專利名稱：用于白血病分型和研究的蛋白質芯片的制作方法
技術領域：
本發明用于白血病分型和研究的蛋白質芯片屬于生命科學領域。蛋白質芯片是一種在固態基底上有序排布的蛋白質或多肽陣列，以實現對蛋白質進行并行檢測、識別、鑒定和診斷的器件。可應用于生物學、醫學及其相關領域。
AML是髓系白細胞異常增殖，隨血液循環釋放到外組織和浸潤各種組織器官。起病急驟，約66％的病人在一個月內起病，病情急，發展快。貧血和發熱時首發癥狀，中后期出現出血。其長期存活率差(20-30％)，最好在緩解后，繼續接受骨髓移植，以提高治愈機會。ALL是由原始淋巴細胞大量增殖引起的，除發熱和出血外，還有明顯的肝、脾、淋巴結腫大等癥狀。其生存率高(60-70％)，若不幸復發，方可考慮接受骨髓移植。CML是一種起源于多能干細胞的腫瘤性增生疾病，臨床特點是粒細胞顯著增多，脾明顯腫大，絕大多數CML有較特異的Ph標記染色體，病程較緩慢，急性變預后極差，如不積極治療往往在數月內死亡。CLL是由于一種小淋巴細胞克隆性擴展，逐步積累而浸潤骨髓、血液、淋巴結和其他器官，最終導致造血功能衰竭的一種惡性疾病。這種細胞形態上雖類似成熟淋巴細胞，但是一種免疫學不成熟的、功能不全的細胞。CLL絕大多數為B細胞性，T細胞性極少。因此，白血病初診時類型的確定，對評估預后、制定治療策略、提高緩解率有重要價值。
目前臨床上白血病分型的方法主要是根據細胞形態學和細胞化學來進行的。一般是抽取病人血液和骨髓做細胞涂片檢查，可辨別是否有異常的細胞增殖，再進行細胞化學染色和細胞計數來檢測白血病細胞的類型和數量，從而確定白血病的類型，但該方法存在靈敏度低、效率差等缺點。近來由于免疫學的進步，發現有247種表達于細胞表面的CD(Cluster of Differentiation)抗原分子與白血病細胞相關。不同類型的白血病細胞會表達特異的CD分子，利用標有熒光標記的抗CD的抗體可以檢出表達相應CD分子的細胞，但此法每次反應只能檢測一個指標，速度慢，浪費大量人力和物力。隨著生物芯片技術的發展，Golub等從38位AML或ALL病人的骨髓提取物的基因表達譜中檢測到1100個與AML-ALL分型有關的基因，并利用其中差異性最顯著的50個基因制成了精確度很高的DNA芯片。但這種方法實驗步驟復雜，適用范圍小，成本昂貴，不太適用于臨床檢測。此外，還有根據細胞遺傳學或分子特征分型的方法，都存在著實驗復雜、效率低的缺點。并且上述種種方法都是僅僅為分型而設計，沒有考慮到對不同白血病亞型的分子特性進行全面的研究。
本發明目的可通過以下技術方案實現是將與白血病相關的表達于白細胞細胞膜上的特異性表面標志CD系列抗原分子的相應抗體以及陽性對照、陰性對照同時高密度點印于固相載體上，蛋白質通過化學鍵連接固定在固相載體上，以用于對病人的外周血進行白血病的分型和研究。
其中，表面標志CD系列抗原，可包括迄今已經發現的所有CD分子，也可選擇其中的一部分；陽性對照分別采用CD4和CD8；陰性對照采用人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)。
在上述技術方案的基礎上，本發明的目的可通過下述技術方案實現采用雙抗體夾心法對病人的外周血進行白血病的分型和研究，即是取病人外周血，稀釋后滴加于芯片表面，表達分泌不同CD抗原分子的細胞分別被固定在芯片上的相對應的抗體捕獲，洗去未結合的其他物質后，加入熒光標記的CD4抗體和CD8抗體的混合液，由于CD4和CD8是正常白細胞和病態白細胞普遍表達的表面標志，洗去未結合的抗體后，進行熒光掃描。
在上述技術方案的基礎上，對熒光掃描的結果分析如下某點產生熒光信號，則表明該病人的白細胞可分泌表達該點所對應的CD分子，記為陽性，例如CD5+；如果不產生熒光信號，則記為陰性，例如CD10-；對所有結果進行綜合分析，即可對該病人進行白血病分型，或研究不同型白血病的CD表達特征。
本發明用于白血病分型和研究的蛋白質芯片的制備方法如下第一步，根據樣品數目選擇合適的多樣品微陣列生物芯片，確定每個樣品對應的檢測CD分子的腔室，做好標記，并確定點陣的排列方式和點樣位置；第二步，點樣針從多孔板取出蛋白質樣品(各種CD抗體以及對照品)后直接高密度點印于固態基底上；第三步，室溫過夜或37℃溫育1小時，以固定樣品；第四步，利用制作蛋白芯片的常規方法封閉、洗滌、干燥、包裝和保存。
本發明用于白血病分型和研究的蛋白質芯片的檢測方法如下第一步，在點樣好的芯片上滴加患者白細胞樣品，37℃溫育1小時，使抗原抗體充分反應；第二步，用低濃度鈉離子鹽為主的洗脫液洗去多余樣品，室溫晾干；第三步，加封阻液封阻并再次洗凈晾干；第四步，滴加以封阻液稀釋過的熒光標記的CD4和CD8的抗體混合液，37℃避光溫育30分鐘，洗凈并室溫晾干；第五步，反應結束后，利用專業的芯片掃描分析儀進行結果的判讀和分析。
本發明具有下述優越性第一，可在蛋白質分子水平對各種白血病進行精確分型，結果準確、可靠，并可盡早確診。而用傳統的免疫學實驗方法對單種CD分子逐一檢測，速度慢、效率低、實用性差；細胞形態法檢測往往需要多種方法輔助檢查才能明確診斷，而且一般只適用于急性白血病，對慢性白血病和一些白細胞不增多癥缺乏靈活的確診方法。且傳統方法靈敏度低、限制因素多而且重復性差；而采用本技術可以通過一次反應即可得到多種指標的逐項反應結果，確定所有與白血病相關的CD抗原表達情況，因而大大提高了檢測的速度和效率。第二，可對不同型白血病的白細胞特征和分子特征進行研究，并有機會發現更多的型和亞型。而此前的方法著眼于檢測，很難進行全面的研究。第三，操作系統化，工藝簡單，分析方便，成本較低，實用性強。
4——加入熒光標記的CD4抗體和CD8抗體5——熒光標記物結合于白細胞表面，從而可通過發熒光的位點判讀該樣品的CD分子表型。
雜交反應第一步，在點樣好的芯片上滴加患者白細胞稀釋液樣品，37℃溫育1小時，使抗原抗體充分反應；第二步，用低濃度鈉離子鹽為主的洗脫液洗去多余樣品，室溫晾干；第三步，加封阻液封阻并再次洗凈晾干；第四步，滴加以封阻液稀釋過的熒光標記的CD4和CD8的抗體混合液，37℃避光溫育30分鐘，洗凈并室溫晾干。
結果的檢測、分析反應結束后，利用專業的芯片掃描分析儀進行結果的判讀和分析。對熒光掃描的結果分析如下某點產生熒光信號，則表明該病人的白細胞可分泌該點所對應的CD分子，記為陽性，例如CD5+；如果不產生熒光信號，則記為陰性，例如CD10-；對所有結果進行綜合分析，即可對該病人進行白血病分型，或研究不同型白血病的CD表達特征。
本實施例中，A病人的CD特異性表型為CD11c+，CD22+，CD19+，CD25+，CD103+/CD5-，CD10-；B病人的特異表型為CD5+，CD19+，CD20+，CD23+/CD10-，CD22-，表明前者患有毛細胞白血病，后者患有慢性淋巴細胞白血病。其它CD分子在這兩種白血病的分型中無關，此處不一一列舉。
權利要求
1，用于白血病分型和研究的蛋白質芯片，其特征在于，將與白血病相關的表達于白細胞細胞膜上的特異性表面標志CD(Cluster ofDifferentiation)系列抗原分子的相應抗體以及陽性對照、陰性對照同時高密度點印于固相載體上，蛋白質通過化學鍵連接固定在固相載體上。
2，根據權利要求1所述的用于白血病分型和研究的蛋白質芯片，其特征在于，所述表面標志CD系列抗原，可包括已知的CD分子或其中的一部分；所述陽性對照分別采用CD4和CD8；所述陰性對照采用人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)。
3，用于白血病分型和研究的蛋白質芯片的使用方法，其特征在于，采用雙抗體夾心法，即是取病人外周血，稀釋后滴加于芯片表面，表達分泌不同CD抗原分子的細胞分別被固定在芯片上的相對應的抗體捕獲，洗去未結合的其他物質后，加入熒光標記的CD4抗體和CD8抗體的混合液，由于CD4和CD8是正常白細胞和病態白細胞普遍表達的表面標志，洗去未結合的抗體后，進行熒光掃描、分析。
4，根據權利要求3所述的用于白血病分型和研究的蛋白質芯片的使用方法，其特征在于，對熒光掃描的結果分析如下某點產生熒光信號，則表明該病人的白細胞可分泌表達該點所對應的CD分子，記為陽性；如果不產生熒光信號，則記為陰性。
5，用于白血病分型和研究的蛋白質芯片的用途，其特征在于，用于對病人進行白血病分型，或研究不同型白血病的CD表達特征。
6，用于白血病分型和研究的蛋白質芯片的制備方法，其特征在于，第一步，根據樣品數目選擇合適的多樣品微陣列生物芯片，確定每個樣品對應的檢測CD分子的腔室，做好標記，并確定點陣的排列方式和點樣位置；第二步，點樣針從多孔板取出包括各種CD抗體以及對照品的蛋白質樣品后直接高密度點印于固態基底上；第三步，室溫過夜或37℃溫育1小時，以固定樣品；第四步，利用制作蛋白芯片的常規方法封閉、洗滌、干燥、包裝和保存。
7，用于白血病分型和研究的蛋白質芯片的檢測方法，其特征在于，進行雜交反應第一步，在點樣好的芯片上滴加患者白細胞稀釋液樣品，37℃溫育1小時，使抗原抗體充分反應；第二步，用低濃度鈉離子鹽為主的洗脫液洗去多余樣品，室溫晾干；第三步，加封阻液封阻并再次洗凈晾干；第四步，滴加以封阻液稀釋過的熒光標記的CD4和CD8的抗體混合液，37℃避光溫育30分鐘，洗凈并室溫晾干；第五步，反應結束后，利用專業的芯片掃描分析儀進行結果的判讀和分析。
全文摘要
本發明用于白血病分型和研究的蛋白質芯片涉及一種蛋白質芯片,可實現對蛋白質進行并行檢測、識別、鑒定和診斷。本發明是將與白血病相關的表達于白細胞細胞膜上的特異性表面標志CD系列抗原分子的相應抗體以及陽性對照、陰性對照同時高密度點印于固相載體上,蛋白質通過化學鍵連接固定在固相載體上。本發明可在蛋白質分子水平對各種白血病進行精確分型,通過一次反應即可得到多種指標的逐項反應結果,確定所有與白血病相關的CD抗原表達情況,結果準確、可靠,檢測的速度和效率高,并可盡早確診;可對不同型白血病的白細胞特征和分子特征進行深入研究;操作系統化,工藝簡單,分析方便,成本較低,實用性強。
文檔編號G01N33/68GK1372143SQ02111129
公開日2002年10月2日 申請日期2002年3月21日 優先權日2002年3月21日
發明者張濤, 李賓, 彭永濟, 徐鋒, 任一萍 申請人:上海晶泰生物技術有限公司
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