專利名稱：鎂診斷/測定試劑盒及鎂的濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種鎂診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定鎂濃 度的方法，屬于醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。
背景技術：
鎂測定方法很多，概括起來有比色法、熒光法、離子層析法，離子
選擇性電極法(ISE)、酶法、原子吸收分光光度法(AAS)、同位素稀 釋質譜法(ID-MS)等。
鎂測定的決定性方法是同位素稀釋質譜法，參考方法是原子吸收分 光光度法法。這些方法雖然結果準確，但設備復雜，費用昂貴，不適 合常規實驗室和自動分析。
比色法是應用最廣泛的方法，包括甲基麝香草酚藍法(MTB)、達 旦黃法、鄰甲酚酞絡合酮法(0CPC)、鈣鎂試劑(Calmagite)法、以 及新近報道的2-(8'-羥基喹啉-5'-磺酸-7'-偶氮)-變色酸(8Q5SAC) 法。比色法操作簡便，費用低，適合常規實驗室應用。但存在試劑空 白吸光度高，膽紅素和其它陽離子的干擾，試劑穩定性差及試劑中含 有腐蝕性或毒性成分等缺點。
離子選擇性電極法可測定生理溶液中鎂離子活度。采用中性載體 (ETH7025)液膜離子選擇電極測定準確度較高。但還存在鈣干擾(生 理范圍內)Ca2+最大干擾10%等不足。 離子色譜法測定血清總鎂在測定之前需對樣本進行預處理，包括
酸化稀釋和過濾。Thie叩ont等使用該法對五種國際標準和技術學會 用火焰原子吸收分光光度法的定值血清進行了分析，結果平均偏差僅 為0. 35%，認為離子色譜法可作為總鎂測定有價值的參考方法。
Mg2+的酶法測定技術在近幾年研究非常活躍，取得較大進展。已應 用于Mg2+測定的酶學方法有①己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶偶聯 法；②甘油激酶、磷酸甘油氧化酶和過氧化物酶偶聯法；③葡萄糖激 酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶偶聯法；④酶聯化學發光法；⑤磷酸葡萄糖 變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶偶聯法；⑥異檸檬酸脫氫酶法；⑦丙酮 酸激酶和乳酸脫氫酶偶聯法。酶法檢測鎂結果準確，干擾影響小，適 合于自動化分析。由于酶試劑不斷更新，使測定快速、靈敏，操作簡 便，因而具有較好的應用前景。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，連續
監測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化， 得以測定鎂濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的鎂 診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全 自動生化分析儀上進行鎂濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因 而可以得到切實的推廣應用。
本發明鎂濃度測定方法原理如下
腺苷二磷酸+甘油-3-磷酸甘油激酶/Mg^甘油+ 腺苷三磷酸
甘油+輔酶甘油脫氫酶甘油酸+還原型輔酶
這種方法應用需要鎂離子激活的甘油激酶(Glycerokinase ; EC 2.7丄30)酶(偶)聯甘油脫氫酶(glycerol dehydrogenase ; EC 1丄1.6; EC1丄1.72; EC1丄1.156; EC 1丄99.22)酶促反應連續監測法。甘油 激酶酶解甘油-3-磷酸產生甘油，再通過(偶)聯合甘油脫氫酶的作用， 最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm 處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速 度，通過測量340nm處吸光度上升的速度，可以測算鎂的濃度大小。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考 慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明鎂診斷/測定
試劑盒較為理想
緩沖液 100mmol/L
穩定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
甘油激酶 12000 U/L
甘油脫氫酶 20000 U/L
腺苷二磷酸 6 mmol/L
甘油-3-磷酸 10mmol/L
本發明的鎂診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩定劑、輔酶、腺苷二磷酸、甘油-3-磷酸、甘油激酶、 甘油脫氫酶。
試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩定劑、輔酶、腺苷二磷酸、甘油-3-磷酸。 試劑2
緩沖液、穩定劑、甘油激酶、甘油脫氫酶。 輔酶、腺苷二磷酸、甘油-3-磷酸、甘油激酶、甘油脫氫酶在試劑1 或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水 溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑l
緩沖液、穩定劑、輔酶。 試劑2
緩沖液、穩定劑、腺苷二磷酸、甘油-3-磷酸。 試劑3
緩沖液、穩定劑、甘油激酶、甘油脫氫酶。 輔酶、腺苷二磷酸、甘油-3-磷酸、甘油激酶、甘油脫氫酶在試劑1、 試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用 前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定鎂濃度的方法，其輔酶可 以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的鎂診斷/測定試劑為單試劑，包括:
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
甘油激酶 12000 U/L
甘油脫氫酶 20000 U/L
腺苷二磷酸 6 mmol/L
甘油-3-磷酸 10mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑； 使用前，加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37"C，反應時間10分鐘，起始 吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測鎂樣品 與試劑的體積比例為1/25,反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間 大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出鎂的濃 度大小。 實施例二
本實施例的鎂診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩定劑
輔酶
腺苷二磷酸 甘油-3-磷酸
歸mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 8 mmol/L 12 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩定劑
甘油激酶
甘油脫氫酶
50 mmol/L
16000U/L
30000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37"C，反應時間10分鐘，起始
吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測鎂樣品
與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為正反應(上升反應)，
延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化
分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出鎂的濃
度大
小,
實施例三
本實施例的鎂診斷/測定試劑為三試劑，包括: 試劑1(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩定劑
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L
試劑2
(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩定劑
腺苷二磷酸
甘油-3-磷酸
畫mmol/L 50 mmol/L 16 mmol/L 30 mmol/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩定劑
甘油激酶
甘油脫氫酶
100mmol/L
50 mmol/L
24000 U/L 36000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定鎂濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37°C，反應時 間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測鎂樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方 向為正反應(上升反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘 左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出鎂的濃
度大小。
申請人經過實驗驗證，采用以上發明內容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達到本發明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實 施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明，采用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分 析儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應 用。
權利要求
1.一種酶比色法的鎂濃度測定方法，其方法原理如下腺苷二磷酸+甘油-3-磷酸 甘油激酶/Mg2+ 甘油+ 腺苷三磷酸甘油+輔酶 甘油脫氫酶 甘油酸+還原型輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出鎂的濃度大小測定結果。
2. —種鎂診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20——500 mmol/L穩定劑 1~~~ 50mmol/L輔酶 1- 6 mmol/L甘油激酶 1000——80000 U/L甘油脫氫酶 1000——80000 U/L腺苷二磷酸 1——50 mmol/L甘油-3-磷酸 1——50mmol/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用; 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述鎂診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩定劑、輔酶、腺苷二磷酸、甘油-3-磷酸、甘油激酶、 甘油脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述鎂診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、輔酶、腺苷二磷酸、甘油-3-磷酸、甘油激酶、 甘油脫氫酶組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩定劑、輔酶、腺 苷二磷酸、甘油-3-磷酸組成；試劑2，由緩沖液、穩定劑、甘油激 酶、甘油脫氫酶組成。輔酶、腺苷二磷酸、甘油-3-磷酸、甘油激酶、 甘油脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述鎂診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、輔酶、腺苷二磷酸、甘油-3-磷酸、甘油激酶、 甘油脫氫酶組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩定劑、輔酶組成; 試劑2，由緩沖液、穩定劑、腺苷二磷酸、甘油-3-磷酸組成；試劑 3，由緩沖液、穩定劑、甘油激酶、甘油脫氫酶組成。輔酶、腺苷 二磷酸、甘油-3-磷酸、甘油激酶、甘油脫氫酶在試劑l、試劑2或 試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述鎂診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩 定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩定劑為硫酸 銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的鎂診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定鎂濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、腺苷二磷酸、甘油-3-磷酸、甘油激酶、甘油脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的速度，從而測算出鎂的濃度大小。采用本發明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結果。
文檔編號G01N33/84GK101173934SQ20061009731
公開日2008年5月7日 申請日期2006年10月30日 優先權日2006年10月30日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
