專利名稱：泰樂菌素殘留快速檢測試紙條的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測獸藥的器具，特別是涉及一種泰樂菌素(Tylosin，本文簡稱TL)殘留快速檢測試紙條。
二、技術背景泰樂菌素是抗生素類藥，用于革蘭氏陰性細菌及支原體感染。從弗氏鏈霉菌的一類似菌株培養液中取得，為白色結晶，微溶于水，具弱堿性，一般成鹽后易溶于水，泰樂菌素對革蘭氏陽性菌和一些陰性菌有抗菌作用，對金黃色葡萄球菌、化膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、化膿棒狀桿菌均敏感。在蜂養殖、畜禽飼養過程中，獸藥泰樂菌素不僅用于預防和控制畜禽、蜜蜂的疾病，并且具有促生長作用，是目前廣泛添加于飼料中的藥物，其耐藥性問題日益突出，這是蜜蜂、奶牛、生豬、禽肉等產品變為非安全的食品的重要因素之一。歐盟早在1999年已經禁用泰樂菌素作為飼料添加劑使用，香港規定了畜禽肉品及牛奶、蜂蜜等產品中最高殘留限量。我國禁用復方泰樂菌素，同時在中華人民共和國農業部公告(第278號)中嚴格規定了泰樂菌素在豬牛養殖中的停藥期，我國首批綠色畜產品認證準則中《飼料和飼料添加劑準則》明確規定禁止使用泰樂菌素作為藥物性飼料添加劑，無公害蜂產品規定了泰樂菌素殘留檢測的檢測標準和方法，泰樂菌素現有的檢測方法主要有高壓液相色譜法、氣相色譜法、氣質連用法以及ELISA等。色譜技術是非常有效、準確、敏感的方法，但是待檢樣品需經一系列的預處理，繁瑣費時，從樣品預處理到得出檢驗結果至少需2～3天時間，檢測費用很高。另一方面這種檢測方法還必須有昂貴的儀器設備。只有特定的專業人員才能應用，而且每次檢測的樣品有限，不適應大批樣品的篩查，嚴重阻礙了該檢測方法的推廣應用，更不適應于現場檢驗。ELISA也是一種常用的檢測技術，它是以競爭性酶聯反應為檢測原理，檢測全過程約需2-4小時。由于ELISA是一種敏感性很強的檢測方法，不同的操作者往往會出現不同的結果，所以該方法常常造成人為的誤檢和漏檢。因此在實際生產中急需一種快速檢測泰樂菌素的檢測方法。目前各級食品檢驗部門，尤其是外貿出口單位，加強了泰樂菌素的檢測力度，以確保人民群眾的動物性食品安全。因此研制靈敏、快速，準確的泰樂菌素檢測方法，檢測蜂蜜、牛奶及家畜家禽等產品和組織飼料中是否含泰樂菌素有著十分重要的意義。
發明內容
本發明的目的研制出特異、敏感、快速、簡便的泰樂菌素殘留快速檢測試紙條。
本發明的技術方案一種泰樂菌素殘留快速檢測試紙條，底層為支撐層，中間層吸附層固定在支撐層上，外層保護膜固定在吸附層上，吸附層從測試端依次為纖維層，吸附金標抗體纖維層，纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，其中在纖維素膜層上有用偶聯泰樂菌素的載體蛋白溶液印制的直線式檢測印跡，用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液印制的直線式對照印跡，檢測印跡和對照印跡平行組合排列為“||”。
支撐層是用不吸水的硬質塑膠片條或硬紙條制成。
測試端纖維層用玻璃棉、或尼龍膜、或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、或聚酯膜制成，優選玻璃棉。吸水材料層用吸水紙制成。
纖維素膜層用硝酸纖維素膜、或純纖維素膜，或羧化纖維素膜制成。
金標抗體纖維層用吸附泰樂菌素的金標抗體玻璃棉，泰樂菌素金標抗體為膠體金標記泰樂菌素的單克隆抗體或多克隆抗體，偶聯泰樂菌素的載體蛋白溶液為泰樂菌素與載體蛋白偶聯的復合溶液。
在測試端吸跗纖維層、金標抗體纖維層及吸水材料層上覆蓋有保護膜，在測試端纖維層與金標抗體纖維層交界處對應的保護膜上印制有樣品標記線，該標記線偏向測試端纖維層一側約0.5cm處。
偶聯泰樂菌素的載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA)，或為雞卵清白蛋白(OVA)，或為鐵蛋白，或為血藍蛋白。
本發明的泰樂菌素殘留快速檢測試紙條具有以下優點(1)特異性強，敏感性高。該試紙條以膠體金標記高親和力的單克隆抗體(W1)為基礎制備而成，金標抗體中金顆粒與抗體分子之間無共價鍵形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結合，膠體金標對單克隆抗體(W1)特異性和親和力影響很小，且具有較高的標記率。因此，快速檢測試紙條具有較高的特異性和敏感性，可檢測到0.1納克的微量TL殘留。
(2)操作簡便、快速。使用本發明試紙條時無需任何其它試劑，只要將其插入待檢樣品10秒左右，在2分鐘內即可判定檢測結果。
(3)結果顯示形象、直觀、準確。本測試紙條以顯示紅棕色“|”及“‖”印跡作為檢測的陽性和陰性標記，即在纖維素膜上顯示一條棕紅色“|”印跡表示在被檢測樣品液中含有TL，兩條棕紅色“‖”印跡表示在被檢樣品中不含TL，結果判定形象、直觀、準確，簡單明了，不易出現假陰性和假陽性誤判。
(4)成本低，投資少。使用快速檢測試紙條，不需另配儀器設備及其它試劑，隨時隨地進行檢測，費用低廉，可節省大量貴重儀器及設備費用。
(5)應用范圍廣，便于推廣應用。本發明快速檢測試紙操作簡單，能滿足不同層次人員的需要，包括專業化驗、海關檢疫、衛生防疫、質量監測、畜產品加工、集約化養殖到個體養殖等，具有廣闊的市場前景和較好的經濟、社會效益。
四
圖1為泰樂菌素殘留快速檢測試紙條結構示意圖。
圖2為泰樂菌素殘留快速檢測試紙條俯視結構示意圖。
圖中，1支撐層，2測試端纖維層，3金標抗體纖維層，4纖維素膜層，5吸水材料層，6隱形檢測印跡帶，7隱形對照印跡帶，8-1測試端保護膜，8-2手柄端保護膜，9標記線。
五具體實施例方式制備泰樂菌素殘留快速檢測試紙條，首先需制備偶聯TL的載體蛋白和金標抗體，從而制備檢測印跡和金標抗體纖維；其次需制備羊抗或兔抗小鼠IgG抗體，用于制備對照印跡。
1.泰樂菌素TL與載體蛋白Xi的偶聯采用羧甲基羥胺法或碳化二亞胺(EDC)法碳化二亞胺(EDC)法將TL與載體蛋白進行偶聯制備免疫抗原。將5mg泰樂菌素溶解于磷酸鹽緩沖液中(pH7.0)中，加入10mgEDC，室溫避光攪拌6小時。將載體牛血清白蛋白(或雞卵清白蛋白或鐵蛋白，或血藍蛋白)溶于PBS緩沖液中，按摩爾比25∶1加入上反應中，溫室攪拌過夜。將反應液用PBS(磷酸緩沖液)透析即可。
2.抗泰樂菌素單克隆抗體(W1)的制備以50～100μg/只的偶聯TL的載體蛋白免疫BALB/c系小鼠三次，每次間隔15～30天；第三次加強免疫后3～4天，將免疫小鼠眼球放血，拉頸致死，用75％酒精浸泡5～10min，無菌取其脾細胞；剪碎并經100目尼龍網過濾，1000r/min離心10min，收集脾細胞；將1×108的脾細胞與2～5×107的NS0骨髓瘤細胞，1000r/min離心10min棄上清，細胞沉淀于37℃的水溶中緩緩加入0.7～1ml的40～50％PEG4000(pH 8.5～9.0)作用1min，然后緩慢加入無血清1640培養基15ml，以終止PEG的作用，37℃水浴5～10min，1000r/min離心10min棄上清，將細胞沉淀重懸于HAT選擇培養基中，并加入96孔培養板(100～200μl/孔)，置于37℃5％CO2培養箱中培養。培養7～10天后，以5～1Q μg/ml的偶聯TL的載體蛋白包被酶標板(96孔/塊)，以酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測雜交瘤的培養上清，挑取強性細胞克隆(OD450＝0.5以上)，進行連續三次的有限稀釋法克隆化，所生產的雜交瘤細胞染色體數為92～98，其分泌的單克隆抗體(W1)特異地與TL反應，而不與其它蛋白發生交叉反應，親和力常數達109～10，輕鏈亞型為κ或λ，重鏈亞型為IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3，針對TL特異抗原決定簇的單克隆抗體(W1)，用于制備金標抗體。
3.泰樂菌素金標抗體(W1)和金標抗體玻璃棉的制備以檸檬酸鈉還原法制備金溶膠，即在50～100ml沸騰的0.01～0.05％氯金酸水溶液中加入2～4ml的0.5～2％檸檬酸三鈉溶液，獲得直徑15nm左右的膠體金。以0.1mol/L的K2CO3調膠體金pH至8.5～9.5，置于以1∶1000～1300的標記比將待標記的TL單克隆抗體(M1)加入pH8.5～9.5的金溶膠中，標記10min后，加20％PEG10000至終濃度0.05％，4℃、1500～3000rpm離心20min，除去未結合的膠體金顆粒，4℃、15000rpm離心1h，棄上清，獲初步純化金標抗體蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱層析，分離純化金標蛋白，獲得TL膠體金標記抗體。將1∶(100～500)稀釋的膠金標記抗體吸附于精制玻璃棉中，4℃低溫真空干燥，制備TL金標抗體玻璃棉。
4.羊抗或兔抗小鼠IgG的制備以飽和硫酸銨提取小鼠血清IgG，取1份小鼠血清加2份PBS(pH 7.2)混勻，加等體積飽和硫酸銨混勻，置4℃冰箱2h，4℃、1200r/min離心15min，棄上清；以適量PBS(pH7.2)溶解沉淀，加飽和硫酸銨至終濃度33％，置4℃冰箱2h，4℃、1200r/min離心15min，棄上清，以少量PBS(pH7.2)溶解沉淀，置4℃冰箱內用PBS(pH7.2)過夜透析，換液2～3次，4℃、12000r/min離心15min，收集上清，以紫外分光光度計測定其蛋白濃度，以50～100μg/kg體重(小鼠血清IgG)經皮下和肌肉注射免疫健康羊或家兔3～4次，末次免疫10天后，靜脈采血，以ELISA測定其血清抗體效價在1∶2000以上，心臟采血或頸動脈放血，收集其高免血清，以飽和硫酸銨提取羊抗或兔抗小鼠IgG(方法與提取小鼠血清IgG相同，不重述)，用于TL快速檢測試紙條對照顯示印跡的制備。
5.泰樂菌素TL快速檢測試紙條實施檢測反應原理當泰樂菌素TL快速檢測試紙條樣品端插入待檢測樣品溶液后，待檢溶液通過虹吸帶動待檢TL及金標抗體棉中的金標抗體(W1)一起向硝酸纖維素膜擴散，并最終滲入手柄端濾紙中，擴散過程中待檢TL可與金標抗體(W1)相結合，進而封閉金標抗體(W1)上TL的抗原結合點，阻止金標抗體(W1)與纖維素膜上偶聯TL的載體蛋白(Xi)的檢測印跡結合，不能顯示檢測印跡，而羊抗或兔抗小鼠IgG(Y)則可與金標抗體(W1)結合，形成紅棕色對照印跡“|”，即一條紅棕色“|”印跡為陽性標記，反之樣品溶液中無TL則不能阻止金標抗體(W1)與纖維素膜上偶聯TL的載體蛋白(Xi)檢測印跡結合，顯示紅棕色檢測印跡“|”，同樣羊抗或兔抗小鼠IgG(Y)也與金標抗體(W1)結合，顯示紅棕色對照印跡“|”，形成兩條紅棕色“‖”為陰性標記，如果纖維素膜上沒有紅棕色標記顯示，則表明試紙條已失效。
實施例一泰樂菌素殘留快速檢測試紙條的結構，參見圖1、圖2。圖中1為支撐層，用塑膠條制成，2為測試樣品端的纖維層，用玻璃棉制成，3為吸附有泰樂菌素TL的金標抗體(W1)纖維層，根據上述具體實施方式
3中所述的制備方法，制備吸附有泰樂菌素單克隆抗體的金標抗體(W1)玻璃棉，4為纖維素膜層，采用硝酸纖維素膜，5為吸水材料層，用吸水濾紙制成，將編號2、3、4、5各層從左至右依次粘貼固定在塑膠條1上，各層交界處纖維互相交叉滲透。在硝酸纖維素膜層4上，6為用偶聯泰樂菌素的牛血清白蛋白(BSA)溶液印上檢測印跡“|”，7為用羊抗小鼠IgG(Y)溶液印上對照印跡“|”，兩印跡平行排列形成組合印跡帶“‖”。8-1為覆蓋在纖維層2和金標抗體纖維層3上面的測試樣品端白色保護膜，在2和3交界處對應保護膜8-1位置上偏向于纖維層2一側0.5cm處印有標記線9，9的右端印有箭頭及max字樣，手柄端吸水層5上覆蓋有其它顏色(如黃色)保護膜8-2。
檢測樣品液的制備若檢測動物的尿液樣品，可直接取動物的尿液作為檢測樣品；若檢測肉、肉制品或其它組織樣品，可將組織樣品剪碎、研磨，將肉樣和生理鹽水以1∶1～100的比例制成樣品懸液；若檢測對象是蛋、奶或蜂蜜，可直接將蛋、奶或蜂蜜用生理鹽水制成1∶1～100待檢測樣品懸液；若檢測的對象是動物的血液，則提取血清，用生理鹽水將血清制成1∶1～100作為待測樣品。
檢測操作方法將TL快速檢測試紙條樣品端插入待檢測樣品液中，插入深度不超過標記線，約10秒后取出檢測試紙條，水平放置約2分鐘，觀察結果。
檢測結果判斷如果在纖維素膜上有一條紅棕色標記“|”顯示，檢測結果呈陽性，表示在被檢測樣品液中含TL，含量超過國家殘留標準的產品不能在市場上流通；如果TL快速檢測試紙條上的纖維素膜上出現兩條紅棕色標記“‖”，檢測結果呈陰性，表示待檢樣品中不含泰樂菌素成份。
實施例二泰樂菌素殘留快速檢測試紙條結構和實施例一基本相同，不同之處在于支撐層1用不吸水的硬紙條制成，測試端纖維層2用尼龍膜，金標抗體纖維層3吸附有膠金標記的泰樂菌素TL多克隆抗體，纖維素膜層4采用純纖維素膜，隱形檢測印跡帶6中偶聯TL載體蛋白溶液為鐵蛋白，隱形對照印跡帶7用兔抗小鼠IgG溶液在纖維素膜上制備而成。
檢測樣品制備檢測肉樣，將樣品切碎、研磨，將肉樣和生理鹽水以1∶30的比例制成待檢測樣品懸液。
其它操作方法和結果判定均同實施例一，不重述。
實施例三泰樂菌素殘留快速檢測試紙條結構和實施例一基本相同，不同之處在于測試端吸附纖維層2用聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，纖維素膜層4采用羧化纖維素膜，隱形檢測印跡帶6中偶聯TL載體蛋白溶液為雞卵清白蛋白(OVA)，隱形對照印跡帶7用羊抗小鼠IgG溶液在纖維素膜上制備而成。
其它包括檢測樣品制備、操作方法和結果判定等均同實施例一，不重述。
實施例四泰樂菌素殘留快速檢測試紙條結構和實施例一基本相同，不同之處在于測試端吸附纖維層2用聚酯膜，金標抗體纖維層3吸附有膠金標記的TL多克隆抗體，隱形檢測印跡帶6中偶聯TL載體蛋白溶液為血藍蛋白。
其它包括檢測樣品制備、操作方法和結果判定均同實施例一，不重述。
權利要求
1.一種泰樂菌素殘留快速檢測試紙條，底層為支撐層，中間層吸附層固定在支撐層上，外層保護膜固定在吸附層上，其特征是吸附層從測試端依次為纖維層、金標抗體纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，其中在纖維素膜層上有用偶聯泰樂菌素的載體蛋白溶液印制的直線式檢測印跡，有用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液印制的直線式對照印跡，檢測印跡和對照印跡平行組合排列為“‖”。
2.根據權利要求1所述的試紙條，其特征是支撐層是用不吸水的硬質塑膠條或硬紙條制成。
3.根據權利要求1所述的試紙條，其特征是測試端纖維層用玻璃棉、或尼龍膜、或聚偏二氟乙烯膜、或聚酯膜制成。
4.根據權利要求1所述的試紙條，其特征是吸水材料層用吸水紙制成。
5.根據權利要求1所述的試紙條，其特征是纖維素膜層用硝酸纖維素膜、或純纖維素膜、或羧化纖維素膜制成。
6.根據權利要求1所述的試紙條，其特征是金標抗體纖維層用吸附泰樂菌素的金標抗體玻璃棉，泰樂菌素金標抗體為膠體金標記的泰樂菌素單克隆抗體或多克隆抗體，偶聯泰樂菌素的載體蛋白溶液為泰樂菌素與載體蛋白偶聯的復合溶液。
7.根據權利要求1所述的試紙條，其特征是在測試端吸附纖維層、金標抗體纖維層及吸水材料層上覆蓋有保護膜，在測試端纖維層與金標抗體纖維層交界處對應的保護膜上印制有樣品標記線，該標記線偏向測試端纖維層一側約0.5cm處。
8.根據權利要求1所述的試紙條，其特征是偶聯泰樂菌素的載體蛋白為牛血清白蛋白，或為雞卵清白蛋白，或為鐵蛋白，或為血藍蛋白。
全文摘要
本發明公開了一種泰樂菌素殘留快速檢測試紙條。試紙條底層為支撐層，中間層吸附層固定在支撐層上，外層保護膜固定在吸附層上，吸附層從測試端依次為纖維層，吸附金標抗體纖維層，纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，其中在纖維素膜層上有用偶聯泰樂菌素的載體蛋白溶液印制的直線式檢測印跡，用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液印制的直線式對照印跡，檢測印跡和對照印跡平行組合排列為“‖”。試紙條具有以下優點特異性強，敏感性高，可檢測到0.1納克的微量TL殘留，操作簡便、快速，在2分鐘內即可判定檢測結果；結果顯示形象、直觀、準確，不易出現假陰性和假陽性誤判；并且成本低，應用范圍廣，便于推廣應用。
文檔編號G01N33/577GK101029893SQ20061012842
公開日2007年9月5日 申請日期2006年12月19日 優先權日2006年12月19日
發明者張改平, 趙東, 鄧瑞廣, 李學伍, 楊艷艷, 肖治軍, 王選年, 王自良, 邢廣旭, 楊繼飛, 柴書軍, 劉慶堂, 羅俊, 郝桂芳, 王麗, 藤蔓 申請人:河南省農業科學院生物技術研究所
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
