專利名稱：對癌癥的診斷測試、預測測試和預后測試的制作方法
技術領域：
本發明在廣義上涉及癌癥領域。具體而言，本發明涉及癌癥的預后和治療方案。
背景技術：
人體內大多數的細胞處于非增殖、離開細胞周期的狀態，僅少數細胞群活躍地經 歷細胞周期。這些周期細胞主要位于如宮頸、結腸或皮膚等自我更新組織的干細胞轉運增 殖區室(stem-transit amplifyingcompartment)中。相反，大多數的功能細胞(如肝細 胞)處于靜止的(GO)、可逆停滯狀態，或者已經從有絲分裂細胞分裂周期不可逆地轉變為 終末分化狀態(如神經元、肌細胞或表面結腸上皮細胞)。與上述相反，癌癥的特征在于不 受控制的細胞生長，因此包含高比例的周期細胞。細胞在G1的不連續時間(稱為限制點)對其環境中的絲裂原起反應。無絲裂原 時不影響細胞周期經過S、G2和M期，直至細胞返回至它們在G1中的敏感窗口。細胞對高 細胞密度或絲裂原缺乏的反應是積聚2N DNA內含物并退出至GO。細胞周期時相變化由細 胞周期蛋白-CDK對的變化驅動。細胞周期蛋白D-CDK4、細胞周期蛋白D-CDK6和細胞周期 蛋白E-⑶K2可調節G0/G1，并且是完全的E2F活性所需的，S期由細胞周期蛋白A-⑶K2啟 動，細胞周期蛋白B-CDK1可調節通過G2期并進入有絲分裂的過程。是什么可將離開細胞 周期狀態的細胞與處于細胞周期中的細胞區分開仍有待于被闡明。癌癥是一類復雜的、由基因突變的積聚引起的異質疾病，所述基因突變可增加刺 激細胞增殖的調節基因的活性，并降低在正常情況下限制細胞增殖的蛋白的活性。通過點 突變、基因擴增、過甲基化、易位或與病毒癌蛋白的相互作用，顯性刺激性癌基因的激活或 隱性腫瘤抑制基因的失活可影響所有的生長信號傳遞通路水平，包括絲裂原、絲裂原生長 因子受體、Ras、Raf、ABL、例如以下分子的上游的PI3激酶AKt 下游的pl6INK4A、Myc、細胞 周期蛋白D、細胞周期蛋白E、pRB和p53。微陣列基因表達譜理想地適合于分析表征腫瘤發生特征的基因表達中的復雜多 因素的、交互的且分步驟的改變，并且目前成為旨在鑒定出可被用于癌癥診斷和預后的獨 特分子標志的深入研究領域。有趣的是，這些表達陣列包括增殖標志、表達模式與腫瘤級別 (分化狀態)相關的基因、細胞周期狀態和倍增時間。該增殖標志是在腫瘤數據集中觀察到 的最主要的基因表達模式之一(不管組織的來源如何)，其包括許多細胞周期調節基因如 E2F1、BUB1、PLK1、細胞周期蛋白 E1、D1 和 B1。不幸地是，使用基因表達的預測規則的實際表現并不如最初針對許多腫瘤類型所 提出的那樣表現出具有信息含量，并且所鑒定的基因列表可能是高度不穩定的。例如，與常 規的臨床病理學標準如腫瘤分化狀態、擴散范圍和增殖指數相比，使用基因表達的大多數 預測規則都未提供顯著改良的乳腺癌預后分類。實際上，已經發現，許多發表的、預測癌癥 的無遠端轉移的存活的基因標志與分化狀態顯著相關。用于鑒定可用于臨床的增殖標志的全局微陣列方法有可能受到限制。首先，微陣 列方法在一定意義上假定了一種單區室腫瘤模型，其中癌癥由增殖的對數生長細胞構成。然而，新生物相對于個體腫瘤細胞的細胞周期狀態是高度異質的。例如，在高度分化的、低 級腫瘤中，僅很小部分的克隆原腫瘤細胞可處于周期中，而其中的大多數已完成其分化程 序并不可逆地從周期中轉至分化狀態(非增殖區室)。因此，良性超增殖的狀態(如增生) 和生理修復性生長——包含大量有絲分裂細胞的反應性病理狀態——可表現出高于高度 分化的癌癥的增殖標志。其次，腫瘤細胞在體內還可能從周期可逆地退到非增殖的GO狀態。事實上，在許 多腫瘤中多數都是非增殖細胞；即生長分數(增殖細胞與總細胞的比例)低于0.5。這種 情況可能不非令人意外，原因是正常組織是由混合的增殖元件和非增殖元件構成，并且該 復雜表現的某剩余部分與大多數癌癥實際相關(hardwire)。污染的良性新生物細胞、腫瘤 間質、淋巴濾泡、瘤內和瘤周炎性浸潤物以及其他結締組織如血管的存在也會通過加入大 量具有其他復雜的細胞周期動力學的細胞而扭曲分析結果。因此，個體腫瘤中復雜且異質 的細胞周期動力學可能會妨礙對臨床有用的微陣列增殖標志的鑒定，該問題還限制流式細 胞術在常規臨床實踐中的應用。流式細胞術的使用同樣具有有限的影響，這是因為臨床樣品經常不適于這類分 析。這一點部分地是由于固定假象、組織的量不足，以及因為由來自活動間質和/或良性元 件的污染群造成的解釋困難。對細胞增殖標記物的評估以前未提供任何預后的和預測的解決方案，本領域的專 家對增殖標記物將會提供有用的臨床信息有懷疑。對細胞增殖參數的測量被認為可提供關 于腫瘤的客觀信息，但雖然有大量的研究，但是幾乎沒有直接證據表明使用某些細胞增殖 標記物會真正改善最佳應用的常規組織學評估。甚至很少有研究說明增殖標記物與標準的 組織病理學分級和分期相比的相對價值這一關鍵問題。雖然基因表達已在癌癥中被應用于預測結果，但是使用基因表達的預測規則的實 際表現出像最初提出的那樣具有信息性。例如，在乳腺癌中與常規的NPI預后因子相比，現 在使用基因表達的大多數預測規則未提供顯著改善的預后分類。因此迫切需要鑒定新的生 物標記物，以在普通癌癥中改善預后評估。乳腺癌是常見癌癥的一個示例，它是一種復雜疾病，原因是其形態學和生物學的 異質性、其獲得化學抗性的傾向性以及其發病機制背后存在多種分子機制。接受乳腺癌局 部治療的半數女性將不會復發，而另一半將最終死于轉移的疾病。因此為了最佳的臨床管 理，必需在這兩組患者之間進行清楚地區分。不幸地是，至今為止乳腺癌的預后標記物是有 限的。還沒有試驗(預測性試驗)來選擇最適合的抗癌藥物，特別是對于靶向參與生長控 制和細胞周期轉換的關鍵激酶的新產生小分子抑制劑而言。例如在乳腺癌中，預測性試驗 現階段局限于Her2免疫表達作譜。上皮卵巢癌(E0C)是另一種常見癌癥，并且在美國和英國是女性中第四大常見癌 癥。患者經常出現晚期疾病，雖然在藥物治療中有改善，但存活很少。在現階段，腫瘤階段 是最重要的預后因素。手術后的殘留疾病、組織學亞型和腫瘤等級也可預測存活，但幾乎不 能提供有關決定階段進展和結果的生物學變量的信息。對于由異常增殖引起的疾病例如癌或前癌病癥，仍然有對改良的診斷方法、預后 方法和預測方法的需求。本發明涉及改善現有技術的至少一種不利情況。
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本說明書包括的任何關于文獻、裝置、作用或知識的描述用來解釋本發明的上下 文。不應認為，這些素材中任何一種可形成本公開內容和權利要求優先權日之時或之前的 現有技術基礎或相關領域公知常識的一部分。
發明內容
本發明的其他適用范圍將從下文中給出的具體描述中顯而易見。然而，應了解，雖 然那些具體的描述和具體的實施例表明了本發明的優選實施方案，但它們僅通過示例的方 式給出，這是因為對于本領域技術人員來說，根據這些具體描述，在本發明主旨和范圍內可 明顯作出多種變化和修改。在第一方面中，本發明提供了一種確定來自個體的身體樣品中存在或不存在異常 增殖細胞或細胞生長異常的方法，所述方法包括在所述樣品中檢測一種生物標記物，其中 所述生物標記物選自DNA復制準許因子、Aurora激酶、Ki67、孿蛋白(geminin) .Polo樣激 酶及其底物組蛋白H3(下文中稱為“H3S10ph”)以及它們的結合物。在一個實施方案中，使用針對所述生物標記物的靶多肽的特異性結合成員檢測所 述生物標記物。在第二方面中，本發明提供了一種將組織分為(i)正常型或者(ii)潛在的或實 際的前癌型或癌型、發育異常型或新生物型的方法，所述方法包括確定針對一種生物標記 物的特異性結合成員對所述組織的樣品的結合，其中所述生物標記物選自DNA復制準許因 子、Aurora激酶、Ki67、孿蛋白、Polo樣激酶、H3S10ph和它們的結合物。在一個實施方案中，所述特異性結合成員可針對一種所述生物標記物的靶多肽。在一個實施方案中，可將所述結合的模式或程度與已知的正常樣品和/或已知的 異常樣品進行比較。在一個實施方案中，確定一種生物標記物與另一種生物標記物的比例。在第三方面中，本發明提供了一種在組織樣品中標記異常細胞的方法，所述方法 包括將所述樣品與一種針對一種靶多肽的特異性結合成員在如下條件下相接觸，其中所述 靶多肽選自DNA復制準許因子、Aurora激酶、Ki67、孿蛋白、Polo樣激酶、H3S10ph和它們的 結合物，所述條件即所述特異性結合成員可結合于異常增殖細胞，但不結合正常細胞的條 件。在第四方面中，本發明提供了針對一種靶多肽的一種特異性結合成員的如下用 途，所述用途即在組織或組織樣品中確定、評估或診斷存在或不存在異常細胞增殖、細胞生 長異常、腫瘤細胞周期動力學、細胞周期時相分布、發育異常、新生物形成或者潛在的或實 際的前癌狀態或癌狀態。在一個實施方案中，所述靶多肽包括選自以下的兩種或多種標記物DNA復制準 許因子、Aurora激酶、Ki67、孿蛋白、Polo樣激酶、H3S10ph和它們的結合物。在第五方面中，本發明提供了一種預測對癌癥的治療的反應或預測癌癥的疾病進 展的方法，所述方法包括在來自一個個體的身體樣品中確定存在或不存在異常增殖細胞或 細胞生長異常，所述方法包括在所述樣品中檢測一種靶多肽，其中所述靶多肽選自DNA復 制準許因子、Aurora激酶、Ki67、孿蛋白、Polo樣激酶、H3S10ph和它們的結合物。在第六方面中，本發明提供了一種監測對治療藥物開發研究的反應的方法，所述方法包括在身體樣品中檢測一種生物標記物，其中所述生物標記物選自DNA復制準許因 子、Aurora激酶、Ki67、孿蛋白、Polo樣激酶、H3S10ph和它們的結合物，評估所述標記物的 表達，以確定在所述樣品中存在或不存在異常細胞增殖、細胞生長異常、腫瘤細胞周期動力 學、細胞周期時相分布、發育異常、新生物形成或者潛在的或實際的前癌狀態或癌狀態。在一個實施方案中，所述藥物開發研究為臨床前藥物開發研究。在一個實施方案中，所述藥物開發研究為臨床前藥物開發研究。在一些實施方案中，所述臨床前藥物開發研究為體內異種移植腫瘤模型。在第七方面中，本發明提供了一種在受試者中確定癌癥進展的預后的方法，所述 方法包括步驟(a)在來自所述受試者的生物樣品中評估選自Mcm2-7中的至少一種的第一生物 標記物的水平；以及(b)在來自所述受試者的生物樣品中評估選自孿蛋白、Aurora A、Plkl、Ki67和 H3S10ph中的至少一種的第二生物標記物的水平，其中將所述第一生物標記物相對于一個預定值的水平變化與所述第二生物標記 物相對于一個預定值的水平變化相結合來指示所述受試者中的癌癥進展。在一個實施方案中，所述在受試者中確定癌癥進展的方法還包括，在來自所述受 試者的生物樣品中評估選自孿蛋白、Aurora A、Plkl、Ki67和H3S10ph中的至少一種的第三 生物標記物的水平，其中所述第二和第三生物標記物不相同。在第八方面中，本發明提供了一種為患有癌癥的受試者確定治療方案的方法，所 述方法包括步驟(a)在來自所述受試者的生物樣品中評估選自Mcm2-7中的至少一種的第一生物 標記物的水平；以及(b)在來自所述受試者的生物樣品中評估選自孿蛋白、Aurora A、Plkl、Ki67和 H3S10ph中的至少一種的第二生物標記物的水平，其中將所述第一生物標記物相對于一個預定值的水平變化與所述第二生物標記 物相對于一個預定值的水平變化相結合來指示為所述受試者制定的治療方案。在一個實施方案中，所述為患有癌癥的受試者確定治療方案的方法還包括，在來 自所述受試者的生物樣品中評估選自孿蛋白、AuroraA、Plkl、Ki67和H3S10ph中的至少一 種的第三生物標記物的水平，其中所述第二和第三生物標記物不相同。在第九方面中，本發明提供了一種確定對患有癌癥的受試者的治療有效性的方 法，所述方法包括步驟(a)在來自所述受試者的生物樣品中評估選自Mcm2-7中的至少一種的第一生物 標記物的水平；以及(b)在來自所述受試者的生物樣品中評估選自孿蛋白、Aurora A、Plkl、Ki67和 H3S10ph中的至少一種的第二生物標記物的水平，其中將所述第一生物標記物相對于一個預定值的水平變化與所述第二生物標記 物相對于一個預定值的水平變化相結合來指示所述治療有效性。
相關領域的技術人員通過結合附圖參考下文對優選實施方案的描述，可更好地理 解本發明的其他公開內容、目標、優點和方面，所述附圖以僅示例性的方式給出，因此不限 制本發明的范圍，其中圖1示出Ki67、Mcm2、孿蛋白、Aurora A和H3S10ph在細胞有絲分裂周期過程中的 存在情況。Mcm2-7 DNA復制準許因子的水平在經歷細胞周期的過程中不會顯著變化，而內 源性準許阻遏蛋白孿蛋白的表達局限于S-G2-M期。孿蛋白表達增加在多個惡性瘤中被觀 察到，并與增殖正相關。值得注意的是，該表達增加總是局限于S-G2-M，甚至在侵襲性腫瘤 中也是這樣。Aurora A(和PLK1 ；數據未顯示)水平在G1過程中可忽略，在S期過程中增 加，在G2/M過程中達到峰值。H3S10ph的存在局限于有絲分裂，因此可用作有絲分裂標記 物。Mem 2-7蛋白表達可以用于在組織中確定細胞周期狀態。Mcm2-7可標識處于細胞周期 (G1-S-G2-M期)的細胞，但在細胞退到靜止(GO)狀態、分化狀態和衰老的“離開細胞周期” 的狀態后被嚴格地下調。由于Ki67在增殖細胞的整個細胞周期中表達，因而可以將S-G2-M 期或M期標記物與Ki67的比例(例如孿蛋白/Ki67、Aurora A/Ki67或H3S10ph/Ki67)用 作G1期相對長度的指標，從而用作細胞周期進展速度的指標。圖2示出自我更新組織中DNA復制準許因子表達的示意圖。該模型包括干細胞區 室、分裂-轉運區室和功能性區室。細胞連續流過這些區室；新細胞由干細胞區室(S)提 供，并且其數目在分裂-轉運區室(T)中擴增。在細胞進入成熟區室(M)中時變成完全分 化并且有功能性能力。干細胞區室顯示出低表達的DNA復制準許因子Mcm2-7。Mcm2-7水 平在細胞進入分裂-轉運區室中時迅速升高。隨著細胞分化及采用完全分化的功能表型， Mcm2-7逐步下調。然而，隨著細胞離開分裂-轉運區室，增殖能力在執行分化程序過程中的 較早時間點喪失，并且與Mcm2-7裝載因子Cdc6相偶合。值得注意的是，可表征癌癥特征的 抑制分化(特別是在高級別的腫瘤中)與下調Mcm2-7失敗相關聯。圖3示出乳腺癌中的細胞周期時相進展。Mcm2、Ki67、孿蛋白、Aurora A和H3p免 疫染色的兩個乳腺癌活檢標本顯示于(A)和(B)。兩種情形都具有Mcm2蛋白高表達的特 征，表明大多數的腫瘤細胞處于細胞分裂周期中。雖然兩腫瘤標本都顯示出如Mcm2表達所 定義的高生長部分，但S-G2-M標記物孿蛋白和Aurora A與有絲分裂標記物H3S10ph的表 達有顯著差異。(A)該腫瘤顯示出很低表達水平的孿蛋白和Aurora A，少量細胞顯示出組 蛋白H3第10位絲氨酸的磷酸化(H3S10ph)，表明G1期的停滯或延長。(B)相反，該腫瘤顯 示出高表達水平的孿蛋白和Aurora A以及增加的H3S10磷酸化，表明快速的細胞周期時相 進展。因此可以推定，⑶中顯示的腫瘤對于S或G2/M細胞周期時相特異性藥物更加敏感。圖4示出對用于預后性和預測性癌癥試驗的DNA復制準許因子、Aurora激酶、 Ki67、孿蛋白、Polo樣激酶、H3S10ph和它們的結合物的多參數分析。在多參數分析中使用 這些標記物組合，有可能確定腫瘤細胞是否離開周期(即非增殖腫瘤細胞)——對針對細 胞周期的抗癌劑和輻射會產生抗性的細胞群。而且，對于那些處于周期中的腫瘤細胞(Mem 2-7陽性)，則可確定細胞周期進展的速度。圖5示出對標記物多參數分析的驗證。(A)Mcm2抗體、孿蛋白抗體、Aurora A抗 體、Plkl抗體和H3S10ph抗體對非同步MCF-7全細胞裂解物的免疫印跡。(B)石蠟包埋的 以Ki67抗體、Mcm2抗體、孿蛋白抗體、Aurora A抗體、Plkl抗體和H3S10ph抗體免疫組織
9化學染色的3級乳腺癌組織切片的顯微照片(原始放大率400X)。插圖顯示出正常乳腺的 免疫染色(放大率800X)。圖6示出Aurora A和Plkl在乳腺癌系列的各腫瘤級別中的表達。圖7示出乳腺癌系列(A)NPI、(B)Plkl和(C) Aurora A的復發時間曲線。圖9示出乳腺癌系列(A)NPI和Plkl,以及B)NPI和Aurora A的復發時間曲線。圖10示出(A)Mcm2抗體、孿蛋白抗體、Aurora A抗體、AuroraB抗體和H3S10ph 抗體對非同步HeLa S3全細胞裂解物的免疫印跡。(B)生物標記物和肌動蛋白(加載的對 照物)在來自同步化HeLa S3細胞的全細胞裂解物中的免疫印跡。以2小時間隔的同步化 HeLa S3細胞的FACS圖譜。(C)石蠟包埋的以Ki67抗體、Mcm2抗體、孿蛋白抗體、Aurora A抗體、Aurora B抗體和H3S10ph抗體免疫組織化學染色的上皮卵巢癌(E0C)組織切片的 顯微照片。原始放大率，400 X ；插圖，1000 X。圖11示出各腫瘤級別(E0C系列)中Aurora A的表達。圖12中顯示的Kaplan-Meier曲線示出Aurora A、腫瘤倍性狀態和E0C系列的 患者存活率之間的關聯。(A)整個系列中的Aurora A(低三分位組< 11. 3%，中三分位組 11. 3-21.3%，高三分位組>21. 3%)和無疾病存活率；對數秩檢驗，p = 0.01。(B)整個系 列中的腫瘤倍性狀態和無疾病存活；對數秩檢驗，P = 0. 03。(C)早期亞組中的AuroraA (低 三分位組< 8. 7%，中三分位組8. 7-19. 6%，高三分位組> 19. 6% )和無疾病存活；對數秩 檢驗，p = 0. 004。(D)早期亞組中的腫瘤倍性狀態和無疾病存活；對數秩檢驗，p = 0. 04。 (E)早期亞組中的Aurora A(低三分位組< 8. 7%，中三分位組8. 7-19. 6%，高三分位組> 19. 6% )和總存活；對數秩檢驗，p = 0. 01。(F)早期亞組中的腫瘤倍性狀態和總存活；對 數秩檢驗，P = 0. 08。圖13的圖示顯示了 Mcm2在研究樣品中的表達分布。Mcm2蛋白在乳腺癌患者組中 的表達頻率。(平均值=64. 4101，標準差=30. 4632，N = 182)。圖14的圖示顯示了通過細胞周期標記物表達分布定義了 3種不同細胞周期表型； (I )離開細胞周期狀態；(II )在周期的G1期延遲/停滯狀態；(III)活動周期狀態。顯 示了中值(黑實線)、四分位數間距(加框)和排除偏離情況的可靠范圍(robust range) (閉合線)。偏離情況由孤立點顯示。(LI 標記指數)。圖15的Kaplan-Meier曲線圖顯示出細胞周期表型和無疾病存活的關聯。(I) 離開細胞周期狀態；(II )在周期的G1期延遲/停滯狀態；(III)活動周期狀態。一元分 析比較了表型III與表型I和II的組合；HR = 3. 90 (1. 81-8. 40)、p < 0. 001。多元分析對PI 進行調整，HR = 2. 71 (1. 18-6. 23)、p = 0. 19。圖16的圖示顯示了細胞周期表型和乳腺癌亞組的關系。子圖顯示了表現出細胞 周期表型I (離開周期)、II (G1延遲/停滯)和III (活動周期)的每種乳腺癌亞型的比 例。值得注意的是，大多數的Her-2和三重陰性腫瘤(triple negative tumour)表現活動 周期表型(III)。
具體實施例方式提供了生物標記物的用途(包括臨床用途)，以及如何可將這些生物標記物的分 析與其他關鍵細胞周期調節物相整合以提供患者腫瘤樣品中細胞周期動力學和時相分布的信息。該分析可提供診斷算法用于改善預后評估，而且具有預測對細胞周期時相特異性 藥物的治療反應的能力。在該方法中，可使用生物標記物在常規的患者腫瘤活檢材料上進 行多參數細胞周期分析，所述生物標記物形成DNA復制準許通路和有絲分裂機制的核心組 分。該算法不僅提供預后工具，而且還可以開發為細胞周期時相特異性藥物(包括輻射) 或抑制上游生長調節通路的藥物的預測試驗。該算法還可以在臨床前研究(體內異種移植 腫瘤模型)和臨床試驗中用來評估新藥物候選物的有效性。在第一方面中，本發明提供了一種確定來自個體的身體樣品中存在或不存在異常 增殖細胞或細胞生長異常的方法，所述方法包括在所述樣品中檢測一種生物標記物，其中 所述生物標記物選自DNA復制準許因子、Aurora激酶、Ki67、孿蛋白、Polo樣激酶及其底物 組蛋白H3(下文中稱為“H3S10ph”)以及它們的結合物。在一個實施方案中，使用針對一種所述生物標記物的靶多肽的特異性結合成員檢 測所述生物標記物。“身體樣品”意指任何在其中可以檢測生物標記物表達的取樣細胞、組織或體液。 這類身體樣品的實例包括但不限于，血液、淋巴、尿、女性分泌液、活檢物和涂片。可通過多 種技術獲得患者的身體樣品，所述技術包括例如擦拭或拭取區域，或者使用針頭吸出體液。 用于收集多種身體樣品的方法在本領域中是公知的。可將身體樣品轉移至玻片上放大觀 察。可將固定液和染色液加到玻片上的細胞上，用于保存標本以及用于有助于檢查。在一個實施方案中，身體樣品可源自于宮頸(包括試驗性宮頸涂片)、乳房、尿道 惡性瘤(對活檢組織樣品和尿細胞學涂片兩者進行試驗)、結腸、肺、膀胱、皮膚、喉、食管、 支氣管、淋巴結和血液惡性瘤的任一種，還可源自于血液和血清用于檢查轉移肉瘤和癌的 跡象。在一些實施方案中，本發明可另外用于評估宮頸腺上皮細胞的惡變前異常(腺上皮 內的瘤形成，GIN)或其他組織中的惡變前異常。在一些實施方案中，它可特別合適地用于在檢測新生物細胞或它們與顯示活性變 化的細胞的區別方面可能非常困難的其他臨床標本的細胞學或生物化學評估。這類標本包括 痰、支氣管肺泡灌洗液標本、尿和來自消化道(包括食道、胃和胰腺、膽管和胰管)的刷洗液。在一些實施方案中，本發明可應用于對組織進行組織學或生物學評估，這里對增 殖的評估可能能夠更準確地預測臨床結果，以及/或者更合理地選擇療法。標本可包括惡 性的腺細胞(如肺細胞、乳腺細胞、結腸細胞、前列腺細胞、胃細胞)、鱗狀上皮細胞(如肺細 胞、皮膚細胞、食管細胞)或其他上皮細胞類型(如膀胱細胞、輸尿管細胞、腎細胞、卵巢細 胞)。在一個實施方案中，對 Mcm2、Mcm3、Mcm4、Mcm5、Mcm6、Mcm7、孿蛋白、Aurora A 禾口 Aurora B以及它們的底物組蛋白H3的多參數分析可用于在體外或體內評估E0C的進展和 該腫瘤類型的細胞周期動力學。在第二方面中，本發明提供了一種將組織分為(i)正常型或者(ii)潛在的或實 際的前癌型或癌型、發育異常型或新生物型，所述方法包括確定針對一種生物標記物的特 異性結合成員對所述組織的樣品的結合，其中所述生物標記物選自DNA復制準許因子、 Aurora激酶、Ki67、孿蛋白、Polo樣激酶、H3S10ph和它們的結合物。在一個實施方案中，所述特異性結合成員可針對一種所述生物標記物的靶多肽。在一個實施方案中，可將所述結合的模式或程度與已知的正常樣品和/或已知的
11異常樣品進行比較。在一個實施方案中，確定一種生物標記物與另一種生物標記物的比例。“生物標記物”是在生物樣品中的表達水平與一個預定水平相比有變化的任何基 因或蛋白。預定水平可以是來自正常或健康受試者的生物樣品中的水平。本發明的生物標 記物對于異常增殖細胞或細胞生長異常是選擇性的。在本發明的另一個實施方案中，所述生物標記物是在生物樣品中其水平與一個預 定表達水平相比有變化的任何基因或蛋白。例如，在所述生物樣品中第一生物標記物的預 定值大于所述生物樣品中的所述第一生物標記物陽性細胞的20%、大于25%或者30%或 以上。在相關的方面中，在所述生物樣品中第二或第三生物標記物的預定值小于所述生 物樣品中的所述第二或第三生物標記物陽性細胞的20%、小于15%、小于10%或者7%或 以下。本發明的生物標記物包括基因和蛋白，以及它們的變體和片段。這類生物標記物 包括這樣的DNA，即該DNA含有編碼該生物標記物的核酸序列的全部或部分序列，或者含有 該序列的互補序列。所述生物標記物核酸還包括這樣的RNA，即該RNA包含任意目的核酸序 列的全部或部分序列。生物標記物蛋白由本發明的DNA生物標記物編碼或對應于本發明的 DNA生物標記物。生物標記物蛋白包含任意生物標記物蛋白或多肽的全部或部分氨基酸序 列。本發明基于這樣的意外發現，即通過對常規固定的外科活檢材料進行免疫表達作 譜而靶向如下的生物標記物可提供對這些腫瘤的細胞周期動力學的獨特認識調節G1-S 時相轉變的DNA復制準許通路的生物標記物(如Mcm2、Mcm3、Mcm4、Mcm5、Mcm6、Mcm7和孿 蛋白)與參與G2-M轉變的有絲分裂機制的生物標記物(如Aurora A及其底物H3)的組合。 在多參數分析中使用這些標記物組合，有可能確定腫瘤細胞是否從周期退出(即非增殖腫 瘤細胞)——對針對細胞周期的抗癌劑和輻射具有抗性的細胞群。而且，對于這那處于周期 中的腫瘤細胞(Mem 2-7陽性)，則可確定細胞周期進展的速度。表現出進展延遲并主要停留于G1的腫瘤可能顯示出對于靶向S和G2-M期的試劑 (表1)的反應較弱，因此應以靶向G1的試劑進行處理(腫瘤表型——Mcm2-7水平高，但 同時孿蛋白、Aurora A和H3S10ph水平低并且孿蛋白/Ki67比值趨向于0)。相反，表現出 細胞周期進展加快的腫瘤可能顯示出對于靶向S和G2/M的試劑(表1)反應良好(腫瘤表 型——Mcm2-7水平高、孿蛋白高、Aurora A高、H3S10ph高，并且孿蛋白/Ki67比值趨向于 1)。表現出細胞周期進展加快和高G2-M分數的腫瘤還可能顯示對輻射有最佳反應。特別 有用的是針對DNA復制準許通路的核心組分(Mcm2-7家族蛋白和孿蛋白)的結合分子以及 針對有絲分裂機制核心組分(Aurora A、Polo樣激酶1和H3S10ph)的結合分子。可將其他 生物標記物用作可對細胞周期進展的速率進行分析的該算法中的其他參數。使得可對細胞 周期進展的速率進行分析的生物標記物包括Ki67。在一個實施方案中，本發明提供了一種在常規處理的手術活檢材料中確定腫瘤群 的細胞周期動力學的方法。所述多參數算法使得可將活性周期細胞與抗細胞周期時相特異 性藥物和輻射的非增殖的周期外(非增殖)細胞區分開。多參數分析使得可確定精確的腫 瘤細胞周期動力學，并因此使得可以選出最適合治療該具體的患者的、靶向細胞周期時相的藥物(個性化的藥物)(表1)。該多參數分析除了作為潛在的有力預測試驗用于指導治 療干預之外，還可提供有力的預后工具，用于確定復發時間(無病存活期/無病期間)和死 亡時間(總存活期)。在第三方面中，本發明提供了一種在組織樣品中標記異常細胞的方法，所述方法 包括將所述樣品與一種針對一種靶多肽的特異性結合成員在如下條件下相接觸，其中所述 靶多肽選自DNA復制準許因子、Aurora激酶、Ki67、孿蛋白、Polo樣激酶、H3S10ph和它們 的結合物，所述條件即所述特異性結合成員可結合于異常增殖細胞但不結合正常細胞的條 件。可確定所述特異性結合成員是否結合于所述樣品，目的是確定異常增殖細胞在所 述樣品中的存在情況。在第四方面中，本發明提供了一種針對一種靶多肽的特異性結合成員的如下用 途，所述用途即在組織或組織樣品中確定、評估或診斷存在或不存在異常細胞增殖、細胞生 長異常、腫瘤細胞周期動力學、細胞周期時相分布、發育異常、新生物形成或者潛在的或實 際的前癌狀態或癌狀態。在一個實施方案中，所述靶多肽包括選自以下的兩種或多種標記物DNA復制準 許因子、Aurora激酶、Ki67、孿蛋白、Polo樣激酶、H3S10ph和它們的結合物。在每個細胞分裂周期過程中精確復制DNA對于基因組的穩定性而言是必需的，這 種精確復制通過嚴格調節的起始事件實現。DNA復制起始依賴于在有絲分裂晚期和早&期 過程中在復制起始點組裝復制前復合體。復制前復合體組裝涉及起點識別復合體(0RC)、 Cdc6、Cdtl和Mcm2-7與起始點的依次結合，并使得染色質“準許”在S期過程中進行DNA合 成。DNA復制準許因子如Mcm2-7蛋白水平的調節可提供控制人組織中的細胞增殖的有力 下游機制。Mcm2-7調節異常是多步驟腫瘤發生中的早期事件。對復制前復合體組裝的抑 制——其保證每個細胞周期起始點引發一次且僅一次——對于保持基因組完整性很關鍵。準許抑制物孿蛋白在S-G2-M期過程中以高水平表達，并通過其與Cdtl的相互作 用阻斷Mcm2-7再次加載于染色質上。在人體內細胞群中，孿蛋白缺失會導致因DNA過度復 制而使基因組極不穩定，這致使有非整倍體大核的細胞出現，這些細胞是侵襲性癌癥的形 態學/病理學標志。孿蛋白的失活也會造成中心體過量復制，這和G2-M檢查點機制失效一 塊導致了可促進染色體錯誤分離和非整倍性的多重有絲分裂缺陷。這些研究結果強調了孿 蛋白在細胞周期的多個階段保持基因組完整性中所起的關鍵作用。有絲分裂事件的嚴格控制對于成功完成姐妹染色單體分離和細胞分裂是必需的。 雖然CDK是進入有絲分裂的主調節物，但它們不是單獨發揮作用。Polo樣激酶1 (PLK1)、 Aurora A和Aurora B是另外三種控制關鍵有絲分裂事件亞組的蛋白激酶。有絲分裂過程 中的轉變依賴于蛋白激酶例如Polo樣激酶(PLK)和Aurora激酶。Aurora激酶是數個有絲 分裂階段的重要調節物，所述有絲分裂階段包括中心體成熟和分離、染色體定向和分離以 及胞質分裂。如孿蛋白一樣，Aurora激酶的內源水平以細胞周期依賴的方式被嚴格地調節，在 G1-S具有低水平，在G2-M過程中積聚并在有絲分裂結束時快速降解。腫瘤細胞周期動力學不僅會影響預后算法，而且對于預測對細胞周期時相特異性 藥物的反應也很重要(見上文)。本申請人已經證明，使用簡單的免疫組織學技術并直接應用于常規的手術活檢材料來分析細胞周期機制的關鍵組分可獲得對于體內存在的腫瘤細 胞周期動力學譜的詳細且獨特的認識。如上文所述，Mcm2、Mcm3、Mcm4、Mcm5、Mcm6禾口 Mcm7 (在本文中稱為 ‘‘Mcm2_7，，或 "Mcm2至7”)表達使得正在經歷細胞周期的細胞可以區別于停留于“周期外”狀態的細胞。 起始準許抑制物孿蛋白僅在S-G2-M期過程中可檢測到，有絲分裂激酶PLKl、Aur0ra A和B 也是如此。組蛋白H3是Aurora激酶的底物，僅在有絲分裂中被磷酸化。因此，磷酸組蛋白 H3(H3S10ph)是一種M期標記物。因此，對這些G1/S和G2/M調節物的多參數分析可就(常 規固定和處理的)手術活檢材料提供對細胞周期狀態詳細表征。例如，在絕經前期休眠乳 腺中，Mcm2-7高表達，但孿蛋白、Aurora A/B、PLK1和H3S1 Oph蛋白水平低，表明乳房腔上皮 細胞處于G1延長態或停滯態——一種還出現在惡變前損害和慢生長新生物中的表型。相 反，在快速生長的侵襲性腫瘤中，不但Mcm2-7的表達水平高，而且S-G2-M和M期標記物的 表達增加。該譜指示出，細胞周期進展加速似乎與腫瘤級別提高(更低的分化狀態)、基因 組不穩定性增加和存活率降低相關聯。因此，細胞周期生物標記物分析具有作為治療反應預測物的價值，尤其是對于細 胞周期時相特異性藥物的治療反應預測。例如，Aurora A和PLK1 (小分子抑制物的有效靶) 的表達水平在卵巢癌和乳腺癌中可顯著變化。這些腫瘤還顯示非常不同的細胞周期動力學 和細胞周期時相分布。呈現細胞周期進展加速以及這些靶蛋白高水平表達的腫瘤最有可能 表現出對基于這類機制的治療介入的最大反應。在異常增殖細胞或細胞生長異常中，對細胞周期動力學的分析還可用于監測對通 過激活檢查點通路影響細胞周期進展的藥物的反應。例如，在治療前和治療后的活檢材料 中對孿蛋白、Aurora A、PLKl、H3S10ph和gemini/Ki67的免疫表達分析可提供讀數，以鑒定 UCN-01的耐受劑量，然后可以將該耐受劑量用于使順鉬誘導的細胞周期停滯失效。在一些實施方案中，提供了利用抗體來檢測生物標記物多肽在來自個體的樣品中 的過表達的免疫細胞化學技術。在本發明的該方面中，使用至少一種抗目的特異性生物標 記物的抗體。過表達還可以通過基于核酸的技術檢測，所述技術包括例如雜交和RT-PCR。 還提供了包含用于實施本發明的方法的試劑盒。雖然本發明的方法需要在用于檢測疾病的患者樣品 檢測至少一種生物標記物， 但是在一些實施方案中，可使用2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種生物標記物來實施本發明。 對身體樣品中多于一種的生物標記物進行檢測被認為可用來鑒定疾病例。因此，在一些實 施方案中，使用兩種或多種生物標記物，更優選使用兩種或多種互補生物標記物。“互補”意 指，對身體樣品中的生物標記物組合進行檢測所成功實現的疾病識別的病例百分數大于僅 使用一種所述生物標記物能識別的病例百分數。因此，在一些病例中，使用至少兩種生物標 記物可更準確地確定疾病。因此，如果使用至少兩種生物標記物，那么可使用靶向不同生物標記物多肽的至 少兩種抗體來實施本文公開的免疫細胞化學方法。該抗體可同時地或共同地與身體樣品相 接觸。在一個實施方案中，根據第1-5方面中任一方面的方法可包括在所述樣品中檢 測另一靶多肽，其中所述靶多肽選自對G1/S期分界處或對S期特異的細胞周期調節基 因。這類基因包括但不限于，解旋酶(DDX11)、尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)、E2F5、細胞周期蛋白 El (CCNE1)、細胞周期蛋白 E2 (CCNE2)、CDC25A、CDC45L、CDC6、p21 WAF-1 (CDKN1A)、 CDKN3, E2F1、NPAT、PCNA、莖環 BP(SLBP)、BRCAU BRCA2, CCNG2, CDKN2C、二氫葉酸還原酶 (DHFR)、組蛋白HI、組蛋白H2A、組蛋白H2B、組蛋白H3、組蛋白H4、MSH2、NASP、核苷酸還 原酶Ml (RRM1)、核苷酸還原酶M2(RRM2)、胸苷合成酶(TYMS)、復制因子C4(RFC4)、RAD51、 染色質因子1A(CHAF1A)、染色質因子1B(CHAF1B)、拓撲異構酶III (T0P3A)、0RC1、引發酶 2A(PRIM2A)、CDC27、引發酶l(PRIMl)、側翼結構內切核酸酶(FEW)、范可尼貧血互補組 A(FNACA)、PKMYT1和復制蛋白A2 (RPA2)。其他S期目的基因包括細胞周期蛋白依賴性激酶 2 (CDK2)、DNA 聚合酶 I a (DNAP0L1)、DNA 連接酶 l、B_Myb、DNA 甲基轉移酶(DNA MET)、粒周 蛋白(pericentrin) (PER)、KIF4、DP_1、ID_3、RAN 結合蛋白(RANBP1)、間隙連接 a 6 (GJA6)、 氨基乙酰丙酸脫水酶(ALDH)、組蛋白2A Z(H2A. Z)、精胺合成酶(SpmS)、增殖蛋白2、T-淋 巴細胞活化蛋白、磷脂酶A2(PLA2)和L6抗原(L6)。在一些實施方案中，所述生物標記物包括由E2F轉錄因子誘導的基因。這類基因 包括但不限于，胸苷酸合成酶、胸苷激酶1、核苷酸還原酶Ml、核苷酸還原酶M2、CDK2、細胞 周期蛋白E、PCNA、DNA引發酶小亞基、拓撲異構酶II A(Topo2A)、DNA連接酶1、側翼內切核 酸酶1、RAD51、⑶C2、細胞周期蛋白A2、細胞周期蛋白B1、細胞周期蛋白B2、KIFC1、FIN16, BUB1、輸入蛋白 a-2(importina-2)、HMG2、zeste 增強子、STK-1、組蛋白莖環 BP、Rb、 P18-INK4C、膜聯蛋白VIII、c-Myb、CDC25A、細胞周期蛋白D3、細胞周期蛋白E1、脫氧胞嘧啶 激酶、DP-1、內皮縮血管肽轉化酶、烯醇化酶2、P18INK4C、核苷酸還原酶和尿嘧啶DNA糖基 化酶2。在具體實施方案中，目的生物標記物為由參與細胞周期調節和DNA復制的E2F轉錄 因子誘導的基因，例如細胞周期蛋白E2、p57KIP2、RANBPM和復制蛋白A1。一些所需的E2f 誘導基因參與細胞凋亡，包括APAFl、Bcl-2、胱天蛋白酶3(Caspase 3)、MAP3激酶5和TNF 受體相關因子。其他E2f誘導的基因可參與轉錄調節，包括例如ash2樣因子、polyhomeotic 2、胚胎外胚層蛋白、zeste增強子、多毛或斷裂增強子(hairy/enhancer of split)、同源 框A10、同源框A7、同源框A9、同源結構域TF1、前B細胞白血病FT3、YY1 TF、P0U結構域 TF、TAFII130、TBP 因子 172、堿性 TF3、布羅莫結構域 / 鋅指、SWI/SNF、ID4、TEA-4、NFATC1、 NFATC3、BT、CNC-1、MAF、MAFF、MAFG、核心結合蛋白、E74 樣因子 4、c_F0S、JUNB、鋅指 DNA BP 和Cbp/p300反式激活因子。參與信號轉導的E2F誘導基因也是可能的目的生物標記物， 包括TGF0、卵泡抑素(follistatin)、骨形態發生蛋白2、1A型BMP受體、卷曲同源物1、 WNT10B、鞘氨醇激酶1、雙特異性磷酸酶7、雙特異性(Y)磷酸酶、FGF受體3、蛋白酪氨酸磷 酸酶、雙特異性(Y)磷酸酶D6655、胰島素受體、成熟T細胞增殖1、FGF受體2、TGFa、⑶C42 效應物蛋白 3、Met、CD58、CD83、TACCl 和 TEAD4。如果基于根據本發明在組織樣品中檢測的異常將組織分為潛在的或實際的前癌 型或癌型，那么需要診斷的和/或臨床的合適追蹤現察。本發明還提供了一種用于確定對所診斷的病癥的治療進程的預測方法。因此，在第五方面中，本發明提供了一種預測癌癥的治療的反應或預測癌癥的疾 病進展的方法，所述方法包括在來自一個個體的身體樣品中確定存在或不存在異常增殖細 胞或細胞生長異常，所述方法包括在所述樣品中檢測一種靶多肽，其中所述靶多肽選自DNA 復制準許因子、Aurora激酶、Ki67、孿蛋白、Polo樣激酶、H3S10ph和它們的結合物。細胞生長異常包括前癌細胞或癌細胞，其他細胞增殖性疾病包括但不限于，銀屑
15病和炎性腸病如潰瘍性結腸炎和克羅恩病(Crohn' sdisease)。炎性腸疾病除本身為細胞增殖性疾病外，還可為癌狀態的前體(雖然不在所有患 者中)，因此本發明的方法對它們的檢測可用來提供有價值的結果以用于更密切的追蹤現 察中。在炎性腸疾病中，可能有結腸細胞和腸細胞脫落，使得可對大便樣品進行分析并從這 類樣品制備細胞。根據本發明的不同實施方案，可使用任意可用技術制備待與根據本發明的多個方 面的特異性結合成員相接觸的樣品，所述可用技術使特異性結合分子可與所述靶多肽結 合，并使得可確定核酸水平、酶活性等。各種技術是本領域中的標準技術，例如(對于諸如 結合靶多肽的抗體等分子)用于免疫組織化學中固定細胞的技術。可通過任何合適方法在對照樣品和試驗樣品中進行特異性結合成員如抗體的檢 測。一種可能是以個體報告物分子加標簽。所述報告物分子可直接地或間接地產生可檢測 的——優選可測量的——信號。報告分子的連接可以是直接的或間接的，共價的(如肽鍵) 或非共價的。肽鍵連接可以為編碼結合分子(如抗體)和報告分子的基因融合物的重組表 達產物。一個有利的模型是將每個結合成員與具有光譜孤立吸收或發射特征的個體熒光 染料、磷光體或激光染料共價連接。合適的熒光染料包括熒光素、羅丹明、藻紅蛋白和德克 薩斯紅。合適的發色染料包括二氨基聯苯胺。其他報告物包括大分子膠體顆粒或微粒材料，例如有色、磁性或順磁的膠乳珠，以 及可直接或間接產生可肉眼觀察、電子檢測或其他方式記錄的可檢測信號的生物活性劑或 化學活性劑。例如，這些分子可以是催化形成顏色或改變顏色或者引起電性質變化的反應 的酶。它們可以是分子可激發的，使得在能量態之間的電子轉移可產生特征性的光譜吸收 或發射。它們可包含用于連接生物傳感器的化學實體。可應用生物素/親和素或者生物素 /鏈親和素以及堿性磷酸酶檢測系統。其他的實例有辣根過氧化物酶和化學發光。特異性結合分子可在試劑盒中提供，所述試劑盒可包含用于根據本發明的用途的 說明書。這類試劑盒作為本發明的另一方面提供。可包含一種或多種其他試劑，例如標記 分子。試劑可提供于避免試劑接觸外部環境的容器如密封的玻璃瓶中。試劑盒可包含一種 或多種用于提供試驗樣品本身的物品，其取決于目的組織，例如用于從口腔取細胞的拭子、 用于取血樣的注射器、用于取宮頸涂片的匙狀片、活檢槍等(這類組件通常是無菌的)。試劑盒可包含以下物質的任何組合或全部物質減少非特異性染色的封閉劑、用 于在保存過程中保持結合分子活性的保存緩沖物、在抗體染色過程中使用的染色緩沖物和 /或洗滌緩沖物、陽性對照物、陰性對照物等。陽性和陰性對照物可用于驗證根據本發明應 用的試劑的活性和正確用途，它們可提供于試劑盒中。對照物可包括對于靶的存在已知呈 陽性或陰性的樣品，如組織切片、固定于蓋玻片上的細胞等，所述靶例如為本文描述的一種 或多種生物標記物。對照物的設計和使用是標準的，并且在本領域普通技術人員的常規能 力范圍內。可使用任何便利的手段和技術從身體取出樣品。匙狀片或拭子可用于取內皮細 胞，例如從宮頸或口腔取。血液和其他流體樣品可使用注射器或針取。其他組織樣品可通 過活檢或組織切片取。在第六方面中，本發明提供了一種監測對治療藥物開發研究的反應的方法，所述方法包括在身體樣品中檢測一種生物標記物，其中所述生物標記物選自DNA復制準許因 子、Aurora激酶、Ki67、孿蛋白、Polo樣激酶、H3S10ph和它們的結合物，評估所述生物標 記物的表達，以確定在所述樣品中存在或不存在異常細胞增殖、細胞生長異常、腫瘤細胞周 期動力學、細胞周期時相分布、發育異常、新生物形成或者潛在的或實際的前癌狀態或癌狀 態。在一個實施方案中，所述藥物開發研究為臨床前藥物開發研究。在一個實施方案中，所述藥物開發研究為臨床前藥物開發研究。在一些實施方案中，所述臨床前藥物開發研究為體內異種移植腫瘤模型。在第七方面中，本發明提供了一種在受試者中確定癌癥進展的預后的方法，所述 方法包括步驟(a)在來自所述受試者的生物樣品中評估選自Mcm2-7中的至少一種的第一生物 標記物的水平；以及(b)在來自所述受試者的生物樣品中評估選自孿蛋白、Aurora A、Plkl、Ki67和 H3S10ph中的至少一種的第二生物標記物的水平，其中將所述第一生物標記物相對于一個預定值的水平變化與所述述第二生物標 記物相對于一個預定值的水平變化相結合來指示所述受試者中的癌癥進展。在一個相關的實施方案中，所述確定癌癥進展預后的方法還包括，在來自所述受 試者的生物樣品中評估選自孿蛋白、Aurora A、Plkl、Ki67和H3S10ph中的至少一種的第三 生物標記物的水平，其中所述第二和第三生物標記物不相同。在又一實施方案中，如果所述第一生物標記物的水平低于預定值并且所述第二生 物標記物的水平低于預定值，那么所述受試者的預后被指示為癌癥進展的可能性降低。在一個相關實施方案中，如果所述第一生物標記物的水平低于預定值并且所述第 二生物標記物的水平低于預定值，那么所述受試者的預后被指示為5年存活率大于80%、 85%或 89%。在另一實施方案中，如果所述第一生物標記物的水平高于預定值并且所述第二生 物標記物的水平低于預定值，那么所述受試者的預后被指示為癌癥進展的可能性降低。在一個相關實施方案中，如果所述第一生物標記物的水平高于預定值并且所述第 二生物標記物的水平低于預定值，那么所述受試者的預后被指示為5年存活率大于80%、 85%或 87%。在又一實施方案中，如果所述第一生物標記物的水平高于預定值并且所述第二生 物標記物的水平高于預定值，那么所述受試者的預后被指示為癌癥進展的可能性升高。在一個相關實施方案中，如果所述第一生物標記物的水平高于預定值并且所述第 二生物標記物的水平高于預定值，那么所述受試者的預后被指示為5年存活率小于70%、 60%或 56%。可使用本領域技術人員已知的任意方法測量本發明的生物標記物的水平。在一個 方面中，可以使用免疫測定方法測量生物標記物水平，所述免疫測定方法例如但不限于，點 印跡、狹線印跡、RIA、微陣列和ELISA。在另一方面中，可以使用基于分子生物學的測定方 法測量生物標記物水平，所述基于分子生物學的測定方法例如但不限于，RNA印跡分析、DNA 印跡分析、蛋白質印跡分析、RT_PCR、PCR、基于核酸序列的擴增測定(NASBA)、轉錄介導的擴
17增(TMA)或計算機化的檢測矩陣。需重點指出的是，所述第一、第二、第三或之后的生物標記物的水平的測量順序不 是重要的。例如，可同時地測量所有生物標記物。或者，對第二、第三或之后的生物標記物 的評估可早于對第一生物標記物的水平。在第八方面中，本發明提供了一種為患有癌癥的受試者確定治療方案的方法，所 述方法包括步驟(a)在來自所述受試者的生物樣品中評估選自Mcm2-7中的至少一種的第一生物 標記物的水平；以及(b)在來自所述受試者的生物樣品中評估選自孿蛋白、Aurora A、PlkU Ki67和 H3S10ph中的至少一種的第二生物標記物的水平，其中將所述第一生物標記物相對于一個預定值的水平變化與所述第二生物標記 物相對于一個預定值的水平變化相結合來指示為所述受試者制定的治療方案。在一個相關實施方案中，所述為受試者確定治療方案的方法還包括，在來自所述 受試者的生物樣品中評估選自孿蛋白、Aurora A、Plkl、Ki67和H3S10ph中的至少一種的第 三生物標記物的水平，其中所述第二和第三生物標記物不相同。在又一實施方案中，如果所述第一生物標記物的水平低于預定值并且所述第二生 物標記物的水平低于預定值，那么所述治療方案選自以下的一項或多項(a)監測；以及(b)以非細胞周期特異性化學治療劑進行治療。在另一實施方案中，如果所述第一生物標記物的水平高于預定值并且所述第二生 物標記物的水平低于預定值，那么所述治療方案選自以下的一項或多項(a)監測；(b)以Gl或非細胞周期特異性試劑進行治療；以及(c)以非S和G2/M細胞周期特異性化學治療劑進行治療。在再一實施方案中，如果所述第一生物標記物的水平高于預定值并且所述第二生 物標記物的水平高于預定值，那么所述治療方案選自以下的一項或多項(a)手術；以及(b)以S和G2/M細胞周期特異性化學治療劑進行治療。非細胞周期化學治療劑包括但不限于，絲裂霉素C(MMC)、1_ (4-氨基_2_甲基嘧 啶-5-基)_甲基-3-(2-氯乙基)3_亞硝基脲鹽酸鹽(ACNU)、氮芥(HN2)、順鉬、4-氫過氧 環磷酰胺、夫拉平度(Flavopiridol)。S期細胞周期藥劑包括但不限于，5-氟尿嘧啶、羥基脲、甲氨蝶呤、表柔比星、依托 泊苷、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、5-氟脫氧尿苷、阿糖胞苷、吉西他濱、克拉屈濱、硫鳥嘌呤、氟 達拉濱、羥基脲、拓撲異構酶I抑制劑(伊立替康，托泊替康)、拓撲異構酶II抑制劑(依托 泊苷、替尼泊苷、蒽環類、表柔比星)。Gl細胞周期藥劑包括但不限于，門冬酰胺酶、潑尼松龍。G2/M細胞周期試劑包括但不限于，依托泊苷、順鉬、星狀孢子素、ZM447439、長春堿 類(長春地辛、長春瑞濱(vinelobrine)、長春新堿、長春堿)、紫杉烷類(紫杉醇、多西他 賽)、博來霉素、星狀孢子素、ZM447439 (Aurora激酶A和B抑制劑)、BI2536 (Polo樣激酶I抑制劑)。M細胞周期試劑包括但不限于，多西他賽、BI 2536。在細胞周期多個步驟中起作用的藥劑包括但不限于夫拉平度。雖然本發明已通過其具體實施方案加以描述，但應理解能夠作出進一步修改。本 申請意欲涵蓋如下這樣的本發明的任意變體、用途或改變，即它們遵循本發明一般原理并 包含在本發明所述領域的已知技術或常規技術范圍內且可適用于前文所述實質特征的相 對本文公開內容的偏離方案。因為可以在不背離本發明的實質特征的主旨的情況下以多種方式實施本發明，所 以應理解的是，除非另外指出，否則上述的實施方案不是對本發明進行限制，而應在隨附權 利要求書中定義的本發明的主旨和范圍內進行寬泛地解釋。多種修改和等同方案意欲被包 括在本發明的主旨和范圍內以及隨附的權利要求書中。“含有/包括”在用于本說明書中時用于敘述存在所述特征、整數、步驟或組分，但 不排除存在或加入一種或多種其他特征、整數、步驟、組分或它們的組。實施例實施例1 :DNA復制準許因子和有絲分裂激酶在乳腺癌中的增殖狀態表征及與臨 床后果的關聯。研究組從英國倫敦UCL Hospitals外科擁有的乳腺癌數據庫中鑒定了 182名確診患浸潤 性乳腺癌的患者。對于研究的所有患者進行常規的手術后臨床評估，并用于橫斷面分析。10 人未能進行追蹤現察，5人癌癥復發，其中2人死于乳腺癌。167名患者用于存活和復發情 況的預期分析，其中24人(14% )在研究時間內死于癌癥，12人死于其他無關的原因，131 人在最后追蹤現察時仍存活。有40 (24%)例復發事件，包含癌癥復發和因癌癥死亡。追蹤 現察期的中值為47個月(范圍1_92個月)。復發患者的平均復發時間是26個月(標準 差(SD) = 15個月，范圍2-55個月)。未復發患者的平均追蹤現察時間為52個月(SD = 20個月，范圍2-92個月)。死亡患者的平均存活時間為21個月(SD = 12個月，范圍4_44 個月)。未死亡患者的平均追蹤現察時間為50個月(SD = 21個月，范圍1-92個月)。從 包括所有3個組織學分級(1-3)的病理檔案取出來自這些患者的福爾馬林固定的石蠟包埋 外科乳腺組織，所述組織學分級由Nottingham改良的Bloom和Richardson方法確定。可 獲取所有病例的組織學報告和載玻片。這些包括142例浸潤性導管癌、26小葉型、4例粘蛋 白型、1例微乳頭狀型和9例混合型。記錄的參數包括組織級別、腫瘤大小、腫瘤類型、淋巴 結狀態、淋巴管浸潤(LVI)、年齡和NPI。我們還研究了來自以下人員的正常乳腺組織的隨 機選擇案例21名進行過乳房復位成形術的絕經前女性。地方研究倫理委員會對該研究的 批準獲自聯合的UCL/UCLH人類研究倫理委員會。抗體如(Wharton SB,Hibberd S,Eward KL，et al. Br J Cancer2004 ；91 262~9)所述 生成人類孿蛋白的兔多克隆抗體。Ki67 MAb(克隆MIB-1)獲自DAK0(Glostrup，丹麥)，Mcm2 MAb (克隆 46)獲自 BD Transduction Laboratories (Lexington, KY)，雌二醇受體 α (ER) MAb (克隆 ID5)和孕酮受體 MAb (克隆 PgR 636)獲自 DAK0，AuroraA MAb NCL-L-AK2 (克隆 JLM28)獲自 Novocastra Laboratories (Newcastle, UK)，Polo 樣激酶 1 (PLKl)MAb (克隆35-206)，第 10 位絲氨酸磷酸化的組蛋白 H3(H3S10ph)PAb 獲自 Upstate (LakePlacid，NY)。細胞培養將人MCF-7乳腺上皮腺癌細胞(ATCC HTB-22)培養于添加有2mM谷氨酰胺、非 必需氨基酸、10 % FCS、100U/ml 青霉素和 0. lmg/ml 鏈霉素的 EMEM (Gibco-BRL，Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中。制備蛋白提取物和免疫印跡以胰蛋白酶進行處理收獲MCF7細胞，將其以PBS洗滌并以2 X IO7細胞/ml懸浮于 裂解緩沖液(50mM Tris-Cl pH 7. 5,150mM NaCl,20mM EDTA,0. 5% NP40)中。將裂解物在 冰上孵育30分鐘，之后通過離心(13，000g, 15min,4°C )使之澄清。將裂解物通過4-20% SDS-PAGE[75 μ g 蛋白 / 孑L ]分離，并如(Stoeber et al. J Cell Sci，114 :2027_41，2001) 所述進行免疫印跡。使用如下條件進行阻斷、抗體孵育和洗滌步驟對于Mcm2、Aurora A 和PLKl，PBS/0. 吐溫20/5%乳；對于孿蛋白，PBS/1 %吐溫20/10 %乳；對于H3S10ph， PBS/5%乳。免疫組織化學在初次診斷得到的檔案記錄的福爾馬林固定的石蠟包埋組織(PWET)獲自所 有患者，對于每個標本選擇包含代表性浸潤腫瘤樣品的一個標本塊。將3μπι切片切于 Superfrost Plus載玻片(VisionsBiosystems，UK)上，在二甲苯中脫蠟，并按乙醇至水的 梯度進行復水。將組織切片在PH 6.0的0. IM檸檬酸緩沖液中壓煮2分鐘，并使用Bond Polymer Refine Detection試劑盒和BoncT-Max 自動系統(Vi sion Biosystems,Newcastle Upon Tyne，UK)免疫染色。以如下稀釋度應用一抗Ki67 (1/300)、Mcm2 (1/2000)、孿蛋白 (1/600)、ER (1/200)、PR (1/200)、Aurora A (1/70)、PLKl (1/1000)、H3S10ph (1/300)。依照 制造商的說明書，使用DAKO Here印Test (DAKO)進行HER-2免疫染色。用Pertex封固劑 (Cell Path Ltd, NewtownPowys, UK)加蓋蓋玻片。將無一抗的孵育用作陰性對照，將結腸 上皮切片作為陽性對照。蛋白表達譜分析通過如(Shetty et al. Br J Cancer 93 1295—300，2005，Dudderidge etal. Clin Cancer Res 11 =2510-7,2005)所述在每種腫瘤中確定標記物的標記指數(Li)進行蛋白表 達分析。在低倍放大率(100X)下評估載玻片來識別具有最高染色強度的腫瘤區域。從這 些選擇的區域中，以電荷耦合器件照相機(charged coupled device camera)和分析軟件 (SIS, Munster, Germany)在400X放大率捕獲3_5個視野。隨后打印圖像用于定量分析， 該分析在觀察者不知道臨床病理變量的情況下進行。將該視野內的陽性和陰性細胞計數， 并將間質細胞或炎癥細胞排除。識別陽性細胞的標準取決于生物標記物對于Ki67、Mcm2、 孿蛋白、ER、I3R和H3S10ph，具有任何程度的核染色的細胞被記錄為陽性；對于Aurora A 和PLK1，具有任何程度的核染色或細胞質染色的細胞被記錄為陽性(Gritsko et al. Clin Cancer Res 9 1420-6，2003)。對每個試驗例計數了最少的500個細胞。使用下式計算LI LI =陽性細胞數目/總細胞數目X100。為了評估HER-2蛋白過表達，依照DAKO推薦的 FDA認可的評分體系評估膜染色。DNA圖像細胞計數對于每個試驗例，將獲自如IHC所評估的同一標本塊的一個40μπι的PWET切片用于如(Sudbo et al.N Engl J Med 344 1270-8,2001. Haroske et al. Anal Cell Pathol 1998 ;17 :189-200，1997)所述制備胞核。如(Sudbo et al. 2001，見上文)所述， 將 Fairfield DNA Ploidy System (Fairfield Imaging Ltd, Nottingham, UK)用于圖像處 理、分析和分類。淋巴細胞和漿細胞作為內部對照被包括在內，高級別的膀胱腫瘤和正常結 腸組織的40 μ m切片分別作為非整倍體群和二倍體群的外部對照。依照公開的標準(Sudbo et al. 2001，見上文，Haroske 1998，見上文)對直方圖進行分類。直方圖由兩名獨立評估 員進行分類，他們在不知道臨床病理變量的情況下具有高度一致性。為了進行統計分析，將 四倍體腫瘤和多倍體腫瘤與非整倍體腫瘤成組。統計分析以中值和四分位數間距概括生物標記物。將Marm-Whitney U檢驗用于將每個 標記物與淋巴結階段、倍性狀態和相對于正常樣品的第3階段進行比較。將趨勢分析 Jonckheere-Terpstra非參數檢驗用于將標記物與階段和Her2狀態比較。將Spearman秩 相關系數用于評估標記物和NPI之間的關聯。將通過與1維自由度的線性關聯的線性分析 Χ 2檢驗用于測試Her2和倍性狀態之間的關聯。依照倍性狀態將非配對t檢驗用于比較平 均 NPI。將線性回歸用于評估Her2的平均NPI趨勢。將Cox回歸用于分析癌癥復發和癌 癥死亡，以提供風險比并評估對標記物的預測，在對NPI調整的單變量模型和多變量模型 中在中值處分成兩類。將Kaplan-Meier作圖用于顯示忽略NPI類且按NPI類分層的標記 物的估計預測效應。所有分析涉及雙側檢驗，結果使用95%的置信區間概括并使用SPSS軟 件(版本12. 0. 1)評估為5%的統計顯著性水平。結果驗證生物標記物多參數分析及其生物學含義通過以下方式在來自非同步MCF7細胞的總細胞提取物中確認抗Mcm2、孿蛋白、 Aurora A、Plkl和H3S10ph的抗體的單特異性檢測具有與相應人抗原的報道電泳遷移率 一致的分子量的單一蛋白(圖5A)。在對HeLa S3細胞和SK-OV 3卵巢癌細胞中的該生物 標記物組的獨立研究中，我們已經證明Mcm2水平在經過細胞周期過程中不顯著變化，而孿 蛋白表達局限于S-G2-M。Aurora A和PLKl水平在Gl過程中可忽略，在S期升高并在G2/ M過程中達到峰值，降解發生在從有絲分裂停滯解除后2-4小時。H3S10ph的存在局限于有 絲分裂，這就強化了將它用作有絲分裂標記物的合理性。由于增殖標記物Ki67存在于增殖 細胞的整個細胞周期中，可以將S-G2-M期或M期標記物與Ki67的比值(如孿蛋白/Ki67、 Aurora Α/Κ 67或H3S10ph/Ki67)用作Gl期相對時長的指示物，從而作為細胞周期進展速 率的指示物。值得注意的是，孿蛋白表達增加局限于S-G2-M，甚至在侵襲性腫瘤中也是如 此。首先在乳房復位成形術后的正常乳腺標本(η = 21)中研究這些細胞周期標記物 的蛋白表達分析。高水平的Mcm2表達出現于終末導管小葉單位(TDLU)的上皮細胞，表明 這些細胞處于“細胞周期內”狀態(中值33. 5% )0然而，Mcm2表達的水平較高，Κ 67以 低水平表達(中值2. 8% )。值得注意的是，孿蛋白、Aurora A、PLK1 (S-G2-M期標記物)和 H3S10ph(M期標記物)僅在TDLU的很小部分的細胞(< 1%)中表達，表明細胞周期進展的 阻斷。總之，該細胞周期表型與Gl停滯狀態是一致的。相反，浸潤性乳腺癌顯示出預示細胞周期進展的高水平的生物標記物表達(圖5B)。當將侵襲性3級腫瘤與正常相比，Ki67、 Mcm2、孿蛋白、Aurora A、Plkl和H3S10ph的蛋白表達水平有顯著升高(中值Mcm2[33. 5v 92. 3%,ρ < 0. 001],Ki67[2. 8v 40. 2%，p < 0· 001]，孿蛋白
, Aurora A
, PLKl
以及 H3S10ph
)。該升高與Mcm2/Ki67比值的顯著增大相關聯(中值9. 3v 1. 71%,p<0. 001)。 Mcm2/Ki67值的減小可反映了從準許的非增殖Gl停滯狀態向活性的增殖狀態的轉變，并且 與預示細胞周期進展的S-G2-M標記物的表達相關聯。生物標記物、腫瘤DNA倍性狀態和臨床病理參數之間的關系該研究的臨床病理特征總結于表2中。首先，我們檢查了細胞周期生物標記物表 達和腫瘤分化狀態之間的關系。所有6種生物標記物的表達水平都與腫瘤分級強相關(表 3)，然而生物標記物水平的分布在不同級別之間有一些重疊(如Aurora A和PLKl水平， 圖6)。這些數據不但顯示處于腫瘤間變增加的周期中的細胞比例增大，而且表明所述生物 標記物沒有將處于每個級別的所有患者的級別完全區分開。與這些發現一致的是，發現了 腫瘤級別和倍性狀態之間的高顯著相關性(P < 0. 001)。孿蛋白/Ki67、Aurora A/Ki67、 Aurora Β/Κ 67和H3S10ph/Ki67的比值隨級別增加未顯示顯著變化，表明在高級別腫瘤中 分化停滯與細胞周期進展加速無關(表3)。這顯著不同于我們在卵巢癌中的發現，其中隨 腫瘤間變增加出現了細胞周期進展速度加快(孿蛋白/Ki67 :p < 0. 007,Aurora Α/Κ 67 :p
<0. 0002，H3S10ph/Ki67 :p < 0. 0002)。相反，并且與我們在其他癌癥類型中的發現一致 的是，Mcm2/Ki67比值隨腫瘤級別增加而減小，這反映了高度分化腫瘤中DNA復制準許的、 但非增殖的細胞向低度分化腫瘤中活性循環細胞的比例轉變(表3)。孿蛋白表達與腫瘤間 變和基因組不穩定性增加之間的正相關性可表明，該起點準許抑制物在乳腺癌中似乎不發 揮腫瘤抑制物的作用。這已在其他腫瘤類型中發現，例如在外周B細胞淋巴瘤和卵巢癌中， 其中孿蛋白表達細胞的數目與細胞增殖指數成比例。為了研究生物標記物和基因組不穩定性之間的關系，我們將它們的表達譜與腫瘤 DNA含量相關聯(表4)。基因組不穩定性和包括以下所示在內的所有細胞周期生物標記 物的表達水平之間具有顯著高的相關性:Ki67(p <0. 001)、Mcm2(p = 0.009)、孿蛋白(ρ
<0. 001) ,AuroraA (ρ < 0. 001) ,PLKl (ρ = 0. 002)以及 H3S10ph (ρ < 0. 001)。Mcm2/Ki67 比值也顯著減小(ρ = 0.004)。總之，這些數據表明，非整倍體腫瘤中活性周期細胞的比例 高于二倍體腫瘤。有趣的是，如在這些腫瘤的分化狀態的情況一樣，在非整倍體腫瘤中也沒 有細胞周期進展加速的證據，這不同于我們在卵巢癌中的發現，即其中多個細胞周期生物 標記物/Ki67比值增大。在Ki67、Mcm2、孿蛋白、Aurora A、PLKl表達和淋巴結轉移之間沒有發現顯著關聯 (表 5)。發現了，與 H3S10ph 表達弱關聯(ρ = 0. 02)。與 ER (ρ = 0. 007)和 PR (ρ = 0. 005) 表達有強的逆相關。這不同于我們在卵巢中的發現，即在卵巢中Aurora A(p = 0.006)、 H3S10ph (ρ = 0. 002) ,Aurora A/Ki67(p = 0. 003)、H3S10ph/Ki67 (ρ = 0. 005)和腫瘤分級 之間出現顯著相關性，反映了 Aurora A調節異常在早期上皮卵巢腫瘤發生和發展成為晚期 疾病中的作用。Ki67、Mcm2、孿蛋白、Aurora A、PLK1、H3S10ph的表達水平顯示了與NPI值 增大的強正相關，ER和I3R顯示了與NPI值增大的負相關(表6)。Mcm2/Ki67比值也有顯 著減小，表示隨NPI值增大，準許非增殖狀態轉變成活性增殖狀態。細胞周期生物標記物表達與Her2狀態不顯著相關，但與I3R表達有強逆相關(ρ < 0. 001)(表7)。在NPI值增大和 Her2過表達之間也有關聯，并且觀察到非整倍性和NPI值增大之間有弱相關性(表8)。弱 相關還出現于Her2值增大和非整倍性之間(x 2檢驗=3. 03，ρ = 0. 082)。生物標記物、腫瘤DNA倍性狀態和患者結局的關系單變量分析在本患者組中，NPI值是乳腺癌復發和死亡的強預測指標，其具有每單位NPI值 2倍以下增大(HR= 1.81 [1.47-2. 23]，ρ < 0. 001)的復發風險，每單位NPI值2倍以上 增大的死亡風險(HR = 2. 15 [1. 61-2. 88]，ρ < 0. 001)。患者年齡不是預測性因素(表9) (圖7Α)。Ki67、Mcm2、孿蛋白、Aurora A、PLKl和H3S10ph被鑒定為乳腺癌復發的強預測 物(分別有 HR = 2. 77 [1. 44-5. 30]，ρ = 0. 002 ；HR = 3 [1. 56-5. 76]，ρ < 0. 001 ；HR = 3. 93 [1. 98-7. 80], ρ < 0. 001 ； HR = 3. 31 [1. 67-6. 57], ρ < 0. 001 ； HR = 4. 48 [2. 21-9. 09]， ρ < 0. 001 ；HR = 3. 49[1. 76-6. 92]，ρ < 0. 001)(圖 7Β 和 7C)。這些關聯還出現于存活 者中，但由于在該組中較少的事件數目關聯性沒那么強(Mcm2 =HR = 2. 32
, ρ =0. 05 ；孿蛋白HR = 2. 43 [1. 04-5. 68]，ρ = 0. 04 ；Aurora A :HR = 2. 18
， ρ = 0. 07 ； PLKl :HR = 3. 46 [1· 37-8. 71], ρ = 0. 009 ；H3S10ph :HR = 3. 29 [1. 31-8. 30]， P = 0.01)。較低的復發風險出現在二倍體組中，但不顯著(HR = 0. 62
，ρ =0. 14)。在Her2表達增加組中復發或死亡的風險有顯著增大的趨勢(分別有HR =
1.44[1. 13-1. 83]，ρ = 0. 003 禾口 HR= 1. 40[1. 02-1. 94]，ρ = 0. 04)。優于和超過NPI的生物標記物預測值多變量分析表明，這些細胞周期生物標記物的效應甚至在對NPI調整后對癌癥復 發仍具有是統計學顯著和預測性。Ki67、Mcm2、孿蛋白、Aurora A、PLK1和H3S10ph被鑒定為 優于和超過NPI的乳腺癌強獨立預測物(分別有HR = 2. 13 [1. 08-4. 23]，ρ = 0. 03 ；HR =
2.22[1· 12-4. 41], ρ = 0. 02 ； HR = 2. 64[1· 27-5. 49]，ρ = 0. 01 ； HR = 2. 82[1· 37-5. 80], ρ = 0. 005 ；HR = 3. 31 [1. 57-6. 97]，ρ = 0. 002 ；HR = 2. 07 [1. 02-4. 20]，ρ = 0. 04)(圖 8 和9)。雖然使用一種細胞周期生物標記物來預測復發是有價值的，但包含兩種或多種標記 物沒有獲得更大的價值。這部分是因為在標記物和臨床病理變量之間有關聯。有趣的是， 有絲分裂激酶AuroraA和PLKl被鑒定為乳腺癌復發的最強有力的獨立預測物。細胞周期表型、臨床病理變量和患者結果之間的關系我們發現，細胞周期相特異性生物標記物各自都是乳腺癌中有力的獨立預后標記 物。這產生了這樣的問題，即腫瘤的細胞周期動力學或細胞周期表型是否還有可能對該具 體腫瘤類型的病理生物學有影響。我們在以前的DNA復制體外測定中已證明，Mcm2-7準 許因子——DNA解旋酶的組分——的下調是一種如下所述的遍在的下游機制，即在以下情 形時細胞的增殖能力通過該機制降低細胞離開細胞分裂周期進入周期狀態之外的靜止期 (GO)、分化態或衰老態(ffilliamsand Stoeber, Curr Opin Cell Biol 19 :672_679，2007 ； Blow and Hodgson, Trends Cell Biol 12 72-78,2002 ；Stoeber et al. , EMBO J 17: 7219-7229,1998 ；Stoeber et al.，J Cell Sci 114 :2027_2041，2001 ；Kingsbury et al.， Exp Cell Res 309 56-67,2005 ；Barkley et al. , Exp Cell Res313 :3789_3799，2007)。 為了確定細胞周期表型，我們為Mcm2蛋白表達選擇了一個30%的割點以確定一個組(Mcm2 < 30%，表型I )，在該組中大多數的腫瘤細胞處于周期狀態之外(圖13，圖14)。該組(表
23型I )占所有腫瘤的18%，具有低于7%的孿蛋白水平。這一點與我們的體外測定和自我更 新組織的結果一致，即在細胞進入靜止期(GO)和周期狀態外分化態時孿蛋白也被嚴格地 下調(Williams and Stoeber，2007，見上文；Eward et al.，J Cell Sci 117 :5875_5886， 2004 ；Kingsburyet al.，2005，見上文；Barkley et al.，2007，見上文)(圖 4，表 1)。相反， 大多數癌癥的Mcm2表達水平高于30% (Mcm2 >30% )，其中大多數的腫瘤細胞處于周期內 狀態(Williams and Stoeber，2007，見上文)(圖13，圖14，表15)。58%的這些腫瘤(表 型III)顯示出孿蛋白水平高于7%指示的活性細胞周期進展，割點7%由周期外狀態的標記 指數定義(圖14，表15)。值得注意的是，許多乳腺癌(表型II )——占所有腫瘤24%—— 呈現周期內表型(Mcm2 >30% )，但孿蛋白表達水平低于7%，其預示Gl延遲或停滯的狀態 (Williams and Stoeber, 2007，見上文；Stoeber et al.，2001，見上文；Blow and Hodgson, 2002，見上文；Shetty et al. , Br J Cancer 93 1295-1300,2005 ；Dudderidge et al.， ClinCancer Res 11 25110-2517, 2005 ；Gonzalez et al.，J Pathol 204 121-130，2004) (圖14，表15)。重要的是，其他S-G2-M生物標記物在三組之間的分布完全反映了孿蛋白的 觀察結果，這進一步加強了 3種不同細胞周期表型的分離(圖14)。我們接著研究了細胞周期表型是否影響體內表現及其與包括NPI在內的臨床病 理變量的相關性。值得注意的是，與年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移、ER/ra或Her-2受體狀態 無關。然而，呈現分化停滯的更大比例的3級腫瘤顯示出活性周期表型。該細胞周期譜還 與較高NPI值相關(ρ < 0. 001)(表15)。對NPI調整的單變量和多變量分析還證明，該細 胞周期表型是無疾病存活者的強預測物。在單變量和多變量分析中，活性周期表型(表型 III)都顯示了大大高于表型I和II的復發風險，分別有HR = 3. 90 (1. 81-8. 40)、p < 0. 001 和HR = 2. 71 (1. 81-6. 23)、p = 0. 019 (圖15)。引人注意的是，在高度分化的周期外腫瘤和 呈現Gl延遲/停滯表型的高級別腫瘤(表型I和II ) (HR = 1. 00
,ρ = 0. 99 ； 圖15)中出現幾乎相同的低復發風險。值得注意的是，顯著的強相關出現在乳腺癌亞型和 細胞周期表型之間(P <0.001)。與管腔亞型(49%，71/145)相比，具有活性周期表型(表 型III)的患者比例在Her-2 (91%，10/11) (ρ = 0.003)和三重陰性亞型(96%, 25/26) (ρ < 0. 001)中顯著更高(圖16)。然而，呈現周期外表型(表型I )和Gl延遲/停滯表型 (表型II )的激素受體陰性腫瘤的比例僅分別為4% (1/26)和9% (1/11)，該比例在管腔 亞型中為51% (74/145)，其中21% (30/145)呈現表型I ,30% (44/145)呈現表型II (圖 16)。討論通過全基因組廣泛分析對控制如增殖、分化、凋亡和DNA損傷反應這類過程的復 雜且冗余的通路的分析正證明了其作為乳腺癌的預后工具的局限性(Dimkler et al. Eur J Cancer, 43 :745_751，2007)。我們在本文中聚焦于高度演化的保守細胞周期機制，該機制位 于影響細胞周期進展的復雜信號傳遞通路的下游，因此可以看作是通過該通路的信息轉導 的整合點。我們已經證明，這種新型的多參數細胞周期分析不僅可提供對腫瘤的細胞周期 動力學的新認識，而且在包括前列腺癌、腎癌和卵巢癌的一系列腫瘤類型中有重要的預后
眉、ο我們對DNA復制準許因子和有絲分裂調節物的分析可進一步表征絕經期前乳腺 組織中的異常細胞周期狀態。雖然由標準增殖標記物Ki67鑒定的生長部分較小，但TDLU中的大量乳房上皮細胞表達Mcm2，這表明大量細胞似乎被準許并因此“在周期內”。然而， 這些細胞不能表達細胞周期進展的標記物，包括S-G2-M標記物孿蛋白、Aurora A、PLKl和 有絲分裂標記物H3S10ph，表明這些細胞處于Gl停滯狀態。非增殖性乳腺中這種引發的準 許狀態可能是為允許對妊娠快速反應的進化改變，而且不能下調DNA復制準許通路可能使 得轉換成不受控制的細胞增殖更容易實現。我們對乳腺癌的細胞周期分析表明腫瘤分化水平的降低和基因組不穩定性的增 加——侵襲性更高的腫瘤的標志物——與此1112、孿蛋白、4111~0^ A、Plkl和H3S10ph的水平 升高相關聯，表明處于細胞周期中的細胞比例增大。然而，與卵巢不同，腫瘤分化和非整倍 性水平降低與細胞周期進展加速沒有關聯。而且，在腫瘤階段和細胞周期生物標記物之間 沒有出現關聯，這再次與卵巢不同，在卵巢中urora A、H3S10ph和腫瘤FIGO階段之間有高 顯著的相關性。這意味著不同腫瘤類型之間細胞周期機制的調節異常有基本差異，并且這 可能與不同的癌癥遺傳背景相關。我們對乳腺癌的分析已表明，DNA復制準許通路的核心組分(G1-S調節物)和有 絲分裂機制的核心組分(G2-M調節物)在乳腺癌中是有力的獨立預后標記物，與單獨的NPI 分值的預后價值相比具有更高和更優的價值。吸引人的是，最有效的復發和存活預后標記 物為有絲分裂激酶Aurora A和PLK1，二者現在都是小分子抑制物癌癥藥物發現過程的主 要關注點。這增大了將活檢腫瘤樣品的多參數細胞周期分析用作靶向所述細胞周期機制的 小分子的預測性試驗的可能性。重要的是，PLKl和Aurora A表達在級別和階段之間顯示 大量重疊，表明常規的臨床病理參數可能不足以預測治療反應。我們的數據支持了為將新 型小分子經濟有效地引至臨床實踐中使生物標記物和個性化靶向療法共同進化這一觀念。 除基于機制的治療法之外，多參數細胞周期分析在預測對常規化學治療劑和電離輻射的反 應中也可能有價值。已從周期退出的非增殖細胞對化學療法具有特別的重要性，這是因為 它們對S期和有絲分裂相關試劑有免疫性。而且，細胞周期時相可決定腫瘤細胞的相對放 射敏感性，細胞在G2-M期放射敏感性更高，在Gl較不敏感，在S期的后期最不敏感。所研究的許多細胞周期標記物——包括Ki67，Mcm2、孿蛋白、Aurora A、Plkl和 H3S10ph——與乳腺癌復發相關。重要的是，該效應在對NPI調整后仍是統計學顯著的，因 此是獨立的預后因子。然而，細胞周期機制的這些關鍵組分位于即刻早期基因和延遲反應 基因下游的絲裂原信號傳遞通路與E2F轉錄調節控制系統的交匯點處。總之，我們已表明，該細胞周期機制一一上游生長調節通路的整合點——的核心 組分可以大大增強乳腺癌的預后評估，并為標準臨床病理參數和整合的NPI分值提供額外 的信息。Aurora A和PLKl似乎有特別的預后重要性，并因此可能作為用于正進入臨床試驗 的選擇性有絲分裂激酶抑制物的預測性標記物。實施例2 在上皮卵巢癌中DNA復制準許因子和aurora激酶與非整倍性和臨床后 果關聯研究組從月中瘤學系(University College London Hospital GynaecologicalCancer Centre, UCL Hospitals, London, UK)擁有的卵巢癌數據庫鑒定了在1999年1月1日至 2004年12月31日被確診患有EOC的143名患者。基于可用的組織學材料選擇患者。組 織學標本由婦科腫瘤學病理學者進行診斷觀察，并根據WHO標準進行組織學亞型評估和核分級。在完成治療后每3-6個月對大多數患者進行持續2年的觀察，之后每年一次。從患 者的醫院記錄直接獲得了如下的臨床信息出生日期、診斷日期、包括殘余疾病量在內的手 術結果、基于臨床檢查和手術探查的結論以及細胞學結果的國際婦產科聯盟(Federation oflnternational Obstetricians and Gynecologists，FIGO)分期、診斷和復發時的CA125 值、化學療法開始時的行為狀態、復發日期、最后一次追蹤現察的日期以及死亡的日期和原 因。在這143名患者中，67 (47%)在研究時間內復發。復發的患者中的平均復發時間為 16.9個月(SD:11.0個月；范圍0-47個月)。未復發患者中的平均追蹤現察時間為33. 2 個月(SD:18.5個月；范圍5-75個月)。34名患者(24% )在研究時間內死亡，107名在最 后一次追蹤現察時仍存活。死亡患者的平均存活時間為21. 9個月(SD :15. 6個月；范圍 0-60個月)。未死亡患者的平均追蹤現察時間為33. 3個月(SD 18. 8個月；范圍5_75個 月)。兩名患者未能追蹤現察。倫理委員會的批準獲自聯合的UCL/UCLH人類研究倫理委員石。抗體如(WhartonSB et al. Br J Cancer 2004 ；91 262-9, 2004)所述生成人孿蛋白的 兔多克隆抗體。Ki67單克隆抗體(克隆MIB-1)獲自DAKO (Glostrup，Denmark)，Mcm2單克隆 抗體(克隆 46)獲自 BDTransduction Laboratories, Aurora A 單克隆抗體 NCL-L-AK2 (克 隆 JLM28)獲自 Novocastra Laboratories, Aurora B 單克隆抗體 Ab2254 獲自 Abeam PLC, 第10位絲氨酸磷酸化的組蛋白H3(H3S10ph)多克隆抗體獲自Upstate。細胞培養和同步化如(Stoeber et al. 2001，見上文)所述培養HeLa S3細胞(歐洲動物細胞培養物 保藏中心(European Collection of Animal CellCultures)87110901)并同步化。如前人 描述(Krude et al. Cell ；88 109-19,1997)通過分離核的流式細胞術確認細胞周期同步 化。制備蛋白提取物和免疫印跡。以胰蛋白酶進行處理收獲HeLa S3細胞，將其以PBS洗滌 并以 2xl07 細胞 /ml 懸浮于裂解緩沖液[50mM Tris-Cl (pH 7. 5)，150mM NaCl, 20mM EDTA, 0. 5% ΝΡ40]中。將裂解物在冰上孵育30分鐘，然后通過離心(13，OOOXg, 15min，4°C )使 之澄清。將裂解物通過4-20% SDS-PAGE (75 μ g蛋白/孔)分離，并如前人所述(Stoeber et al.，見上文)進行免疫印跡。使用如下條件進行阻斷、抗體孵育和洗滌步驟對于Mcm2 和Aurora A, PBS/0. 吐溫20/5%乳；對于孿蛋白，PBS/1%吐溫20/10%乳；對于Aurora B 禾口 H3S10ph, PBS/5%乳。免疫組織化學在初次診斷得到的檔案記錄的福爾馬林固定的石蠟包埋組織獲自所有患者，對于 每個標本選擇包含代表性浸潤腫瘤樣品的一個標本塊。將來自每個石蠟包埋的組織塊的 連續系列切片用于免疫組織化學。將3微米切片切于Superfrost Plus載玻片(Visions Biosystems)上，在二甲苯中脫蠟，并按乙醇至水的梯度進行復水。將組織切片在pH 6.0 下于0. lmol/L檸檬酸緩沖液中壓煮2分鐘，并使用Bond PolymerRefine Detection試 劑盒和Bond-X自動系統(Vision Biosystems)免疫染色。以如下稀釋度應用一抗 Ki67(l 100)、Mcm2(l 2000)、孿蛋白(1 600) ,Aurora A(1 50) ,Aurora B(1 200) 且H3S10ph(l 300)。用Pertex封固劑(Cell Path Ltd)加蓋蓋玻片。將無一抗的孵育 用作陰性對照，將結腸上皮切片作為陽性對照。
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蛋白表達譜分析如前人所述(Shettyet al. 2005，見上文.Dudderidge et al. 2005，見上文)，通 過在每種腫瘤中確定標記物的標記指數進行蛋白表達分析。在低倍放大率(xlOO)下評估 載玻片來識別具有最高染色強度的腫瘤區域。從這些選擇的區域中，以電荷耦合器件照相 機和分析軟件(SIS)在X400放大率下捕獲3-5個視野。隨后打印圖像用于定量分析，該分 析在觀察者不知道臨床病理變量的情況下進行。將該視野中的陽性和陰性細胞計數，并將 間質細胞或炎癥細胞排除。識別陽性細胞的標準取決于生物標記物對于Ki67、Mcm2、孿蛋 白、Aurora B和H3S10ph，具有任何程度的核染色的細胞被記錄為陽性；對于Aurora A，具 有任何程度的核染色和細胞質染色的細胞被記錄為陽性(Gritsko et al. 2003，見上文)。 對每個試驗例計數了最少的500個細胞。使用下式計算標記指數標記指數=陽性細胞數 目/總細胞數目xlOO。由獨立的評估人員對10個隨機選擇的試驗例進行的再次評估顯示 了高水平的一致性。DNA圖像細胞計數對于每個試驗例，將獲自如免疫組織化學所評估的同一標本塊的石蠟包埋組 織的一個 40μπι 切片用于如(Sudbo et al. 2001，見上文.Haroske et al. 1997，見上 文)所述制備胞核。如(Sudbo et al. 2001，見上文)所述，將Fairfield DNA Ploidy System (Fairfield Imaging Ltd)用于圖像處理、分析和分類。淋巴細胞和漿細胞作為內部 對照被包括在內，高級別的膀胱腫瘤和正常結腸組織的40 μ m切片分別作為非整倍體群和 二倍體群的內部對照。依照公開的標準(Sudbo et al. 2001，見上文，Haroske 1998，見上 文)對直方圖進行分類。直方圖由兩名獨立評估人員進行分類，他們在不知道臨床病理變 量的情況下具有高度一致性。為了進行統計分析，將四倍體腫瘤和多倍體腫瘤與非整倍體 腫瘤成組。統計分析將Spearman秩相關系數用于檢查生物標記物之間的關聯。根據需要，使用非參數 Jonckheere-Terpstra和Mann-Whitney U檢驗評估生物標記物表達與腫瘤分級、階段和倍 性狀態之間的關系。然后將數據概括為觀察到的整個組的標記指數的中值和四分位數間 距。使用以下工具進行無疾病和所有存活數據的分析Aaplan-Meier作圖(對于生物標記 物使用三分位數)、對數秩檢驗和Cox回歸(除非另外說明，否則生物標記物作為連續變量 處理)。對于每種生物標記物，基于標記指數將該組分成三分位數組。在每個三分位數組 中，分別對于無疾病者和所有存活者使用Kaplan-Meier方法計算無疾病者或存活者的剩 余比例。首先未校正地估計生物標記物的95%置信區間(95% Cl)的風險比(HR)，然后就 年齡、分級和階段進行校正。將數據不全的患者排除于多變量分析之外。候選生物標記物 列于附表Sl中。所有檢驗都是雙側的并使用0. 05的顯著性水平，不允許進行多重假設檢 驗。使用 Windows 下的 SPSS 12. O (SPSS, Inc.)進行分析。結果生物標記物多參數分析的驗證及其生物學含義通過以下方式在來自非同步HeLa S3細胞的總細胞提取物中確認抗Mcm2、孿蛋 白、Aurora A.Aurora B和H3S10ph的抗體的單特異性檢測具有與相應人抗原的報道電泳 遷移率一致的分子量的單一蛋白(圖10A)。體外研究的首個實例選擇HeLa S3細胞，因為該細胞系具有熟知的細胞周期相轉變時間和成熟的同步化方案。將來自同步化細胞的總細 胞裂解物以表征的抗體進行免疫印跡(圖10B)。Mcm2水平在通過細胞周期的過程中不顯著 變化，而孿蛋白表達局限于S-G2-M。Aurora A水平在S期過程中升高并在有絲分裂過程中 達到峰值，降解發生在從有絲分裂停滯解除后2-4小時。類似地，Aurora B水平在Gl過程 中可忽略，在S期過程中逐漸升高并在G2-M過程中達到峰值，在有絲分裂后降低。H3S10ph 的存在局限于有絲分裂，這就強化了將它用作有絲分裂標記物的合理性。在同步化的SK-OV 3卵巢癌細胞中觀察到了這些生物標記物的相同細胞周期依賴性表達(數據未顯示)。由于 Ki67在增殖細胞的整個細胞周期中表達且孿蛋白表達局限于S-G2-M期，我們已提出，孿蛋 白/Ki67比值可用作Gl相對時長的指示物，并因此作為細胞周期進展速度的指示物。以上 描述的數據可確認，Aurora A和Aurora B的細胞周期依賴性表達使得還能用它們與Ki67 的比值作為細胞周期進展的指示物。孿蛋白表達增加總是局限于S-G2-M期，甚至在高度侵 襲性腫瘤中也是如此。因此，我們體外實驗的發現還可表明，Aurora A或Aurora B與孿蛋 白之間的相對比值增大(比值> 1)可指示激酶在細胞周期過程中激酶的過表達。為了評 估我們的體外實驗發現及其生物學含義在EOC中的預后意義，我們分析了生物標記物在一 系列143個病例中的表達(圖10C)。還在5個正常卵巢組織中研究了蛋白表達。生物標 記物在正常卵巢表面上皮中的表達非常低(< 4% )，這與它的低增殖能力一致(數據未顯 示)。相反，EOC顯示出高水平的生物標記物表達，指示再次進入細胞周期和增殖。接下來，我們檢查了腫瘤系列中生物標記物對之間的關聯。AuroraA和Aurora B 的表達水平與它們的底物H3S10ph的表達水平顯示了強正相關[Spearman相關度分別為 0. 57(95% CI，0· 45-0. 67)和 0. 52(95% CI，0· 39-0. 63) ]。Mcm2、孿蛋白和 H3S10ph 的表達 水平與Ki67水平強正相關[Spearman相關度分別為0. 73(95% CI，0. 64-0. 8) ；0. 74(95% CI，0. 66-0. 81)；和0. 52 (95 % CI,0. 39-0. 63)]，這支持了它們作為增殖標記物的作用。 值得注意的是，孿蛋白/Ki67和Aurora Α/Κ 67的比值與H3S10ph有強度較弱的正相關 [Spearman 相關度分別為 0. 25 (95% CI,0. 09-0. 40)和 0. 42 (95% CI,0. 27-0. 55)]，這反映 出Gl的相對時長相對于延長的S-G2-M轉換時間的變化，這可能出現在內S或G2-M檢查點 通路的活化過程中。這一點與腫瘤塊只有在腫瘤細胞進行大比例的細胞群倍增——約為40個的總數 中有30個倍增——后才逐漸可進行臨床檢測是一致的。該數目的細胞群倍增代表了與生命 相容的最大物塊，這是已經不考慮大多數細胞周期檢查點機制的體克隆進化中的一個點。生物標記物、腫瘤DNA倍性狀態和臨床病理特征之間的關系該研究組的臨床病理特征總結于表10中。為了研究生物標記物和基因組不穩定 性之間的關系，我們將它們的表達譜與腫瘤DNA含量相關聯。在所有生物標記物的表達水 平和多個生物標記物/Ki67比值與基因組不穩定性之間有高度顯著相關性(表11)，反映了 與二倍體腫瘤相比非整倍體腫瘤中的周期細胞比例增大和細胞周期進展加速。所有6種生物標記物都與腫瘤分級強相關(表12)；然而生物標記物水平的分布 在不同級別之間有一些重疊(如Aurora A水平；圖11)。這些數據不但可確認腫瘤間變增 加的處于周期中的細胞的比例增大，而且表明所述生物標記物沒有將每個級別的所有患者 的級別完全區分開。與這些發現一致的是，發現了腫瘤級別和倍性狀態之間的高顯著相關性(ρ
28< 0. 001)。孿蛋白 /Ki67,Aurora Α/Κ 67,Aurora Β/Κ 67 和 H3S10ph/Ki67 的比值也與腫 瘤分化顯著相關(表12)，指示在高級別腫瘤中細胞周期進展速度加快。相反，并且與我們 在其他腫瘤類型中的發現一致的是，Mcm2/Ki67比值隨腫瘤級別增加而減小(表12)，反映 了高度分化腫瘤中DNA復制準許的、但非增殖的細胞向低度分化腫瘤中活性周期細胞的比 例轉變。孿蛋白表達與腫瘤間變和基因組不穩定性增加之間的正相關性(表11和12)可 表明，該準許抑制物在EOC中不發揮腫瘤抑制物的作用。已發現 Aurora A、H3S10ph、Aurora A/Ki67、H3S10ph/Ki67 與腫瘤階段之間有顯 著相關性(表13)。這表明Aurora A調節異常可能是早期上皮卵巢腫瘤發生和向晚期疾病 發展中的關鍵事件。再者，晚期疾病與Aurora A/孿蛋白比值增大顯著相關(ρ = 0. 04 ；表
13)，這也支持了Aurora A調節異常和腫瘤進展之間的關聯性。生物標記物、腫瘤DNA倍性狀態和患者結果的關系單變量分析Aurora A (ρ = 0. 01 ；圖 12Α)、Aurora A/Ki67、Aurora Β/Κ 67 和 H3S10ph (表
14)都與較短的無疾病存活顯著相關，但不與總體存活相關。患者年齡、腫瘤級別和階段 也可預測無疾病存活，較年輕的患者、高度分化的腫瘤以及特別是早期疾病具有顯著更長 的復發時間[分別為 HR 1. 02(1. 00-1. 05)，ρ = 0. 05 ；HR 1. 59(1. 03-2. 45)，ρ = 0. 04 ； HR 2. 07(1. 58-2. 71),ρ < 0. 0001]。患者年齡和腫瘤階段還預測了總體存活[分別為HR 1. 05 (1. 02-1. 09)，ρ = 0. 003 ；HR 3. 21 (1. 33-7. 79), ρ = 0.01],但腫瘤級別未能預測(ρ =0.70)，這強調了現行分級體系的局限性。腫瘤倍性狀態也與無疾病存活顯著相關[HR， 1.80(1.05-3. 08)，ρ = 0.03 ；圖12Β]，具有非整倍體腫瘤的患者具有更短的總體存活的傾 向，但這未達到統計顯著性[HR 1. 95(0. 88-4. 31)，ρ = 0. 10]。我們將我們的系列細分成兩組早期疾病(FIG0階段I和II )及晚期疾病(FIG0 階段III和IV)，以更準確地定義具體的亞組，對于這些亞組，生物標記物可具有特別的預后 重要性。Aurora A和AuroraA/Ki67比值都在早期亞組中對較短的無疾病存活[分別為 HR 1. 72 (1. 19-2. 48)，ρ = 0. 004 (圖 12C) ；HR 1. 59 (1. 13-2. 24)，ρ = 0. 008]和總體存活 [分別為 HR :1. 81(1. 14-2. 87), ρ = 0·01(圖 12Ε) ；HR 1. 68(1. 11-2. 54), ρ = 0. 01]具有 強預測性。該相關未出現于晚期亞組中[分別為對于無疾病存活HR: 1.06 (0.81-1. 37)，ρ =0. 67 ；HR 1. 04 (0. 90-1. 20)，ρ = 0. 58 ；對于總體存活 HR 0. 88 (0. 58-1. 33)，ρ = 0. 88 ； HR 0. 89(0. 69-1. 15)，ρ = 0. 36]。腫瘤倍性狀態還在早期亞組中預測了無疾病存活[HR 4. 58(1. 04-20. 19),ρ = 0. 04 ； 12D]，在具有非整倍體腫瘤中有較短總體存活的傾向[HR 6. 34(0. 82-49. 18)，ρ = 0. 08 ；圖12D]。然而，它對于晚期亞組則失去其預測價值[對于無 疾病存活和總體存活分別為 HR 1. 47(0. 81-2. 66),ρ = 0. 21 和 HR 1. 36(0. 55-3. 33),ρ = 0. 5]。多變量分析Cox回歸存活分析表明，腫瘤階段是無疾病存活僅有的顯著有效的獨立預測物 [HR 2. 06(1. 49-2. 85)，ρ < 0. 0001]。患者年齡和腫瘤階段是總體存活的獨立預測物，年 齡較大的患者和晚期腫瘤具有較短的總體存活時間[分別為HR 1. 05(1. 01-1. 09)，ρ = 0.007 ;HR:3. 19(1.31-7. 75)，ρ = 0. 01]。雖然在多變量分析中多種生物標記物是顯著有 效的預后因子，但在就年齡、級別和階段校正后沒有一種是無疾病存活或總體存活的顯著有效的預測物。這一點部分是由于生物標記物與腫瘤級別和階段之間的高度顯著相關性， 使得難以分離出它們的獨立效應。討論進行該研究以獲得對EOC的生物標記物的進一步認識，所述生物標記物可能具有 預后價值和預測價值，并且可能導致更深入地理解其發病機制。我們的發現表明，在EOC中 Mcm2和孿蛋白復制準許因子、Aurora A和B激酶以及它們的底物H3S10ph有預后價值。腫 瘤分化和該生物標記物組之間存在的關聯暗示著它們有可能被用作增殖標記物從而改進 現有分級體系。我們的多參數分析表明，該多參數分析還可被用于提供患者腫瘤樣品的細 胞周期進展的信息，以及可翻譯成重要預后信息的數據。這些發現與在乳腺和腎細胞癌癥中對準許因子的分析是一致的。此外，該生物標 記物組和腫瘤倍性狀態之間的高度顯著相關性表明，在EOC中準許機制和有絲分裂激酶的 調節異常與基因組不穩定性的形成有復雜的聯系。Aurora A在G2-M轉化的數個關鍵階段 中起到調節作用。在本文中，我們報告了 Aurora A的異常調節和EOC進展之間的有趣聯系。 我們的數據顯示出Aurora A、H3S10ph與腫瘤FIGO階段之間的高度顯著的相關，其支持了 Aurora A調節異常可能是上皮卵巢癌發生的早期事件的觀點，并表明該調解異常可能在發 展成晚期疾病中起到重要作用。與這些發現一致，Aurora A/孿蛋白在晚期階段腫瘤中顯著較高，這也表明Aurora A過表達可能在腫瘤進展中起作用或者可能是腫瘤進展的結果。在體內，這類過表達有可能 不僅受基因擴增的調節，而且受其他機制例如蛋白降解的轉錄激活和抑制作用的調節。我 們的數據表明，Aurora A和H3S10ph的多參數分析使得可進行能用于補充臨床分級方法的 分子分級。在EOC中FIGO階段是重要的預后指示物，然而，外科和放射學分級方法有其局限 性。隨機試驗已顯示，輔助化學療法在具有I期疾病的亞最佳分級患者中是特別有利的。然 而，在最近較大的隨機對照試驗中，僅34%的患者是依照指導方針(Vegote let al Curr. Op. Oncol. 2003 ；15 :452_5)進行最佳分級的。在這些被不適當分級的患者中，這些生物標 記物可能提供了真正的I期或更晚期疾病的支持性證據，對有關使用輔助化學療法的決策 提供輔助。IC0N1/ACTI0N試驗的發現表明了對于輔助化學療法的總體益處較少(Trimbos JB et al J Natl Cancer Inst 2003 ;95 :105_12)，但仍不清楚哪些合適分級的I期疾病患 者真正需要化學療法。在該研究組中，Aurora A、H3S10ph和基因組不穩定性也是無疾病存活的顯著有效 的預測物。進一步的亞組分析顯示，Aurora A和腫瘤倍性狀態可在早期疾病中預測無疾病 存活(Aurora A表達還可預測總體存活)。然而，當考慮到如年齡和階段等預后因素時該關 聯有降低。相反，這些變量在后期疾病中失去其預測價值[例如，Aurora A的HR從早期疾 病的1.72(1. 19-2.48)降至晚期疾病的1. 06 (0. 81-1. 37)]，表明其他生物學因素可能優先 影響這些患者的復發和結局。另外，治療方案的復雜性和異質性可能掩蓋這些生物標記物 在晚期的預測價值。總之，我們的數據支持如下這樣的生物學機制，即通過該機制在腫瘤發生過程中 較早時間點的Aurora A調節異常可能會促進遺傳不穩定性，從而導致在早期疾病患者亞組 中產生侵襲性腫瘤并且存活時間更短。DNA復制準許因子和有絲分裂激酶是細胞周期進展的關鍵調節物，因此是現行治療藥物開發項目的焦點。在本文中，我們已經證明，對Gl-S和G2-M轉換的核心調節物的多 參數表達分析使得可評估個體患者腫瘤樣品中的細胞周期進展速度，以及評估與這些腫瘤 的生物學表現有關的變量。該類型的分析可用作預測性試驗，用于預測靶向細胞周期機制 或加速細胞周期進展的上游生長信號轉導通路的小分子。而且，各級別間的Aurora A表達 并不能完全區分開的這一結果表明，傳統的臨床病理學變量不總是可預測治療反應，這支 持了生物標記物和個體化靶向治療協同進化的觀念。考慮到特異性Aurora激酶抑制劑最 近的發展，我們的數據在將Aurora A用作生物標記物和潛在的治療靶這一方面具有重要 的——預后、預測和治療——意義。參考文獻Barkley et al. ，Exp Cell Res 313 :3789_3799，2007Blow and Hodgson, Trends Cell Biol 12 :72_78，2002Dudderidge et al. Clin Cancer Res 11 :2510_7，2005Dudderidge et al.，Clin Cancer Res 11 :25110_2517，2005Dunkler et al. Eur J Cancer，43 :745_751，2007Eward et al. ，J Cell Sci 117 :5875_5886，2004Gonzalez et al. ，J Pathol 204 :121_130，2004Gritsko et al. Clin Cancer Res 9 :1420_6，2003Haroske et al. Anal Cell Pathol 1998 ；17 =189-200,1997Kingsbury et al. , Exp Cell Res 309 :56_67，2005Krude et al. Cell ;88 :109_19，1997Shetty et al. Br J Cancer 93 1295-300,2005Shetty et al. , Br J Cancer 93 :1295_1300，2005Stoeber et al. J Cell Sci，114 :2027_41，2001Stoeber et al. ，EMBO J 17 :7219_7229，1998Stoeber et al. , J Cell Sci 114 :2027_2041，2001Sudbo et al. N Engl J Med 344 1270-8，2001Wharton et al.Br J Cancer ；91 :262_9，2004Williams and Stoeber, Curr Opin Cell Biol 19:672-679,2007
年齡(歲)<40 40-49 50-59 60-69 70+頻率(數目) 7% (12) 19% (34) 28% (Sl) 22% (41) · 24% (44)大小(mm)<11 11-20 21-30 31-40 >409% (16) 33% (60) 30% (54) 16% (29) 13% (23)淋巴結階段陰性結 陽性，1-3 陽性，4或以上 未知53% (97) 22% (40) 18% (32) 7% (13)分級1 2 313% (24) 44% (80) 43% (78)NPI分值平均值(sd)4.49(l_3i) <3.4 3.4-5.4 >5.4 未知18% (32) 51% (93) 24% (44) 7% (13)倍性狀態二倍體 非整倍體 未知47% (86) 50% (90) 3% (6)Her20 1+ 2+ 3+59% (108) 18% (33) 7% (13) 15% (28)ER陽性 (100%) 陰性(<100%)53% (96) 47% (86)PR陽性 (<63%) 陰性 (>63%)50% (91) 50% (91)ER陽性、PR陽性 ER或PR陰性37% (67) 63% (115)淋巴管浸潤不存在 存在 未知47% (86) 38% (69) 15% 07)腫瘤類型漫潤性導管癌 小葉型 粘蛋白型 混合型 微孔頭狀型78% (142) 14% (26) 2% (4) 5% (9) 1%(1)乳腺癌權是 否 未知26% (48) 68% (124) 6% (10)乳腺癌死亡是 否 未知14% 06) 80% (146) 6% (10)復發絲觀察(年) 存活取縣觀測(年)632 (每受試者3. 8) 684 (每受試者4.1 >3 生物標記物和腫秀_分化之間的關系
33 丨Jonckheere-Terpstra 檢驗1 示記指數(表示為百分數)$中值(四分位數間距)表4 腫瘤標記物和腫瘤DNA倍性狀態之間的關系 丨Mann-Whitney 檢驗1 示記指數(表示為百分數) 中值(四分位數間距)表5 生物標記物和淋巴結階段之間的關系 t Mann-Whitney 檢驗1 示記指數(表示為百分數) 中值(四分位數間距)表6 生物標記物和NPI之間的關系 *標記指數(表示為百分數)t非參數Spearman相關系數
*非成對t_檢驗t時線性趨勢的線性回歸檢驗表9 =NPI對復發和癌癥死亡的影響 表10 患者的特征
38 *行為狀態表11 生物標記物和腫瘤DNA倍性狀態之間的關系 t Mann-Whitney 檢驗1 示記指數(表示為百分數)$中值(四分位數間距)表12 生物標記物和腫瘤分化Ω之間的關系 卞 Jonckheere—Terpstra 檢驗1 示記指數(表示為百分數)$中值(四分位數間距)ω143例中19例(13% )是不可分級的。表13 生物標記物和腫瘤階段之間的關系Ω t Mann-Whitney 檢驗1 示記指數(表示為百分數)$中值(四分位數間距)Ω1個病例由于丟失階段信息而被排除在分析外。表14 生物標記物和無疾病存活之間的關系 t對數秩檢驗*風險比是指生物標記物百分數絕對增加10% .“風險比是指比值絕對增加0.1.°變量高度偏移，因此在中值(對于H3S10ph是1.99，對于H3S10ph/Ki67是 0.032)處將其分成兩類。每個變量的風險比是較高組比較低組。對于其他變量，風險比是指增加1個單位。表15 細胞周期表型和臨床病理參數之間的關系 t中值(四分位數間距)*顯著相關性局限于表型III
權利要求
一種在受試者中確定癌癥進展的預后的方法，所述方法包括如下步驟(a)在來自所述受試者的生物樣品中評估選自Mcm2 7中的至少一種的第一生物標記物的水平；以及(b)在來自所述受試者的生物樣品中評估選自孿蛋白、Aurora A、Plk1、Ki67和H3S10ph中的至少一種的第二生物標記物的水平，其中將所述第一生物標記物相對于一個預定值的水平變化與與所述第二生物標記物相對于一個預定值的水平變化相結合來指示所述受試者中的癌癥進展。
2.權利要求1的方法，所述方法還包括在來自所述受試者的生物樣品中評估選自孿蛋 白、Aurora A、Plkl、Ki67和H3S10ph中的至少一種的第三生物標記物的水平，其中所述第 二和第三生物標記物不相同。
3.權利要求1的方法，其中如果所述第一生物標記物的水平低于預定值并且所述第二 生物標記物的水平低于預定值，那么所述受試者的預后被指示為癌癥進展的可能性降低。
4.權利要求1的方法，其中如果所述第一生物標記物的水平高于預定值并且所述第二 生物標記物的水平低于預定值，那么所述受試者的預后被指示為癌癥進展的可能性降低。
5.權利要求1的方法，其中如果所述第一生物標記物的水平高于預定值并且所述第二 生物標記物的水平高于預定值，那么所述受試者的預后被指示為癌癥進展的可能性升高。
6.權利要求1的方法，其中用于所述第一生物標記物的預定值為對所述第一生物標記 物呈陽性的細胞的20%。
7.權利要求1的方法，其中用于所述第一生物標記物的預定值為對所述第一生物標記 物呈陽性的細胞的30%。
8.權利要求1的方法，其中用于所述第二生物標記物的預定值為對所述第二生物標記 物呈陽性的細胞的20%。
9.權利要求1的方法，其中用于所述第二生物標記物的預定值為對所述第二生物標記 物呈陽性的細胞的10%。
10.權利要求1的方法，其中用于所述第二生物標記物的預定值為對所述第二生物標 記物呈陽性的細胞的7%。
11.根據權利要求1的方法，其中所述生物樣品選自腫瘤活檢物、組織、全血、血漿、血 清、宮頸涂片、尿、支氣管灌洗液、痰和來自消化道的刷洗液。
12.權利要求1的方法，其中使用免疫測定方法確定所述第一和第二生物標記物的水平。
13.權利要求12的方法，其中所述免疫測定方法選自點印跡分析、狹線印跡分析、RIA、 肽微陣列和ELISA。
14.權利要求1的方法，其中使用基于分子生物學的測定方法確定所述第一和第二生 物標記物的水平。
15.權利要求14的方法，其中所述基于分子生物學的測定方法選自RNA印跡分析、DNA 印跡分析、蛋白質印跡分析、RT_PCR、PCR、基于核酸序列的擴增測定(NASBA)、轉錄介導的擴 增(TMA)或計算機化的檢測矩陣。
16.權利要求1的方法，其中所述受試者具有選自以下的癌癥乳腺癌、子宮內膜癌、卵 巢癌、上皮卵巢癌、肺癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、口腔黏膜的癌癥、食管癌、淋巴網狀內皮系統的癌癥、腦癌、生殖泌尿癌、皮膚癌、結腸癌、胃癌、膀胱癌、輸尿管的癌癥和呼吸消化道的癌癥。
17.權利要求1的方法，其中可以連續地或同時地測量所述第一和第二生物標記物。
18.權利要求1的方法，其中在測量所述第二生物標記物的水平之前測量所述第一生 物標記物的水平。
19.一種為患有癌癥的受試者確定治療方案的方法，所述方法包括如下步驟(a)在來自所述受試者的生物樣品中評估選自Mcm2-7中的至少一種的第一生物標記 物的水平；以及(b)在來自所述受試者的生物樣品中評估選自孿蛋白、AuroraA、Plkl、Ki67和 H3S10ph中的至少一種的第二生物標記物的水平，其中將所述第一生物標記物相對于一個預定值的水平變化與所述第二生物標記物相 對于一個預定值的水平變化相結合來指示為所述受試者制定的治療方案。
20.權利要求19的方法，所述方法還包括在來自所述受試者的生物樣品中評估選自孿 蛋白、Aurora A、Plkl、Ki67和H3S10ph中的至少一種的第三生物標記物的水平，其中所述 第二和第三生物標記物不相同。
21.權利要求19的方法，其中如果所述第一生物標記物的水平低于預定值并且所述第 二生物標記物的水平低于預定值，那么所述治療方案選自以下的一項或多項(a)監測；以及(b)以非細胞周期特異性化學治療劑進行治療。
22.權利要求19的方法，其中如果所述第一生物標記物的水平高于預定值并且所述第 二生物標記物的水平高于預定值，那么所述治療方案選自以下的一項或多項(a)監測；(b)以Gl或非細胞周期特異性試劑進行治療；以及(c)以非S和G2/M細胞周期特異性化學治療劑進行治療。
23.權利要求19的方法，其中如果所述第一生物標記物的水平高于預定值并且所述第 二生物標記物的水平高于預定值，那么所述治療方案選自以下的一項或多項(a)手術；以及(b)以S和G2/M細胞周期特異性化學治療劑進行治療。
24.根據權利要求19的方法，其中所述生物樣品選自腫瘤活檢物、組織、全血、血漿、血 清、宮頸涂片、尿、支氣管灌洗液、痰和來自消化道的刷洗液。
25.權利要求19的方法，其中使用免疫測定方法確定所述第一和第二生物標記物的水平。
26.權利要求25的方法，其中所述免疫測定方法選自點印跡分析、狹線印跡分析、RIA、 肽微陣列和ELISA。
27.權利要求19的方法，其中使用基于分子生物學的測定方法確定所述第一和第二生 物標記物的水平。
28.權利要求27的方法，其中所述基于分子生物學的測定方法選自RNA印跡分析、DNA 印跡分析、蛋白質印跡分析、RT_PCR、PCR、基于核酸序列的擴增測定(NASBA)、轉錄介導的擴 增(TMA)或計算機化的檢測矩陣。
29.權利要求19的方法，其中所述受試者具有選自以下的癌癥乳腺癌、子宮內膜癌、 卵巢癌、上皮卵巢癌、肺癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、口腔黏膜的癌癥、食管癌、淋巴網狀內 皮系統的癌癥、腦癌、生殖泌尿癌、皮膚癌、結腸癌、胃癌、膀胱癌、輸尿管的癌癥和呼吸消化 道的癌癥。
30.權利要求19的方法，其中可以連續地或同時地測量所述第一和第二生物標記物。
31.權利要求19的方法，其中在測量所述第二生物標記物的水平之前測量所述第一生 物標記物的水平。
32.一種確定對患有癌癥的受試者的治療有效性的方法，所述方法包括如下步驟(a)在來自所述受試者的生物樣品中評估選自Mcm2-7中的至少一種的第一生物標記 物的水平；以及(b)在來自所述受試者的生物樣品中評估選自孿蛋白、AuroraA、Plkl、Ki67和 H3S10ph中的至少一種的第二生物標記物的水平，其中將所述第一生物標記物相對于一個預定值的水平變化與所述第二生物標記物相 對于一個預定值的水平變化相結合來指示所述治療有效性。
33.權利要求32的方法，所述方法還包括在來自所述受試者的生物樣品中評估選自孿 蛋白、Aurora A、Plkl、Ki67和H3S10ph中的至少一種的第三生物標記物的水平，其中所述 第二和第三生物標記物不相同。
34.根據權利要求32的方法，其中所述生物樣品選自腫瘤活檢物、組織、全血、血漿、血 清、宮頸涂片、尿、支氣管灌洗液、痰和來自消化道的刷洗液。
35.權利要求32的方法，其中使用免疫測定方法確定所述第一和第二生物標記物的水平。
36.權利要求35的方法，其中所述免疫測定方法選自點印跡分析、狹線印跡分析、RIA、 肽微陣列和ELISA。
37.權利要求32的方法，其中使用基于分子生物學的測定方法確定所述第一和第二生 物標記物的水平。
38.權利要求37的方法，其中所述基于分子生物學的測定方法選自RNA印跡分析、DNA 印跡分析、蛋白質印跡分析、RT_PCR、PCR、基于核酸序列的擴增測定(NASBA)、轉錄介導的擴 增(TMA)或計算機化的檢測矩陣。
39.權利要求32的方法，其中所述受試者具有選自以下的癌癥乳腺癌、子宮內膜癌、 卵巢癌、上皮卵巢癌、肺癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、口腔黏膜的癌癥、食管癌、淋巴網狀內 皮系統的癌癥、腦癌、生殖泌尿癌、皮膚癌、結腸癌、胃癌、膀胱癌、輸尿管的癌癥和呼吸消化 道的癌癥。
40.權利要求32的方法，其中可以連續地或同時地測量所述第一和第二生物標記物。
41.權利要求32的方法，其中在測量所述第二生物標記物的水平之前測量所述第一生 物標記物的水平。
全文摘要
本申請涉及一種確定受試者癌癥進程的預后的方法、一種確定對患癌癥的受試者的治療方案的方法，或者一種確定受試者的治療效果的方法，所述方法包括如下步驟(a)評估來自所述受試者的生物樣本中第一生物標記物的水平，所述第一生物標記物選自Mcm 2-7中的至少一種；和(b)評估來自所述受試者的生物樣本中第二生物標記物的水平，所述第二生物標記物選自孿蛋白、Aurora A、Plkl、Ki67和H3SI0ph，其中將所述第一生物標記物相對于一個預定值的水平變化以及所述第二生物標記物相對于一個預定值的水平變化相結合來指示所述受試者的癌癥進程，或者指示為所述受試者制定的治療方案，或者指示所述治療的效果。
文檔編號G01N33/574GK101896819SQ200880120923
公開日2010年11月24日 申請日期2008年10月15日 優先權日2007年10月15日
發明者G·H·威廉斯, K·斯托伯 申請人:劍橋癌癥診斷有限公司
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