檢測心臟標記物的試紙條及制備方法和檢測方法
【專利摘要】本發明涉及臨床免疫學檢測領域，公開了一種檢測心臟標記物的試紙條，其包括底板和依次交錯設置在底板上的樣品墊、膠體金墊、包被膜和吸水墊，所述膠體金墊與包被膜之間設有緩沖液墊，且緩沖液墊分別和膠體金墊、包被膜接觸，所述膠體金墊和緩沖液墊為一體式結構墊，所述一體式結構墊的一側噴涂有膠體金標記的抗心臟標志物抗體溶液作為所述膠體金墊，其另一側作為所述緩沖液墊，本發明還公開了一種該試紙條的制備方法及檢測方法。本發明靈敏度高、穩定性好、可信度高、操作簡便、適合大規模生產。
【專利說明】檢測心臟標記物的試紙條及制備方法和檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及臨床免疫學檢測【技術領域】，特別是涉及一種檢測心臟標記物的膠體金試紙條及其制備方法和檢測方法。
【背景技術】
[0002]POCT (point-of-care testing,即時檢驗),指在病人旁邊進行的臨床檢測,通常不一定是臨床檢驗師來進行，是在采樣現場即刻進行分析，省去標本在實驗室檢驗時的復雜處理程序，快速得到檢驗結果的一類新方法。當今社會，隨著醫學的診斷和治療水平的不斷提高及實際工作的需要，以及醫學模式的轉變和醫療體制的改革，從而帶動了 POCT的發展，而且隨著免疫反應和分子生物技術的引進，POCT在檢驗醫學中的新領域受到人們的關注和重視，是隨著醫學模式和人們對健康理念的轉變發展起來的，POCT的使用更為便捷，檢測和應用的范圍更為廣泛。
[0003]心臟標志物檢測是POCT檢測的一個重要領域，急性心血管疾病如AMI (急性心肌梗死)是大多數心血管疾病的最主要死亡病因，如何快速識別出早期急性心肌梗死患者并及時治療是提高其存活率的關鍵，如果無法在短時間內確診胸痛病人是否患有致命的AMI的話，那么那些非AMI的病人不但要無端的擔驚受怕，而且每天要承擔額外的大額醫藥費和住院費，不僅如此，有些AMI患者因診斷不及時得不到及時治療而延誤病情甚至死亡，因此，臨床快速診斷對于患者搶救和治療以及控制病情發展十分重要，對于無典型胸痛和心電圖改變的AMI患者，檢測血清心肌標志物是診斷AMI的必要依據，其中的心肌蛋白質類標志物如心肌肌鈣蛋白I (cTnl)對心肌損傷有高度的特異性和敏感性，已成為臨床診斷心肌損傷的確定標志物，尤其對于AMI的臨床診斷具有重要意義。肌紅蛋白(MyO)是早期診斷AMI最重要的指標，肌酸激酶同功酶(CK?MB)是臨床醫師診斷AMI最信賴的心肌標志物，心肌肌鈣蛋白I是心肌損傷檢測的金標準，B鈉尿肽(BNP)是全新的充血性心力衰竭診斷的標志物，可協助診斷充血性心力衰竭，判斷病情的嚴重程度，預防以及指導治療等。目前上述指標都已可以用POCT方法測定，這對于心肌損傷性疾病特別是心肌梗死的早期診斷、及時采取有效的治療措施具有非常重要的意義。
[0004]盡管心臟標志物檢測具有一系列的優點，但目前POCT產品中仍然存在問題，例如靈敏度和重復性欠佳，不能正確反映患者病情；檢測結果誤差大即變異系數(CV)太大，同一批產品可能出現不同的檢測結果。因此無法保證每一批產品，每一個測試單元質量都一樣、結果都一致，這一問題也直接制約著心臟標志物POCT產品的使用和發展。
【發明內容】
[0005](一)要解決的技術問題
[0006]本發明要解決的技術問題是如何提供一種靈敏度高、穩定性好和可信度高的用于檢測心臟標記物的膠體金試紙條。
[0007](二)技術方案[0008]為了解決上述技術問題，本發明提供一種檢測心臟標記物的試紙條，其包括底板和依次交錯設置在底板上的樣品墊、膠體金墊、包被膜和吸水墊，所述膠體金墊與包被膜之間設有緩沖液墊，且緩沖液墊分別和膠體金墊、包被膜接觸。
[0009]其中，所述膠體金墊和緩沖液墊可以為一體式結構墊，在所述一體式結構墊的一側噴涂有膠體金標記的抗心臟標志物抗體溶液作為所述膠體金墊，其另一側作為所述緩沖液墊。
[0010]其中，所述膠體金墊和緩沖液墊均由玻璃纖維或聚酯纖維材料制成。
[0011]其中，所述膠體金墊上噴涂有顆粒直徑為20nm-100nm的膠體金標記的單克隆抗體或多克隆抗體蛋白。
[0012]其中，所述包被膜上間隔設有一條抗心臟標志物抗體檢測帶和一條兔抗鼠抗體質控帶，所述抗心臟標志物抗體的量為I?50 μ g。
[0013]其中，所述緩沖液墊與包被膜上的檢測帶之間的距離不小于0.5cm。
[0014]其中，所述檢測帶涂覆有單克隆抗體或多克隆抗體蛋白。
[0015]其中，所述質控帶涂覆有能與所述膠體金標記的單克隆抗體或多克隆抗體蛋白相結合的抗抗體。
[0016]其中，所述包被膜由硝酸纖維素膜制成。
[0017]本發明還提供一種如上述任一項技術方案所述的檢測心臟標記物的試紙條的制備方法，包括如下步驟:
[0018](I)制備膠體金墊:將牛血清白蛋白或聚乙二醇封閉的膠體金標記的抗心臟標志物抗體溶液噴灑于玻璃纖維膜或聚酯纖維膜的一端，烘干備用；另一端作為緩沖液墊；
[0019](2)制備包被膜:將抗心臟標志物抗體稀釋液和抗抗體稀釋液噴涂于硝酸纖維素膜上，烘干備用；
[0020](3)將樣品墊用樣品溶液處理后烘干備用；
[0021](4)選取一種吸水性強的材質制作成吸水墊；
[0022](5)在所述底板上依次相互交錯地粘上制備的樣品墊、膠體金墊、緩沖液墊、包被膜以及吸水墊，然后在其上表面覆蓋透明塑料密封膜得到所述試紙條。
[0023]本發明還提供一種利用上述任一技術方案所述的檢測心臟標記物的試紙條的檢測方法，首先將緩沖液滴加在所述緩沖液墊上，隨著緩沖液的滲析，待緩沖液滲透整個包被膜后，再將待測樣品滴加在樣品墊上，待測樣品再次將包被膜浸濕，15_20min后，根據包被膜上的檢測帶與質控帶的顏色變化，讀取檢測結果:當檢測線與質控線均為顯色時檢測結果為陽性；當只有檢測線為顯色時檢測結果為陰性；當檢測線與質控線均未顯色時檢測結果為無效。
[0024]其中，所述緩沖液與待測樣本添加的時間間隔為0.5-lmin。
[0025]其中，所述緩沖液與待測樣本添加的體積分別為20_80ul和80_120ul。
[0026](三)有益效果
[0027]與現有技術相比，本發明具有以下優點:
[0028]本發明提供的一種檢測心臟標記物的試紙條設有緩沖液墊，預先用合適的緩沖液濕潤包被膜上的抗體，使其從干燥狀態變為溶液狀態，在測試時可大大提高抗體抗原的靈敏度，通過對試紙條的改進，從而大大提高了該心臟標志物試紙條的檢測靈敏度，降低了試紙條之間的變異系數(CV)，提高了現有試紙條的穩定性和可信度。
[0029]本發明操作簡便、適合大規模生產，這對于心臟標志物特別是心肌鈣蛋白的定量診斷有著積極的意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030]圖1a為本發明一種檢測心臟標記物的試紙條的正面示意圖；
[0031]圖1b為本發明一種檢測心臟標記物的試紙條的側面示意圖；
[0032]圖2為本發明一種檢測心臟標記物的試紙條的檢測結果示意圖；
[0033]圖3為本發明實施例二中以檢測線的信號強度為縱坐標和以心肌肌鈣蛋白I的溶液濃度為橫坐標擬合的曲線圖。
[0034]圖中:1:樣品墊；2:膠體金墊；3:緩沖液墊；4:包被膜；T:檢測帶；C:質控帶；5:吸水墊；6:底板。
【具體實施方式】
[0035]下面結合附圖和實施例，對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細描述。以下實例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0036]如圖1a和圖1b所示，為本發明提供的一種檢測心臟標記物的試紙條，其包括底板6和依次交錯設置在底板6上的樣品墊1、膠體金墊2、包被膜4和吸水墊5，所述膠體金墊2與包被膜4之間設有緩沖液墊3，且緩沖液墊3分別和膠體金墊2、包被膜4接觸，所述緩沖液墊3與包被膜4有部分重疊，以便于在層析過程中，滴加在所述緩沖液墊3上的液體能夠快速滲透整個包被膜4。
[0037]其中，所述膠體金墊2和緩沖液墊3為一體式結構墊，所述一體式結構墊的一側噴涂有膠體金標記的抗心臟標志物抗體溶液作為所述膠體金墊2，其另一側作為所述緩沖液墊3。其噴涂的一端與樣品墊I接觸，未噴涂的一端與包被膜4接觸。
[0038]其中，所述膠體金墊2和緩沖液墊3均由玻璃纖維或聚酯纖維材料制成。所述樣品墊I也可以由玻璃纖維或聚酯纖維材料制成，所述樣品墊I可做預先處理也可不作處理，所述緩沖液墊3可做預先處理也可不作處理，所述緩沖液的種類不固定，可以根據實際情況進行選擇和調整。
[0039]其中,所述膠體金墊2噴涂有顆粒直徑為20nm-100nm的膠體金標記的單克隆抗體或多克隆抗體蛋白。
[0040]其中，所述包被膜4上間隔設有一條抗心臟標志物抗體檢測帶T和一條兔抗鼠抗體質控帶C,所述抗心臟標志物抗體的量為I?50 μ g。
[0041 ] 其中，所述緩沖液墊3與檢測帶T不接觸，且兩者之間的距離不小于0.5cm,兩者之間的距離可調節。
[0042]其中，所述檢測帶T包有單克隆抗體或多克隆抗體蛋白。
[0043]其中，所述質控帶C包有能與所述膠體金標記的單克隆抗體或多克隆抗體蛋白相結合的抗抗體。
[0044]其中，所述包被膜4優選由硝酸纖維素膜制成。
[0045]其中，所述吸水墊5采用吸水性強的材料制成，用于吸收反應中多余的水分，也可以起到引流的作用。
[0046]下面以兩個實施例具體說明本發明，但不用來限制本發明的范圍:
[0047]實施例一
[0048]以心肌肌鈣蛋白I抗體的制備為實施例用于說明本發明的試紙條的制備方法:
[0049]心肌肌鈣蛋白I抗體的制備:選用商品化的心肌肌鈣蛋白I抗體，IOmM PBS,pH7.2，4°C的透析液。
[0050]緩沖液的配制:IOmM pH7.2的磷酸緩沖液，0.22 μ m微孔濾膜過濾除菌后置于4°C環境下保存備用；用該緩沖液將抗心肌肌鈣蛋白I抗體和兔抗鼠抗體分別稀釋到0.5mg/mL和0.7mg/mL,使用Biodot劃膜儀的三維噴點平臺將兩者以1.5cm的間隔均勻噴印于
2.5cmX0.6cm的硝酸纖維素膜上，于35?38°C烘干8小時，加入干燥劑封存備用，制作出包被膜4 ；
[0051]膠體金標記的抗心肌肌鈣蛋白I抗體的膠體金墊2的制備:
[0052]用0.1M碳酸鉀調節顆粒粒徑為40nm的膠體金溶液的pH值為7.2，加入抗心肌肌鈣蛋白I抗體，在室溫攪拌30min后，加入濃度為1%的牛血清白蛋白溶液終止，于12000rpm, 4°C冷凍離心后，用IOmM磷酸緩沖液含有0.5%牛血清白蛋白清洗后再次離心，用復溶液(IOmM磷酸緩沖液含有0.5%牛血清白蛋白、2%蔗糖、0.1%疊氮鈉)將膠體金標記的抗心肌肌鈣蛋白I抗體懸浮，4°C保存備用，使用Biodot劃膜儀的三維噴點平臺將該懸浮液以1.8 μ L/cm的速度噴灑于0.8cmX 0.4cm的聚酯纖維膜上，于35?38°C烘干8小時，加入干燥劑封存備用，制作出膠體金墊2 ；
[0053]裁剪出0.5cmX0.4cm的聚酯纖維膜作為緩沖液墊3 ；
[0054]將2.5cmX 0.4cm的聚酯纖維膜放入樣品溶液(0.1M Tris緩沖液含0.1%S9，1%BSA，0.9%NaCl)中浸泡I小時后取出于35?38°C烘干8小時，制作出樣品墊I ;
[0055]選取或裁剪出2.8cm X 0.4cm的吸水紙作為吸水墊5 ；
[0056]試紙條的組裝及切割以及下列所有操作必須在濕度小于38%，溫度在20?25V的房間內進行:
[0057]按照要求手工將包被膜4、吸水墊5、膠體金墊2、樣品墊I和緩沖液墊3裝于PVC底板6上，組裝成試紙板，并切成4_寬的成品試紙條。
[0058]實施例二
[0059]對本發明一種檢測心臟標記物的試紙條的靈敏度的檢測:
[0060]1.標準曲線的繪制
[0061]將心肌肌I丐蛋白I的標準溶液配制成100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、10ng/ml、Ing/ml、0.5ng/ml、0.lng/ml不同濃度的溶液,用同一批次的試紙條,每個樣品濃度測試5條,通過肉眼判讀結果，對比圖2中所示的檢測結果，判斷心肌肌鈣蛋白I的含量，Ca)中:T、C兩條線均為顯色時檢測結果為陽性；(b)中:只有C 一條線為顯色時檢測結果為陰性；(c)中:當T、C兩條線均未顯色時檢測結果為無效。當血清中的心肌肌鈣蛋白I含量低于0.5ng/mL時，普通膠體金試紙條無法檢測，而本發明的試紙條即使血清中的心肌肌鈣蛋白I的濃度為0.1ng/mL，仍能準確判斷。這一實驗結果表明，該試紙條大大提高了現有膠體金試紙條的靈敏度，具有重要的臨床應用價值。按照統計學方法，以檢測線的信號強度為縱坐標，心肌肌鈣蛋白I的溶液濃度為橫坐標，建立方程并擬合成標準曲線，如圖3所示，由圖可見，在心肌肌鈣蛋白I的溶液濃度很低，接近于零時，檢測線仍然有信號顯示，隨著心肌肌鈣蛋白I的溶液濃度的逐漸增大，檢測線的信號強度也隨之增強，兩者呈正比例顯示，由實驗可得，本發明的檢測心臟標記物的試紙條具有很高的靈敏度。
[0062]2.樣品的檢測:
[0063](I)平放試紙條，量取30ul緩沖液加到緩沖液墊3，30s后量取IOOul樣本血清加到樣品墊上，室溫反應15分鐘；
[0064](2)開啟檢測設備，并將檢測條及校準卡插入檢測設備的插卡口，運行儀器，儀器通過相應的分析軟件自動計算出待測樣本中的心肌肌鈣蛋白溶液的濃度。其中，待測試紙條分為兩組，一組為根據本發明制作的試紙條作為實驗組；一組為不加緩沖液的常用試紙條作為對照組，按照統計學方法，觀察檢測線的信號強度，并計算信號強度的平均值和變異系數(CV)，如表1所示。
[0065]表1為本發明所述的試紙條的檢測與對照組的比較。
[0066]
【權利要求】
1.一種檢測心臟標記物的試紙條，其特征在于，包括底板和依次交錯設置在底板上的樣品墊、膠體金墊、包被膜和吸水墊，所述膠體金墊與包被膜之間設有緩沖液墊，且緩沖液墊分別和膠體金墊、包被膜接觸。
2.如權利要求1所述的檢測心臟標記物的試紙條，其特征在于，所述膠體金墊和緩沖液墊為一體式結構墊，所述一體式結構墊的一側噴涂有膠體金標記的抗心臟標志物抗體溶液作為所述膠體金墊，其另一側作為所述緩沖液墊。
3.如權利要求2所述的檢測心臟標記物的試紙條，其特征在于，所述膠體金墊和緩沖液墊均由玻璃纖維或聚酯纖維材料制成。
4.如權利要求3所述的檢測心臟標記物的試紙條，其特征在于，所述膠體金墊上噴涂有顆粒直徑為20nm-100nm的膠體金標記的單克隆抗體或多克隆抗體蛋白。
5.如權利要求4所述的檢測心臟標記物的試紙條，其特征在于，所述包被膜上間隔設有一條檢測帶和一條質控帶。
6.如權利要求5所述的檢測心臟標記物的試紙條，其特征在于，所述緩沖液墊與包被膜上的檢測帶之間的距離不小于0.5cm。
7.如權利要求6所述的檢測心臟標記物的試紙條，其特征在于，所述檢測帶涂覆有單克隆抗體或多克隆抗體蛋白。
8.如權利要求7所述的檢測心臟標記物的試紙條，其特征在于，所述質控帶涂覆有能與所述膠體金標記的單克隆抗體或多克隆抗體蛋白相結合的抗抗體。
9.如權利要求8所述的檢測心臟標記物的試紙條，其特征在于，所述包被膜由硝酸纖維素膜制成。
10.一種如權利要求1-9任一項所述的檢測心臟標記物的試紙條的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (O制備膠體金墊:將牛血清白蛋白或聚乙二醇封閉的膠體金標記的抗心臟標志物抗體溶液噴灑于玻璃纖維膜或聚酯纖維膜的一端，烘干備用；其另一端作為緩沖液墊； (2)制備包被膜:將抗心臟標志物抗體稀釋液和抗抗體稀釋液噴涂于硝酸纖維素膜上，烘干備用； (3)將樣品墊用樣品溶液處理后烘干備用； (4)選取一種吸水性強的材質制作成吸水墊； (5)在所述底板上依次相互交錯地粘上制備的樣品墊、膠體金墊、緩沖液墊、包被膜以及吸水墊，然后在其上表面覆蓋透明塑料密封膜得到所述試紙條。
11.一種利用如權利要求1-9任一項所述的檢測心臟標記物的試紙條的檢測方法，其特征在于，首先將緩沖液滴加在所述緩沖液墊上，隨著緩沖液的滲析，待緩沖液滲透整個包被膜后，再將待測樣品滴加在樣品墊上，待測樣品再次將包被膜浸濕，15_20min后，根據包被膜上的檢測帶與質控帶的顏色變化，讀取檢測結果:當檢測線與質控線均為顯色時檢測結果為陽性；當只有檢測線為顯色時檢測結果為陰性；當檢測線與質控線均未顯色時檢測結果為無效。
12.如權利要求11所述的利用檢測心臟標記物的試紙條的檢測方法，其特征在于，所述緩沖液與待測樣本添加的時間間隔為0.5-lmin。
13.如權利要求12所述的利用檢測心臟標記物的試紙條的檢測方法，其特征在于，所述緩沖液與待 測樣本添加的體積分別為20-80ul和80-120ul。
【文檔編號】G01N33/558GK103837677SQ201310727014
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2013年12月25日 優先權日:2013年12月25日
【發明者】張靜, 邱笑違 申請人:北京樂普醫療科技有限責任公司
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
