年3月8日 申請(qǐng)日期2005年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月1日
發(fā)明者許丹科, 劉志紅, 何為, 韓歡歡 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所