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專利名稱：一種測定殺菌劑對黃瓜霜霉病菌毒力的方法
技術領域：
本發明涉及植物保護領域中一種測定殺菌劑對病原菌毒力的方法，特別是涉及一種測定殺菌劑對黃瓜霜霉病菌毒力的方法。
背景技術：
黃瓜是我國蔬菜產區露地和保護地栽培的主要種植品種，在多數地區可以整年種植。霜霉病是黃瓜生產上最重要的病害之一，凡栽培黃瓜的地區均有發生，在我國尤以北方地區受害最重，露地栽培以春茬黃瓜發病最重，保護地栽培則春季或冬季發病較重。該病主要由氣流傳播，具有侵染頻繁、潛育期短、流行危害嚴重的特點，能在幾日內導致植物全部死亡，俗稱“跑馬干”。也因在其發病后，黃瓜葉背出現大量紫褐色的霉狀物，而稱之為“黑毛病”。
由于黃瓜霜霉病已成為制約黃瓜生產的一個關鍵因素，生產上通常采用農業方法、培育抗病品種、生物防治、植物檢疫和化學防治等不同的防治措施來減輕其危害。在諸多防治措施中，化學藥劑的使用仍是控制黃瓜霜霉病危害的主要手段之一，在農業生產中發揮著重要作用。國內外許多研究單位和農化企業一直嘗試創制和篩選對黃瓜霜霉病具有顯著防治效果的新型殺菌劑。由于其防治的主要靶標菌黃瓜霜霉病菌為氣流傳播的專性寄生菌，國際殺菌劑抗性行動委員會(FRAC)認為該病原菌對殺菌劑具有潛在的高抗藥性風險。因此，新型殺菌劑投入使用后必須采取嚴格的抗性監測和治理措施來避免和延緩抗藥性的產生，延長殺菌劑的使用壽命。
研究穩定可靠、可重復性強的毒力測定方法，用來篩選對黃瓜霜霉病具有優異防效的殺菌劑及建立病原菌對藥劑的敏感基線，監測田間病原菌對藥劑的敏感性變化，是殺菌劑活性篩選和抗藥性研究及治理的前提，是實現植物病害化學防治可持續發展的基礎。
針對非專性寄生菌，一般采用離體毒力測定法進行藥劑的篩選和田間病原菌對藥劑敏感性的監測，即在實驗室條件下進行的不依附于病原寄主的農藥本身(原藥)對靶標菌的抑菌作用的測定法，如傳統毒力測定方法中的孢子萌發法和生長速率測定法等。但黃瓜霜霉病菌為專性寄生菌，其孢子萌發后菌絲主要在寄主細胞間隙擴展，不能在人工培養基上生長；同時病原菌菌株難于在離體條件下進行長期保存，且生產中用于黃瓜霜霉病害防治的幾種殺菌劑對病原菌不同發育階段的影響有所區別如氟嗎啉和烯酰嗎啉對黃瓜霜霉病菌的休止胞萌發、芽管伸長和菌絲擴展、孢囊梗形成有影響；霜脲氰對黃瓜霜霉病菌菌絲擴展、孢囊梗形成各階段沒有影響，而對休止胞萌發、芽管伸長有影響；代森錳鋅對休止胞萌發、芽管伸長都有抑制作用，而對附著胞的產生、菌絲擴展和孢囊梗形成沒有影響；腈嘧菌酯除對孢囊梗的產生、休止胞萌發沒有影響外，對其它各階段都有影響。因此傳統的毒力測定方法如孢子萌發法和生長速率測定法難于檢測這類藥劑的真實抑菌作用。目前，一般采用活體植株法和葉盤漂浮法進行殺菌劑的毒力測定。活體植株法用于毒力測定，一般是在田間或溫室自然發病的植株上進行，采用噴霧法進行不同梯度濃度的殺菌劑試驗，一般7-10d噴藥一次，共噴三次，調查噴藥前后植株葉片的病斑面積，換算為病情指數，計算試驗接種條件下各藥劑處理的防病效果。并以防病效果數據轉換成機率值為縱坐標，以藥劑濃度對數為橫坐標，作圖并求其毒力回歸式，計算出各藥劑對病原菌的EC50，比較不同藥劑的毒力及抑菌活性。該方法存在著測定周期長，需要大于40d時間；測定過程中影響因素較多，除藥劑本身的毒力起作用外，其他各種條件均對藥劑毒力的發揮產生影響，包括具體劑型，施藥質量，作物生長情況及防治對象生育情況；試驗可重復性較差，采用人工多點調查方法不可避免具有一定的誤差，影響了方法的準確度和精密度；試驗實施中因為涉及到溫室盆栽或田間試驗，工作量大、需要耗材較多等諸多弊端。活體植株法用于監測田間病原菌對藥劑的敏感性變化，一般需要將采自田間的菌株人工接種至黃瓜植株上，待植株葉片發病后按照上述方法進行測定。
葉盤漂浮法是針對活體植株法中的弊端，而采用的一種改良的方法。即用打孔器將生長健康完好的黃瓜葉片制成直徑為1.5cm的葉盤，在含系列濃度殺菌劑和清水對照的培養皿中(Φ9cm)分別漂浮5-10片葉盤，在每個葉盤上接種10μL的黃瓜霜霉病菌孢子懸浮液，保持懸浮狀態，置于16-20℃條件下光照黑暗交替培養6-8d，檢查每個葉盤的病情指數，計算防效，求其毒力回歸式和EC50。
該方法雖然目前一些學者相互引用，但技術人員在實際測定中發現存在黃瓜葉齡不統一，病原菌接種體濃度不一致，漂浮液以水為溶劑，展著性和滲透性差，漂浮時間過長(達6-8d)，影響葉片正常的生理代謝，漂浮液易揮發導致處理濃度的改變等影響因素，而最終導致試驗重復性和準確性較差，因此不同人員、不同批次的測定結果也沒有可比性和引用價值，不能將葉盤漂浮法作為殺菌劑對黃瓜霜霉病菌毒力測定的一種標準方法。
國家農藥檢定部門及藥劑研發部門迫切需要建立一種準確和有效的檢測殺菌劑活性的方法，以確定和比較不同藥劑對黃瓜霜霉病菌的抑菌效果和毒力，并為新型殺菌劑的篩選和田間抗性菌株的監測提供理論方法。

發明內容
本發明的目的是提供一種測定殺菌劑對黃瓜霜霉病菌毒力的方法。
本發明所提供的測定殺菌劑對黃瓜霜霉病菌毒力的方法，是在無菌條件下，用經消毒的黃瓜植株第3-5葉位上的健康離體葉片制成葉碟，將其分成若干組，分別于稀釋為若干濃度的殺菌劑中浸泡1-2h，所述殺菌劑中添加有質量百分濃度相同的0.003-0.01％的吐溫20和0.1-0.3％的甲醇；再將每個葉碟背面接種濃度為1.0×104-1.0×105個孢子囊/mL的黃瓜霜霉病菌的孢子囊懸浮液，然后將其在17-20℃黑暗條件下保濕培養20-28h，再于17-20℃、濕度RH大于80％、10-14h光暗交替條件下保濕培養5-7d，測量葉碟上的發病面積，計算防治效果和EC50值。
上述方法中，所述健康離體葉片優選為黃瓜植株第4葉位上的葉片；葉碟的尺寸為φ1.2-2.0cm，優選為φ1.5cm；所述殺菌劑中吐溫20的含量優選為0.005％，甲醇的含量優選為0.1％；所述浸泡時間優選為1h；黃瓜霜霉病菌的孢子囊懸浮液的濃度優選為1.0×104個孢子囊/mL；每個葉碟背面滴加的孢子囊懸浮液的體積為10μL；背面滴加有黃瓜霜霉病菌的孢子囊懸浮液的葉碟的培養條件優選為先在19℃的黑暗條件下保濕培養24h，再于19℃、濕度RH大于80％、12h光暗交替條件下保濕培養5d。
浸泡過程中需經常攪動，以確保每個葉碟都被均勻的濕潤。
接種方法為將葉盤上的藥液吸干，葉背朝上置于培樣皿內用相同藥劑濃度潤濕的吸水紙上，然后用液滴法將孢子囊懸浮液滴加于葉盤中央。
所述接種孢子懸浮液時所用的儀器可為5-40μL的移液槍。
本發明針對目前黃瓜霜霉病菌(專性寄生菌)菌株不能長期保存，采用的活體植株法測定殺菌劑對黃瓜霜霉病菌的毒力作用過程中存在的實驗周期長，影響因素多，工作量大等弊端；針對葉盤漂浮法測定過程中存在的黃瓜葉齡/葉位和病原菌接種體濃度不確定，漂浮液以水為溶劑，展著性和滲透性差，在液體溶液中漂浮時間過長(達6-8天)，影響葉片正常的生理代謝，葉盤易黃花及腐爛，導致病斑面積調查中出現誤差，漂浮液易揮發導致處理濃度的改變等影響試驗重復性和準確性的問題。建立了穩定可靠、重復性好、精密度高的檢測殺菌劑對黃瓜霜霉病菌毒力的測定方法，將其命名為葉碟保濕培養法，該方法測定周期約為5天；測定過程中供試藥劑均為高含量的原藥，不受施藥方法和劑型的影響；原藥借助表面展著劑及有機溶劑的定量添加增強了藥液在葉碟上的展著和滲透，葉碟在藥液中漂浮的時間縮短為1h，杜絕了因長時間在藥液中懸浮造成的葉碟黃花現象；測定過程在離體葉碟上進行，是不依附于活體植株進行的農藥本身(原藥)對于靶標菌的抑菌作用的測定，不受植物生長情況的影響，方法的準確度和精密度高，平行性好，檢測過程中耗費的試材量少，可準確、可靠的測定殺菌劑對黃瓜霜霉病菌的毒力作用和監測田間黃瓜霜霉病菌對殺菌劑敏感性的變化，為進一步的殺菌劑作用機制和抗藥性研究及治理提供了技術支撐。本發明可作為一種新的具有標準特征的方法，用于測定殺菌劑對黃瓜霜霉病菌的毒力作用和監測田間黃瓜霜霉病菌對殺菌劑敏感性的變化，具有潛在的社會經濟意義。


圖1為用葉碟保濕培養法測定殺菌劑對黃瓜霜霉病菌的毒力圖2為不同濃度的殺菌劑處理后葉碟的發病情況圖3為黃瓜霜霉病菌對氟嗎啉的敏感性分布圖4為77株黃瓜霜霉病菌對氟嗎啉的敏感性頻率分布具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。
供試藥劑96％氟嗎啉(flumorph)原藥(沈陽化工研究院)；97％甲霜靈(metalaxyl)原藥(新加坡利農私人有限公司)；95％腈嘧菌酯(azoxystrobin)懸浮劑(先正達中國投資有限公司)。
供試植物材料將感病黃瓜品種長春密刺栽培于φ15cm，高12cm的育苗缽內，置于玻璃溫室中培養，待植株長到10葉期后采集相同葉位的葉片，用于黃瓜霜霉病菌的培養及毒力測定。
實施例1、葉碟保濕法測定殺菌劑對黃瓜霜霉病菌的毒力中各處理條件的選擇1、葉碟保濕測定法中黃瓜葉齡的選擇采集黃瓜植株的第3-10個葉位上的健康葉片，用無菌水清洗3次，然后分別將不同葉位上的葉片用φ15mm的打孔器制成葉碟，葉背朝上整齊的放置于用吸水紙保濕的φ150mm培養皿中，每皿50個葉碟(圖1)，在每個葉碟中央接種10μL濃度為1×104孢子囊/mL黃瓜霜霉病菌孢子囊的懸浮液，并置于20℃，RH＞80％，12h光暗交替的生長間培養，7d后調查葉碟上的霉層面積，比較不同葉齡黃瓜葉碟上黃瓜霜霉病菌發病的嚴重度(試驗重復3次)。結果如表1所示，表明不同葉位上的葉片對黃瓜霜霉病菌侵染有明顯影響，第3、4、5和6葉位上葉片制成的葉碟之間發病面積沒有顯著差異，而第7、8、9、10葉位上葉片制成的葉碟發病面積明顯降低，表明隨著葉齡的增大，葉片對黃瓜霜霉病菌的侵入具有一定的抵抗能力。因此，選擇第4葉位上的葉片進行藥劑的敏感性測定，可降低由葉片之間的差異而導致的誤差，也可以節省培養植物材料需要的時間。
表1 黃瓜葉片葉齡對黃瓜霜霉病菌侵染的影響

注a3代表植株完全展開的第一片葉，隨著數值增大，葉齡也相應變大。b三次重復之間的標準誤。
2、葉碟保濕測定法中接種體濃度的選擇采集黃瓜植株第4位葉片，按步驟1的方法制成葉碟，每50個葉碟一個處理，用液滴法于每個葉碟背面接種10μL濃度分別為1×103，1×104和1×105個孢子囊/mL的懸浮液，然后保濕培養，7d后測量葉碟的發病面積，比較不同接種體濃度對發病的影響(試驗重復3次)。結果如圖2所示，對發病面積進行統計，統計結果如表2所示，接種濃度為1×104和1×105個孢子囊/mL的懸浮液的葉碟發病面積之間沒有顯著差異，而接種濃度為1×103個孢子囊/mL的葉碟發病嚴重度明顯降低，表面接種體濃度也會對發病的嚴重程度產生影響，因此，選擇1×104個孢子囊/mL的濃度進行接種。
表2 接種體濃度對黃瓜霜霉病菌侵染的影響

3、葉碟保濕測定法中表面展著劑及溶劑的選擇測定0.005％的吐溫20和0.1％的甲醇溶劑對測定結果的影響，以無菌水為對照。采集黃瓜植株第4位葉片，按步驟1的方法制成葉碟，每50個葉碟一個處理，分別于100mL無菌水，0.005％吐溫20溶液，0.1％甲醇溶液及同時含有0.005％吐溫20和0.1％甲醇的溶液里浸泡1h，浸泡過程中經常攪動，以確保每個葉碟都被均勻的潤濕。然后按步驟1的方法進行接菌、培養和數據處理，比較表面展著劑和有機溶劑對發病的影響，結果如表3所示，0.005％的吐溫20和0.1％的甲醇對試驗結果均沒有明顯影響，表明可采用濃度低于0.005％的吐溫20作為表面展著劑，0.1％甲醇(methanol)作為有機溶劑進行原藥的溶解，且將藥劑稀釋液中甲醇的含量控制在≤0.1％范圍內。
表3表面展著劑(Tween 20)和有機溶劑(甲醇)對黃瓜霜霉病菌侵染的影響

4、葉碟保濕測定法的精密度試驗隨機選用6個黃瓜霜霉病菌菌株，采用葉碟保濕法進行殺菌劑氟嗎啉對其毒力測定，具體方法為取黃瓜植株上第4葉位的健康離體葉片，制成φ15mm的黃瓜葉碟。隨機混勻，分成7組，每組50個葉碟，分別于系列濃度(0.00、0.05、0.10、0.30、0.50、0.70和1.00μg/mL)的氟嗎啉藥液中浸泡1h。浸泡過程中經常攪動，以確保每個葉碟都被均勻的濕潤。每個處理均含有0.005％的吐溫20和0.1％的甲醇。浸泡結束后將葉碟上的藥液吸干，葉背朝上置于培樣皿內用相同藥劑濃度潤濕的吸水紙上，然后用液滴法接種濃度為每毫升含有104個孢子囊的懸浮液10μL于葉碟中央。將接種后的葉碟放置于19℃、RH＞80％、12h光暗交替的條件下培養，5d后測量葉碟上的發病面積，計算防治效果和EC50。每個菌株重復5次，計算藥劑對各個菌株的EC50及每個菌株5次重復間的變異系數，通過變異系數確定試驗方法的精密度。6個供試菌株，每個菌株5次重復的精密度測定結果如表4所示，5次重復間的變異系數在1.4-5.3％之間，均表現出了較高的重復性。進一步證明葉碟保濕測定法具有很好的重復性和精密度，該方法適用于進行殺菌劑氟嗎啉對專性寄生菌黃瓜霜霉病菌毒力的測定。
表4 葉碟保濕測定法用于氟嗎啉敏對黃瓜霜霉病菌毒力測定的重復性


5、殺菌劑之間的交互抗藥性試驗采用上述精密度試驗中的測定方法，分別選用6株甲霜靈和腈嘧菌酯抗藥性菌株進行氟嗎啉、甲霜靈和腈嘧菌酯之間的交互抗藥性試驗，結果如表5所示，甲霜靈和腈嘧菌酯對甲霜靈抗藥性菌株和腈嘧菌酯抗藥性菌株的EC50分別在63.10-87.10μg/mL和2.82-7.33μg/mL之間，而氟嗎啉對所有菌株的EC50均在0.08-0.18μg/mL之間，統計分析表明氟嗎啉和甲霜靈(r＝0.000685，n＝6)及氟嗎啉和腈嘧菌酯(r＝0.220137，n＝6)之間的相關性均很低，證明氟嗎啉和甲霜靈及腈嘧菌酯之間不存在交互抗藥性。
表5 6株甲霜靈抗藥性菌株和6株腈嘧菌酯抗藥性菌株對氟嗎啉、甲霜靈和腈嘧菌酯的敏感性

實施例2、葉碟保濕法測定殺菌劑對黃瓜霜霉病菌的毒力(田間抗藥性菌株的監測供試藥劑96％氟嗎啉(flumorph)原藥(沈陽化工研究院)。
供試植株將感病黃瓜品種長春密刺栽培于φ15cm，高12cm的育苗缽內，置于玻璃溫室中培養，待植株長到6葉期后采集第4葉位的葉片，用于黃瓜霜霉病菌的培養及毒力測定。
供試菌株從北京郊區的平谷東高村崔莊子科技園、懷柔王化村西菜地、延慶永寧鎮孔化營村、昌平南郝莊蘋園及中國農業大學昌平實驗站、房山豆店村、海淀區西北旺村及河北巒平、內蒙等地區未施用過氟嗎啉及同類藥劑烯酰嗎啉的黃瓜栽培地采集黃瓜霜霉病樣本，分離獲得77株敏感菌株，按照實施例1中的方法對菌株進行繼代培養和低溫冷藏長久保存。
按照實施例1中的葉碟保濕法測定黃瓜霜霉病菌對殺菌劑的敏感性。具體方法為采集黃瓜植株第4葉位葉片，制備φ15mm的葉碟，隨機混勻，分成7組，每組50個葉碟，分別于0、0.05、0.10、0.30、0.50、0.70、1.000μg/mL氟嗎啉溶液中浸泡1h浸泡過程中經常攪動，以確保每個葉碟都被均勻的濕潤。每個處理均含有0.005％的吐溫20和0.1％的甲醇。浸泡結束后將葉碟上的藥液吸干，葉背朝上置于用相同藥劑濃度潤濕的吸水紙上，然后用液滴法接種濃度為每毫升含有104個孢子囊的懸浮液10μL于葉碟中央。將接種后的葉碟放置于19℃、RH＞80％、12h光暗交替的條件下培養，7d后測量葉碟上的發病面積，計算防治效果和EC50。用該法測定從田間采集的77個菌株對氟嗎啉的敏感性，建立敏感基線，測定如圖3所示，其中EC50最大的為0.2647μg/mL，最小的為0.0213μg/mL，相差12.43倍，平均EC50＝(0.1360±0.0487)μg/mL。從77株黃瓜霜霉病菌對氟嗎啉的敏感性頻率分布圖(圖4)可以看出，77個菌株對氟嗎啉的敏感性分布呈連續的單峰曲線，沒有出現敏感性下降的抗藥病原亞群，因此可用該單峰曲線作為將來進行田間抗藥性監測的敏感基線。
權利要求
1.一種測定殺菌劑對黃瓜霜霉病菌毒力的方法，是在無菌條件下，用經消毒的黃瓜植株第3-5葉位上的健康離體葉片制成葉碟，將其分成若干組，分別于稀釋為若干濃度的殺菌劑中浸泡1-2h，所述殺菌劑中添加有質量百分濃度相同的0.003-0.01％的吐溫20和0.1-0.3％的甲醇；再將每個葉碟背面接種濃度為1.0×104-1.0×105個孢子囊/mL的黃瓜霜霉病菌的孢子囊懸浮液，然后將其在17-20℃黑暗條件下保濕培養20-28h，再于17-20℃、濕度RH大于80％、10-14h光暗交替條件下保濕培養5-7d，測量葉碟上的發病面積，計算防治效果和EC50值。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述健康離體葉片為黃瓜植株第4葉位上的葉片。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述殺菌劑中吐溫20的含量為0.005％，甲醇的含量為0.1％。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述黃瓜霜霉病菌的孢子囊懸浮液的濃度為1.0×104個孢子囊/mL。
5.根據權利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于所述葉碟的尺寸為φ1.2-2.0cm。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述葉碟的尺寸為φ1.5cm；每個葉碟背面滴加的孢子囊懸浮液的體積為10μL。
7.根據權利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于所述背面滴加有黃瓜霜霉病菌的孢子囊懸浮液的葉碟的培養條件為先在19℃的黑暗條件下保濕培養24h，再于19℃、濕度RH大于80％、12h光暗交替條件下保濕培養7天。
8.根據權利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于所述浸泡過程中要不斷攪動。
全文摘要
本發明公開了一種測定殺菌劑對黃瓜霜霉病菌毒力的方法。該方法是在無菌條件下，用經消毒的黃瓜植株第3－5葉位上的健康離體葉片制成葉碟，將其分成若干組，分別于稀釋為若干濃度的殺菌劑中浸泡1－2h，所述殺菌劑中添加有質量百分濃度相同的0.003－0.01％的吐溫20和0.1－0.3％的甲醇；再將每個葉碟背面接種濃度為1.0×10
文檔編號G01N33/00GK1687774SQ20051007097
公開日2005年10月26日 申請日期2005年5月19日 優先權日2005年5月19日
發明者劉西莉, 朱書生, 李健強, 顧寶根, 袁善奎, 劉亮, 王巖 申請人:中國農業大學