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專利名稱：免疫測定方法
技術領域：
本發明涉及的是采用特異性結合如免疫測定的測定方法。
微顆粒固相免疫測定系統已為人們所熟知。它們通過免疫原(被測物)與一種或多種特異性結合物之間發生的免疫結合反應，對被測樣品中的免疫原進行定性和/或定量的測定，其中至少有一種特異結合物與一種不溶性載體連接并與含試樣的液相介質接觸。生成的連在載體上的免疫復合物這一事實對于隨后測定結合反應的進行程度是有利的。測定常在一個帶標記的特異性結合物的參與下進行，結合反應可以是“競爭”反應或者“夾心”反應，這兩種反應方式在本領域中目前已被廣泛應用。
典型的“競爭”反應中，與測定介質(通常是含水的)相互接觸的固相載體上固定了一種對被測物具有特異性的結合物(如單克隆抗體)，在測定介質中含有帶標記的已知量的被測物(或其具有同樣抗原決定簇的類似物)以及已知量的預期含被測物的試樣。當試樣中不含有被測物時，帶標記被測物或類似物就與固相載體上的特異性結合物發生結合反應，其結合的程度通過標準實驗可以確定。當試樣中含有被測物時，它就與帶標記的被測物或它的類似物競爭特異性結合物，結果使原來帶標記的被測物與特異性結合物的結合程度下降。將此現象與標準狀態作比較(即與不含被測物所得的結果比較)就可以推斷出被測物在試樣中的濃度。
在典型的“夾心”反應中，對被測物有特異性的第一結合物與固相載體連接，其測定介質(通常也是含水的)還含有帶標記的與被測物有特異性結合能力的第二結合物。當無被測物時，兩個結合物間不會發生結合。當試樣中存在被測物時，它可以在固相化的和帶標記的這兩個結合物之間起“橋梁”的作用，而間接地使兩者發生結合。結合的程度可用于測定試樣中被測物的濃度。兩個結合物對被測物的特異性可以不同，但如果被測物分子具有一個以上的相同抗原決定簇，那么同一個特異性結合物即可用作固定相，又可用作游離的帶標記結合物。
已知的微顆粒載體免疫測定系統有好幾種。其中有一些包含復雜的測定系統以檢測特異性結合反應而形成的復合體，和/或用物理方法使帶有復合體的微顆粒載體與測定介質完全分離，該方法包括在測定前要將所有未結合物去除。本發明的一個實施例中，提出了一種不需要分離微顆粒載體的免疫測定系統，它對樣品的測定簡便而快速，特別是免疫測定僅需一步就能完成。
許多專利文件已描述了各種涉及微顆粒固相載體在測定介質中定位的免疫測定。EP0169434號文件中描述了一種免疫熒光測定法它先將抗原附著在磁性顆粒上，在測定時，在磁場的作用下將顆粒拉向容器壁。當然要從這樣一個測定系統得到分析結果，還必須用外加能量如用紫外線去激發熒光的產生。
EP0149565描述的免疫測定法是采用一個帶標記的結合物和另一個與磁性顆粒聯結的結合物，這種不溶性的顆粒懸浮在液相測定液中。當帶標記的結合物以與樣品中被測物濃度相應的比例在液相和顆粒載體間進行分配后，除去液相。之后將顆粒載體再懸浮在另一液相介質中并測定標記物的濃度。據稱此法尤其適用在熒光和化學發生的標記系統，它便于在微量滴定板上操作，無論從井的上部或下部，都能對板上的井逐個地進行掃描觀察。EP0149565中特別提到如不將顆粒物從懸浮液中分離掉，就很難對光學訊號進行有效的測量。
本發明與EP0149565所述的發明在指導思想上截然相反，因為我們發現實際上對定位的固相作準確的觀察要比對分散的固相更為優越。
本發明提出了一個以載體為基礎的測定系統，它采用一個帶標記的特異結合物，這種標記又能參與化學反應產生化學“信號”，在這樣的系統中，經過與試樣共孵育以進行特異結合反應后，載體穿過測定介質被移到離化學“信號”檢測器最近的測定介質中，在那里一種信號影響劑被釋放到測定介質中，導致了可測信號的產生，這個信號的質和/或量則依賴于被測免疫原與掛在載體上的特異性結合物之間結合反應的程度。
更確切地說，本發明提供了一種通過特異性結合而對試樣中被測物的存在進行定性和/或定量測定的方法，在該方法中，樣品與一種可移動的固相載體物質接觸，在它上面固定著二個結合物，一是連接在載體上的對被測物有特異性的第一結合物，二是帶有標記的結合物，當存在被測物時，它就會與第一種結合物發生“夾心”或“競爭”反應，在這一方法中，經過一段時間孵育使反應充分后，可移動的固相載體被移到離化學信號檢測器很近的測定介質中，在這里一種信號影響劑被釋放進來，從而使可測信號得以產生，這個信號的質和/或量則依賴于被測免疫原與顆粒載體上所攜帶的特異性結合物之間所發生的結合的程度。
信號影響劑可以是一種可作為一個重要部分參與化學信號發生的化學反應的化學成份。在這個實施例中，例如化學信號有可能是由連在特異性結合物上的標記來產生時，則除非遇到信號影響劑，否則信號就不會產生。
另外，信號影響劑也可以是一種能產生化學“信號”的化學反應效率增加的化學成份，因此，當帶標記的特異結合物來到檢測器近旁時，它就對信號產生起了放大的作用。
在測定介質中要形成一個信號影響劑的濃度梯度，離檢測器越近，其濃度越高。如果檢測信號所需時間很短的話，既使在很小的試液體積中也能形成有效的濃度梯度，因為信號影響劑來不及擴散到整個測定介質體系中，形成較高的濃度，本發明中有一選例就采用小體積試樣孵育，在載體定位到檢測器之前將樣品稀釋。稀釋后樣品體積很大的增加將有助于建立一個信號影響劑的濃度梯度。
信號影響劑必要的局部釋放可以通過以下方法實現，例如在信號檢測器上或其附近，設一個向外擴散信號影響劑的來源。假如信號影響劑是水溶性固體，就可以將它以一定量固定在信號檢測器上或其附近，讓它逐漸溶解，使檢測器附近的液相測定介質中具有高濃度的信號影響劑。另外也可將信號影響劑包被起來，或者用物理方法將其束縛在檢測器上或附近并與液相測定介質想接觸，使其緩慢地釋放到測定介質中。例如將信號影響劑放在一層或一塊凝膠中包著檢測器或放在其附近，以逐漸地向測定介質中釋放。
與本發明相應的測定藥箱應包括有一個進行測定的容器，容器中有一個信號檢測器以及位于信號檢測器內或近旁的信號影響劑的來源。例如水溶性的信號影響劑就能以固體的形式，覆蓋在信號檢測器的內表面和/或離檢測器較近的容器內壁上。也可以把信號影響劑包在可釋放的囊中，然后把它們連檢測器的內外及附近。
凈效應是在檢測器近旁產生的化學信號將被增強，但在離檢測器較遠的測定介質區域中，由于不含有信號影響劑(或相對較少)因此就減少了由未參與結合反應的游離在測定介質中的被標記特異結合物所產生的任何“本底”化學信號的干擾。
進一步降低本底信號的方法是向測定介質中加入掩蓋劑或者淬滅劑，它們能抑制化學信號的產生或影響對信號的觀察。掩蓋劑或淬滅劑應均勻分布在測定介質中，但它們的濃度須經選擇，以使在載體定位在檢測器附近和信號影響劑被釋放的同時，掩蓋劑或淬滅劑不會影響到信號在那里被測出。在整個樣品體積中信號抑制效應必須得到平衡，這樣局部濃縮的標記產生了一個可測信號。在任何給定的系統中，信號抑制水平要靠實驗或者經驗來判斷。但這并不難辦到。載體與結合的信號發生物以及游離的信號發生物的均勻分散的混和物，就代表了未定位樣品中所期望的濃度，對均勻分散在混合液中的上述三者用適當的信號抑制劑進行“滴定”，例如用某種消耗劑，讓信號抑制的水平正好達到一定值，使不存在結合的信號發生物時的信號產生量等于零。
本發明主要從有關微顆粒載體免疫測定的方面作詳細的說明，但從下面的敘述中明顯可見，由于本發明意義廣泛，也可影響到其它的實際應用。
在本發明的敘述中，“信號”一詞用來表示能被定性或定量地觀察或測定的任何現象，“可測信號”一詞則表示能觀察到或測到的信號變化。例如一種化學成份的濃度可以是一種信號，而它的濃度從一個相對一致的“本底”信號(可以為零)的上升或下降則可以作為可測信號。某種化學成份積累速率的變化也可以作為可測信號。另外電磁輻射強度的變化也可以作為可測信號，例如從化學成份，如化學發光劑所放出的可見光等。
因此，本發明中的免疫測定系統具以下特征a.如果介質中存在合適的輔粒曇俏錁陀諧中藕諾那蹦 b.帶標記的結合物與其它結合物發生聯結，本身不會顯著改變標記物產生信號的潛能;
c.只有當連有復合標記的載體定位在離信號檢測器很近的小范圍測定介質中，同時又有信號影響劑向這里釋放的情況下，可測信號才得以出現。
微粒載體等固相物質在剛進入到測定介質中時，會受到測定介質固有的任何抑制信號作用的影響。溶液中的信號抑制作用可能只是一個筒單的稀釋效應，或者另處還存在一種或幾種能干擾信號產生的理化因素。隨后，固相物就抵達信號檢測器的近旁，在這里載體與整個測定介質相對游離，而受抑制信號效應的影響就小。為了產生出可測的信號，全部需要做的事只是將載體顆粒簡單地用物理方法局部定位。
對散布在溶液中的被標記結合物部份產生信號的抑制是本發明的優點。信號被抑制的機制則取決于信號發生系統本身的性質。下面舉出的幾個僅用作例子的不同機制，概括了所存在的可能性。
一種能與底物作用生成新的化學產物的物質就可以作為標記。假如測定介質含有適當濃度的一種消耗劑時，它在化學產物剛形成時就使其全部或大部完全被破壞，只要標記物還分散在整個測定介質中，就能保持在一個穩定的本底信號(例如產物的絕對濃度值或濃度變化的速率)水平。但是，當與掛在載體上的特異結合物發生聯結反應后，由于載體在檢測器附近的測定介質中定位以及必要的底物向該小區域中的釋放，就會導致化學產物在這里積累，其積累速率超過了它被消耗劑破壞的速率，這種化學產物在定位載體附近局部的增加就形成了一個可測信號。
當微粒載體定位在測定介質的某一區域時，消耗劑必須是均勻地散布在整個測定溶液中。
這種化學抑制可以非常容易做到，例如，當用葡萄糖氧化酶作為標記，葡萄糖作為可釋放性底物，過氧化氫酶則作為測定介質中的消耗劑。可選擇過氧化氫酶在反應介質中的濃度，使其在正常條件下，只要葡萄糖氧化酶均勻地散布在測定介質中，它與葡萄糖作用所產生的過氧化氫馬上被過氧化氫酶破壞。這樣過氧化氫的本底水平可維持恒定或者僅有緩慢而平穩的變化。但是當帶有葡萄糖氧化酶標記的特異性結合體，隨聯結在載體上的復合物一起，在釋放葡萄糖的檢測器附近的測定介質中集聚時，生成的大量過氧化氫就積聚在這一局部的區域中，過氧化氫酶就無法解離它們，那么這種過氧化物積累速率的變化就能被測定。例如用一個合適的電極就能測定H2O2的量，顆粒載體在局部的定位將影響電極附近的區域。有一些干擾物，如抗壞血酸或4-乙酰氨基酚(撲熱息痛)，存在于樣品中時造成假的類似過氧化物引起的電化學信號，從而干擾測定的結果，用另一電極就可消除這類干擾，這樣就不必再用選擇性透膜來保護工作電極了。
再者，化學產物“信號”的檢測可以利用它與另一定位于某個表面上的物質之間發生的進一步化學反應來實現。例如，聯有復合物載體可以被定位在鄰近某一表面(它可以是平板、紙張、膠片、膜或第二載體)的附近，此表面含有或帶有一種化學試劑，能與“信號”產物相互作用，而造成某種結果，例如在表面上產生顏色的變化。就舉剛才描述的過氧化氫生成系統為例，檢測表面可含有或帶有過氧化物利用酶，例如辣根過氧化物酶(HRP)，它能氧化在測定表面上或測定表面內的N-四甲聯苯胺(TMB)這類物質，導致發生顏色變化。
另一方法采用改變測定介質PH的物質作標記，例如脲酶或青霉素酶。與標記酶相應的底物，在脲酶的例子中就是脲，可在PH檢測器附近向測定介質中釋放。在分散狀態下，標記物的作用被測定介質中的PH緩沖液所掩蓋或淬滅。一旦發生結合反應，并且復合物隨載體定位后，在PH檢測器的附近由于標記物濃度較高，超過了PH緩沖液的容量，將造成局部的PH變化。這種PH的變化可被測出，例如用PH電極或PH試紙來做為檢測感受方式。
還有一個實施例中，檢測器有一個裝在測試容器外部的氣體檢測裝置。檢測裝置可以是一種能感受氨的化學場效應晶體管(Chemfet)。這種檢測裝置可安放在容器壁上透氣性膜的附近，緊挨著載體。脲酶作標記物時，把在局部釋放的脲轉變成氨，而測定介質則含有左旋谷氨酸脫氫酶作為消耗劑。
另一個系統在原理上相似，但細節上全然不同，它采用的標記是化學發光化合物，或是參與和一個或幾個其它成份進行化學發光反應的化合物，這些成份中至少有一種被釋放到檢測器附近的測定介質中。假如當被標記的特異結合體均勻分散在測定介質中時，測定介質不透光，或者至少透過的光弱到無法測到的程度，就測不出光學信號。但更好的辦法是在測定介質中加入能與發光系統相互作用并使光學信號受到抑制或淬滅的物質。隨后，含被標記特異結合體的復合體就與微載體一起被定位在檢測器附近，使局部的光信號強度加大，達到能被測定的程度。載體可以被定位在測定容器的“小窗”附近，或者在光感受器附近。光感受器可采用光電倍增管。另處還可用一種“相機”裝置，就象英國專利說明書第2169704B號上所描述的那樣，把光信號記錄在感光膠片上。為了推算或使測定規范化，在測定液中加入一個(第二種)光敏感受器以測定本底光強度可能是有用的。
這樣的系統可采用例如HRP等作為標記，測定介質中含有過氧化物(如H2O2)，氨基苯二酰肼(魯米諾)則被釋放到離光檢測器鄰近的測定介質中。另一個系統可以用葡萄糖氧化酶作標記，魯米諾分散在測定介質中，而葡萄糖則被釋放到離光檢測器鄰近的溶液中。測定介質中也可以含有一種染料，它的化學惰性使它不受過氧化物反應的影響，這種染料使測定介質在合適的波長處具有很高的光密度(最好0.0值至少大約為2)，使分散的標記物發出的光與在檢測器附近定位的標記物發出的光比起來要弱得多。更好的方法就是使測定介質含有一種能干擾化學光產生的化學試劑。
另一系統在測定介質中含有競爭劑，例如沒食子酸或亞硫基二乙酸，HRP作為標記物與過氧化氫和魯和米諾作用產生可見光，魯米諾是從光檢測器的附近被釋放到溶液中的。
另一個系統含一個檢測區，例如用含魯米諾的凝膠，它同時還包含結合的HRP以及作為底物的可釋放的葡萄糖，還有作為標記的葡萄糖氧化酶。
在本發明的敘述中，雖然特別傾向用魯米諾(5，-氨基-2，3-二氫-1，4酞嗪二酮)這種化學發光劑，但其它化合物或者化學反應也可采用。例如，2，3-二氫-1，4-酞嗪二酮的其它衍生物(如6-氨基衍生物，即異氨基苯二酰肼)也可用，此外還可采用熒光素和吖啶醚。在GB1552607，GB2112779A和GB2095830B這些專利中，就普遍地采用這些方法。在EP87959，EP87959，EP116454和GB2162946A這三項專利中，則描述了采用對碘苯酚等物質增強發光反應進行的方法。
本發明的一個重要的實施例，是一個微載體免疫測定系統，它利用一種特異性的能參加發光化學反應的物質，它用一種參加化學發光反應的試劑作為標記，一種或多種參與發光反應的其它化合物則被釋放到檢測器附近的測定介質中，當標記結合物均勻分布在全部溶液中時，它發出的光被掩蓋或淬滅，發生結合反應后，在檢測器的周圍微載體相對集中，這樣它所帶的特異結合體復合體上的標記也形成在局部地濃縮，這時它足以克服測定介質在此局部的掩蓋或淬滅作用，其發出的化學光形成可測的信號，而且光的質和量依賴于被測樣品與載體上特異結合體之間結合的程度。
本發明的另一個實施例的是一種微顆粒載體免疫測定，它利用a.第一種可定位微粒載體(例如“磁性”顆粒)，它連著一個特異性的參與被測物結合的成份。
b.不與微粒載體連接的另一個參與特異結合的成份，它們所帶的化學標記能與底物作用產生一個發光化學反應的前體物。
c.可選擇一種分散在測定介質中的消耗劑，當帶標記的特異結合體分散在測定介質中時，消耗劑能與前體進行有力的競爭，從而起抑制化學發光的作用。
d.第二種可定位載體，可帶有或內含一種能與前體物作用使化學光產生的物質。
e.光檢測器
f.一個化學發光反應的底物來源，它能向檢測器鄰近的溶液中釋放底物。
在此方法中，兩種載體都定位在檢測器附近，使化學光的測定成為可能，并且產生的光量依賴于第一顆粒載體上參于特異性結合的成份與被測樣品之間發生結合的程度。
在前述實施例中，做為例子可把葡萄糖氧化酶作為標記物，它與被釋放到檢測器鄰近的葡萄糖及測定介質中的氧一起作用，產生了前體物過氧化氫，同時可用過氧化氫酶作消耗劑;結合試劑可采用HRP，它能與測定介質中的魯米諾反應。如果需要的話，這種結合物試劑可以帶到第二種載體的表面上或包在它的里面。
按一定順序地向溶液中加入各個組份是有利的，例如在加入底物使標記物發生信號之前，要有一段合宜的“孵育”時間以使免疫結合反應充分。只有在加入必要的底物后，標記才能持續地發出信號，這一點是值得稱道的。底物也總是在固相物再定位在檢測區之前加入的。信號的產生至少在固相定位及對其測定的這段時間內必須持續。
特異結合反應所需的孵育時間依賴于許多因素，例如試劑和被測物的性質，它們的相對或絕對濃度，還有溫度等物理因素。熟悉免疫技術的人對這些參數了如指掌。一般說來，孵育時間不超過1小時，大多采用30分鐘到1小時的范圍。
載體的定位可通過許多途徑來實現。
一個簡單的實施例可采用重力下沉的辦法，當然這需要用一些手段例如振蕩，使得發生結合反應時，載體能保持在測定介質中均勻地懸浮。離心法可用來代替重力。另外，還可以將全部測定介質通過一透性膜或過濾器，把溶液中全部的顆粒集中到一個小體積中。此外，也可以用一種能在磁力等外力的作用下集中到溶液的某一部分的微粒載體，還可在超聲驅動駐波的驅使下，使微粒載體在溶液中移動。
固相可以由任何合適的載體材料制成。所謂的“磁性”顆粒(也即受磁場影響能在溶液中移動的顆粒)可以有不同的大小，如小到1μm，大至300μm，它們都已有商品。如用重力分離，基于材料的密度，顆粒大小最好選擇在50-30μm之間。已成為商品的環氧乙烷丙烯酸顆粒就是很合適的材料，它尤其適合于采用標記半抗原的測定方法。將固相載體致敏或偶聯到結合試劑(如免疫球蛋白)上去的技術，是本類方法中已熟知的標準方法，在本發明中不再提及。
可用本發明分析的物質是范圍極廣的。下列數種僅是做為例子類固醇激素，例如參與妊娠或影響受精過程的，如雌激素和孕酮尿中的代謝物，例如雌酮-3-葡糖苷酸和孕二酮-3-葡糖苷酸。人絨毛膜促性腺激素，促黃體素以及促濾泡素等多肽激素。蛋白質例如尿白蛋白，β-2-微球蛋白及視黃醇結合蛋白。高密度和低密度脂蛋白，它們在心血管監測中是有價值的，還有心肌的肌鈣蛋白。傳染病原的標志，例如風診抗體和弓漿蟲抗體。免疫球蛋白，例如單克隆抗體。
測試對象可有多種來源，尤其是象尿、血清和血漿這類的體液均可被采用。
采用的參與特異性結合的成份可以是多克隆或單克隆抗體，也可是抗原、凝集素或者是激素以及它們的受體。這些制劑在本類技術中都是眾所周知的，許多并已成為商品，本發明不涉及它們的精細本質。
假如預期含有被測物的樣品性質不同(例如血清和尿)或者在樣品中含有干擾特異結合反應和觀測信號產生的物質，這時應對樣品進行稀釋，例如用水和緩沖液，從而使干擾物的作用在使用本發明中的方法進行測定前就受到削弱。
根據本發明設計的測定藥箱擁有一可重復使用的帶有一個信號檢測器(例如小電極)的檢測池，或者是一種帶有膜的一次使用性檢測池，信號可以穿過這個膜到達可重復使用的檢測器附近，或者是一整個帶有信號感受器的一次性使用的檢測池。必要的話，固相載體以及其它重要試劑等也可供應。
本發明的一個實施例，上文中已公布的一個方法中的設計包括一頂部開口的測定介質的容器，一個能將容器封閉的蓋子，蓋子上帶有含信號影響劑的水不溶性凝膠，當凝膠與測定介質接觸時，影響劑就可從凝膠中釋放到測定介質中，凝膠中也可以含有其它與產生可測信號有關的的試劑。
本發明的進一步實施例是一種測定方法，它利用了上一段公布的設計，其測定介質由以下成份配成a)樣品水溶液。
b)一種能易于依靠重力將其從水溶液中分離的微粒固相載體，它上面接有對樣品中的被測物特異的第一結合體。
c)一種標記的特異結合體，當存在被測物時，它能與第一結合體共同參與“夾心”或“競爭”反應;在進行孵育使反應充分之前或之后，加入一定體積的測定介質，然后蓋上蓋子并將其倒置，讓微載體沉到蓋子的凝膠上，使測定得以進行。
下面的例子從多方面對本發明加以概括。
例1本發明原理在下述免疫測定法中得到闡明附

圖1和附圖2顯示的是測試藥箱采用的裝置。
圖1所示的裝置有一個可封閉的容器，它由圓柱體(11)、永久封閉的底部(12)以及敞開的頂部(13)這三部分組成。容器頂部可被一個蓋(14)蓋住。雖然不是本項發明中有意義的內容，但在本例中，圖中所畫的蓋子的內徑與圓柱體(11)的外徑相等，在封蓋時，蓋上的螺紋(15)與圓柱體上的螺紋(16)可互相嚙合。在蓋子內側的螺紋只占蓋子內壁的一部分，在側壁上仍留出了一部分光滑的表面(17)，蓋子與(14)最靠里的空間(18)則充有一層覆蓋蓋內全長的凝膠(19)。圖1中的容器與蓋子是分開的，圓柱體則盛有一定量的樣品液(20)，液體中則含有許多分散的載體顆粒(21)。
在圖2中，顯示了容器(11)用蓋(14)封閉后，并倒置使樣品(20)與凝膠(19)接觸。同時圖2還顯示載體顆粒(21)也已不再是分散在液體中而落到了凝膠的表面(22)上。
下面詳細描述的是載體顆粒參與的微粒載體免疫測定法。根據本項發明，將凝膠做為感受手段，并與其它一種或幾種成份協同，對在孵育時所發生的標記結合物與載體接觸所產生的化學信號進行檢測。凝膠也被用來貯存可釋放的信號影響劑，當容器被倒置后，液體與凝膠相遇，這時信號影響劑就向液體樣品中擴散。當標記的結合物隨載體集中到凝膠表面上時，就產生了可測的化學信號并可在凝膠表面進行測定，假如產生的信號能向凝膠層中擴散，那么檢測就能在凝膠內部進行。例如采用使凝膠顏色變化的方法進行信號測定。為了便于在不需取走蓋子的條件下觀察容器中凝膠的顏色反應，在制作蓋子時可全部或局部地采用透明或者半透明的材料。例如在蓋的頂部或側面開一個透明的“小窗”，這樣就能輕而易舉地看到凝膠的顏色變化。
凝膠中的PH與測定介質中的可能不同，這樣就能在兩種環境中分別采用最適PH值不同的酶。
如果凝膠是熱成型的，那么其成型溫度就不宜太高，致使在藥箱制作過程中凝膠所要包含進去的一些不穩定的試劑(例如酶)會因此而變性。一般成型溫度最好不要低于30℃，但也最好不要高于40℃。瓊脂糖凝膠就十分理想，因為它的凝固點正是在此范圍內。
采用上文中剛記敘過的測試藥箱，可進行下列實驗。
例1a一套可封閉的透明小塑料樣品管被用作基本的試驗容器。每個管徑約1cm，高約3cm。每個管的基部加0.15ml的瓊脂糖指示凝膠。每個管除了加入溶在PH6的磷酸緩沖液(PBS)中的液體樣品之外，還含有固相商品的環氧樹脂激活的環氧乙烷丙烯酸小珠(大小為100-200μm)每10克干重的顆粒用16mg從雞蛋中提取的抗生物素蛋白處理致敏。聯有抗生物素蛋白的小珠保存在PH7.1的磷酸緩沖鹽水(PBS)中。
偶合物與生物素連接的葡萄糖氧化酶的商品為凍干粉，大約1mg蛋白中含20nmols的生物素。臨用前按說明用PBS配制并稀釋。
生物素商品化的右旋生物素為固相晶體。先將準確稱量的生物素溶在PBS中，然后以此為參比溶液，稀釋成各種合適的濃度。其范圍在5到100ng/ml之間。
用PH6.0的PBS配制含1.5%(重量體積比，即W/V)瓊脂糖的凝膠，并含有100mM的葡萄糖，60mM碘化鉀，1%(W/V)的淀粉，以及0.005單位的HRP膠囊。這種HRP膠囊已成為商品，是直徑20-80μ的聚酰胺小囊(直徑，每mg濕重的固體中含0.656單位的HRP。這種囊的膜前臚感緣模琀2O2和KI等小分子可以穿過它，但卻能留住分子量大于10，000的物質。
在一系列含凝膠的管中加入各種不同濃度的過氧化物溶液，就可以測出上述配方的凝膠檢測過氧化物的能力。發現1ml50μm的過氧化物溶液，能在20分鐘內使凝膠變蘭。
測定方法連有抗生物素蛋白的載體小珠經過離心，去除上清部分。加入含0.05%Keltrol的緩沖液，使載體形成50/50的懸浮液。將葡萄糖氧化酶與生物素的結合體用含0.05%Keltrol的緩沖液配成5μg/ml的濃度。用一批微離心管，每管中入100μl的載體懸浮液，500μl的結合體溶液以及500μl的生物素溶液，加蓋后放在一個顛倒混勻器上，在室溫不斷混和2小時。
經過這樣的孵育后，從每管中取出50μl與1ml緩沖液混和后，加入到含凝膠的樣品管中。這時載體顆粒馬上落到凝膠表面，在不含生物素或含量很微的管子中的凝膠，在幾分鐘后就出現蘭色的斑點，而游離生物素水平較高的管中顏色就很淡。隨著反應的進行，所有管中出現顏色，但無游離生物素的管出現顏色又快又深。如果將此同一系統的稀釋體積增大，則能提高測定的分辨率。
例1b同樣的實驗可采用對PH敏感的試紙，將它放到蓋子里的瓊脂中，瓊脂中含有脲作用可釋性底物，并用脲酶做為生物素的標記。定位了的載體顆粒帶著生物素與脲酶的結合物將與被釋放的脲相互作用，由于產生氨造成的凝膠局部的PH變化則可在PH試紙上顯示出來。如果測試樣品是配制在緩沖液中，則在離凝膠遠近外的溶液將不會有PH的改變。
例1C此例中采用的載體小珠、結合體以及游離的生物素與例1a中相同，區別是它有一個能測化學發光的凝膠層。
此凝膠是由1%(W/V)的瓊脂糖溶在PH為8.5的0.1MTris緩沖液中配成，內含150mM葡萄糖，1.25mM的魯米諾，1mM對碘苯酚和包在囊中的HRP(與例1a相同)，每10ml凝膠中含1mlHRP膠囊，相當于200個單位的酶活性。每個樣品管中加0.15ml的凝膠。
向每管中加入50μl攜有葡萄糖氧化酶的小珠及2mlPBS緩沖液。這時載體就落在凝膠的表面，在不含或含微量游離生物素的管中，凝膠層就能發出明顯的蘭色化學光。
權利要求
1.一種用特異性結合對樣品中被測物進行定性和/或定量分析的測定方法，在該方法中，樣品與一種可移動的固相載體物質相接觸，在該固相載體上固化著二個結合體，其一是連接在載體上的對被測物有特異性的第一結合體，其二是標記的能在被測物存在時與第一結合體共同參與“夾心”或“競爭”反應的有特異性的第二結合體，在該方法中，經過一段孵育時間使反應充分后，可移動的固相載體被移到離化學信號檢測器很近的測定介質中，在這里一種信號影向劑被釋放入測定介質中，從而使可測信號得以產生，可測信號的質和量則取決于被測免疫原與載體顆粒上特異性結合體之間結合的程度。
2.根據權權要求1的測定方法，其信號影響劑是一種化學成份，它是產生信號的化學反應的重要組分。
3.根據權利要求1的測定方法，其信號影響劑是一種能提高產生化學“信號”的化學反應效率的化學成份。
4.根據上述任意一項權利要求的測定方法，其測試樣品在小體積中孵育，在載體定位到檢測器附近之前將樣品稀釋。
5.根據上述任意一項權利要求的測定方法，其信號影響劑從位于信號檢測器上或附近的一個來源向外擴散。
6.根據上述任意一項權利要求的測定方法，其測定介質中含有掩蓋劑或淬滅劑，它們使得在獨爰觳餛韉那蛑校藕諾牟凸鄄焓艿揭種啤
7.根據上述任意一項權利要求的測定方法，檢測器測到的信號是由化學發光反應產生的可見光。
8.根據權利要求7的測定方法，標記物在測定介質中生成過氧化氫，而對過氧化物的檢測是通過它本身參與化學發光反應來實現的。
9.根據權利要求7的測定方法，標記物是參加化學發光反應的一種過氧化物分解酶。
10.根據權利要求1至6的任意一項的測定方法，其標記物在測定介質中生成過氧化氫，并且采用電化學方法來檢測該過氧化物。
11.根據權利要求6的測定方法，其可測信號為化學光，掩蓋劑或淬滅劑造成測定介質呈不透明或至少是不充分透明的，這樣足以阻止光從較遠處到達信號檢測器。
12.根據權利要求6的測定方法，其使用的掩蓋劑或淬滅劑是能消耗信號產生系統某一重要部分的一種化學試劑。
13.根據權利要求12的測定方法，其標記物在測定介質中產生過氧化氫，消耗劑是過氧化氫酶。
14.根據權利要求7至9的任意一項的測定方法，其標記物是辣根過氧化物酶(HRP)測定介質中含有如過氧化氫的過氧化物，一種能發出化學光的2，3-二氫-1，4-酞嗪二酮如氨基苯二酰肼(魯米諾)被釋放到光檢測器的附近部位的測定介質中。
15.根據權利要求7至9的任意一項的測定方法，其標記物是葡萄糖氧化酶，測定介質中含有能發化光的2，3-二氫-1，4-酞嗪二酮如魯米諾，葡萄糖被釋放到光檢測器附近的測定介質中。
16.根據權利要求7至9中的任意一項的測定方法，其標記物是葡萄糖氧化酶;檢測區是一層凝膠，內含能發光的2，3-二氫-1，4-酞嗪二酮如魯米諾，結合著辣根過氧化物酶，可釋放到測定介質中的葡萄糖作為葡萄糖氧化酶的底物。
17.根據權利要求7的測定方法，它采用(a)第一種可定位微載體(如“磁性”顆粒)，上面連有一個對被測物具有特異性的結合物。(b)一種不與載體連接的特異性結合物，它所帶的化學標記能與底物作用產生一個發光化學反應的前體物。(c)可選用一種分散在測定介質中的消耗劑，當帶標記的特異性結合體分散在測定介質中時，消耗劑能與前體物有效的競爭，從而起到抑制化學發光的作用。(d)第二種可定位載體，可帶有或含有一種能與前體物作用使化學光生成的物質。(e)一個光檢測器。(f)要有一個化學發光反應的底物來源，它可向光檢測器附近的介質中釋放底物。在此測定方法中，兩種顆粒載體都定位在光檢測器附近，它使化學光的測定成為可能，且其產生的光量取決于第一顆粒載體上所攜帶的特異性結合物與被測樣品之間發生結合的程度。
18.根據權利要求17的測定方法，其標記物是葡萄糖氧化酶，此標記物與釋放到光檢測器附近的測定介質中的葡萄糖以及測定介質中的氧共同作用生成作為前體物的過氧化氫，其消耗劑是過氧化氫酶，結合物是辣根過氧化物酶，它與測定介質中的魯米諾相互作用。
19.根據權利要求1的方法中所采用的裝置，它包括一個進行測試的容器，容器中包括一個信號檢測器以及一個位于檢測器上或附近的信號影響劑的來源。
20.根據權利要求1的方法中所采用的裝置，它包括一個頂部開口的盛放測定介質的容器，一個能將容器封閉的蓋子，蓋子上帶有含信號影響劑的水不溶性凝膠，當凝膠與測定介質接觸時，信號影響劑就從凝膠中釋放出來。凝膠中也可含有產生可測信號所必需的其它試劑。
21.根據權利要求19的裝置，其凝膠是瓊脂糖凝膠。
22.根據權利要求20或21中所用裝置的測定方法，其測定介質由以下組成配制a)樣品水溶液。b)一種依靠重力能易于從溶液中分離的微粒固相載體，它上面帶有對預期存在于樣品中的被測物具有特異性的第一結合體。c)一種標記的特異結合體，當存在被測物時，它能與第一結合體共同參與“夾心”或“競爭”反應。在經孵育使反應進行充分之前或者之后向裝置內放入一定體積的測定介質，之后用蓋封閉容器，再將其倒置，讓微粒固相載體沉到蓋子的凝膠上，以測定分析結果。
23.根據權利要求22的方法，其標記物是葡萄糖氧化酶，凝膠中含有可釋放到測定介質中的葡萄糖、碘化鉀、淀粉以及辣根過氧化物酶。
24.根據權利要求22的方法，其標記物是葡萄糖氧化酶，凝膠中除含有可釋放到測定介質中的葡萄糖外，還含有魯米諾，對碘苯酚以及辣根過氧化物酶。
全文摘要
一種用特異性結合對樣品中被測物進行定性或定量分析的免疫測定方法，測定時樣品與一種可移動的固相載體如顆粒(21)接觸，在該固相載體上固化著對被測物有特異性的第一結合體，還帶有一種標記物，當存在被測物時，它們就共同參與一個“夾心”或者“競爭”反應，反應充分后，在測定介質(20)內的可移動的固相載體(21)就移動到離信號檢測器(19)附近的位置，在這里，信號影響劑如底物也釋放到測定介質中，并且與標記物共同起作用產生信號，產生的信號的大小，可以用來測定結合反應的程度。
文檔編號G01N33/535GK1032399SQ8710674
公開日1989年4月12日 申請日期1987年10月1日 優先權日1986年5月22日
發明者保羅·詹姆斯·戴維斯, 羅斯瑪麗·安·露西·德雷克, 威廉·愛德華·霍恩比 申請人:尤尼利弗公司